Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Meting van vier subtypes van NK-cellen in de baarmoeder met behulp van gemultiplexte fluorescerende immunohistochemische kleuring bij vrouwen met herhaald implantatiefalen

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67284

⸱

25 oktober 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynaecology, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 2Department of Pathology, School of Clinical Medicine, The University of Hong Kong, Queen Mary Hospital, 3Reproduction and Development Laboratory, Li Ka Shing Institute of Health Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 4School of Biomedical Sciences, Prince of Wales Hospital, The Chinese University of Hong Kong, 5Chinese University of Hong Kong - Sichuan University Joint Laboratory in Reproductive Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 6Laboratory for Reproductive Immunology, Hospital of Obstetrics and Gynecology, Fudan University, 7NHC Key Lab of Reproduction Regulation, Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies, Fudan University, 8Shanghai Key Laboratory of Female Reproductive Endocrine Related Diseases, Hospital of Obstetrics and Gynecology, Fudan University

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie presenteert een baanbrekende methode voor het kwantificeren van subsets van natuurlijke killercellen van de baarmoeder tijdens het implantatievenster met behulp van geavanceerde gemultiplexte fluorescerende immunohistochemische kleuringstechnieken.

Samenvatting

Immunohistochemie (IHC) speelt een cruciale rol in biologisch onderzoek en klinische diagnose en dient als de meest gebruikte methode voor het identificeren en visualiseren van weefselantigenen. Traditionele IHC-kleuringsmethoden hebben echter beperkingen bij het onderscheiden van verschillende subtypes van immuuncellen. Deze uitdaging heeft wetenschappers ertoe aangezet nieuwe technologieën en methodologieën te verkennen voor nauwkeurige identificatie en differentiatie van subtypes van immuuncellen. In de afgelopen jaren is multiplex IHC naar voren gekomen als een oplossing, die de gelijktijdige detectie van meerdere antigenen en hun visualisatie binnen hetzelfde weefselmonster mogelijk maakt. Uterine natural killer (uNK) -cellen spelen een cruciale rol in vroege zwangerschapsprocessen, waaronder decidualisatie, hermodellering van baarmoederspiraalslagaders en implantatie van embryo's. Verschillende subtypes van uNK-cellen vertonen verschillende functies, waardoor ze verschillende biologische gebeurtenissen kunnen coördineren voor een succesvolle embryonale ontwikkeling en zwangerschap. Daarom is diepgaand onderzoek naar uNK-celsubtypes essentieel voor het ophelderen van immuunregulatiemechanismen tijdens de zwangerschap. Dergelijke studies bieden waardevolle inzichten en nieuwe benaderingen voor het aanpakken van gerelateerde aandoeningen zoals onvruchtbaarheid en terugkerend reproductief falen. Dit artikel introduceert een gedetailleerd multiplex IHC-kleuringsprotocol voor het bestuderen van de dichtheid van vier subtypes van uNK-cellen in endometriummonsters tijdens het implantatievenster (WOI). Het protocol omvat monstervoorbereiding, optimalisatie van subtypemarkers, microscopische beeldvorming en data-analyses. Dit multiplex IHC-kleuringsprotocol biedt een hoge specificiteit en gevoeligheid, waardoor gelijktijdige detectie van verschillende uNK-celsubtypes mogelijk is, waardoor onderzoekers een krachtig hulpmiddel krijgen om de fijne kneepjes en mechanismen van immuunregulatie tijdens de zwangerschap te onderzoeken.

Inleiding

De eerste gedocumenteerde levendgeborene na in-vitrofertilisatie-embryotransfer (IVF-ET) werd gerapporteerd in 1978. In de afgelopen 40 jaar is er een grote vraag geweest naar de hulp van IVF-ET onder onvruchtbare paren1. In 2021 startten 238,126 patiënten in totaal 413,776 IVF-cycli in de Verenigde Staten. Dit markeert een toename van 25% in cycli ten opzichte van 2 jaar eerder en een stijging van 135% ten opzichte van 20122. Deze stijging wordt voornamelijk toegeschreven aan de stijgende prevalentie van onvruchtbaarheid en vertraagde planning voor zwangerschap. Vooruitgang in embryokweektechnieken en superovulatieprotocollen hebben geleid tot een verhoogd aantal levendgeborenen per ET-cyclus, tot 30%-50% bij vrouwen jonger dan 40 jaar en minder dan 30% bij vrouwen ouder dan 40 jaar. Ondanks deze vooruitgang slaagt meer dan de helft van de teruggeplaatste embryo's er echter nog steeds niet in om te implanteren. Herhaald implantatiefalen (RIF), meestal gedefinieerd als falen na drie of meer opeenvolgende pogingen om embryo's van hoge kwaliteit terug te plaatsen, treft 15% van de vrouwen die IVF-ETondergaan 3. Paren met RIF zijn uiterst kwetsbaar en meer geneigd om dure en onnodige procedures te ondergaan die hen aan onnodige risico's kunnen blootstellen4. Daarom is het begrijpen van de oorzaken van RIF en het verbeteren van embryo-implantatie cruciaal om het succes van IVF-ET te vergroten, met name voor vrouwen met RIF. De voorbereiding van het baarmoederslijmvlies is van cruciaal belang voor een succesvolle implantatie van embryo's. Dit proces wordt gekenmerkt door een aanzienlijke accumulatie van uNEK-cellen (uNK), die overgaan van 30% van het totale aantal lymfocyten in het baarmoederslijmvlies tijdens de middelste secretoire fase tot 70%-80% in de decidua tijdens devroege zwangerschap. UNK-cellen verschillen met name van perifere NK-cellen, die cytotoxische lymfocyten zijn die cruciaal zijn voor het aangeboren immuunsysteem voor het veroorzaken van de dood van de geïnfecteerde cellen door lysis of apoptose. Hoewel de exacte functies van uNK-cellen nog niet volledig worden begrepen, suggereren verschillende bewijslijnen dat ze betrokken zijn bij angiogenese-remodellering, trofoblastinvasie en foetale ontwikkeling6. De associatie tussen het percentage uNK-cellen ten opzichte van stromale cellen en RIF heeft de afgelopen 20 jaar een grote aantrekkingskracht gekregen. Een recente meta-analyse, die 8 studies omvatte waarbij 604 vrouwen betrokken waren, toonde aan dat de dichtheid van CD56+uNK-cellen tijdens de mid-luteale fase significant verhoogd is bij vrouwen met RIF in vergelijking met vruchtbare controles7. Het is echter belangrijk op te merken dat de kenmerken van uNK-cellen tijdens de mid-luteale fase aanzienlijk verschillen van die van deciduale NK (dNK)-cellen. Hoewel uNK-cellen na de zwangerschap verder kunnen differentiëren in verschillende subsets van dNK-cellen, geeft het meten van uNK-cellen alleen dNK-cellen niet nauwkeurig weer8. uNK-cellen ondergaan dynamische differentiatie en spelen verschillende rollen in de menstruatiecyclus en decidualisatieprocessen, waardoor ze complexer zijn dan alleen door CD56 kan worden geïdentificeerd. Er zijn meerdere markers nodig om een uitgebreid begrip te krijgen van het gedrag van uNK-cellen tijdens de voorbereiding van het endometrium. Onze recente studie maakte gebruik van single-cell RNA-sequencing om de diversiteit van uNK-cellen tijdens menstruatiecycli te identificeren. De resultaten, gevalideerd met behulp van flowcytometrie, hebben de aanwezigheid aangetoond van vier verschillende subtypes van uNK-cellen, die elk dynamische veranderingen vertonen tijdens de menstruatiecyclus9. Analyse van genverrijking en functionele verrijking van genontologie geven aan dat deze uNK-subgroepen verschillende functies vervullen in verschillende stadia van de menstruatie. Flowcytometrie is echter niet universeel toegankelijk in klinische laboratoria, en de onmiddellijke verwerking van vers endometriumweefsel voor enzymvertering maakt het onmogelijk om experimentele stappen op fouten te herhalen.

Het doel van deze studie was daarom om de meting van deze vier subpopulaties van NK-cellen te onderzoeken met behulp van een multiplex-kleuringstest, die een meer praktische diagnostische benadering biedt. Bij meervoudige kleuring zijn verschillende specifieke antilichamen tegen elk doelwit gekoppeld aan verschillende fluorofoorlabels die verschillende golflengten van licht uitzenden wanneer ze worden opgewonden door een specifieke golflengte van licht. Vergeleken met de traditionele IHC-kleuringsmethode kan deze methode de relatieve abundantie en verdeling van meerdere doelen in een monster kwantitatief vergelijken en informatie verschaffen over de interactie en co-lokalisatie van verschillende doelen, waardoor we verschillende subtypes van uNK-cellen kunnen identificeren. Deze benadering zal niet alleen ons begrip van de relatie tussen uNK-cellen en RIF verdiepen, maar zal ook inzichten opleveren voor het onderzoeken van andere subpopulaties van immuuncellen bij endometriumgerelateerde ziekten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De studie werd goedgekeurd door de Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee (CREC ref nr.: 2022.581). Vrouwen met RIF werden gerekruteerd uit het Assisted Reproductive Technology Center, Prince of Wales Hospital, Chinese University of Hong Kong. RIF werd gedefinieerd als het niet bereiken van een klinische zwangerschap na de terugplaatsing van ten minste 4 embryo's van goede kwaliteit in minimaal 3 verse of ingevroren cycli bij een vrouw jonger dan 40 jaar10. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de deelnemers voordat de endometriumbiopsieën werden verzameld.

1. Verwerving en verwerking van endometriummonsters

  1. Timing van het verzamelen van endometriummonsters
    1. Verzamel endometriummonsters volgens een strikt protocol om consistentie tussen de deelnemers aan het onderzoek te garanderen. Voor patiënten met natuurlijke cycli, voer urineonderzoek uit vanaf de 9edag van de menstruatiecyclus en voer endometriumbiopsie uit op de 7edag na de LH-piek (LH+7)11 . Voor patiënten die cycli van hormoonsubstitutietherapie (HST) ondergaan, dient u dagelijks 6 mg oestradiolvaleraat oraal toe vanaf dag 2 van de menstruatiecyclus.
    2. Beoordeel de dikte van het baarmoederslijmvlies door middel van echografie op dag 13 van de menstruatiecyclus. Wanneer de dikte van het endometrium 8 mm of meer bereikt, dient u progesteron transvaginaal toe en voert u 5 dagen na toediening van progesteron een endometriumbiopsie uit12.
  2. Afname en fixatie van endometriummonsters: breng een pipetmonsternemer in de baarmoederholte en breng deze naar het fundale gebied; Zuig door de interne zuiger naar beneden te trekken en tegelijkertijd het endometriumoppervlak te schrapen door middel van roterende en verticale bewegingen in de baarmoederholte. Spoel de verzamelde monsters af met normale zoutoplossing om cervicale en baarmoedersecreties te elimineren. Meet monsters en beoordeel de maat. Dompel monsters van 3 mm x 15-25 mm onmiddellijk onder in 10 ml 10% neutraal gebufferde formaline en fixeer ze 24-48 uur bij kamertemperatuur.
  3. Uitdroging: Na voltooiing van de fixatie onderwerpt u de monsters aan een uitdrogingssequentie die is ontworpen om water te vervangen door ethanol. Om dit te doen, dompelt u tissues onder in baden van 70%, 80%, 90% en 100% ethanol om volledige uitdroging te garanderen. Na het laatste ethanolbad maakt u de monsters vrij in xyleen om eventuele resterende alcohol te verwijderen en ze voor te bereiden op paraffine-infiltratie.
  4. Inbedding: Nadat u het weefsel plat op de bodem van de mal hebt gelegd, smelt u paraffine en voegt u het voorzichtig toe aan de monsters om ervoor te zorgen dat het endometriumweefsel volledig is ingekapseld in de paraffinematrix. Nadat je de vormpjes met paraffinewas hebt gevuld, koel je ze af op een diepvriestafel om de stolling van de paraffinewas te bevorderen. Zodra de paraffineblokken zijn uitgehard, bewaart u ze bij kamertemperatuur tot verdere verwerking nodig is.
    OPMERKING: De gebruikte mallen zijn speciaal gekozen om plaats te bieden aan de grootte van de verkregen endometriummonsters, zodat het endometriumweefsel plat op de bodem kan liggen zonder te vouwen, waardoor een optimale oriëntatie voor de volgende secties wordt gegarandeerd en zonder onnodig overschot te creëren.
  5. Secties: Om u voor te bereiden op het snijden, zet u de paraffineblokken gedurende 2 uur in de koelkast bij 4 °C. Snijd de monsters met behulp van een microtoom in secties van 4 μm, druk de plakjes plat op het oppervlak van gedestilleerd water dat is opgewarmd tot 42 °C en monteer ze op zelfklevende glasplaatjes. Leg de plakjes een nacht op een glijbaandroger en bewaar ze voor gebruik op kamertemperatuur.

2. Optimalisatie van multiplex immunohistochemische omstandigheden

  1. IHC-validatie: Voor de validatie van IHC-kleuringsparameters moet u een systematische aanpak hanteren om de omstandigheden voor het ophalen van antigeen, de antilichaamconcentratie en de incubatietijden te verfijnen.
    1. Test binnen het door de fabrikant aanbevolen verdunningsbereik 2-3 concentraties voor elk antilichaam. Optimaliseer het ophalen van antigeen door buffers bij pH 6 en pH 9 te vergelijken en evalueer incubatieprotocollen bij zowel kamertemperatuur gedurende 1,5 uur als 's nachts bij 4 °C.
    2. Beoordeel elke aandoening nauwgezet, waarbij u zich concentreert op de kleurintensiteit, specificiteit en achtergrondgeluid. Selecteer de optimale combinatie die de helderste, meest specifieke kleuring oplevert met minimale niet-specifieke binding. Deze rigoureuze validatie zorgde voor de hoogste nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid in het IHC-protocol.
  2. Tyramide Signal Amplification (TSA) monoplex-kleuring: Na het bepalen van de optimale kleuringsparameters voor individuele antilichamen, optimaliseert u de koppeling van antilichamen met verschillende TSA-kleurstoffen. Combineer de marker met een hogere expressie met een kleurstof met een lager fluorescentie-intensiteitsniveau, of vice versa. Maak tijdens deze fase aanpassingen aan de antilichaamconcentratie en incubatietijd op basis van de waargenomen fluorescentiesignaalsterkte. Als er significante achtergrond- of niet-specifieke kleuring wordt waargenomen, verander dan de gepaarde kleurstof13.
  3. TSA multiplex kleuring: Voor het multiplex immunohistochemie (m-IHC) protocol is de sequentiële volgorde van kleuring zorgvuldig gedefinieerd volgens vastgestelde principes. Om ervoor te zorgen dat het multiplexingproces de gevoeligheid en specificiteit van single-label kleuring weerspiegelt, prioriteren antilichamen met lagere expressieniveaus aan het begin van de kleuringssequentie. Plaats antilichamen die baseherstel vereisen voor het ophalen van antigeen aan het einde van de kleuringssequentie, aangezien baseherstel robuust is in vergelijking met op zuur gebaseerde methoden, die in sommige gevallen niet-specifieke kleuringsartefacten kunnen versterken.
  4. Aan de hand van de bevindingen van stap 2.1 en 2.2 kunt u beslissen welke antilichamen moeten worden gebruikt en in welk stadium, op basis van hun vereisten voor het ophalen van antigeen en de expressiedichtheden. Het CXCR4-antilichaam, dat een basisreparatie vereist voor het ophalen van antigeen, is bijvoorbeeld in de laatste stadia van kleuring geplaatst. Omgekeerd heeft het CD49a-antilichaam, dat wordt gekenmerkt door een lagere expressiedichtheid, de eerste positie in de kleuringssequentie gekregen. Maximaliseer de kans op succesvolle detectie en minimaliseer eventuele maskeringseffecten die in de latere stadia van de multiplexingprocedure kunnen optreden.
  5. Test voor de resterende antilichamen verschillende combinaties tijdens de optimalisatiefase om de meest effectieve sequentie te bepalen die zowel sensitiviteit als specificiteit in evenwicht houdt. De resultaten van deze vergelijkende analyses zullen als leidraad dienen voor de uiteindelijke samenstelling van het multiplexpaneel, zoals beschreven in tabel 1, om ervoor te zorgen dat het geselecteerde paneel optimale prestaties levert terwijl de achtergrond tot een minimum wordt beperkt.

3. m-IHC-proces

  1. Ontwaxen, hydratatie en fixatie: Bak de weefselsecties gedurende 2 uur op 60 °C, gevolgd door achtereenvolgende onderdompeling in xyleen I (10 min), xyleen II (10 min), 100% ethanol (5 min), 95% ethanol (5 min), 80% ethanol (5 min), 75% ethanol (5 min), ddH2O (2 min voor 3x), 10% neutraal gebufferd formaline (minstens 20 min), en ddH2O (2 min voor 3x).
  2. Antigeenverwijdering: Voeg 200 ml van de respectieve AR6- of AR9-buffer, zoals vermeld in tabel 1 voor elk antilichaam, toe aan een hittebestendige cassette voor het ophalen van antigeen. Plaats de secties in de juiste buffer voor het ophalen van antigeen en verwarm ze in een magnetron op hoog vermogen gedurende ongeveer 2 minuten tot ze koken. Dek de cassette vervolgens losjes af, verwarm 15 minuten op laag vermogen en laat afkoelen tot kamertemperatuur. Spoel de secties af met ddH2O en PBST.
  3. Hydrofobe barrière tekenen: Nadat u de overtollige oplossing met absorberend papier hebt verwijderd, tekent u een volledige cirkel rond het weefsel met behulp van een hydrofobe barrièrepen.
  4. Inactivatie van de endogene enzymactiviteit: Behandel secties met 3% waterstofperoxide en incubeer gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur. Was met PBST 3x gedurende 2 minuten elk.
  5. Blokkering van niet-specifieke plaatsen: Na droging met absorberend papier een blokkerende oplossing (1x Antilichaam verdunningsmiddel/Blok) aanbrengen en 10 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
  6. Incubatie met primair antilichaam: Breng na verwijdering van de blokkerende oplossing 150 μL van het eerste primaire antilichaam, CD49a, aan op elk objectglaasje in een verdunning van 1:1000 in 1x antilichaamverdunningsmiddel. Incuberen zoals eerder geoptimaliseerd in sectie 2. Was de objectglaasjes na incubatie 3x gedurende 2 minuten met PBST. Voor de overige antilichamen, zie Tabel 1 voor specifieke verdunningsverhoudingen.
  7. Incubatie met secundair antilichaam: Voordat u het secundaire antilichaam aanbrengt, gebruikt u absorberend papier om overtollig vocht te verwijderen om verdunning van het reagens te voorkomen. Voeg 4-5 druppels (ongeveer 150 μL) van het 1x Anti-Ms + Rb HRP secundaire antilichaam toe aan elk objectglaasje, gevolgd door een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur. Voer drie wasbeurten uit met PBST gedurende 2 minuten elk na de incubatie.
    OPMERKING: Houd er rekening mee dat het 1x Anti-Ms + Rb HRP secundaire antilichaam specifiek is voor primaire antilichamen van konijnen en muizen.
  8. Signaalversterking met TSA-kleurstof: Na het deppen van overtollig vocht, verdunt u de TSA-kleurstof 1:100 in het verdunningsmiddel. Voeg 150 μL van deze verdunde TSA-kleurstofoplossing toe aan elk objectglaasje. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was met PBST 3x gedurende 2 minuten elk.
  9. Herhaal stap 3.2 en 3.5-3.8 voor de TSA-procedure met behulp van het bijbehorende antilichaam en de bijbehorende kleurstof.
  10. Kleuringskernen: Na het kleuren van het laatste antilichaam, elimineert u ongebonden fluoroforen door secties in de magnetron te zetten in 200 ml AR6-buffer in een hittebestendige cassette, 2 minuten te koken en vervolgens gedurende 15 minuten op laag vermogen te verwarmen. Koel de monsters af tot kamertemperatuur en spoel ze af met ddH2O en PBST. Voeg druppelsgewijs 150 μl DAPI-werkoplossing verdund in PBST (1:10) toe, incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en spoel 2x met ddH2O.
  11. Montage: Zodra de secties ongeveer 30 minuten volledig aan de lucht zijn gedroogd in een donkere ruimte, brengt u een enkele druppel (ongeveer 30 μL) van de anti-blussende fluorescerende montering aan en plaatst u dekglaasjes.
    OPMERKING: Bescherm alle bewerkingen tegen licht na de eerste toepassing van TSA-kleurstof. Snelle observatie en het vastleggen van beelden waren essentieel na de voltooiing van de kleuring om fluorescentie-uitdoving te voorkomen.

4. Beeldacquisitie en -analyse

  1. Belichtingstijd: Leg beelden vast met behulp van een imager die excitatie- en emissiegolflengten erft die overeenkomen met de fluoroforen. Controleer bij het instellen van belichtingstijden dia's met een breed scala aan markeringsuitdrukkingen om nauwkeurigheid te garanderen. Stel voor elke combinatie van markering en filter handmatig scherp op verschillende delen van de dia. Gebruik de functie Automatische belichting om de belichtingstijd in te stellen.
  2. Selecteer filters op basis van de TSA-kleurstoffen en onderzoek meerdere objectglaasjes om de optimale belichtingstijden per kanaal te bepalen. Pas deze instellingen consequent toe op alle volgende acquisities om de vergelijkbaarheid tijdens de beeldvorming te behouden.
  3. Selectie van opnamegebieden: Om een onbevooroordeelde bemonstering over weefselsecties en een consistente opname van het luminale epitheel in elk geanalyseerd veld te garanderen, selecteert u willekeurig het initiële gebied voor beeldacquisitie, met als cruciaal criterium de aanwezigheid van de luminale epitheelgrens.
  4. Na de opname van dit eerste veld, selecteert u systematisch volgende gebieden door één veld links of rechts van het startpunt te verplaatsen (waarbij u één veld tussen elk vastgelegd beeld weglaat) terwijl u de luminale epitheelgrens binnen het frame behoudt. Herhaal dit proces om ten minste vijf verschillende gebieden vast te leggen, elk met ten minste een deel van het luminale epitheel, om een consistente analysediepte te behouden gedurende14. Deze aanpak was gericht op het opnemen van minimaal ongeveer 10.000 stromale cellen in alle vastgelegde velden om een uitgebreide en representatieve gegevensverzameling te garanderen.
  5. Analyse van afbeeldingen
    1. Beeldvoorbereiding: Om multispectrale beelden te importeren en te analyseren, navigeert u eerst naar Bestand > Open Afbeelding in de software-interface om de bestanden en het Autofluorescentieglaasje (AF) te laden. Nadat u de afbeeldingen hebt geüpload, gaat u verder met het ontmengen van de fluoroforen door op de knop Fluor selecteren te klikken en de juiste spectrale bibliotheek te selecteren. Zodra alle fluoroforen zijn geselecteerd, klikt u op OK om de selectie te bevestigen. Als u het AF-spectrum wilt isoleren, gebruikt u het AF-pipet om een representatief weefselgebied uit het AF-beeld te bemonsteren, waarbij u ervoor zorgt dat alle niet-weefselpixels worden uitgesloten. Klik na het nemen van een steekproef op Afbeelding voorbereiden of Alles voorbereiden in de linkerbenedenhoek van de interface15.
    2. Weefselsegmentatie: Start het segmentatieproces door handmatig een basislijn van 3-5 regio's per weefseltype binnen het beeld af te bakenen, inclusief epitheelgebieden die epitheelcellen bevatten, stromale gebieden die stromale cellen bevatten en lege gebieden zonder cellulaire inhoud. Als de eerste segmentatieresultaten niet bevredigend zijn, annoteer dan handmatig extra regio's om de trainingsdataset te verbeteren, waardoor de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de volgende analyses wordt verhoogd. Deze dynamische aanpassing van regio's en parameters zorgt ervoor dat de software automatisch vergelijkbare structuren in de huidige en andere geïmporteerde afbeeldingen met verhoogde nauwkeurigheid kan identificeren.
      OPMERKING: De eerste annotatie dient als een trainingsdataset voor de software om de kenmerken van elk weefselonderdeel te leren. De segmentatiemogelijkheden van de software worden vervolgens iteratief verfijnd op basis van de complexiteit en variabiliteit van het weefsel.
    3. Celsegmentatie: Klik op Cellen segmenteren om celsegmentatie te starten. Selecteer in de instelling Celsegmentatie de optie Kernen en Membraan. Kies DAPI om celkernen te identificeren en pas de intensiteitsinstelling aan om alle celkernen te detecteren zonder achtergrondruis. Selecteer CD16-, CD49a- en CD56-signalen om het membraan te vinden en gebruik dit signaal om te helpen bij het splitsen van kernen. Gebruik de functie voor het splitsen van nucleaire componenten om dicht bij elkaar gelegen kernen te onderscheiden.
      OPMERKING: DAPI markeert de binnenkant van cellen. De functie voor het splitsen van nucleaire componenten helpt om celkernen te onderscheiden wanneer ze dicht bij elkaar staan of samengevoegd lijken. Deze stap is belangrijk voor het verkrijgen van betrouwbare celtellingen en het behouden van de integriteit van de analyse.
    4. Celfenotypering: Gebruik vier verschillende celoppervlaktemarkers, waaronder CD56, CD49a, CXCR4 en CD16 om verschillende subtypes van NK-cellen te differentiëren. Label in het fenotyperingsschema deze vier markers als de fenotypes die moeten worden voortgezet. Wijs in de sectie Associate View specifieke kleuren toe aan elk van de fenotypen voor identificatie. Gebruik de knop Toevoegen om cellen te categoriseren als positief of negatief expressie van de markeringen; in het CD56-fenotype kunnen cellen bijvoorbeeld worden gelabeld als CD56+ of CD56-. Label handmatig ten minste vijf cellen voor elk fenotype tijdens het trainingsproces. Voer aanvullende handmatige etikettering uit als de initiële training geen effectieve resultaten oplevert.
    5. Nadat de configuratie van de celfenotypering is ingesteld, geeft elke cel in de afbeelding aan of de vier oppervlaktemarkeringen positief of negatief tot expressie komen. Exporteer de resulterende gegevens naar een spreadsheet voor verdere analyse.
    6. Gegevensverwerking: Importeer de gegevens die uit alle afbeeldingen zijn verkregen in een spreadsheet voor verwerking. Bereken de percentages van alle uNK-celsubtypen ten opzichte van het totale aantal cellen in de afbeelding. Het uiteindelijke celgetal vertegenwoordigt het gemiddelde aantal over meerdere afbeeldingen en biedt een uitgebreid overzicht van de populatie van verschillende uNK-celsubtypen binnen de steekproef.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om consistentie te behouden in de timing van het verzamelen van endometriummonsters voor vrouwen die de natuurlijke cyclus ondergaan, werd een urinetest uitgevoerd om hun luteïniserend hormoon (LH) -piek nauwkeurig te detecteren, waarbij endometriumbiopsieën 7 dagen na de LH-golf werden uitgevoerd. Voor vrouwen die HST-cycli ondergingen, werden monsters precies 5 dagen na het begin van de progesteronsuppletie gepland. Om verschillende subtypes van NK-cellen in het baarmoederslijmvlies te...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Embryo-implantatie omvat een complexe interactie tussen het embryo en het baarmoederslijmvlies. De immunologische status van endometriumhomeostase speelt een cruciale rol bij het bepalen van de endometriumontvankelijkheid. Tijdens WOI is de overheersende leukocytenpopulatie in het baarmoederslijmvlies NK-cellen. Ongeveer 90% van de uNK-cellen vertoont een hoge CD56-expressie, maar mist CD16. Een kleine subset van uNK-cellen lijkt echter op perifere bloed-NK-cellen, met een lage CD56-expr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten openbaar te maken hebben.

Dankbetuigingen

De huidige studie werd ondersteund door het Fonds voor Gezondheid en Medisch Onderzoek (10210956).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CD49aNovus BiologicalsNBP2-76478Primaire antilichamen
CD56LeicaNCL-L-CD56-504Primaire antilichamen
CD16abcamab183354Primaire antilichamen
CXCR4R&DMAB172Primaire antilichamen
AmplificatiediluentAkoya BiosciencesFP1498 seriesFluorofoorverdunningsbuffer
AntilichaamverdunningenAkoya BiosciencesARD1001EADiluteer het antilichaam
Citraat gebufferde oplossing, pH 6,0 /9,0(10x)Akoya BiosciencesA6001/A9001Antigeenherstel oplossing
inForm geavanceerde beeldanalysesoftwareAkoya BiosciencesinForm Tissue Finder Software 2.2.6Gegevensanalysesoftware
Mantra WorkstationsAkoya BiosciencesCLS140089Spectraal beeldvorming
MicrogolfovenAkoya BiosciencesomvormerMicrogolfstrippen
TSA 520Akoya BiosciencesFP1487001KGeschikt voor tyraamide-gebaseerde fluorescente reagentia
TSA 620Akoya BiosciencesFP1495001KGeschikt voor tyraamide-gebaseerde fluorescente reagentia
TSA 650Akoya BiosciencesFP1496001KGeschikt voor tyraamide-gebaseerde fluorescente reagentia
TSA 570Akoya BiosciencesFP1488001KGeschikt voor tyraamide-gebaseerde fluorescente reagentia
Poly-L-lysine gecoate slidesFisher Technologies120-550-15Slides voor routinematig histologisch gebruik
PolyHRP Breed SpectrumPerkin ElmerARH1001EASecundaire antilichamen
Invitrogen™ Fluoromount-G™ MontagemediumThemoFisher Science495802Installatie
Spectral DAPIAkoya BiosciencesFP1490ANukleinzuurkleuring

Referenties

  1. De Geyter, C. Assisted reproductive technology: Impact on society and need for surveillance. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 33 (1), 3-8 (2019).
  2. State-Specific Assisted Reproductive Technology Surveillance. CDC. , https://www.cdc.gov/art/state-specific-surveillance/2021/index.html (2024).
  3. Busnelli, A., et al. How common is real repeated implantation failure? An indirect estimate of the prevalence. Reprod Biomed Onl. 40 (1), 91-97 (2020).
  4. Ben Rafael, Z. Repeated implantation failure (RIF): an iatrogenic meaningless definition that generates unnecessary and costly use of add-on procedures. Human Reprod. 35 (7), 1479-1483 (2020).
  5. Hanna, J., et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nat Med. 12 (9), 1065-1074 (2006).
  6. Vento-Tormo, R., et al. Single-cell reconstruction of the early maternal-fetal interface in humans. Nature. 563 (7731), 347-353 (2018).
  7. Von Woon, E., et al. Number and function of uterine natural killer cells in recurrent miscarriage and implantation failure: a systematic review and meta-analysis. Human Reprod Update. 28 (4), 548-582 (2022).
  8. Manaster, I., et al. Endometrial NK cells are special immature cells that await pregnancy. J Immunol. 181 (3), 1869-1876 (2008).
  9. Lai, Z. Z., et al. Single-cell transcriptome profiling of the human endometrium of patients with recurrent implantation failure. Theranostics. 12 (15), 6527-6547 (2022).
  10. Coughlan, C., et al. Recurrent implantation failure: definition and management. Reprod BioMed Onl. 28 (1), 14-38 (2014).
  11. Chen, X., et al. Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range. Am J Obst Gyneco. 217 (6), 680.e1-680.e6 (2017).
  12. Yang, W. J., et al. A comparison of uterine natural killer cell density in the peri-implantation period between natural cycles and hormone replacement therapy cycles. Am J Reprod Immunol. 82 (3), e13156(2019).
  13. Syed, J., et al. Multiplex immunohistochemistry: The importance of staining order when producing a validated protocol. Immunother. 5 (2), 1-9 (2019).
  14. Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. J Reprod Immunol. 116, 50-59 (2016).
  15. Mansfield, J. R., Gossage, K. W., Hoyt, C. C., Levenson, R. M. Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in vivo fluorescence imaging. J Biomed Optics. 10 (4), 41207(2005).
  16. Hoyt, C. C. Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: Forming the basis of a clinical test platform for immuno-oncology. Front Mol Biosci. 8, 674747(2021).
  17. Von Woon, E., et al. Number and function of uterine natural killer cells in recurrent miscarriage and implantation failure: a systematic review and meta-analysis. Human Reprod Update. 28 (4), 548-582 (2022).
  18. Lee, J. Y., Lee, M., Lee, S. K. Role of endometrial immune cells in implantation. Clin Exp Reprod Med. 38 (3), 119-125 (2011).
  19. Gothe, J. P., de Mattos, A. C., Silveira, C. F., Malavazi, K. C. Exploring natural killer cell testing in embryo implantation and reproductive failure: An overview of techniques and controversies. Reprod Sci. 31 (3), 603-632 (2024).
  20. Russell, P., et al. The distribution of immune cells and macrophages in the endometrium of women with recurrent reproductive failure: I: Techniques. J Reprod Immunol. 91 (1), 90-102 (2011).
  21. Wang, W., Sung, N., Gilman-Sachs, A., Kwak-Kim, J. T. Helper (Th) cell profiles in pregnancy and recurrent pregnancy losses: Th1/Th2/Th9/Th17/Th22/Tfh cells. Front Immunol. 11, 2025(2020).
  22. Nagamatsu, T., Schust, D. J. The contribution of macrophages to normal and pathological pregnancies. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 460-471 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Uterine NK-cellenMultiplex ImmunohistochemieImmuuncel-subtypenFluorescente KleuringEndometriumweefselCel-fenotyperingCD49a-markerCXCR4-markerWeefsegmentatie
Meting van vier subtypes van NK-cellen in de baarmoeder met behulp van gemultiplexte fluorescerende immunohistochemische kleuring bij vrouwen met herhaald implantatiefalen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.