Method Article

Twee-foton laser-gemedieerde ablatie van osteoblasten in zich ontwikkelende zebravislarven

DOI:

10.3791/67279

⸱

September 6th, 2024

 , 
1CRTD - Center for Regenerative Therapies TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, Faculty of Medicine, TU Dresden

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een twee-foton-laserablatiebenadering die wordt uitgevoerd in zebravislarven, die als model dient om botregeneratie en de effecten van de immuunrespons op ablatie te bestuderen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebravissen (Danio rerio) hebben een uitstekend vermogen om verschillende organen en aanhangsels te regenereren. Botregeneratie bij zebravissen is bestudeerd met behulp van verschillende methoden, zoals amputatie van de vin, schubbenplukken, schedeltrepanatie en microscopische benaderingen. Met behulp van een confocale laserscanopstelling uitgerust met een twee-fotonlaser, werd een laserablatiemethode ontwikkeld als een laesieparadigma om botvormende cellen (osteoblasten) te ablateren in de zich ontwikkelende operkel van zebravislarven. De hier beschreven methode maakt de ablatie van cellen op een precieze manier mogelijk, omdat het gebied, de vorm en de diepte fijn kunnen worden aangepast. Bovendien maakt deze methode beeldvorming van het gebied voor en net na de ablatie mogelijk, zodat de kortetermijneffecten van het letsel kunnen worden geanalyseerd. In deze experimentele opstelling werd de immuunrespons na ablatie van osteoblasten in het geblesseerde gebied bestudeerd. Een toename van de rekrutering van macrofagen werd waargenomen na ablatie, wat de relevantie van hun aanwezigheid tijdens botregeneratie aangeeft.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebravissen regenereren diverse organen zoals het netvlies, de hersenen, het hart en de alvleesklier1. Bovendien regenereren zebravissen skeletelementen, daarom zijn ze gebruikt om de regeneratie van vinnen, schubben en calvariae (schedelkappen) te bestuderen2. Verschillende experimentele paradigma's zijn gebruikt om weefsel- en botregeneratie te bestuderen, zoals vinresectie (amputatie), vinfractuur, schedeltrepanatie 3,4, cryoletsel 5,6 of genetische ablatie 7,8,9. Onlangs zijn laserablatiebenaderingen op grote schaal gebruikt bij zebravissen om de genezings- en regeneratierespons na verwonding te bestuderen 10,11,12,13,14.

Lasergemedieerde ablatie is gebruikt in verschillende gebieden van biologisch onderzoek, zoals mechanobiologie, ontwikkelingsbiologie, regeneratieonderzoek en tumorchirurgie 10,11,12,15,16,17,18,19. Er zijn verschillende methoden voor laserablatie, zoals het gebruik van YAG (yttrium aluminium granaat), UV (ultraviolet) of 2p (twee-foton) lasers20. Laserablatie maakt het mogelijk om afzonderlijke cellen of grotere delen van weefsels op een zeer nauwkeurige manier te verwijderen, waardoor verschillende processen kunnen worden bestudeerd, zoals de reactie van het immuunsysteem op tumorablatie21 of tijdens de regeneratie van zebravissen. In het laatste voorbeeld werd ablatie bevestigd door het verdwijnen van het nucleaire en cytoplasmatische fluorofoorsignaal en necrosekleuring10,22.

Het is algemeen bekend dat de aangeboren immuunrespons en de gereguleerde kinetiek ervan essentieel zijn voor een passende weefselregeneratie. Neutrofielen en macrofagen zijn de eerste cellen die worden gerekruteerd naar de plaats van de verwonding, waar ze verschillende rollen vervullen, zoals het vrijkomen van cytokines en groeifactoren, het verwijderen van cellulair puin en het hermodelleren van extracellulairematrixen. Deze rekrutering en de daaropvolgende functionalisering van macrofagen zijn ook waargenomen bij geamputeerde zebravisvinnen24 en de zich ontwikkelende operkel, die werd onderworpen aan laser 'nanodissectie' die leidde tot osteoblastablatie10. In het laatste experiment werd herstel van het aantal osteoblasten, normale operkelontwikkeling en rekrutering van aangeboren immuuncellen (neutrofielen, macrofagen en osteoclastachtige cellen) naar het geblesseerde gebied waargenomen na UV-laser en twee-fotonlaser-gemedieerde ablatie10. Experimenten bij zebravissen waarbij het immuunsysteem farmacologisch werd onderdrukt door het gebruik van glucocorticoïden toonden een verslechtering van de regeneratie bij een verkeerd gereguleerde immuniteit, wat de functionele rol van het immuunsysteem bij weefselherstel ondersteunt 3,10,25,26.

Hier wordt een twee-foton-laser-gemedieerde ablatiemethodologie beschreven om de biologie van botregeneratie bij het ontwikkelen van zebravisbotten te bestuderen. In het bijzonder wordt het effect van de osteoblast-ablatiebenadering in de operkel aangetoond in termen van de immuunrespons, die wordt onderzocht door de rekrutering van macrofagen naar de ablatieplaats te volgen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderzoeksprotocol werd goedgekeurd door de Landesdirektion Sachsen, vergunningsnummers 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. De gebruikte zebravisstammen werden onderhouden volgens de nationale wetgeving en onder gestandaardiseerde omstandigheden zoals eerder beschreven27,28. De details van alle reagentia en de apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van materialen en oplossingen

  1. Onderhoud de embryo's in 1x E3 media. Bereid de 1x E3-media voor door 170 ml van een 60x E3-bouillon te verdunnen in 10 L gedeïoniseerd water en 2 ml 0,1% methyleenblauw toe te voegen.
    1. Bereid het 60x E3 mediapapier voor door 17,2 g NaCl, 0,76 g KCl, 2,90 g CaCl2,2 H2O, 4,90 g MgSO4,7 H2O te mengen in 1 l gedeïoniseerd geautoclaveerd water.
  2. Bereid voor de inbedding van de larven van tevoren aliquots van agarose met een laag smeltpunt (LMA) en bewaar ze op kamertemperatuur.
    1. Om aliquots te bereiden, lost u LMA op in 1x E3-media, bijv. 500 mg LMA in 50 ml 1x E3 in een erlenmeyer, verwarmt u de oplossing in de magnetron totdat de agarose volledig is opgelost en doseert u het in aliquots van 1 ml in buisjes van 1,5 ml.

2. Zebraviskweek en embryocollectie

OPMERKING: Dubbele transgene zebravislarven die de aanwezigheid van toegewijde osteoblasten rapporteren [osterix:nGFP = Tg(Ola.Sp7:NLS-GFP)zf132]29 en macrofagen [mpeg:mCherry = Tg(mpeg:mCherry)gl23] werden hier gebruikt30 (Figuur 1A).

  1. Zet de avond voor de paring ouderlijke zebravissen met de gewenste enkele transgenen in standaard paringskooien.
    OPMERKING: Standaard paringskooien laten de eieren naar een lager compartiment gaan waar de ouderlijke zebravissen er niet bij kunnen.
    1. Houd mannetjes en vrouwtjes gescheiden tot het paren met behulp van een verdeler in de paringskooi. Verwijder de verdeler in de ochtend van de volgende dag om de paring te starten.
  2. Haal uiterlijk 's middags ouderlijke zebravissen uit de kweektanks en verzamel de embryo's, zeef het water uit de paringskooi door een zeef.
    OPMERKING: Als de exacte leeftijd van de larven doorslaggevend is, oogst dan embryo's met regelmatige tussenpozen van ongeveer 30 minuten. Koppelingspartners moeten worden gebruikt in experimenten met verschillende experimentele groepen.
  3. Plaats de embryo's in een schaaltje met een diameter van 100 mm met 1x E3-media en bewaar ze in een incubator bij 28 °C31.
  4. Verwijder onbevruchte eieren en dode embryo's uit het schaaltje met behulp van een plastic pipet met behulp van een stereomicroscoop en vervang dagelijks 1x E3-media.
  5. Sorteer vóór het experiment larven die positief zijn voor de transgenen van de reporter met behulp van een fluorescentie-stereomicroscoop.

3. Larven inbedding in agarose met een laag smeltend gehalte

  1. Smelt LMA-aliquots in een thermoblock of waterbad bij 65 °C. Zodra de LMA is gesmolten, houdt u deze op 42 °C totdat deze is ingebed (Figuur 1B). Voeg 50 μL 0,4% MS-222 toe aan de gesmolten 1 ml LMA-aliquot om een MS-222-concentratie van 0,02% voor anesthesie te bereiken.
  2. Verdoving 4 dpf (dagen na bevruchting) larven (of oudere larven) in 0,02% MS-222 E3 media.
  3. Breng de verdoofde larven over in een microtiterschaal met glazen bodem met behulp van een plastic pasteurpipet van 3 ml en verwijder het overtollige E3-medium met dezelfde pipet (Figuur 1B). Voorkom uitdroging van de larven.
    OPMERKING: Er kan meer dan één larve tegelijkertijd in een schaal worden ingebed; Het wordt aanbevolen om 3 tot 5 larven in te bedden om voldoende tijd te geven voor plaatsing.
  4. Haal de gesmolten LMA-agarose uit het waterbad/thermoblock en voeg een (verkoelende) druppel LMA toe aan de schaal, waarbij je de glasbodem bedekt waar de larven zich bevonden. Let er wel op dat de LMA niet te heet is maar nog wel vloeibaar.
  5. Plaats de larven vervolgens in de gewenste zijpositie voordat de agarose stolt. Zorg hier voor een zijdelingse positie waarin de operkel zich zo dicht mogelijk bij de glazen bodem van de schaal bevindt als voorbereiding op de opstelling van de omgekeerde microscoop (Figuur 1B).
  6. Laat de agarose stollen en voeg vervolgens E3-media (met maximaal 0,02% MS-222) toe aan de schaal om uitdroging van de agarose te voorkomen (Figuur 1B).

figure-protocol-1
Figuur 1: Schematische weergave van de inbeddingsprocedure. (A) Dubbele transgene Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30 zebravislarven met groen gelabelde operculaire osteoblasten en macrofagen gelabeld in rood werden gebruikt. (B) De workflow van de inbeddingsprocedure, zoals beschreven in stap 3 van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. In vivo beeldvorming van de larven en laserablatie

  1. Om osteoblasten te laserablateren in de zich ontwikkelende operkel van transgene zebravis Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30, gebruik een omgekeerde laserscanmicroscoop met twee fotonen met een 25x/0.95 waterobjectief of een gelijkwaardige opstelling.
  2. Plaats de schaal met de ingebedde larven op de microscopische tafel bij de omgekeerde microscoop en plaats het gewenste gebied voor ablatie in het midden van het gezichtsveld. De operkel kan gemakkelijk worden geïdentificeerd met behulp van het GFP-fluorescentiesignaal.
  3. Zodra de operkel is gefocusseerd en gecentreerd in het gezichtsveld van de microscoop, kiest u de z-stack-instellingen (vaak worden z-intervallen van 1-2 μm gebruikt) om de hele breedte van de operkel af te beelden. Kies tegelijkertijd het gebied in een specifiek z-vlak dat moet worden geablateerd (meestal in de achterste zone van de operatie). De twee-foton laserablatie wordt alleen in dit vlak uitgeoefend.
    OPMERKING: Een hogere resolutie in de z-dimensie leidt tot langere beeldvormingstijden, maar maakt later volumetrische analyses van de verkregen gegevens mogelijk.
  4. Stel het interessegebied van de operkel voor de ablatie voor. Gebruik voor de GFP-detectie een witlichtlaser van 488 nm en een hybride detector van 495 nm tot 550 nm of gelijkwaardig. Beeld de macrofagen met behulp van 555 nm (witlichtlaser) excitatie, met een mCherry-detectiebereik van 595 tot 780 nm op een hybride detector (of gelijkwaardig).
    1. Gebruik het beeldformaat 512 x 512 voor een goede kwaliteit/tijdverhouding (andere formaten kunnen worden gebruikt als een hogere resolutie of als alternatief een hogere snelheid gewenst is).
      OPMERKING: Een bij de microscoop geïnstalleerde temperatuurgecontroleerde incubator kan worden gebruikt en afgesteld, bijvoorbeeld op 28 °C.
  5. Teken een cirkelvormig gebied met een diameter van 25 μm (afhankelijk van het experiment kunnen andere vormen en maten worden geselecteerd) in een geselecteerd 2D-vlak en stel de operkel scherp met behulp van de ROI-tool.
  6. Om de ablatie uit te voeren, past u het ablatievermogen (gemeten zonder objectief) toe op 450 mW en stelt u het geselecteerde gebied bloot aan de twee-fotonenlaser met een scansnelheid van 400 Hz en een totale duur van 10 s. Tijdens ablatie kan het gebied worden gevisualiseerd met behulp van een hybride detector in het bereik van 401-443 nm of gelijkwaardig.
  7. Bevestig na de ablatie de ablatie structureel door dezelfde z-stack opnieuw af te beelden met dezelfde instellingen als voor de ablatie. Het geablateerde gebied bevat geen fluorescerende cellen meer.

5. Herstel van larven en beeldvorming om de rekrutering van immuuncellen te monitoren

  1. Als de beeldvorming van de rekrutering van immuuncellen met vertraging moet worden uitgevoerd, herstel dan de larven uit de beeldvorming en anesthesie. Verwijder de larven voorzichtig uit de LMA met behulp van een tang of een dissectienaald.
    1. Verwijder eerst een laag agarose die de larven bedekt. Ten tweede, verwijder de agarose die in direct contact komt met de larven. Laat deze stap achterwege als er onmiddellijke beeldvorming van de rekrutering van immuuncellen plaatsvindt.
  2. Plaats de larven terug in een schaal met zuivere E3-media en controleer hun herstel. Herstel is duidelijk te zien aan het zwemmen van de larven.
  3. Bij 4 of 6 hpl (uren na laesie) beeldt u het operatiegebied opnieuw af met dezelfde instellingen op dezelfde microscoop om te controleren op de effecten van de ablatie op de rekrutering van macrofagen. Om dit te doen, herhaalt u de inbedding (stap 3) en beeldvorming zoals eerder uitgevoerd (stap 4).
  4. Verwijder na beeldvorming de larven uit de LMA. Het offeren van de larven kan worden uitgevoerd door incubatie in ijswater of met een overdosis MS-222 in E3, afhankelijk van de wettelijke vereisten. Monsters kunnen vervolgens worden gebruikt voor vervolgonderzoek of worden weggegooid.

6. Beeldanalyse en statistische analyse

  1. Verwerk de afbeeldingen met behulp van beeldverwerkingssoftware zoals Fiji32. Afhankelijk van de z-resolutie van de verkregen gegevens kunnen analyses in 2D of 3D worden uitgevoerd.
  2. Kwantificeer de macrofagen handmatig door cellen op te nemen die duidelijk gescheiden zijn, bijvoorbeeld door de belangrijkste cellichamen te onderscheiden, of door cellen te kwantificeren met een nucleair label of door het gebied te meten voor het geval cellen elkaar overlappen (volgende stap).
  3. Maak voor het kwantificeren van het gebied een masker dat de macrofagen omvat. Gebruik hiervoor de tool Afbeelding > Pas > drempel aan en maak een ROI (Analyze > Tools > ROI Manager > Add) in Fiji. Sluit kleine deeltjes op de achtergrond uit voor kwantificering.
    1. Meet vervolgens het gebied (Analyze > Measure). Overweeg of gebieden met overlappende cellulaire fluorescentie in de meting moeten worden opgenomen.
      OPMERKING: Hier werd het cirkelvormige ablatiegebied weggelaten uit de gebiedsmetingen, omdat gerekruteerde macrofagen in dit gebied niet kunnen worden onderscheiden.
  4. Genereer grafieken die de meetresultaten uitzetten met behulp van geschikte software. Om de gegevens voor en na de ablatie te vergelijken, voert u een geschikte statistische test uit (hier werd een gepaarde eenzijdige t-test uitgevoerd).
    OPMERKING: De figuren kunnen worden voorbereid met behulp van fotobewerkings- en grafische ontwerpsoftware.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laserablatie werd uitgevoerd zoals aangegeven in het bovenstaande protocol. Het GFP-signaal van de osteoblasten in het geablateerde gebied verdween onmiddellijk na ablatie. Om de respons van de osteoblastablatie in termen van de immuunrespons te bestuderen, werd de aanwezigheid van macrofagen in 6 dpf-larven vóór en bij 6 hpl in beeld gebracht. Vóór de ablatie werden zeer weinig macrofagen waargenomen in het operkelgebied10 (Figuur 2). Bij 6 hpl werd een sterke accumulatie van macrofagen in het geablateerde operkelgebied en een verhoogd aantal macrofagen in het gezichtsveld, inclusief de operkel en het gebied rond de operkel, gedetecteerd10 (Figuur 2).

figure-results-1
Figuur 2: Rekrutering van macrofagen bij 6 hpl in 6 dpf zebravislarven. Operkelgebied zonder ablatie en bij 6 hpl. Operculaire osteoblasten zijn gelabeld in groen, macrofagen in magenta en de gestippelde cirkel geeft het lasergeablateerde gebied aan. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De rekrutering van macrofagen werd ook geanalyseerd in larven van 4 dpf met veel kleinere operkels bij 4 hpl, waarbij vergelijkbare resultaten werden waargenomen (Figuur 3). Kwantificering van het aantal macrofagen (buiten de directe laserablatieplaats) toonde een toename binnen het onderzochte tijdsbestek (4,00 ± 2,37 macrofagen vóór ablatie versus 7,00 ± 2,76 macrofagen bij 4 hpl) (Figuur 3B)). Evenzo nam het macrofaaggebied (gemeten in μm2, 785,8 μm2 ± 723,1 μm2 vóór ablatie versus 1553 μm2 ± 869,9 μm2 bij 4 hpl) toe (Figuur 3C). Omdat macrofagen soms moeilijk uit elkaar te houden zijn, is het meten van het macrofaaggebied in plaats van het aantal macrofagen aan te bevelen, zoals hier is gedaan.

figure-results-2
Figuur 3: Rekrutering van macrofagen bij 4 hpl in 4 dpf zebravislarven. (A) Operkelgebied zonder ablatie en bij 4 hpl. Operculaire osteoblasten zijn gelabeld in groen, macrofagen in magenta en de gestippelde cirkel geeft het lasergeablateerde gebied aan. Schaalbalk: 50 μm. (B) Kwantificering van het aantal macrofagen in het operatiegebied direct voor (0 hpl) en na ablatie (4 hpl). (C) Kwantificering van het macrofaaggebied (exclusief de plaats van laserablatie). Gepaarde eenzijdige t-tests. Elke stip vertegenwoordigt de gegevens van één larve en het gemiddelde ± SD wordt weergegeven, n = 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laserablatie is toegepast in verschillende disciplines van biologisch onderzoek. Het is met name nuttig geweest als methode om weefselregeneratie te bestuderen 10,11,12. Bijvoorbeeld, de rekrutering en fenotype veranderingen van aangeboren immuuncellen werden onlangs in de loop van de tijd geanalyseerd met behulp van UV-laser of twee-foton laserablatie-assays, samen met het herstel van osteoblasten op de laserablatieplaats10. Live beeldvorming van de rekrutering van immuuncellen werd uitgevoerd tot 12 uur na de laesie (hpl); Er kunnen echter langere beeldvormingsperioden worden overwogen met de juiste aanpassingen in de anesthesie en goedkeuring van de respectieve autoriteiten. In Geurtzen et al. werden analyses uitgevoerd tot enkele dagen na laserablatie en hielpen ze om het ontstekingsmilieu op de ablatieplaats te definiëren en om de ondersteunende rol van macrofagen bij botregeneratie vast te stellen10. Veel andere toepassingen, zoals het bestuderen van de rol van reactieve zuurstofspecies die33 vrijgeven bij celdood in botweefsel, zijn denkbaar.

Een van de voordelen van het gebruik van twee-fotonlaser-gemedieerde celablatie is de mogelijkheid om het te combineren met confocale beeldvorming. De software die hier wordt gebruikt (zie Materiaaltabel) kan worden ingesteld op een modus (Live Data Mode) waarin beeldvorming en ablatie achtereenvolgens plaatsvinden, waardoor het proces wordt versneld. Een ander voordeel van de technologie is de nauwkeurigheid van de ablatie. De grootte en vorm van de ablatie kan in de software eenvoudig op een zeer precieze manier worden aangepast. In de hier gepresenteerde experimentele setting werd een cirkelvormig gebied met een diameter van 25 μm gekozen voor ablatie. Andere ablatie-experimenten in Drosophila gebruikten echter lineaire ablaties van 25 μm om de weefselspanning in het embryonale epitheel te verminderen door de cellulaire verbindingen van buurman en buurman te knippen34. Deze nauwkeurigheid maakt de ablatie van een specifiek en gecontroleerd aantal cellen, enkele cellen of zelfs celmembranen mogelijk.

Met name het type laesie dat wordt uitgevoerd met een twee-fotonlaser lijkt niet op verwondingen en celdood die van nature voorkomen, wat in gedachten moet worden gehouden bij regeneratieonderzoek, maar ook bij andere disciplines. In het bijzonder creëren laserablaties zeer gerichte laesies door de cellen in het interessegebied volledig te vernietigen (verbranden)20 met minimale schade in de omliggende weefsels, terwijl mechanische of andere soorten verwondingen de neiging hebben om verschillende weefseltypen en lagen op een bredere schaal aan te tasten. Dit kan leiden tot tal van gevolgen met betrekking tot verschillende soorten celdood (bijv. necrose, apoptose, autofagie)35 en verschillende regeneratieve resultaten. Bovendien kunnen reacties op laserablatie verschillen in cellulaire en moleculaire termen. Er werd bijvoorbeeld aangetoond dat hoewel cellen rond de plaats van de laserlaesie de integriteit van het plasmamembraan kunnen verliezen, ze de schade kunnen overleven en de integriteit kunnen herstellen36. Laserablatie leidt ook tot gebieden van de beschadigde extracellulaire matrix, die het gevolg kunnen zijn van "thermische explosies" in het midden van de toegepaste laserstraal en ook van sterke blootstelling aan hitte in de direct aangrenzende cellen10,37. Desalniettemin vertonen cellen rond laserablatieplaatsen een verhoogd aantal apoptotische lichamen, zoals aangetoond voor lasergeablateerd hartweefsel38, en wordt een immuunrespons geactiveerd, zoals hier wordt getoond. Naast de beschreven verschillen kan een andere beperking van laserondersteunde ablatietests de diepte zijn waarop de verwonding kan worden uitgevoerd en de beperkte grootte van de monsters. Structuren die verborgen zijn in dikke exemplaren worden mogelijk niet op de juiste manier geablateerd en beeldvorming zal moeilijk zijn. Dit zal echter sterk afhangen van de gebruikte microscoop en laser, evenals het objectief en de inbedding.

Het is essentieel om de larven zo in te bedden dat de operkel in de buurt van de glazen bodem van de schotel wordt geplaatst in het geval dat een omgekeerde opstelling wordt gebruikt, zoals in het gepresenteerde protocol. Bovendien is het erg belangrijk om de temperatuur van de LMA te testen voordat deze wordt aangebracht om de larven te bedekken (stap 3.4), aangezien hete agarose de larven zal beschadigen. Om dat te voorkomen, neemt u de LMA-aliquot vroeg uit het thermoblok, bijvoorbeeld terwijl u de overgebleven E3-media uit de schotel met glazen bodem verwijdert, en test u de temperatuur, bijvoorbeeld op de huid van de pols. De LMA wordt verondersteld warm te zijn, maar niet heet.

Zodra de larven bedekt zijn met LMA, is het belangrijk om ze snel in de juiste positie te zetten voordat de LMA begint te stollen. De zijligging is het gemakkelijkst te bereiken; In de gepresenteerde studie was de gewenste positie lateraal met een lichte kanteling naar de ventrale zijde. In het geval dat de LMA stolt voordat de larven correct zijn gepositioneerd, is het mogelijk om de LMA te verwijderen (zoals in stap 5.1) en de inbedding te herhalen. Evenzo is het belangrijk dat het gebied dat moet worden afgebeeld (en gelaserd) zich zo dicht mogelijk bij de glazen bodem van de schaal bevindt voor maximale beeldkwaliteit en celablatie, hoewel dit ook afhangt van de werkafstand van het objectief.

Het is mogelijk om meer dan één larve in dezelfde schaal in te bedden voor beeldvorming. Dit bespaart tijd en maakt beter gebruik van de LMA. Het aantal larven dat kan worden ingebed, hangt af van de ervaring van de onderzoeker, maar 3-5 larven worden aanbevolen.

Laserablatie kan ook worden uitgevoerd met rechtopstaande microscopische opstellingen met behulp van dompellenzen. In dit geval is het belangrijk om de larven in te bedden met een licht ventrale weergave (van bovenaf) om een goede beeldvormingskwaliteit en laserablatiesucces van de operkel mogelijk te maken. Bovendien mag slechts een dunne laag LMA de larven bedekken om een goede excitatie en detectie van fluorescerende signalen mogelijk te maken.

In dit protocol wordt een twee-fotonlaser-gemedieerde ablatie-opstelling voor osteoblasten beschreven als een methodologie om laesies uit te voeren in zich ontwikkelende botten, met name in de operatie. Deze methode kan worden aangepast om cellen in andere botten van zich ontwikkelende zebravissen te ablateren. Bovendien is het over het algemeen een nuttige benadering om de regeneratie van beschadigde weefsels te bestuderen 11,12. Het gemak van het uitvoeren van ablaties en weefselsneden van verschillende grootte en vorm maakt het gebruik ervan in verschillende experimentele opstellingen en onderzoeksgebieden mogelijk 15,17,18,19,21,34. Al met al is twee-foton-laser-gemedieerde ablatie een zeer aanpasbare methode - voor verschillende weefsels, organismen en zelfs in vitro-omgevingen - en het is een belangrijk hulpmiddel in biologisch onderzoek.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Duitse Onderzoeksstichting (DFG) Transregio 67 (project 387653785), de DFG SPP 2084 μBone (project KN 1102/2-1) aan FK. Dit werk werd ondersteund door de Light Microscopy Facility (DFG-project 413875620), een kernfaciliteit van het CMCB Technology Platform van de TU Dresden. Het werk aan de TU Dresden werd medegefinancierd met belastinginkomsten op basis van de door het Saksische parlement goedgekeurde begroting ("Landtag").

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Calcium chloride dihydrate, CaCl2·H2OCarl Roth5239.1
Cell Culture Dish, PS, 100/20 mmGreiner Bio-one664160
Dumont #55 FocepsFST11295-51Tip shape straight, 11 cm, 0.05 x 0.02 mm
Falcon 6-well plateCorning353502
Glass-bottom microwell dishMatTekP35G-1.5-14-C35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm Glass Diameter, Uncoated
Insight X3 multiphoton laserSpectra-Physics
Leica Application SuiteLAS X, Leica Microsystems
Low melting agarose Biozyme840101Biozym Plaque Agarose
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2OSigma-AldrichM5921
Mating cagesmany varieties, e.g. Tecniplast
MethyleneblueCarl RothA514.1
MS-222SIGMA AldrichA5040
Potassium Chloride, KClPanReac AppliChem131494
Sodium chloride, NaClCarl Roth3957.1
SP8 FALCON Leica MicrosystemsEquipped with a Insight X3 multiphoton laser and Leica Application Suite software
Stainless Steel Dissect NeedleBochem12010140 mm
Stereo Microscope System SZX16OlympusEquipped with a LED illumination base SZX2-ILLTQ
Thermostatic Cabinets TS - WTWxylemTS 608/2-iFor incubation (embryo)
Transfer pipette, 3.5 mLSARSTEDT861171155 x 15 mm, LD-PE, transparent
Zeiss SteREO Discovery.V12 version 4.7.1.0.ZeissEquipped with Axiocam MRm camera and AxioVision sofware

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marques, I. J., Lupi, E., Mercader, N. Model systems for regeneration: Zebrafish. Dev. 146 (18), dev167692(2019).
  2. Dietrich, K., Fiedler, I. A. K., Kurzyukova, A. Skeletal biology and disease modeling in zebrafish. J Bone Miner Res. 36 (3), 436-458 (2021).
  3. Geurtzen, K., Knopf, F. Adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue. J Vis Exp. (140), e58429(2018).
  4. Sousa, S., Valerio, F., Jacinto, A. A new zebrafish bone crush injury model. Biol Open. 1 (9), 915-921 (2012).
  5. González-Rosa, J. M., Mercader, N. Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish. Nat Protoc. 7 (4), 782-788 (2012).
  6. Chassot, B., Pury, D., Jaźwińska, A. Zebrafish fin regeneration after cryoinjury-induced tissue damage. Biol Open. 5 (6), 819-828 (2016).
  7. Singh, S. P., Holdway, J. E., Poss, K. D. Regeneration of amputated zebrafish fin rays from de novo osteoblasts. Dev Cell. 22 (4), 879-886 (2012).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. Ando, K., Shibata, E., Hans, S., Brand, M., Kawakami, A. Osteoblast production by reserved progenitor cells in zebrafish bone regeneration and maintenance. Dev Cell. 43 (5), 643-650.e3 (2017).
  10. Geurtzen, K., López-Delgado, A. C., Duseja, A., Kurzyukova, A., Knopf, F. Laser-mediated osteoblast ablation triggers a pro-osteogenic inflammatory response regulated by reactive oxygen species and glucocorticoid signaling in zebrafish. Dev. 149 (8), 1998030(2022).
  11. Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells. J Vis Exp. (159), e60966(2020).
  12. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. (54), e2845(2011).
  13. Goldstein, A. M., Fishman, M. C. Notochord regulates cardiac lineage in zebrafish embryos. Dev Biol. 201 (2), 247-252 (1998).
  14. Zhang, J., Jeradi, S., Strähle, U., Akimenko, M. A. Laser ablation of the sonic hedgehog-a-expressing cells during fin regeneration affects ray branching morphogenesis. Dev Biol. 365 (2), 424-433 (2012).
  15. Marshall, A. R., et al. Two-photon cell and tissue level laser ablation methods to study morphogenetic biomechanics. Methods Mol Biol. 2438, 217-230 (2022).
  16. Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
  17. Lee, J., Lee, S., Truong, V. G., et al. Laser ablation of pancreatic cancer using a cylindrical light diffuser. Lasers Med Sci. 37 (6), 2615-2621 (2022).
  18. Luther, E., Mansour, S., Echeverry, N., et al. Laser ablation for cerebral metastases. Neurosurg Clin N Am. 31 (4), 537-547 (2020).
  19. Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -P. UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo. Methods Mol Biol. 1189, 219-235 (2015).
  20. Vogel, A., Venugopalan, V. Mechanisms of pulsed laser ablation of biological tissues. Chem Rev. 103 (2), 577-644 (2003).
  21. Wu, F. Heat-based tumor ablation: Role of the immune response. Adv Exp Med Biol. 880, 131-153 (2016).
  22. Renvoizé, C., Biola, A., Pallardy, M., Bréard, J. Apoptosis: Identification of dying cells. Cell Biol Toxicol. 14 (2), 111-120 (1998).
  23. Julier, Z., Park, A. J., Briquez, P. S., Martino, M. M. Promoting tissue regeneration by modulating the immune system. Acta Biomater. 53, 13-28 (2017).
  24. Petrie, T. A., Strand, N. S., Tsung-Yang, C., Rabinowitz, J. S., Moon, R. T. Macrophages modulate adult zebrafish tail fin regeneration. Dev. 141 (13), 2581-2591 (2014).
  25. Geurtzen, K., Vernet, A., Freidin, A. Immune suppressive and bone inhibitory effects of prednisolone in growing and regenerating zebrafish tissues. J Bone Miner Res. 32 (12), 2476-2488 (2017).
  26. Fleischhauer, L., López-Delgado, A. C., Geurtzen, K., Knopf, F. Glucocorticoid effects in the regenerating fin reflect tissue homeostasis disturbances in zebrafish by affecting Wnt signaling. Front Endocrinol. (Lausanne). 14, 1122351(2023).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. https://books.google.de/books?id=Iy8PngEACAAJ (2002).
  28. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
  29. Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Dev. 135 (22), 3765-3774 (2008).
  30. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  31. JoVE Science Education Database. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).
  32. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
  34. Blanchard, G. B., Scarpa, E., Muresan, L., Sanson, B. Mechanical stress combines with planar polarised patterning during metaphase to orient embryonic epithelial cell divisions. Dev. 151 (10), dev202862(2024).
  35. Park, W., Wei, S., Kim, B. -S., et al. Diversity and complexity of cell death: A historical review. Exp Mol Med. 55 (8), 1573-1594 (2023).
  36. O'Connor, J., Akbar, F. B., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. Zones of cellular damage around pulsed-laser wounds. PLoS One. 16 (9), e0253032(2021).
  37. Griebel, M., Vasan, A., Chen, C., Eyckmans, J. Fibroblast clearance of damaged tissue following laser ablation in engineered microtissues. APL Bioeng. 7 (1), 16112(2023).
  38. Matrone, G., Taylor, J. M., Wilson, K. S. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Two Photon AblationOsteoblast AblationZebrafish LarvaeBone RegenerationConfocal MicroscopyMacrophage RecruitmentImmune ResponseOpercle ImagingLow Melting AgaroseTransgenic Zebrafish

Related Articles