Methodenartikel

Gebruik van Mycobacterium smegmatis als bio-indicator voor zink-beperkte groeiomstandigheden in mycobacteriën

1.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67274

⸱

20 september 2024

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, University of Hawaiʻi at Mānoa

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de bereiding van Zn2+-beperkte media, kweekvaten en zaaikulturen om Zn2+-beperkte ribosomen in mycobacteriën te produceren. Sporen van Zn2+ leiden tot Zn2+-beperkte groei en we beschrijven morfogene eigenschappen die als bio-indicatoren worden gebruikt om Zn2+-beperking in vitro te verifiëren in het modelbacterie, Mycobacterium smegmatis, en de humane pathogeen M. tuberculosis.

Samenvatting

Veel bacteriën bouwen alternatieve ribosomen in Zn2+-beperkende groeicondities door Zn2+-bindende ribosomale eiwitten te vervangen door Zn2+-onafhankelijke paralogen. Het definiëren van een systeem om deze alternatieve ribosomen te bestuderen, is moeilijk gebleken omdat Zn2+-besmetting in het laboratorium gebruikelijk is. Om dit probleem aan te pakken, worden soms chelerende middelen toegevoegd aan groeimedia, maar deze aanpak bemoeilijkt het biologische antwoord op geleidelijke Zn2+-beperking en gaat gepaard met ribosomenhibernatie. Hier worden gedetailleerde instructies geschetst voor het bereiden van media en het zaaien van culturen voor Zn2+-beperkte groei zonder chelatoren toe te voegen. Volgens deze methode ondergaat het modelbacterie, Mycobacterium smegmatis, morfogenese, die afhankelijk is van alternatieve ribosomen. Omdat morfogenese hanteerbaar is en alleen plaatsvindt onder Zn2+-beperkende condities, kan M. smegmatis worden gebruikt als bio-indicator om biologisch relevante groeicondities te verifiëren. Drie bio-indicator-fenotypen (celdichtheid, cellengte en co-enzym F420-fluorescentie) die Zn2+-beperking in het wildtype aangeven, worden beschreven, en veranderingen in deze bio-indicatoren voor een deletie-mutant die geen alternatieve ribosomen kan bouwen, worden geschetst. Aangezien sporen van Zn2+-besmetting moeilijk te controleren is voor elke batch media, en precieze kwantificering van Zn2+ in elke mediavoorbereiding overdreven belastend is, is het volgen van dit bio-indicator-fenotype een toegankelijke manier om de bereiding van Zn2+-beperkt groeimedia te valideren. Om de juiste condities voor Zn2+-beperkte groei en alternatieve ribosoombaan te helpen identificeren, werden veranderingen in de bio-indicator-fenotypen ook geprofileerd voor Zn2+-verontreinigde of ernstig Zn2+-gedepleteerde bereidingen van Zn2+-beperkt media. Verdere details om Zn2+-beperkte groei en alternatieve ribosoombaan in M. tuberculosis te bereiken, worden gepresenteerd, samen met het bijbehorende bio-indicator-fenotype. Over het algemeen zullen de gedetailleerde instructies en bio-indicator-fenotypen die hier worden beschreven, helpen bij het standaardiseren van de productie van translationeel actieve alternatieve ribosomen in mycobacteriën.

Inleiding

Zinkion (Zn2+) is een essentieel micronutriënt en een standaard bestanddeel van microbiologische media. Veel bacteriën ondervinden echter beperkingen in Zn2+ in hun omgeving omdat Zn2+-beperkende omstandigheden wijdverbreid zijn; bodem1, zee2 en niches binnen de gastheer3 zijn vaak Zn2+-beperkt. Daarom hebben de meeste bacteriën mechanismen ontwikkeld om Zn2+-beperking te overwinnen en cellulaire functies te behouden4. Systemen die betrokken zijn bij het handhaven van Zn2+-homeostase staan onder strikte transcriptionele controle5 en zijn betrokken bij het vergaren van Zn2+ met behulp van Zn2+-importsystemen met hoge affiniteit, het mobiliseren van cellulaire Zn2+-reserves en het vervangen van bepaalde Zn2+-bindende eiwitten door alternatieve Zn2+-onafhankelijke paralogen6. Een voorbeeld van het laatste zijn Zn2+-onafhankelijke ribosomale eiwit (RPs) paralogen, die een veel voorkomend kenmerk zijn van Zn2+-responsieve regulons in bacteriën4. Deze zeer uiteenlopende Zn2+-onafhankelijke RPs onderscheiden zich van hun Zn2+-bindende paralogen door de verstoring van het Zn2+-bindende CXXC-motief7. Meer dan de helft van de gesequencede prokaryotische genomen bevat ten minste één paar gedupliceerde RPs waarin, in veel van hen, één RP Zn2+ bindt, terwijl zijn paraloog dat niet doet8. Terwijl de C+/C- notatie (die de aanwezigheid/afwezigheid van het cysteïnerijke Zn2+-bindende motief aangeeft) vaak wordt gebruikt met betrekking tot deze paraloge RP-paren7, zijn Zn2+-onafhankelijke RPs ook beschreven als alternatieve (Alt) versies van de primaire (Prim), Zn2+-bindende RP-paralogen, aangezien AltRPs in sommige bacteriën dienen als alternatieve RPs voor ribosoombiosynthese onder Zn2+-beperkte omstandigheden en het is een trefwoord met betere zoekbaarheid9,10,11.

Omdat AltRP-expressie strikt wordt gereguleerd door Zn2+, is het logisch om aan te nemen dat AltRP-expressie functionele redundantie biedt aan Zn2+-afhankelijke ribosomale eiwitten in geval van Zn2+-beperking. Inderdaad is deze eigenschap van AltRPs aangetoond voor het modelgrondbacterie Bacillus subtilis, waar groei wordt gered tijdens Zn2+-beperking door het vrijmaken van het oppervlakte-PrimRP L31 en het vervangen door het AltRP L3112,13. Sommige AltRPs zijn echter paraloog aan kern-PrimRPs, bijv. S14, wat betekent dat hun incorporatie vereist is tijdens ribosoombiosynthese12,13. Het herstellen van het ribosoom met AltRPs is een vastberaden, energie-intensief programma. Hoewel deze kern-AltRPs kunnen dienen om Zn2+ uit het ribosoom te bevrijden, is het ook mogelijk dat sommige AltRPs een extra functie hebben geëvolueerd in de Zn2+-beperkte omgeving. Dit wordt ondersteund door de observatie dat AltRPs verschillen van hun paraloge PrimRPs; sequentiehomologie van AltRP-genen is vaak hoger onder homologen in verschillende soorten dan bij de Zn2+-bindende PrimRP-gensequentie binnen dezelfde soort7,10. Omdat genen die coderen voor zeer uiteenlopende AltRPs onder Zn2+-afhankelijke transcriptionele controle staan, worden ze vrijgesteld van de selectiedruk die wordt uitgeoefend op de strikt gereguleerd en hoog geconserveerde ribosomale superoperons14. Ontkoppelde selectiedruk op de genetische informatie die de ribosomale machinerie en AltRPs codeert, stelt deze RPs bloot aan verschillende evolutionaire trajecten dan de homologe PrimRPs en zou kunnen zorgen voor lijnspecifieke evolutie van dezelfde AltRP in verschillende bacteriën10,15. De wijdverbreide aanwezigheid van AltRPs in bacteriën en de ontkoppelde genetische regulatie van deze unieke RPs roepen een interessante vraag op of de incorporatie van AltRPs in bacteriële ribosomen een speciale eigenschap verleent aan AltRP-bevattende ribosomen (Alt-ribosomen).

Mycobacteriën zijn een ideale groep bacteriën om de mechanistische eigenschappen van Alt-ribosomen te onderzoeken. Ten eerste bezitten mycobacteriën een sterk geconserveerd altRP operon dat vier genen bevat die coderen voor AltRPs: S14-2, S18-2, L28-2 en L33-28,9. Mycobacteriële AltRPs zijn aanzienlijk verschillend van hun PrimRP-paralogen; in alle vier de PrimRP/AltRP-paren is een bepaald AltRP-gen over alle mycobacteriumsoorten meer vergelijkbaar dan het is met het PrimRP-gen in dezelfde soort10. Lijnspecifieke evolutie van AltRPs is ook duidelijk binnen mycobacteriën, zoals blijkt uit AltRPs S18-2 en L28-2 in Mycobacterium tuberculosis en M. bovis, die unieke sequenties bevatten aan het C-uiteinde die niet aanwe

Protocol

OPMERKING: De in deze studie gebruikte stammen zijn wild-type M. smegmatis mc2 155 (geschenk van Dr. Robert Husson, Boston Children's Hospital) en de ΔaltRP deletiestam (afkomstig uit het lab van Prisic10). Deze kunnen worden gekweekt in een laboratorium met biosafety level 1 (BSL1) of BSL2, afhankelijk van de lokale biosafety-regelgeving en beschikbare middelen. Hier is het protocol geschreven voor een BSL2-laboratorium. Indien uitgevoerd in een BSL1-laboratorium, kan een aseptische techniek met een bunsenbrander de biosafety cabinet vervangen. Daarnaast moeten onderzoekers die andere stammen of condities willen toevoegen het benodigde volume medium berekenen op basis van het totale aantal geanalyseerde culturen. Manipuleer pathogene M. tuberculosis H37Rv (Mtb-H37Rv; geschenk van Dr. Robert Husson, Boston Children's Hospital) in een BSL3-laboratorium onder gebruik van een ademhalingsbeschermingsmiddel (bijv. PAPR of N95). Hergebruik geen kolven bij het kweken van zeer virulente mycobacteriën, zoals Mtb-H37Rv. Auxotrope M. tuberculosis mc26206 (Mtb-Aux) is geattenueerd en kan worden gemanipuleerd in een BSL2-laboratorium (geschenk van Dr. William R. Jacobs Jr., Albert Einstein College of Medicine).

1. Voorbereiding van de kolven

OPMERKING: Zn2+-beperkende groeicondities worden bereikt in herbruikbare (autoclaveerbare) polycarbonaat Erlenmeyerkolven van 250 mL. Gebruik geen glazen kolven voor Zn2+-beperkende groei en onderzoek of vergelijk strikte zuurwasprocedures niet met de resultaten die in dit protocol worden gepresenteerd19. Splinternieuwe kolven zijn voldoende om Zn2+-beperkende groeicondities te bereiken, maar meng nooit nieuwe en oude kolven in één experiment. Gooi kolven weg die tekenen van slijtage vertonen (meestal bij de naden) of die meer dan ongeveer 20 keer zijn gebruikt. Controleer de dopfilters regelmatig op degradatie en gooi ze weg als ze zijn aangetast. Gooi, indien aanwezig, de dopdeksels weg die op de bovenkant van de doppen worden geschroefd en de filters afdekken. Deze methode beschrijft de voorzorgsmaatregelen die zijn genomen om de kolven te reinigen en voor te bereiden op hergebruik.

  1. Label de kolven permanent, zodat dezelfde set uitsluitend wordt gebruikt voor Zn2+-beperkende condities. Label een andere set kolven voor Zn2+-verzadigde groei. Het gebruik van verschillende kleuren bij het labelen is handig om te voorkomen dat de kolven worden vermengd.
  2. Laat kweekresiduen nooit opdrogen in de kolven. Voeg onmiddellijk na het afgieten van de kweek uit de kolf water toe aan de kolven (bijv. 100 mL). Als de kweek aan het einde van de groei niet wordt geoogst, leeg dan de kolven door de volledige kweek in een afvalcontainer voor vloeistoffen met een uiteindelijke bleekconcentratie van 10% te gieten, nadat de bioindicator-fenotypes zijn geregistreerd zoals beschreven in dit protocol.
  3. Autoclaveer de kolven via de vloeistofcyclus (minimaal 121 °C bij 15 psi) gedurende 20 min met het water erin en de doppen erop.
  4. Was de kolven na het autoclaveren met een niet-ionisch, laagschuimend reinigingsmiddel en schrob ze goed met een zachte borstel. Wijs een specifieke borstel toe die alleen wordt gebruikt voor het wassen van kolven die voor Zn2+-beperkende groei zijn gebruikt. Zorg ervoor dat de kolven schoon zijn en geen residuen of vuil bevatten. Schrob de doppen niet en gebruik geen zeep op de doppen; spoel ze voorzichtig af met gedeïoniseerd water.
  5. Spoel de kolven goed af met kraanwater, gevolgd door drie spoelgangen met gedeïoniseerd (type II of III) water en ten minste één extra spoeling met ultrapuur (type I) water (18,2 MΩ-cm bij 25 °C en ≤ 5 ppb totaal organische koolstof).
  6. Plaats de kolven verticaal ondersteboven, zodat er geen water op de bodem kan blijven staan. Gebruik geen standaard wandgemonteerde laboratoriumrekjes voor het drogen, omdat deze kolven onder een hoek houden waardoor er een kleine hoeveelheid water kan blijven staan. Standaard afdrukkrekken voor servies zijn voldoende. Laat de kolven en de doppen volledig drogen.
  7. Draai, zodra ze droog zijn, de doppen op de kolven en bedek de doppen met aluminiumfolie. Bevestig een stuk autoclaveerindicator-tape op de folie om de steriele status aan te geven en om de dopfilters tegen stof te beschermen.
  8. Autoclaveer de gereinigde kolven (minimaal 121 °C bij 15 psi) gedurende 20 min, gevolgd door een vacuüm na de cyclus om de lading te drogen (indien de autoclaaf over deze functie beschikt). Bewaar de kolven droog en beschermd tegen stof.

2. Bereiding van Zn2+-beperkt medium (ZLM)

OPMERKING: Gebruik uitsluitend plastic bekerglazen, maatkegels en overige benodigdheden bij het bereiden van media. Wijs een set laboratoriummateriaal aan die exclusief wordt gebruikt voor de bereiding van Zn2+-beperkte media. Spoel al het laboratoriummateriaal grondig met ultrapuur (type I) water vóór en na gebruik. Gebruik chemicaliën van hoge zuiverheid en koop deze, indien mogelijk, bij dezelfde leveranciers.

  1. Bereid Zn2+-beperkt Sauton's medium voor zonder toegevoegde Zn2+ zouten26 door de volgende chemicaliën te mengen met ~950 mL ultrapuur water in een plastic bekerglas van 1 L met een roerstaaf:
    0,5 g KH2PO4 (0,05%; MW: 136,09)
    0,5 g MgSO4 x 7H2O (0,05%; MW: 246,48)
    2 g citroenzuur, anhydrisch (0,2%; MW: 192,12)
    4 g L-asparagine, 99% (0,4%; MW: 132,12)
    60 mL glycerol (6%)
    189 µL 1 M ferric ammonium citrate (0,005%; MW: 265)
    1. Voeg glycerol toe met een wegwerpplastic serologische pipet van 50 mL. Spoel de pipet goed uit door ongeveer 10x op en neer te pipetteren in het medium totdat er geen residu van glycerol meer in aanwezig is.
      OPMERKING: Glycerol is zeer viskeus en moeilijk af te meten. Alternatief kan glycerol in een maatkolf worden gegoten en meerdere keren worden uitgespoeld met ongeveer 30 mL ultrapuur water, dat vervolgens aan het medium wordt toegevoegd. Indien deze methode wordt gebruikt, begin dan met een kleiner volume (~600 mL), zodat het eindvolume niet groter is dan ~950 mL na toevoeging van de glycerol en het spoelwater uit de maatkolf aan het medium.
  2. Vul het volume van het medium aan tot ongeveer 950 mL en meng goed. L-asparagine heeft een paar minuten nodig om op te lossen; wacht tot er geen witte vlokken meer zichtbaar zijn voordat u verder gaat.
    OPMERKING: De ferric ammonium citrate-oplossing geeft het medium een lichtgele kleur.
  3. Bereid 15 mL verse NaOH-oplossing (~10% w/v) met ultrapuur water in een plastic houder (bijv. een conische buis van 15 mL).
  4. Spoel een pH-meter voor gebruik grondig met ultrapuur water en dompel alleen de bulb van de pH-meter in het medium. Laat de pH-meter in het medium terwijl u voorzichtig roert en de pH aanpast. Voeg met een plastic wegwerptransferpipet de vers bereide NaOH toe tot een eind-pH van 7,4.
    OPMERKING: De begin-pH van het medium is zeer zuur. Er is een groot volume NaOH-oplossing nodig om de pH naar het neutrale bereik te brengen. Voeg aanvankelijk 4-6 mL van de NaOH-oplossing toe; zodra de pH rond de 6,5 ligt, voegt u de NaOH-oplossing druppelsgewijs toe. Schiet niet door naar een pH boven de streefwaarde van 7,4. Mocht dit gebeuren, probeer de pH dan niet opnieuw aan te passen met HCl of andere zuren, maar gooi het medium weg. Het is raadzaam om een pH-meter specifiek toe te wijzen aan het maken van ZLM en niet te gebruiken voor het meten van de pH van andere media en buffers die de probe kunnen contamineren.
  5. Breng het medium over naar een maatkolf en vul het aan tot een eindvolume van 1 L met ultrapuur water. Steriliseer het medium door filtratie via een wegwerpfilterkolf van 0,2 µm.
  6. Voeg aseptisch 2,5 mL gefilter-gesteriliseerde 20% Tween-80-oplossing toe (0,05% eindconcentratie). Bewaar gedurende maximaal 6 maanden bij 4 °C en bescherm tegen licht.

3. Zn2+-beperkte groei in M. smegmatis

OPMERKING: Vanwege batchvariatie in de hoeveelheid Zn2+ aanwezig in ZLM, is het essentieel om voor alle culturen in een experiment dezelfde batch medium of meerdere media te gebruiken die goed met elkaar zijn gemengd. Naast het medium dat nodig is voor het opzetten van de culturen, is ongeveer 100 mL extra nodig voor het wassen en normaliseren van de zaadculturen.

  1. Voer alle stappen uit in een veiligheidskast. Bereid de startculturen 18 u vóór het opzetten van een groeiexperiment voor. Gebruik geen overgegroeide of klonterende startculturen. Eén startcultuur per stam is voldoende.
    1. Voeg aseptisch 5 mL 7H9-ADC-medium (Middlebrook 7H9-bouillon met 0,05% Tween 80 en 10% ADC-verrijking [eindconcentratie: 0,5% runder serumalbumine, 0,2% dextrose, 0,085% NaCl en optioneel 0,0003% catalase]) toe aan een bioreactormontagebuis van 50 mL.
    2. Voeg aseptisch 10 µL ontdooide glycerolstockcellen (bereid volgens26) direct toe aan het medium. Schroef de dop op de buis.
    3. Plaats de buizen stevig in een schudincubator onder een hoek van ongeveer 45°, zodat de vloeistof tijdens het schudden ongeveer tot de helft van de buis komt.
    4. Incubeer de buizen gedurende ongeveer 18 u bij 37 °C met schudden op 120 rpm.
  2. Controleer de overnight-startculturen om er zeker van te zijn dat de cultuur gelijkmatig troebel is en niet significant klontert. De optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van de overnight-cultuur is idealiter rond de 0,5-0,8.
  3. Pelleteer de overnight-culturen in de bioreactorbuizen, gebruikt voor de overnight-groei, door centrifugatie bij 3.000 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
  4. Giet het supernatant af of aspireer dit en resuspendeer in 5 mL ZLM. Herhaal de centrifugatie- en resuspensiestappen 2x voor in totaal drie wasbeurten.
    1. Vul tijdens de centrifugatiestappen een cuvette tot overvloeiend met 70% ethanol om te steriliseren. Laat de gevulde cuvette 10 min in de veiligheidskast staan en spoel 3x goed na met ZLM met behulp van een pipet.
      OPMERKING: Het proces van celnormalisatie kost tijd en oefening om efficiënt uit te voeren. Door de cellen direct in de met ethanol gesteriliseerde cuvette te normaliseren, wordt het proces sterk versneld.
    2. Bereid voldoende cuvetten voor het aantal stammen dat in de studie is opgenomen; voor dit protocol zijn bijvoorbeeld twee gesteriliseerde cuvetten nodig, één voor het wildtype en één voor de ΔaltRP-mutant.
  5. Resuspendeer na drie wasbeurten met ZLM elke celpellet in 2 mL ZLM.
  6. Nul een spectrofotometer met 600 µL ZLM in een cuvette. De cuvette hoeft niet gesteriliseerd te zijn. Zet de cuvette apart en gebruik deze om de spectrofotometer te nullen voordat elke cultuur (d.w.z. stam) wordt genormaliseerd.
  7. Verplaats, terwijl u met één stam tegelijk werkt, 600 µL gewassen cellen uit stap 3.5 naar een gesteriliseerde cuvette die is voorbereid in stap 3.4.1 en meet de begin-OD600. Als de OD600 boven de 1 ligt, ga dan door naar stap 3.8. Als de OD600 onder de 1 ligt, volg dan de deelstappen 3.7.1 en 3.7.2.
    1. Als de beginwaarde van de OD600 uit stap 3.7 lager is dan 1, verzamel dan alle cultuur uit de cuvette, voeg deze terug toe aan de resterende gewassen startcellen in de centrifugebuis en centrifugeer de cultuur opnieuw zoals in stap 3.3. Resuspendeer de cultuur in een kleiner volume dan gebruikt in stap 3.5 (bijv. 1 mL) om een hogere celdichtheid te bereiken, en herhaal stap 3.7.
    2. Als de OD600 na stap 3.7.1 nog steeds onder de 1 ligt, is de cultuur niet dicht genoeg; start de procedure opnieuw vanaf stap 3.1. Incubeer de culturen langer of verhoog de hoeveelheid inoculum bij het opzetten van de overnight-culturen, zodat de uiteindelijke overnight-cultuurdichtheid rond de OD600 = 0,5-0,8 ligt, zoals beschreven in stap 3.2.
  8. Bereken het volume ZLM dat moet worden toegevoegd aan de 600 µL gewassen cellen in de cuvette om een OD600 van 1 te verkrijgen, met behulp van de volgende vergelijking en de in stap 3.7 gemeten OD600:
    Volume ZLM (μL) = (begin-OD600 - 1) × 600 μL
  9. Voeg het in stap 3.8 berekende volume ZLM toe aan de cuvette die in stap 3.7 is voorbereid, meng goed door 5x-10x te pipetteren en meet de OD600 opnieuw.
  10. Stel de OD600 in binnen 5% van OD600 = 1 door de onderstaande deelstappen te volgen. Gebruik twee pipetten, waarbij er één (P1000-formaat) uitsluitend wordt gebruikt voor het mengen van de cultuur om te voorkomen dat er te veel tips worden gebruikt voor elke aanpassing.
    1. Als de OD600 boven de 1 ligt, voeg dan druppelsgewijs ZLM toe (~50 µL per keer), meng goed door 5-10 keer op en neer te pipetteren en meet de OD600. Herhaal dit proces indien nodig totdat de cultuur binnen 5% van OD600 = 1 ligt.
    2. Als de OD600 tijdens de normalisatie onder de 1 zakt, voeg dan meer gewassen cellen toe (~20 µL om te beginnen) uit stap 3.5, meng goed door 5x-10x op en neer te pipetteren en meet de OD600. Herhaal dit proces indien nodig (of voeg meer ZLM toe zoals beschreven in stap 3.10.1 als de OD600 boven de 1 komt) totdat de cultuur binnen 5% van OD600 = 1 ligt.
    3. Zorg ervoor dat het volume in de cuvette tijdens de celnormalisatie ~1,5 mL niet overschrijdt om te voorkomen dat er cultuur in de spectrofotometer lekt. Verwijder indien nodig cultuur uit de cuvette bij het verdunnen. Zorg er ook voor dat het cultuurvolume in de cuvette boven het minimum ligt dat vereist is voor een nauwkeurige meting van de OD600 van de spectrofotometer. De meeste spectrofotometers vereisen ten minste 600 µL.
  11. Herhaal de celnormalisatiestappen (3.6 - 3.10) voor alle stammen en condities die in de studie zijn opgenomen.
  12. Bereid het totale aantal kolven voor dat nodig is voor een experiment door aseptisch 50 mL ZLM toe te voegen aan plastic Erlenmeyerkolven van 250 mL, zoals beschreven in stap 1.
  13. Inoculeer de kolven door aseptisch 50 µL van de genormaliseerde cultuur met OD600 = 1 direct vanuit de cuvette toe te voegen voor een uiteindelijke OD600 van 0,001 (1:1000 verdunning van het genormaliseerde inoculum).
  14. Voor culturen die zonder Zn2+-beperking worden gekweekt (d.w.z. Zn2+-verzadigde media, ZRM), voegt u 30 µL steriele 10 mM ZnSO4 (vers bereid uit een steriele 1M stockoplossing) direct toe aan de cultuurkolven tot een eindconcentratie van 6 µM ZnSO4.
  15. Incubeer de kolven bij 37 °C met schudden op 100 rpm gedurende 3 dagen tot de stationaire fase (Dag 0 is de dag van inoculatie).
  16. Meet elke dag van de groei met een monochromator- of filtergebaseerde microplate-reader de volgende groeimetrieken met behulp van 200 µL cultuur in een 96-well microplate met platte bodem. Voer de plaatmetingen direct uit na het aliquoteren van de cellen, zodat deze niet bezinken.
    OPMERKING: Voorverwarmen van de plate-reader is niet nodig, omdat de absolute fluorescentiewaarden minder informatief zijn dan de ratio en fluorescentiescans, en het kleine gemeten volume tijdens het klaarzetten van de plaat snel equilibrium bereikt met de kamertemperatuur. Fluorescentie kan van boven of onder de plaat worden gemeten als condensatie op het deksel problematisch is, hoewel de fluorescentie-intensiteitswaarden over het algemeen lager zijn bij meting vanaf de bodem.
    1. Celdichtheid (d.w.z. OD600): Om de OD600 uit een microplate-reader te rapporteren, dient een standaardcurve te worden gegenereerd om de meting van de microplate-padlengte met een vastgesteld volume (bijv. 200 µL) om te rekenen naar de standaard padlengte van 1 cm.
    2. Fluorescentie van cofactor F420 (ex 420 nm/em 475 nm): Gebruik voor filtergebaseerde microplate-readers de dichtstbijzijnde filterset (bijv. ex 430 nm/em 488 nm) en zwarte 96-well microplates.
    3. Meet de achtergrondfluorescentie bij 375 nm (ex 375 nm/em 475 nm)
    4. Genereer bij gebruik van een monochromator een fluorescentie-intensiteitsscan van ex 230 - 440 nm in stappen van 5 nm en vaste emissie bij 475 nm.
    5. Bereken bij gebruik van een monochromator het percentage fluorescentie-intensiteit bij 375 nm ten opzichte van 420 nm met de volgende vergelijking:
      F375/420 (%) = (F375/F420) x 100

4. Opnemen en meten van de cellengte

  1. Visualiseer en registreer op dag 3 de cellengte. Reinig een glazen objectglas en een dekglas met een pluisvrij doekje. Pipetteer een druppel van 10 µL cultuur op het objectglas en plaats het dekglas direct bovenop de cultuur. Druk voorzichtig op het dekglas zodat de cultuur zich verspreidt en bijna het gehele gebied onder het dekglas vult. Bereid de preparaten voor en visualiseer deze onmiddellijk om uitdroging te voorkomen.
    OPMERKING: Als de cultuur zich niet gemakkelijk verspreidt, verhindert debris een goed contact en zal waterbeweging het in focus brengen van cellen bemoeilijken. Bereid in dat geval een nieuw preparaat.
  2. Visualiseer het voorbereide preparaat met een lichtmicroscoop (of DIC, zie hieronder) met een 100x olie-immersie objectief en 10x oculair (1000x totale vergroting) en een camera-accessoire.
    OPMERKING: Cellen zijn veel gemakkelijker waarneembaar met het contrast van differential interference contrast (DIC) microscopie10. Gebruik indien mogelijk dit type microscoop voor beelden van hoge kwaliteit. Voor routinematige analyse en verificatie van de Zn2+-beperkte groeistatus is een standaard lichtmicroscoop voldoende.
  3. Maak foto's van gebieden op het objectglas met meerdere cellen die in focus zijn, in het vlak liggen (d.w.z. de gehele lengte van de cel is zichtbaar) en niet bewegen. Leg voldoende beelden vast over verschillende gebieden op het objectglas (of over meerdere preparaten van dezelfde cultuur) zodat er ten minste 100 cellen worden gemeten.
  4. Maak met dezelfde microscoop en hetzelfde objectief een afbeelding van een kalibratiepreparaat.
  5. Gebruik in Fiji27 de tool voor rechte lijnen om een lijn over de lengte van het kalibratiepreparaat te trekken. Selecteer Analyze > Set scale en vul de bekende afstand en eenheid van de schaalbalk in. Selecteer Global om de schaal toe te passen op alle toekomstige beelden en metingen.
  6. Open een microscopiefoto. Gebruik de tool voor rechte lijnen om een lijn over de lengte van een cel te trekken en druk op de M-toets op het toetsenbord om de cel te meten. Meet ten minste 100 cellen per cultuur.
  7. Kopieer de gegenereerde lengtegegevens uit het pop-upvenster in Fiji naar een spreadsheetprogramma of sla deze op als een comma-separated value (.csv) bestand voor statistische analyse.

5. Aanpassingen voor het kweken van Zn2+-beperkt M. tuberculosis (Mtb)

OPMERKING: In tegenstelling tot Mtb-H37Rv kan Mtb-Aux geen L-leucine en D-pantothenaat synthetiseren, en deze supplementen worden aan de media toegevoegd28. De supplementatie voor Mtb-Aux heeft geen invloed op de Zn2+ beperking, en beide stammen vertonen vergelijkbare fenotypes in ZLM23. Dit protocol is een aanpassing van een eerder gepubliceerd protocol23; het belangrijkste verschil is dat culturen 8 dagen in plaats van 10 dagen worden gekweekt om klontering te verminderen en verrijking van enkelvoudige cellen mogelijk te maken, wat noodzakelijk is voor downstream toepassingen zoals macrofaaginfecties. Voor overige kleine verschillen wordt verwezen naar de oorspronkelijke publicatie23. De inoculatiemethode verschilt van die voor M. smegmatis vanwege het veel hogere inoculum dat nodig is om de groei van M. tuberculosis te initiëren.

  1. Voeg voor Mtb-Aux in alle media een aanvullende supplementatie toe van 50 µg/mL L-leucine en 48 µg/mL D-pantothenaat. Steriliseer 1000x stockoplossingen van 50 mg/mL L-leucine en 48 mg/mL calcium-D-pantothenaat door filtratie met een 0,2 µm filter en voeg deze toe aan de gesteriliseerde media.
  2. Voeg aseptisch 1 mL ontdooide glycerol stockcellen toe aan 4 mL 7H9-ADC in een 14 mL ronde bodem snap-cap buis (voor Mtb-Aux) of een 50 mL bioreactorbuis (voor Mtb-H37Rv).
  3. Incubeer bij 37 °C zonder schudden totdat de cultuur een OD600 ~1 bereikt. Dit duurt ongeveer 1 week. Belucht de cultuur één keer per dag door de buis in een veiligheidskabinet te openen en enkele keren te pipetteren om de cultuur te mengen.
  4. Inoculeer 1 mL van de stationaire cultuur in 50 mL 7H9-ADC in een 250 mL geventileerde plastic kolf. Eén cultuur van 50 mL in 7H9-ADC is voldoende voor biologische triplicaten per stam en conditie (bijv. wild-type in ZLM en ZRM). Voorkom grote klonten (bijv. grote aggregaten van cellen) door de cultuur vóór inoculatie 5-10 min te laten staan, zodat klonten naar de bodem van de buis zakken, en neem de cultuur van bovenaf af.
    OPMERKING: Inoculatie met grote klonten resulteert in klonterige culturen, wat de normalisatie en reproduceerbaarheid van de cultuur beïnvloedt.
  5. Incubeer bij 37 °C met schudden op 100 rpm totdat de cultuur een OD600 van 0,5-0,8 bereikt (mid-log fase). Dit duurt 3-5 dagen.
  6. Overbreng de cultuur naar een 50 mL conische buis en pellet de cellen door centrifugatie bij 3.000 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant door 40 mL af te zuigen met een serologische pipet en het resterende supernatant te verwijderen met een P1000 micropipet.
    OPMERKING: Deze stap is cruciaal om de overdracht van Zn2+ uit het 7H9-ADC medium te verminderen.
  7. Resuspendeer de pellet in 5 mL ZLM en vul het totale cultuurvolume aan tot 50 mL in de conische buis met ZLM.
  8. Herhaal de centrifugatie bij 3.000 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur om de cellen te pelletten. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de celpellet tot een eindvolume van 50 mL zoals beschreven in stap 5.7.
  9. Meet de OD600 van de gewassen zaadcellen en bereken het volume dat nodig is om een start-OD600 van 0,05 (Mtb-H37Rv) of 0,08 (Mtb-Aux) in 50 mL te verkrijgen met behulp van de volgende vergelijking:
    Vergelijking voor zaadcultuurvolume; optische dichtheidsformule voor microbiologische experimenten.
    OPMERKING: De groei van Mtb-Aux met een start-OD600 van 0,05 is inconsistent; daarom wordt een hogere OD600 van 0,08 gebruikt voor een consistente groei.
  10. Pipetteer het in stap 5.9 berekende volume zaadcultuur in een nieuwe 50 mL conische buis en vul het volume aan tot 50 mL met ZLM. Giet de gewassen en genormaliseerde cultuur vanuit de conische buis over in plastic Erlenmeyerkolven die zijn voorbereid zoals beschreven in stap 1. Herhaal dit met dezelfde conische buis voor alle biologische replica's voor elke stam en conditie.
  11. Voeg voor culturen die zijn gekweekt zonder Zn2+-limitatie (bijv. Zn2+-verzadigde media, ZRM) 30 µL steriele 10 mM ZnSO4 direct toe aan de cultuurkolven tot een eindconcentratie van 6 µM ZnSO4.
  12. Incubeer de cultuurkolven bij 37 °C met schudden op 100 rpm gedurende 8 dagen. Meet de OD600 en de F420 fluorescentie tijdens de groei zoals beschreven in stap 3. Verwijder culturen als ze gedurende de eerste paar dagen van groei klonterig zijn (bijv. de cultuur ziet er niet troebel uit en er zijn overal klonten in de cultuur).
    OPMERKING: Idealiter zijn culturen gedurende de eerste paar dagen van groei grotendeels planktonisch (bijv. vrij van grote klonten die met het blote oog zichtbaar zijn). Mtb-culturen, en met name ZLM-culturen, worden gedurende de groei progressief klonteriger, en klonten die als vlokken op het oppervlak van de media drijven, worden verwacht tegen de late log-fase23.

Resultaten

Bioindicatorfenotypes van M. smegmatis
Wildtype M. smegmatis-culturen gekweekt in ZLM die Zn2+-beperkte groei vertonen, hebben drie belangrijke bioindicatorfenotypes in vergelijking met cellen gekweekt onder Zn2+-verzadigde condities: [1] verlaagde OD600, [2] verlengde cellen en [3] verlaagde piekfluorescentie bij 420 nm. De mutant die AltRP's mist (ΔaltRP) vertoont niet dezelfde Zn2+-afhankelijke morfogenese als het wildtype10, en het unieke fenotype in Zn2+-beperkte media kan als differentiële bioindicator worden gebruikt. Daarom moeten alle drie de bioindicatormetrieken eerst worden geëvalueerd in het wildtype gekweekt in ZRM en ZLM. Indien het verwachte Zn2+-beperkte wildtypefenotype wordt waargenomen, moet vervolgens de ΔaltRP-deletiestam worden geëvalueerd. Groei in ZLM bereikt niet altijd Zn2+-beperkte condities, wat precies de reden is waarom bioindicatoren nodig zijn. Unieke bioindicatorfenotypes van het wildtype en ΔaltRP verifiëren dat biologisch relevante Zn2+-beperkende condities zijn bereikt. Wanneer culturen gekweekt in ZLM geen Zn2+-beperkte groei vertonen als gevolg van Zn2+-contaminatie in de media of cultuurvaten (ZLM-C), zullen deze bioindicatorfenotypes minder uitgesproken zijn, zoals getoond in Figuur 1 en Figuur 2. Omgekeerd, indien de concentratie Zn2+ in ZLM te laag is, wordt de groei belemmerd door Zn2+-uitputting (ZLM-D), wat duidelijk is aan een lage cultuurtroebelheid en gewijzigde bioindicatorfenotypes, eveneens gedetailleerd in Figuur 1 en Figuur 2.

Celdichtheid is een sterke maatstaf voor Zn2+-beperking. Culturen gekweekt in ZRM bereiken na 72 u consistent een hoge troebeling (OD600 boven de 5), mogelijk met klontering, en zijn zichtbaar geler (gegevens niet getoond) dan culturen gekweekt in ZLM (Figuur 1A). Zn2+-beperking remt de groei (gekenmerkt door een lagere OD600) van alle stammen in vergelijking met de Zn2+-verzadigde conditie, waarbij de ΔaltRP-stam een lagere celdichtheid vertoont dan het wildtype (Figuur 1A). Zn2+-beperkte groei in ZLM resulteert consistent in een OD600 tussen 3,5 en 5 bij het wildtype en minder dan 3 bij de ΔaltRP-stam (Figuur 1A). Culturen gekweekt in ZLM met Zn2+-contaminatie (ZLM-C) bereiken een vergelijkbare celdichtheid (OD600 boven de 5) als Zn2+-verzadigde culturen gekweekt in ZRM (Figuur 1A). Als de [Zn2+] in ZLM te laag is, zullen culturen ernstig uitgeput zijn van Zn2+ (ZLM-D) en is de groei belemmerd, wat blijkt uit de lagere celdichtheid in wildtype-culturen (OD600 is minder dan 3; Figuur 1A). De celdichtheid van het wildtype (3,5 < OD600 < 5) dient als eerste bioindicator-fenotype controlepunt om de Zn2+-beperkende condities te verifiëren. Alleen wildtype-culturen die groeien tot de verwachte celdichtheid mogen worden meegenomen, en de analyse van de ΔaltRP -stam moet volgen na de verificatie van het Zn2+-beperkte bioindicator-fenotype in het wildtype.

Wild-type culturen in de stationaire fase gekweekt in ZLM met een beperkte hoeveelheid Zn2+ zijn verlengd met een gemiddelde cellengte van ongeveer 9 µm, terwijl Zn2+-verzadigde culturen gekweekt in ZRM kort zijn met een gemiddelde cellengte van ongeveer 3 µm (Figuur 1B). Wild-type culturen gekweekt in ZLM met Zn2+-contaminatie (ZLM-C) verlengen niet volledig, maar zijn iets langer dan Zn2+-verzadigde cellen met een gemiddelde cellengte van 5 µm. Bio-indicatie van Zn2+-contaminatie in volledige batches ZLM duidt op mogelijke contaminatie tijdens de bereiding, terwijl contaminatie in individuele culturen (d.w.z. kolven) duidt op contaminatie door onjuist wassen van kolven of cultuurbereiding. Wild-type culturen gekweekt in ZLM die ernstig uitgeput zijn van Zn2+ (ZLM-D) vertonen een minder uitgesproken verlenging met een gemiddelde cellengte van ongeveer 7 µm (Figuur 1B). Het verlengde wild-type fenotype wordt niet waargenomen bij de ΔaltRP-stam, en ΔaltRP-cellen met een beperkte hoeveelheid Zn2+ hebben een gemiddelde cellengte van ongeveer 5 µm (Figuur 1B). Figuur 2 toont representatieve afbeeldingen van cellen gekweekt in verschillende bereidingen van ZLM of ZRM (na stap 2) en gevisualiseerd met een samengestelde lichtmicroscoop. Na stap 4 worden cellen uit talrijke velden in afbeeldingen zoals getoond in Figuur 2 gebruikt om de gemiddelde cellengte van de culturen in Figuur 1B te berekenen. Het verlengde wild-type fenotype is specifiek voor Zn2+-beperkende condities; cellulaire verlenging wordt niet waargenomen wanneer culturen Zn2+-verzadigd of ernstig Zn2+-uitgeput zijn (Figuur 1B en Figuur 2).

Het fenotype van de bio-indicator met verminderde F420-fluorescentie wordt het best waargenomen in fluorescentiescans (Figuur 1C). De verminderde fluorescentie van cofactor F420 wordt gekwantificeerd door het percentage fluorescentie-intensiteit bij 375 nm (achtergrond) ten opzichte van 420 nm (autofluorescentie van cofactor F420) te bepalen zoals beschreven in stap 3.16.5, weergegeven als F375/420. Voor monochromatische platenlezers zonder fluorescentiescan-mogelijkheid zijn puntmetingen bij 375 nm en 420 nm (beide met emissie bij 475 nm) geschikt om F375/420 te berekenen. Wildtype-culturen gekweekt onder Zn2+-verzadigde condities (d.w.z. in ZRM) vertonen een zeer reproduceerbare F375/420 van rond de 17% (Figuur 1D). Een afname van de F420-fluorescentie in Zn2+-beperkte culturen gekweekt in ZLM wordt gekenmerkt door een stijging van de F375/420 naar ongeveer 27% (Figuur 1D). De F420-fluorescentie in de Zn2+-beperkte ΔaltRP-stam is opvallend lager dan die van het wildtype onder dezelfde conditie, en dit is visueel duidelijk zichtbaar in fluorescentiescans (Figuur 1C). De F375/420 is variabeler in de Zn2+-beperkte ΔaltRP-stam, met een bereik van ongeveer 50%-80% (Figuur 1D). Culturen gekweekt in ZLM die bio-indicatie van Zn2+-contaminatie vertonen (ZLM-C) hebben een verlaagde F375/420 van rond de 21%, en culturen die Zn2+-uitgeput zijn (ZLM-D) hebben een F375/420 van rond de 35% (Figuur 1D).

Samenvattend moeten drie bioindicator-fenotypes worden beoordeeld in de wild-type en ΔaltRP-stammen om de Zn2+-beperkte status van culturen gekweekt in ZLM te verifiëren. Voor biologisch relevante Zn2+-beperkende groei moeten de bioindicatoren als volgt zijn: [1] de OD600 van het wild-type is 3,5 - 5, en de ΔaltRP-stam is minder dan 3, [2] wild-type cellen zijn ongeveer 10 µm lang, en ΔaltRP-cellen zijn half zo lang, en [3] F375/420 van de ΔaltRP-stam is hoog, d.w.z. boven de 50%.

Bioindicator-fenotypes van M. tuberculosis
Zn2+-beperkte M. tuberculosis vertoont niet hetzelfde morfogene programma als M. smegmatis. In het bijzonder is er geen verschil in de OD600 tussen Zn2+-verzadigde en Zn2+-beperkte culturen, en Zn2+-beperkte culturen vertonen geen duidelijk morfologisch fenotype; ze worden dus niet langer23. Evenzo is er bij M. tuberculosis geen Zn2+-gedepleteerd bioindicator-fenotype (d.w.z. een verminderde celdichtheid) zoals wel wordt waargenomen bij M. smegmatis. Zn2+-beperkte culturen vertonen meer duidelijke klontervorming in vergelijking met Zn2+-verzadigde culturen, hoewel beide condities op dag 10 aanzienlijk klonterig zijn (waargenomen in zowel Mtb-H37Rv als Mtb-Aux). Het belangrijkste bioindicator-fenotype voor Zn2+-beperking in M. tuberculosis is een verminderde piek-F420-fluorescentie, zoals eerder gerapporteerd23. De resultaten voor culturen die 8 dagen zijn gegroeid, worden hier gepresenteerd in plaats van 10 dagen om klontervorming te minimaliseren. Verminderde F420-fluorescentie is zichtbaar in Zn2+-beperkte culturen met zowel monochromatische (Figuur 3) als filtergebaseerde plaatlezers. Bij filtergebaseerde plaatlezers met gebruik van Mtb-H37Rv hebben Zn2+-beperkte culturen (d.w.z. gegroeid in ZLM) ongeveer 50% van de ruwe fluorescentiewaarden van Zn2+-verzadigde culturen (d.w.z. gegroeid in ZRM; gegevens niet getoond). Met een monochromatische plaatlezer in bottom-reading modus en Mtb-Aux hebben Zn2+-verzadigde culturen een F375/420 van rond de 75%, en Zn2+-verontreinigde ZLM-culturen hebben vergelijkbare waarden. De verminderde F420-fluorescentie in Zn2+-beperkte culturen gegroeid in ZLM wordt weerspiegeld door een F375/420 van meer dan 100%. De Zn2+-beperkte ΔaltRP-stam vertoont een vergelijkbare groei en F420-fluorescentie als waargenomen bij het Zn2+-beperkte wild-type (Figuur 3) en is niet bruikbaar als bioindicator in M. tuberculosis zoals dat wel het geval is in M. smegmatis (Figuur 1). Daarom is het raadzaam om media die gebruikt zullen worden voor de kweek van M. tuberculosis eerst te testen met de snelgroeiende M. smegmatis.

Groeicurves, lengteverdeling en fluorescentieanalyse in bacteriële studie; grafieken en boxplots.
Figuur 1: Bioindicator-fenotypes van M. smegmatis gekweekt onder Zn2+-beperking en het effect van Zn2+-contaminatie en Zn2+-depletie op de fenotypes. Representatieve voorbeelden van het bioindicator-fenotype in elk paneel zijn afkomstig van dezelfde culturen na 72 u. Voorbeelden van Zn2+-gecontamineerde (ZLM-C), Zn2+-beperkte (ZLM-L) en Zn2+-gedepleteerde (ZLM-D) groeiresultaten zijn afkomstig van onafhankelijke mediapreparaties die allemaal volgens dezelfde hier gepresenteerde bereidingsmethode zijn uitgevoerd (stap 2). De representatieve fenotypes voor de Zn2+-beperkte wild-type en ΔaltRP-stammen zijn afkomstig uit dezelfde batch ZLM. Alle stammen en condities hebben drie biologische replica's (n=3). (A) Groeicurves die de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) tonen en de afnemende celdichtheid bij Zn2+-beperking en -depletie. Foutenbalken representeren de standaarddeviatie tussen de replica's. (B) Cellengtes van wild-type en ΔaltRP-stammen die het verlengde fenotype van Zn2+-beperkt wild-type aantonen. De boxplot toont het interkwartielafstand, minimum, maximum en de mediane cellengte in µm. (C) Representatieve fluorescentiescans van culturen die een verlaagde piek in F420-fluorescentie tonen bij Zn2+-beperking en een verminderde F420-fluorescentie in de Zn2+-beperkte ΔaltRP-stam. Er wordt slechts één representatieve cultuur uit de biologische triplicaten van elk van de verschillende mediapreparaties getoond. Fluorescentiescans maken gebruik van een excitatiegolflengtebereik van 230 nm tot 440 nm met een stapgrootte van 5 nm en een emissiegolflengte van 475 nm. Het inzetstuk linksboven is een ingezoomd beeld van de Zn2+-beperkte wild-type en ΔaltRP-stammen om de verlaagde fluorescentiepiek bij 420 nm in de Zn2+-beperkte ΔaltRP-stam te accentueren. De as-eenheden zijn gelijk aan die van de hoofdgrafiek. Alle legenda's zijn gelijk aan die in (A). (D) Kwantificatie van de verminderde fluorescentie van cofactor F420, berekend uit het percentage F375/420. Percentages zijn berekend uit de waarden verkregen uit de fluorescentiescans in (C). De boxplot toont het interkwartielafstand, minimum, maximum en de mediane percentages. Afkortingen die de Zn2+-relevante status van het medium representeren en tussen haakjes na het mediatype staan zijn R = Zn2+-verzadigd, C = Zn2+-gecontamineerd, L = Zn2+-beperkt en D = Zn2+-gedepleteerd; overige afkortingen zijn: WT = wild-type stam, a.u. = arbitraire eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten van Zn²⁺-status elektroforese, WT vs ΔaltRP, eiwitscheidingsanalyse.
Figuur 2: Representatieve microscopiebeelden van M. smegmatis na 72 u. De afbeeldingen zijn afkomstig van de culturen die worden getoond in Figuur 1. De cellen zijn gefotografeerd met een samengestelde lichtmicroscoop bij een totale vergroting van 1000x met gebruik van een 100x olie-immersielens. De schaalbalken zijn 10 µm. Afkortingen die de Zn2+-relevante status van het medium weergeven en tussen haakjes na het mediumtype staan, zijn: R = Zn2+-verzadigd, C = Zn2+-gecontamineerd, L = Zn2+-beperkt en D = Zn2+-uitgeput; overige afkortingen zijn: WT = wildtype-stam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Grafiek van het fluorescentie-excitatiespectrum; golflengte versus fluorescentie; proteïne-studie analyse.
Figuur 3: Verlies van het F420 bio-indicatorfenotype in Zn2+-beperkte M. tuberculosis, aangetoond door representatieve fluorescentiescans van auxotrof Mtb mc26206 (Mtb-Aux).Voorbeelden van Zn2+-gecontamineerde en Zn2+-beperkte groeiresultaten zijn afkomstig van onafhankelijke mediumbereidingen. De Zn2+-beperkte wild-type en ΔaltRP stammen zijn afkomstig van dezelfde batch ZLM. Alle stammen en condities hebben drie biologische replica's (n=3). In de grafiek is slechts één representatieve cultuur van de biologische triplicaten uit elk van de verschillende mediumbereidingen en stammen weergegeven. Fluorescentiescans zijn uitgevoerd in de bottom-reading modus na 8 dagen groei, gebruikmakend van een excitatiegolflengtebereik van 230 nm tot 440 nm met een stapgrootte van 5 nm en een emissiegolflengte van 475 nm. Afkortingen die de Zn2+-relevante status van het medium weergeven en tussen haakjes achter het mediumtype staan, zijn: R = Zn2+-replete, C = Zn2+-gecontamineerd, L = Zn2+-beperkt en D = Zn2+-uitgeput; overige afkortingen zijn: WT = wild-type stam, a.u. = arbitraire eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Een grote bijdrage aan de kenniskloof over de mechanistische grondslagen van Alt-ribosomen is de moeilijkheid om Zn2+-beperkende omstandigheden in vitro te bereiken. Sporen van Zn2+-besmetting in het laboratorium is gebruikelijk; dus is het uitdagen om reproduceerbare Zn2+-beperkte groeiomstandigheden te bereiken. Zn2+-besmetting kan uit verschillende bronnen komen, hoewel de belangrijkste en meest voorkomende bron van besmetting en variabiliteit afkomstig is van het ultrapuur water dat wordt gebruikt om laboratoriumglaswerk te spoelen en media te maken. Ultrapuur watersystemen moeten goed worden onderhouden en moeten 1 minuut worden gespoeld voordat laboratoriumglaswerk wordt gespoeld of water voor media wordt gebruikt. Flessen die niet goed worden gewassen of gespoeld met ultrapuur water kunnen Zn2+-besmetting veroorzaken, en dit zal duidelijk zijn door de verhoogde celdichtheid in bepaalde flesjes maar niet in andere van dezelfde batch ZLM. Gloednieuwe flessen kunnen worden gebruikt om te beoordelen of de bron van Zn2+-besmetting afkomstig is van hergebruikte flessen of media. Zn2+-besmetting in ZLM moet worden verholpen door verhoogd spoelen van items die worden gebruikt om media te maken en een aangewezen set materialen voor ZLM-voorbereiding. Als geen van deze maatregelen succesvol blijkt om de verwachte bioindicator-fenotypen te bereiken, moet de [Zn2+] in ultrapuur water en ZLM worden gekwantificeerd om de mogelijkheid uit te sluiten dat de waterbron Zn2+-besmet is. Zoals eerder gerapporteerd, is de [Zn2+] van ZLM 115 ± 37 nM23, en concentraties onder de 70 nM en boven de 150 nM leidden meestal tot Zn2+-uitgeputte en Zn2+-besmette fenotypen, respectievelijk. Echter, goede mediavoorbereiding is slechts één factor die het resultaat beïnvloedt, en ontoereikend of overmatig Zn2+ kan optreden als gevolg van de onjuiste voorbereiding van het inoculum en/of het kweken, dwz. slecht aftappen van Zn2+-rijk media tijdens wasstappen. Alle M. smegmatis culturen die hier worden opgenomen, zijn op dezelfde manier bereid - Zn2+-besmette (ZLM-C) en Zn2+-uitgeputte (ZLM-D) groeiresultaten zijn opgenomen om de variabiliteit te benadrukken die kan optreden tussen verschillende batches van media die hetzelfde ultrapuur watersysteem gebruiken, zelfs wanneer experimenten correct worden uitgevoerd.

Om ervoor te zorgen dat het kweken van cellen in ZLM reproduceerbare Zn2+-beperkende bioindicator-fenotypen oplevert, is het belangrijk om de flessen uniek te labelen, ze altijd voor dezelfde omstandigheden te gebruiken (dwz. met ZLM of ZRM), flessen bij te houden over meerdere gebruiken en flessen weg te gooien die aan het einde van hun levenscyclus zijn, of die blijven leveren Zn2+-besmette bioindicator-fenotypen met ZLM. De juiste inoculumvoorbereiding is erg belangrijk om Zn2+-beperkende groei te bereiken, aangezien Zn2+-overdracht van onvoldoende gewassen zaaicelkjes een veelvoorkomende bron van Zn2+-besmetting is die moeilijk te onderscheiden kan zijn van Zn2+-besmet ZLM. M. smegmatis culturen moeten worden onderzocht en geoogst na 72 uur groei in ZLM (en ZRM parallel gekweekt). De morfogenese en bioindicator-fenotypen zijn uitgesproken van 48-72 uur; daarom kan het evalueren of oogsten van culturen voor Zn2+-beperking te vroeg (of te laat) niet het volledige bioindicator-fenotype opleveren. Culturen die zijn uitgeput in Zn2+ zullen cellengtes vertonen die vergelijkbaar zijn met die welke Zn2+-besmet zijn; dus F420 fluoresceren en OD600 moet worden gebruikt om de twee te onderscheiden. Evenzo kunnen Zn2+-besmette culturen niet altijd beter groeien dan Zn2+-beperkte bacteriën, maar F420 fluoresceren en de cellengte van het wild type en de ΔaltRP mutant zou moeten onthullen of de Zn2+-beperkte conditie is bereikt.

Hetzelfde geldt voor M. tuberculosis, aangezien het verlies van F420 bioindicator-fenotype in Zn2+-beperkte culturen uitgesproken is tussen 8-10 dagen groei in ZLM. Hoewel M. tuberculosis geen sterk Zn2+-beperkt bioindicator-fenotype vertoont zoals M. smegmatis, is de hier gepresenteerde groeimethode gebruikt om verlies van F420 bioindicator-fenotype te associëren met Zn2+-beperkte groei door middel van functionele assays en transcriptomics in zowel de virulente als afgezwakte stammen van M. tuberculosis (ref23 en ongepubliceerde gegevens). Daarom is het volgen van F420 fluoresceren een toegankelijke manier om biologische Zn2+-beperkende omstandigheden in M. tuberculosis te controleren en te verifiëren. Het is belangrijk op te merken dat het mechanisme dat leidt tot verminderde F420 fluoresceren tijdens Zn2+-beperkende omstandigheden nog niet is opgehelderd, evenals het onderscheid of de verminderde fluoresceren te wijten is aan verminderde abundantie van het co-enzym pool als geheel of een verschuiving in zijn redoxtoestand, aangezien alleen de geoxideerde vorm fluoresceren uitzendt29.

Zoals hier aangetoond, is de voorbereiding van Zn2+-beperkende media gen

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door de National Science Foundation (NSF) CAREER Award 1844854, de American Lung Association Innovation Award IA -937538 en het National Institute of Health (NIH) NIAID R21 AI109293 aan S.P. Het huidige adres voor Allexa D. Burger is het Pacific Biosciences Research Center, University of Hawai'i at Mānoa, Honolulu, Hawaii, VS.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1000 mL Vacuum Filtration Systems, Standard LineVWR10040-440
125 mL Erlenmeyer Shaker FlasksGreiner Bio-One679501
14 mL Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position CapsVWR60818-725
250 mL Erlenmeyer Shaker FlasksGreiner Bio-One679502
40X-1000X Lab Binocular Biological Compound MicroscopeOmaxM82EZ
50 mL Bio-Reaction Tubes, SterileVWR76211-286
50 mL High-Performance Centrifuge Tubes with Flag CapsVWR89039-656
Alcojet Low-Foaming Powdered DetergentAlconox1404
Ammonium iron (III) citrate, brownThermo ScientificAAA1119930 MW: 265 g/mol, for 1M solution add 1.325 g to 5 mL ultrapure water; store protected from light at 4 C
Bovine serum albuminThermo ScientificJ10857-A1
Calcium D-PantothenateThermo ScientificAC243300050
CatalaseSigma-AldrichC1345-10G
Citric acid anhydrous, crystallineFisher ScientificBP339-500
Dextrose anhydrousFisher ScientificD14-500
Difco Middlebrook 7H9 BrothBD Diagnostics271310
DiluPhotometer OD600 for the Determination of Cell Density and Bradford AssaysImplenOD600-10
GENios FL Microplate ReaderTecanDiscontinued
GlycerolFisher ScientificG33-4
Infinite M200 PRO Multimode Microplate ReaderTecanLGE140213-20BL
L-AsparagineThermo ScientificAAB2147336 
L-LeucineThermo ScientificA1231122
Macrofire SP CCD cameraOptronicsFor use with Olympus microscope
Magnesium sulfate heptahydrateVWR97062-134
Milli-Q Direct 8 Water Purification SystemMilliporeC85358
Moticam X3MoticDiscontinued, replaced by Moticam X5 Plus; for use with compound microscope
Oleic acidThermo Scientific031997-14
Olympus BX51 upright microscopeOlympusDiscontinued, replaced by BX53M
Potassium phosphate, monobasicFisher ScientificBP362-500
Semi-Micro Two-Sided Disposable Plastic CuvettesVWR97000-590
Sodium chloride, crystalVWRVW1494-01
Sodium hydroxideFisher ScientificS318-500 
Tween 80MP Biomedicals103170
Zinc sulfide heptahydrate, crystalline/ACSMP Biomedicals219145290

Referenties

  1. Alloway, B. Soil factors associated with zinc deficiency in crops and humans. Environ Geochem Health. 31 (5), 537-548 (2009).
  2. Middag, R., de Baar, H. J. W., Bruland, K. W. The relationships between dissolved zinc and major nutrients phosphate and silicate along the GEOTRACES GA02 transect in the west Atlantic ocean. Global Biogeochem Cycles. 33 (1), 63-84 (2019).
  3. Corbin, B. D., et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319 (5865), 962-965 (2008).
  4. Panina, E. M., Mironov, A. A., Gelfand, M. S. Comparative genomics of bacterial zinc regulons: Enhanced ion transport, pathogenesis, and rearrangement of ribosomal proteins. Proc Natl Acad Sci. 100 (17), 9912-9917 (2003).
  5. Outten, C. E., O’Halloran, T. V. Femtomolar sensitivity of metalloregulatory proteins controlling zinc homeostasis. Science. 292 (5526), 2488-2492 (2001).
  6. Merchant, S. S., Helmann, J. D. Elemental economy: microbial strategies for optimizing growth in the face of nutrient limitation. Adv Micro Physiol. 60, 91-210 (2012).
  7. Makarova, K. S., Ponomarev, V. A., Koonin, E. V. Two C or not two C: recurrent disruption of Zn-ribbons, gene duplication, lineage-specific gene loss, and horizontal gene transfer in evolution of bacterial ribosomal proteins. Genom Biol. 2 (9), RESEARCH 0033(2001).
  8. Yutin, N., Puigbò, P., Koonin, E. V., Wolf, Y. I. Phylogenomics of prokaryotic ribosomal proteins. PLoS One. 7 (5), e36972(2012).
  9. Prisic, S., et al. Zinc regulates a switch between primary and alternative S18 ribosomal proteins in Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 97 (2), 263-280 (2015).
  10. Dow, A., Prisic, S. Alternative ribosomal proteins are required for growth and morphogenesis of Mycobacterium smegmatis under zinc limiting conditions. PLoS One. 13 (4), e0196300(2018).
  11. Chen, Y. X., et al. Selective translation by alternative bacterial ribosomes. Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19487-19496 (2020).
  12. Natori, Y., et al. A fail-safe system for the ribosome under zinc-limiting conditions in Bacillus subtilis. Mol Microbiol. 63 (1), 294-307 (2007).
  13. Gabriel, S. E., Helmann, J. D. Contributions of Zur-controlled ribosomal proteins to growth under zinc starvation conditions. J Bacteriol. 191 (19), 6116-6122 (2009).
  14. Wolf, Y. I., Rogozin, I. B., Kondrashov, A. S., Koonin, E. V. Genome alignment, evolution of prokaryotic genome organization, and prediction of gene function using genomic context. Genom Res. 11 (3), 356-372 (2001).
  15. Akanuma, G., et al. Evolution of ribosomal protein S14 demonstrated by the reconstruction of chimeric ribosomes in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 203 (10), e00599(2021).
  16. Owen, G. A., Pascoe, B., Kallifidas, D., Paget, M. S. B. Zinc-responsive regulation of alternative ribosomal protein genes in Streptomyces coelicolor involves Zur and σR. J Bacteriol. 189 (11), 4078-4086 (2007).
  17. Li, Y., et al. Zinc depletion induces ribosome hibernation in mycobacteria. Proc Natl Acad Sci. 115 (32), 8191-8196 (2018).
  18. Li, Y., Corro, J. H., Palmer, C. D., Ojha, A. K. Progression from remodeling to hibernation of ribosomes in zinc-starved mycobacteria. Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19528-19537 (2020).
  19. Graham, A. I., et al. Severe zinc depletion of Escherichia coli. J Biol Chem. 284 (27), 18377-18389 (2009).
  20. Greening, C., et al. Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (2), 451-493 (2016).
  21. Gurumurthy, M., et al. A novel F 420 -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents. Mol Microbiol. 87 (4), 744-755 (2013).
  22. Patino, S., et al. Autofluorescence of mycobacteria as a tool for detection of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 46 (10), 3296-3302 (2008).
  23. Dow, A., et al. Zinc limitation triggers anticipatory adaptations in Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathogens. 17 (5), e1009570(2021).
  24. Tobiasson, V., Dow, A., Prisic, S., Amunts, A. Zinc depletion does not necessarily induce ribosome hibernation in mycobacteria. Proc Natl Acad Sci. 116 (7), 2395-2397 (2019).
  25. Dow, A., Burger, A., Marcantonio, E., Prisic, S. Multi-omics profiling specifies involvement of alternative ribosomal proteins in response to zinc limitation in Mycobacterium smegmatis. Front Microbiol. 13, 811774(2022).
  26. Singh, A. K., Reyrat, J. Laboratory maintenance of Mycobacterium smegmatis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 10, Unit10C.1(2009).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double Leucine and Pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in Guinea pigs. Infect Immunity. 72 (5), 3031-3037 (2004).
  29. Cheeseman, P., Toms-Wood, A., Wolfe, R. S. Isolation and properties of a fluorescent compound factor420, from Methanobacterium strain M.o.H. J Bacteriol. 112 (1), 527-531 (1972).
  30. Wayne, L. G., Hayes, L. G. An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence. Infect Immunity. 64 (6), 2062-2069 (1996).

Herprints en machtigingen

Tags

Zinkbeperkingalternatieve ribosomenbioindicatorfenotyperibosomale eiwittencelmorfogeneseco enzym F420 fluorescentiecelmetingzinkbeperkte mediaMycobacterium tuberculosis
Gebruik van Mycobacterium smegmatis als bio-indicator voor zink-beperkte groeiomstandigheden in mycobacteriën
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.