Meting van vier subtypes van NK-cellen in de baarmoeder met behulp van gemultiplexte fluorescerende immunohistochemische kleuring bij vrouwen met herhaald implantatiefalen

Samenvatting

Deze studie presenteert een baanbrekende methode voor het kwantificeren van subsets van natuurlijke killercellen van de baarmoeder tijdens het implantatievenster met behulp van geavanceerde gemultiplexte fluorescerende immunohistochemische kleuringstechnieken.

Samenvatting

Immunohistochemie (IHC) speelt een cruciale rol in biologisch onderzoek en klinische diagnose en dient als de meest gebruikte methode voor het identificeren en visualiseren van weefselantigenen. Traditionele IHC-kleuringsmethoden hebben echter beperkingen bij het onderscheiden van verschillende subtypes van immuuncellen. Deze uitdaging heeft wetenschappers ertoe aangezet nieuwe technologieën en methodologieën te verkennen voor nauwkeurige identificatie en differentiatie van subtypes van immuuncellen. In de afgelopen jaren is multiplex IHC naar voren gekomen als een oplossing, die de gelijktijdige detectie van meerdere antigenen en hun visualisatie binnen hetzelfde weefselmonster mogelijk maakt. Uterine natural killer (uNK) -cellen spelen een cruciale rol in vroege zwangerschapsprocessen, waaronder decidualisatie, hermodellering van baarmoederspiraalslagaders en implantatie van embryo's. Verschillende subtypes van uNK-cellen vertonen verschillende functies, waardoor ze verschillende biologische gebeurtenissen kunnen coördineren voor een succesvolle embryonale ontwikkeling en zwangerschap. Daarom is diepgaand onderzoek naar uNK-celsubtypes essentieel voor het ophelderen van immuunregulatiemechanismen tijdens de zwangerschap. Dergelijke studies bieden waardevolle inzichten en nieuwe benaderingen voor het aanpakken van gerelateerde aandoeningen zoals onvruchtbaarheid en terugkerend reproductief falen. Dit artikel introduceert een gedetailleerd multiplex IHC-kleuringsprotocol voor het bestuderen van de dichtheid van vier subtypes van uNK-cellen in endometriummonsters tijdens het implantatievenster (WOI). Het protocol omvat monstervoorbereiding, optimalisatie van subtypemarkers, microscopische beeldvorming en data-analyses. Dit multiplex IHC-kleuringsprotocol biedt een hoge specificiteit en gevoeligheid, waardoor gelijktijdige detectie van verschillende uNK-celsubtypes mogelijk is, waardoor onderzoekers een krachtig hulpmiddel krijgen om de fijne kneepjes en mechanismen van immuunregulatie tijdens de zwangerschap te onderzoeken.

Inleiding

De eerste gedocumenteerde levendgeborene na in-vitrofertilisatie-embryotransfer (IVF-ET) werd gerapporteerd in 1978. In de afgelopen 40 jaar is er een grote vraag geweest naar de hulp van IVF-ET onder onvruchtbare paren¹. In 2021 startten 238,126 patiënten in totaal 413,776 IVF-cycli in de Verenigde Staten. Dit markeert een toename van 25% in cycli ten opzichte van 2 jaar eerder en een stijging van 135% ten opzichte van 2012². Deze stijging wordt voornamelijk toegeschreven aan de stijgende prevalentie van onvruchtbaarheid en vertraagde planning voor zwangerschap. Vooruitgang in embryokweektechnieken en superovulatieprotocollen hebben geleid tot een verhoogd aantal levendgeborenen per ET-cyclus, tot 30%-50% bij vrouwen jonger dan 40 jaar en minder dan 30% bij vrouwen ouder dan 40 jaar^. Ondanks deze vooruitgang slaagt meer dan de helft van de teruggeplaatste embryo's er echter nog steeds niet in om te implanteren. Herhaald implantatiefalen (RIF), meestal gedefinieerd als falen na drie of meer opeenvolgende pogingen om embryo's van hoge kwaliteit terug te plaatsen, treft 15% van de vrouwen die IVF-ET^{ondergaan 3}. Paren met RIF zijn uiterst kwetsbaar en meer geneigd om dure en onnodige procedures te ondergaan die hen aan onnodige risico's kunnen blootstellen⁴. Daarom is het begrijpen van de oorzaken van RIF en het verbeteren van embryo-implantatie cruciaal om het succes van IVF-ET te vergroten, met name voor vrouwen met RIF. De voorbereiding van het baarmoederslijmvlies is van cruciaal belang voor een succesvolle implantatie van embryo's. Dit proces wordt gekenmerkt door een aanzienlijke accumulatie van uNEK-cellen (uNK), die overgaan van 30% van het totale aantal lymfocyten in het baarmoederslijmvlies tijdens de middelste secretoire fase tot 70%-80% in de decidua tijdens de^{vroege zwangerschap.} UNK-cellen verschillen met name van perifere NK-cellen, die cytotoxische lymfocyten zijn die cruciaal zijn voor het aangeboren immuunsysteem voor het veroorzaken van de dood van de geïnfecteerde cellen door lysis of apoptose. Hoewel de exacte functies van uNK-cellen nog niet volledig worden begrepen, suggereren verschillende bewijslijnen dat ze betrokken zijn bij angiogenese-remodellering, trofoblastinvasie en foetale ontwikkeling⁶. De associatie tussen het percentage uNK-cellen ten opzichte van stromale cellen en RIF heeft de afgelopen 20 jaar een grote aantrekkingskracht gekregen. Een recente meta-analyse, die 8 studies omvatte waarbij 604 vrouwen betrokken waren, toonde aan dat de dichtheid van CD56+uNK-cellen tijdens de mid-luteale fase significant verhoogd is bij vrouwen met RIF in vergelijking met vruchtbare controles⁷. Het is echter belangrijk op te merken dat de kenmerken van uNK-cellen tijdens de mid-luteale fase aanzienlijk verschillen van die van deciduale NK (dNK)-cellen. Hoewel uNK-cellen na de zwangerschap verder kunnen differentiëren in verschillende subsets van dNK-cellen, geeft het meten van uNK-cellen alleen dNK-cellen niet nauwkeurig weer⁸. uNK-cellen ondergaan dynamische differentiatie en spelen verschillende rollen in de menstruatiecyclus en decidualisatieprocessen, waardoor ze complexer zijn dan alleen door CD56 kan worden geïdentificeerd. Er zijn meerdere markers nodig om een uitgebreid begrip te krijgen van het gedrag van uNK-cellen tijdens de voorbereiding van het endometrium. Onze recente studie maakte gebruik van single-cell RNA-sequencing om de diversiteit van uNK-cellen tijdens menstruatiecycli te identificeren. De resultaten, gevalideerd met behulp van flowcytometrie, hebben de aanwezigheid aangetoond van vier verschillende subtypes van uNK-cellen, die elk dynamische veranderingen vertonen tijdens de menstruatiecyclus⁹. Analyse van genverrijking en functionele verrijking van genontologie geven aan dat deze uNK-subgroepen verschillende functies vervullen in verschillende stadia van de menstruatie. Flowcytometrie is echter niet universeel toegankelijk in klinische laboratoria, en de onmiddellijke verwerking van vers endometriumweefsel voor enzymvertering maakt het onmogelijk om experimentele stappen op fouten te herhalen.

Het doel van deze studie was daarom om de meting van deze vier subpopulaties van NK-cellen te onderzoeken met behulp van een multiplex-kleuringstest, die een meer praktische diagnostische benadering biedt. Bij meervoudige kleuring zijn verschillende specifieke antilichamen tegen elk doelwit gekoppeld aan verschillende fluorofoorlabels die verschillende golflengten van licht uitzenden wanneer ze worden opgewonden door een specifieke golflengte van licht. Vergeleken met de traditionele IHC-kleuringsmethode kan deze methode de relatieve abundantie en verdeling van meerdere doelen in een monster kwantitatief vergelijken en informatie verschaffen over de interactie en co-lokalisatie van verschillende doelen, waardoor we verschillende subtypes van uNK-cellen kunnen identificeren. Deze benadering zal niet alleen ons begrip van de relatie tussen uNK-cellen en RIF verdiepen, maar zal ook inzichten opleveren voor het onderzoeken van andere subpopulaties van immuuncellen bij endometriumgerelateerde ziekten.

Protocol

De studie werd goedgekeurd door de Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee (CREC ref nr.: 2022.581). Vrouwen met RIF werden gerekruteerd uit het Assisted Reproductive Technology Center, Prince of Wales Hospital, Chinese University of Hong Kong. RIF werd gedefinieerd als het niet bereiken van een klinische zwangerschap na de terugplaatsing van ten minste 4 embryo's van goede kwaliteit in minimaal 3 verse of ingevroren cycli bij een vrouw jonger dan 40 jaar¹⁰. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de deelnemers voordat de endometriumbiopsieën werden verzameld.

1. Verwerving en verwerking van endometriummonsters

1. Timing van het verzamelen van endometriummonsters
   1. Verzamel endometriummonsters volgens een strikt protocol om consistentie tussen de deelnemers aan het onderzoek te garanderen. Voor patiënten met natuurlijke cycli, voer urineonderzoek uit vanaf de 9e^{dag van} de menstruatiecyclus en voer endometriumbiopsie uit op de 7e^{dag na} de LH-piek (LH+7)¹¹ . Voor patiënten die cycli van hormoonsubstitutietherapie (HST) ondergaan, dient u dagelijks 6 mg oestradiolvaleraat oraal toe vanaf dag 2 van de menstruatiecyclus.
   2. Beoordeel de dikte van het baarmoederslijmvlies door middel van echografie op dag 13 van de menstruatiecyclus. Wanneer de dikte van het endometrium 8 mm of meer bereikt, dient u progesteron transvaginaal toe en voert u 5 dagen na toediening van progesteron een endometriumbiopsie uit¹².
2. Afname en fixatie van endometriummonsters: breng een pipetmonsternemer in de baarmoederholte en breng deze naar het fundale gebied; Zuig door de interne zuiger naar beneden te trekken en tegelijkertijd het endometriumoppervlak te schrapen door middel van roterende en verticale bewegingen in de baarmoederholte. Spoel de verzamelde monsters af met normale zoutoplossing om cervicale en baarmoedersecreties te elimineren. Meet monsters en beoordeel de maat. Dompel monsters van 3 mm x 15-25 mm onmiddellijk onder in 10 ml 10% neutraal gebufferde formaline en fixeer ze 24-48 uur bij kamertemperatuur.
3. Uitdroging: Na voltooiing van de fixatie onderwerpt u de monsters aan een uitdrogingssequentie die is ontworpen om water te vervangen door ethanol. Om dit te doen, dompelt u tissues onder in baden van 70%, 80%, 90% en 100% ethanol om volledige uitdroging te garanderen. Na het laatste ethanolbad maakt u de monsters vrij in xyleen om eventuele resterende alcohol te verwijderen en ze voor te bereiden op paraffine-infiltratie.
4. Inbedding: Nadat u het weefsel plat op de bodem van de mal hebt gelegd, smelt u paraffine en voegt u het voorzichtig toe aan de monsters om ervoor te zorgen dat het endometriumweefsel volledig is ingekapseld in de paraffinematrix. Nadat je de vormpjes met paraffinewas hebt gevuld, koel je ze af op een diepvriestafel om de stolling van de paraffinewas te bevorderen. Zodra de paraffineblokken zijn uitgehard, bewaart u ze bij kamertemperatuur tot verdere verwerking nodig is.
   OPMERKING: De gebruikte mallen zijn speciaal gekozen om plaats te bieden aan de grootte van de verkregen endometriummonsters, zodat het endometriumweefsel plat op de bodem kan liggen zonder te vouwen, waardoor een optimale oriëntatie voor de volgende secties wordt gegarandeerd en zonder onnodig overschot te creëren.
5. Secties: Om u voor te bereiden op het snijden, zet u de paraffineblokken gedurende 2 uur in de koelkast bij 4 °C. Snijd de monsters met behulp van een microtoom in secties van 4 μm, druk de plakjes plat op het oppervlak van gedestilleerd water dat is opgewarmd tot 42 °C en monteer ze op zelfklevende glasplaatjes. Leg de plakjes een nacht op een glijbaandroger en bewaar ze voor gebruik op kamertemperatuur.

2. Optimalisatie van multiplex immunohistochemische omstandigheden

1. IHC-validatie: Voor de validatie van IHC-kleuringsparameters moet u een systematische aanpak hanteren om de omstandigheden voor het ophalen van antigeen, de antilichaamconcentratie en de incubatietijden te verfijnen.
   1. Test binnen het door de fabrikant aanbevolen verdunningsbereik 2-3 concentraties voor elk antilichaam. Optimaliseer het ophalen van antigeen door buffers bij pH 6 en pH 9 te vergelijken en evalueer incubatieprotocollen bij zowel kamertemperatuur gedurende 1,5 uur als 's nachts bij 4 °C.
   2. Beoordeel elke aandoening nauwgezet, waarbij u zich concentreert op de kleurintensiteit, specificiteit en achtergrondgeluid. Selecteer de optimale combinatie die de helderste, meest specifieke kleuring oplevert met minimale niet-specifieke binding. Deze rigoureuze validatie zorgde voor de hoogste nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid in het IHC-protocol.
2. Tyramide Signal Amplification (TSA) monoplex-kleuring: Na het bepalen van de optimale kleuringsparameters voor individuele antilichamen, optimaliseert u de koppeling van antilichamen met verschillende TSA-kleurstoffen. Combineer de marker met een hogere expressie met een kleurstof met een lager fluorescentie-intensiteitsniveau, of vice versa. Maak tijdens deze fase aanpassingen aan de antilichaamconcentratie en incubatietijd op basis van de waargenomen fluorescentiesignaalsterkte. Als er significante achtergrond- of niet-specifieke kleuring wordt waargenomen, verander dan de gepaarde kleurstof¹³.
3. TSA multiplex kleuring: Voor het multiplex immunohistochemie (m-IHC) protocol is de sequentiële volgorde van kleuring zorgvuldig gedefinieerd volgens vastgestelde principes. Om ervoor te zorgen dat het multiplexingproces de gevoeligheid en specificiteit van single-label kleuring weerspiegelt, prioriteren antilichamen met lagere expressieniveaus aan het begin van de kleuringssequentie. Plaats antilichamen die baseherstel vereisen voor het ophalen van antigeen aan het einde van de kleuringssequentie, aangezien baseherstel robuust is in vergelijking met op zuur gebaseerde methoden, die in sommige gevallen niet-specifieke kleuringsartefacten kunnen versterken.
4. Aan de hand van de bevindingen van stap 2.1 en 2.2 kunt u beslissen welke antilichamen moeten worden gebruikt en in welk stadium, op basis van hun vereisten voor het ophalen van antigeen en de expressiedichtheden. Het CXCR4-antilichaam, dat een basisreparatie vereist voor het ophalen van antigeen, is bijvoorbeeld in de laatste stadia van kleuring geplaatst. Omgekeerd heeft het CD49a-antilichaam, dat wordt gekenmerkt door een lagere expressiedichtheid, de eerste positie in de kleuringssequentie gekregen. Maximaliseer de kans op succesvolle detectie en minimaliseer eventuele maskeringseffecten die in de latere stadia van de multiplexingprocedure kunnen optreden.
5. Test voor de resterende antilichamen verschillende combinaties tijdens de optimalisatiefase om de meest effectieve sequentie te bepalen die zowel sensitiviteit als specificiteit in evenwicht houdt. De resultaten van deze vergelijkende analyses zullen als leidraad dienen voor de uiteindelijke samenstelling van het multiplexpaneel, zoals beschreven in tabel 1, om ervoor te zorgen dat het geselecteerde paneel optimale prestaties levert terwijl de achtergrond tot een minimum wordt beperkt.

3. m-IHC-proces

1. Ontwaxen, hydratatie en fixatie: Bak de weefselsecties gedurende 2 uur op 60 °C, gevolgd door achtereenvolgende onderdompeling in xyleen I (10 min), xyleen II (10 min), 100% ethanol (5 min), 95% ethanol (5 min), 80% ethanol (5 min), 75% ethanol (5 min), ddH₂O (2 min voor 3x), 10% neutraal gebufferd formaline (minstens 20 min), en ddH₂O (2 min voor 3x).
2. Antigeenverwijdering: Voeg 200 ml van de respectieve AR6- of AR9-buffer, zoals vermeld in tabel 1 voor elk antilichaam, toe aan een hittebestendige cassette voor het ophalen van antigeen. Plaats de secties in de juiste buffer voor het ophalen van antigeen en verwarm ze in een magnetron op hoog vermogen gedurende ongeveer 2 minuten tot ze koken. Dek de cassette vervolgens losjes af, verwarm 15 minuten op laag vermogen en laat afkoelen tot kamertemperatuur. Spoel de secties af met ddH₂O en PBST.
3. Hydrofobe barrière tekenen: Nadat u de overtollige oplossing met absorberend papier hebt verwijderd, tekent u een volledige cirkel rond het weefsel met behulp van een hydrofobe barrièrepen.
4. Inactivatie van de endogene enzymactiviteit: Behandel secties met 3% waterstofperoxide en incubeer gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur. Was met PBST 3x gedurende 2 minuten elk.
5. Blokkering van niet-specifieke plaatsen: Na droging met absorberend papier een blokkerende oplossing (1x Antilichaam verdunningsmiddel/Blok) aanbrengen en 10 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
6. Incubatie met primair antilichaam: Breng na verwijdering van de blokkerende oplossing 150 μL van het eerste primaire antilichaam, CD49a, aan op elk objectglaasje in een verdunning van 1:1000 in 1x antilichaamverdunningsmiddel. Incuberen zoals eerder geoptimaliseerd in sectie 2. Was de objectglaasjes na incubatie 3x gedurende 2 minuten met PBST. Voor de overige antilichamen, zie Tabel 1 voor specifieke verdunningsverhoudingen.
7. Incubatie met secundair antilichaam: Voordat u het secundaire antilichaam aanbrengt, gebruikt u absorberend papier om overtollig vocht te verwijderen om verdunning van het reagens te voorkomen. Voeg 4-5 druppels (ongeveer 150 μL) van het 1x Anti-Ms + Rb HRP secundaire antilichaam toe aan elk objectglaasje, gevolgd door een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur. Voer drie wasbeurten uit met PBST gedurende 2 minuten elk na de incubatie.
   OPMERKING: Houd er rekening mee dat het 1x Anti-Ms + Rb HRP secundaire antilichaam specifiek is voor primaire antilichamen van konijnen en muizen.
8. Signaalversterking met TSA-kleurstof: Na het deppen van overtollig vocht, verdunt u de TSA-kleurstof 1:100 in het verdunningsmiddel. Voeg 150 μL van deze verdunde TSA-kleurstofoplossing toe aan elk objectglaasje. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was met PBST 3x gedurende 2 minuten elk.
9. Herhaal stap 3.2 en 3.5-3.8 voor de TSA-procedure met behulp van het bijbehorende antilichaam en de bijbehorende kleurstof.
10. Kleuringskernen: Na het kleuren van het laatste antilichaam, elimineert u ongebonden fluoroforen door secties in de magnetron te zetten in 200 ml AR6-buffer in een hittebestendige cassette, 2 minuten te koken en vervolgens gedurende 15 minuten op laag vermogen te verwarmen. Koel de monsters af tot kamertemperatuur en spoel ze af met ddH₂O en PBST. Voeg druppelsgewijs 150 μl DAPI-werkoplossing verdund in PBST (1:10) toe, incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en spoel 2x met ddH₂O.
11. Montage: Zodra de secties ongeveer 30 minuten volledig aan de lucht zijn gedroogd in een donkere ruimte, brengt u een enkele druppel (ongeveer 30 μL) van de anti-blussende fluorescerende montering aan en plaatst u dekglaasjes.
    OPMERKING: Bescherm alle bewerkingen tegen licht na de eerste toepassing van TSA-kleurstof. Snelle observatie en het vastleggen van beelden waren essentieel na de voltooiing van de kleuring om fluorescentie-uitdoving te voorkomen.

4. Beeldacquisitie en -analyse

1. Belichtingstijd: Leg beelden vast met behulp van een imager die excitatie- en emissiegolflengten erft die overeenkomen met de fluoroforen. Controleer bij het instellen van belichtingstijden dia's met een breed scala aan markeringsuitdrukkingen om nauwkeurigheid te garanderen. Stel voor elke combinatie van markering en filter handmatig scherp op verschillende delen van de dia. Gebruik de functie Automatische belichting om de belichtingstijd in te stellen.
2. Selecteer filters op basis van de TSA-kleurstoffen en onderzoek meerdere objectglaasjes om de optimale belichtingstijden per kanaal te bepalen. Pas deze instellingen consequent toe op alle volgende acquisities om de vergelijkbaarheid tijdens de beeldvorming te behouden.
3. Selectie van opnamegebieden: Om een onbevooroordeelde bemonstering over weefselsecties en een consistente opname van het luminale epitheel in elk geanalyseerd veld te garanderen, selecteert u willekeurig het initiële gebied voor beeldacquisitie, met als cruciaal criterium de aanwezigheid van de luminale epitheelgrens.
4. Na de opname van dit eerste veld, selecteert u systematisch volgende gebieden door één veld links of rechts van het startpunt te verplaatsen (waarbij u één veld tussen elk vastgelegd beeld weglaat) terwijl u de luminale epitheelgrens binnen het frame behoudt. Herhaal dit proces om ten minste vijf verschillende gebieden vast te leggen, elk met ten minste een deel van het luminale epitheel, om een consistente analysediepte te behouden gedurende¹⁴. Deze aanpak was gericht op het opnemen van minimaal ongeveer 10.000 stromale cellen in alle vastgelegde velden om een uitgebreide en representatieve gegevensverzameling te garanderen.
5. Analyse van afbeeldingen
   1. Beeldvoorbereiding: Om multispectrale beelden te importeren en te analyseren, navigeert u eerst naar Bestand > Open Afbeelding in de software-interface om de bestanden en het Autofluorescentieglaasje (AF) te laden. Nadat u de afbeeldingen hebt geüpload, gaat u verder met het ontmengen van de fluoroforen door op de knop Fluor selecteren te klikken en de juiste spectrale bibliotheek te selecteren. Zodra alle fluoroforen zijn geselecteerd, klikt u op OK om de selectie te bevestigen. Als u het AF-spectrum wilt isoleren, gebruikt u het AF-pipet om een representatief weefselgebied uit het AF-beeld te bemonsteren, waarbij u ervoor zorgt dat alle niet-weefselpixels worden uitgesloten. Klik na het nemen van een steekproef op Afbeelding voorbereiden of Alles voorbereiden in de linkerbenedenhoek van de interface¹⁵.
   2. Weefselsegmentatie: Start het segmentatieproces door handmatig een basislijn van 3-5 regio's per weefseltype binnen het beeld af te bakenen, inclusief epitheelgebieden die epitheelcellen bevatten, stromale gebieden die stromale cellen bevatten en lege gebieden zonder cellulaire inhoud. Als de eerste segmentatieresultaten niet bevredigend zijn, annoteer dan handmatig extra regio's om de trainingsdataset te verbeteren, waardoor de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de volgende analyses wordt verhoogd. Deze dynamische aanpassing van regio's en parameters zorgt ervoor dat de software automatisch vergelijkbare structuren in de huidige en andere geïmporteerde afbeeldingen met verhoogde nauwkeurigheid kan identificeren.
      OPMERKING: De eerste annotatie dient als een trainingsdataset voor de software om de kenmerken van elk weefselonderdeel te leren. De segmentatiemogelijkheden van de software worden vervolgens iteratief verfijnd op basis van de complexiteit en variabiliteit van het weefsel.
   3. Celsegmentatie: Klik op Cellen segmenteren om celsegmentatie te starten. Selecteer in de instelling Celsegmentatie de optie Kernen en Membraan. Kies DAPI om celkernen te identificeren en pas de intensiteitsinstelling aan om alle celkernen te detecteren zonder achtergrondruis. Selecteer CD16-, CD49a- en CD56-signalen om het membraan te vinden en gebruik dit signaal om te helpen bij het splitsen van kernen. Gebruik de functie voor het splitsen van nucleaire componenten om dicht bij elkaar gelegen kernen te onderscheiden.
      OPMERKING: DAPI markeert de binnenkant van cellen. De functie voor het splitsen van nucleaire componenten helpt om celkernen te onderscheiden wanneer ze dicht bij elkaar staan of samengevoegd lijken. Deze stap is belangrijk voor het verkrijgen van betrouwbare celtellingen en het behouden van de integriteit van de analyse.
   4. Celfenotypering: Gebruik vier verschillende celoppervlaktemarkers, waaronder CD56, CD49a, CXCR4 en CD16 om verschillende subtypes van NK-cellen te differentiëren. Label in het fenotyperingsschema deze vier markers als de fenotypes die moeten worden voortgezet. Wijs in de sectie Associate View specifieke kleuren toe aan elk van de fenotypen voor identificatie. Gebruik de knop Toevoegen om cellen te categoriseren als positief of negatief expressie van de markeringen; in het CD56-fenotype kunnen cellen bijvoorbeeld worden gelabeld als CD56+ of CD56-. Label handmatig ten minste vijf cellen voor elk fenotype tijdens het trainingsproces. Voer aanvullende handmatige etikettering uit als de initiële training geen effectieve resultaten oplevert.
   5. Nadat de configuratie van de celfenotypering is ingesteld, geeft elke cel in de afbeelding aan of de vier oppervlaktemarkeringen positief of negatief tot expressie komen. Exporteer de resulterende gegevens naar een spreadsheet voor verdere analyse.
   6. Gegevensverwerking: Importeer de gegevens die uit alle afbeeldingen zijn verkregen in een spreadsheet voor verwerking. Bereken de percentages van alle uNK-celsubtypen ten opzichte van het totale aantal cellen in de afbeelding. Het uiteindelijke celgetal vertegenwoordigt het gemiddelde aantal over meerdere afbeeldingen en biedt een uitgebreid overzicht van de populatie van verschillende uNK-celsubtypen binnen de steekproef.

Resultaten

Om consistentie te behouden in de timing van het verzamelen van endometriummonsters voor vrouwen die de natuurlijke cyclus ondergaan, werd een urinetest uitgevoerd om hun luteïniserend hormoon (LH) -piek nauwkeurig te detecteren, waarbij endometriumbiopsieën 7 dagen na de LH-golf werden uitgevoerd. Voor vrouwen die HST-cycli ondergingen, werden monsters precies 5 dagen na het begin van de progesteronsuppletie gepland. Om verschillende subtypes van NK-cellen in het baarmoederslijmvlies te kwantificeren, werd m-IHC-kleuring gebruikt. Een schematische schets van de experimentele procedure is weergegeven in figuur 1.

Optimalisatie van de experimentele procedure is van cruciaal belang voor het bereiken van hoogwaardige m-IHC-kleuringsresultaten om nauwkeurigheid en consistentie in experimentresultaten te garanderen. Aanvankelijk werd IHC gebruikt om de juiste antilichaamconcentratie te bepalen, met de selectie van antigeenophaaloplossingen AR6 of AR9. Voor antilichamen zoals CD56, CD16 en CD49 wordt een oplossing voor het ophalen van antigeen met pH 6 aanbevolen, terwijl voor het CXCR4-antilichaam superieure kleuringsresultaten werden bereikt met behulp van een antigeenhersteloplossing met een pH van 9 in vergelijking met een pH 6-buffer. Zodra de parameters, waaronder de verdunningsverhouding van het antilichaam, de incubatietijd en de omstandigheden voor het ophalen van antigeen, zijn bepaald, kan de meest geschikte TSA-kleurstof worden geselecteerd op basis van de affiniteit van het antilichaam. Een kleurstof met een zwakke fluorescentiehelderheid moet worden gekozen om de hoge affiniteit van het antilichaam aan te vullen. Referentiegegevens over de signaalsterkte van TSA-kleurstoffen zijn te vinden in tabel 2. Na voltooiing van de TSA-monoplextest kan de volgorde van de TSA-multiplex worden bepaald. Aangezien de vier antilichamen zijn ontworpen om verschillende subtypes van uNK-cellen te identificeren, is co-lokalisatie tussen de antilichamen onvermijdelijk. Om spectrale overlapping tot een minimum te beperken en interferentie tussen fluorescerende groepen te voorkomen, werd de volgende strategie toegepast: het selecteren van fluorescerende groepen met golflengten die zo ver mogelijk uit elkaar liggen, het vergelijken van de positie en het aantal positieve signalen van de TSA-multiplex met die van de TSA-monoplex om hun identiteit te verzekeren (Figuur 2) en zorgen voor een heldere achtergrond (Figuur 3)¹⁶.

Na de optimalisatie en voltooiing van de m-IHC-kleuringsprocedures werd het beeldvormingswerkstation gebruikt voor beeldacquisitie en werd de beeldanalysesoftware toegepast voor een diepgaande analyse van de beelden (Figuur 4). Voor de classificatie van uNK-cellen werden zowel traditionele als innovatieve methoden gebruikt. De traditionele classificatie verdeelt NK-cellen in twee categorieën, CD56+CD16- en CD56+CD16+¹⁷, op basis van het expressieniveau van CD16. Voortbouwend op deze basis hebben we geprobeerd de heterogeniteit van NK-cellen verder af te bakenen met behulp van een nieuwe classificatiestrategie. Met behulp van single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) uit ons eerdere onderzoek, isoleerden we individuele NK-cellen door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en voerden we RNA-sequencing uit om de transcriptomische profielen van elke cel vast te leggen. Onze analyse onthulde vier verschillende NK-celsubtypes: NK1 (CD56+CD49a+CXCR4-), NK2 (CD56+CD49a+CXCR4+), NK3 (CD56+CD49a-CXCR4-) en NK4 (CD56+CD49a-CXCR4+). Deze subtypes werden gekenmerkt door differentiële expressie van CD49a en CXCR4, waarbij CD56 diende als een universele marker voor alle NK-cellen. CD49a werd specifiek gedetecteerd in NK1- en NK2-subtypes, terwijl CXCR4 aanwezig was in NK2- en NK4-subtypes. Om deze classificatie te valideren, hebben we flowcytometrie-analyse uitgevoerd om de nauwkeurigheid van onze subtyperingsmethode te garanderen (Figuur 5)⁹. Het aandeel van elk uNK-celsubtype wordt weergegeven als een percentage ten opzichte van het totale aantal stromale cellen.

Figuur 1: Diagram van de workflow van endometrium NK-celanalyse. De belangrijkste stappen zijn het verwerven en verzamelen van het baarmoederslijmvlies, de optimalisatie van het m-IHC-paneel, de m-IHC-kleuring van het baarmoederslijmvlies en het verkrijgen en analyseren van het beeld. Gemaakt met BioRender.com Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve beelden voor kwantificering van biomarkers via DAB, TSA-monoplex en TSA-multiplexkleuring. Representatieve beelden voor elk van de antilichamen gekleurd door DAB (linkerpanelen), TSA-monoplex IHC (middelste panelen) en TSA-multiplex IHC (rechterpanelen) toonden minimale afwijking aan door de ontwikkeling van m-IHC. De TSA-gesimuleerde IHC-beelden eronder imiteren in hoge mate de bijbehorende helderveldbeelden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Experimentele resultaten na m-IHC-kleuring van het baarmoederslijmvlies. (A) Een ongemengd beeld werd verkregen met behulp van de imager bij een vergroting van 200x. (B) Verdere vergroting van dit ongemengde beeld. (C-F) Beelden werden waargenomen in de TSA-kleurstof 570 (CD16), TSA-kleurstof 650 (CD56), TSA-kleurstof 620 (CXCR4) en TSA-kleurstof 520 (CD49a) kanalen na ontmenging met behulp van de beeldvormingssoftware. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 4: Analyseer m-IHC-bevlekte afbeeldingen. De beelden werden geanalyseerd met behulp van beeldvormingssoftware (A) weefselsegmentatie, (B) celsegmentatie en (C) celfenotypefuncties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Subtype-analyse van endometrium-NK-cellen. (A) Conventionele endometrium-NK-cellen kunnen worden ingedeeld in CD56+CD16-NK-cellen en CD56+CD16+NK-cellen op basis van CD16-expressie. (B) De innovatieve subtype-analysemethode classificeerde endometrium-NK-cellen in vier categorieën: NK1 (CD56+CD49a+CXCR4-), NK2 (CD56+CD49a+CXCR4+), NK3 (CD56+CD49a-CXCR4-) en NK4 (CD56+CD49a-CXCR4+). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Kleuring cyclus	Marker	Kloon	Bedrijf	Product	Verdunning van antilichamen	AR-buffer	Fluorofoor
1	CD49a	CL7207	Novus Biologicals	Bekijk materiaal NBP2-76478	1:1000	AR6	TSA 520
2	CD56 zei:	CD564	Leica	NCL-L-CD56-504	1:100	AR6	TSA 650
3	CD16 NL	SP175	abcam	AB183354 NL	1:100	AR6	TSA 570
4	CXCR4 zei:	44716	R&D	MAB172 NL	1:100	AR9	TSA 620

Tabel 1: Lijst van de concentraties van de antilichamen en TSA-kleurstof die in de m-IHC worden gebruikt.

Fluorofoor	Mantra
TSA-kleurstof 520	Hoog
TSA-kleurstof 540	Gemiddeld
TSA-kleurstof 570	Gemiddeld
TSA-kleurstof 620	Gemiddeld
TSA-kleurstof 650	Hoog
TSA-kleurstof 690	Laag

Tabel 2: TSA-kleurstoffen en bijbehorende fluorescentie-intensiteit.

Discussie

Embryo-implantatie omvat een complexe interactie tussen het embryo en het baarmoederslijmvlies. De immunologische status van endometriumhomeostase speelt een cruciale rol bij het bepalen van de endometriumontvankelijkheid. Tijdens WOI is de overheersende leukocytenpopulatie in het baarmoederslijmvlies NK-cellen. Ongeveer 90% van de uNK-cellen vertoont een hoge CD56-expressie, maar mist CD16. Een kleine subset van uNK-cellen lijkt echter op perifere bloed-NK-cellen, met een lage CD56-expressie maar positieve CD16-expressie¹⁸. Deze twee uNK-celsubtypes vertonen verschillende functies. Het CD56+CD16-subtype draagt voornamelijk bij aan de productie van cytokines, vasculaire remodellering en interacties met trofoblastcellen, die cruciaal zijn voor het tot stand brengen en behouden van een zwangerschap. Daarentegen vertoont het subtype CD56+CD16+ een hogere cytotoxiciteit. Met behulp van single-cell RNA-sequencing heeft onze recente studie uNK-cellen verder gecategoriseerd in vier subsets, waarbij CD56+CD16-regulerende NK-cellen verder werden gesubgroepeerd in drie subpopulaties op basis van hun specifieke fenotypes en functies⁹. De NK1-subset, gekenmerkt door CD56+CD49a+CXCR4-, is betrokken bij weefselremodellering. De NK2-subset, geïdentificeerd door CD56+CD49a+CXCR4+, reguleert de immuunrespons. De NK3-subset, gemarkeerd door CD56+CD49a-CXCR4-, interageert met trofoblasten. De NK4-subset, die CD56+CD49a-CXCR4+ vertoont, vertoont overeenkomsten met CD56+CD16+ NK-cellen en vertoont cytotoxische functies⁹. In de huidige studie hebben we voor het eerst met succes een protocol opgesteld om deze vier verschillende NK-celsubsets te identificeren met behulp van m-IHC-kleuring.

Conventionele IHC-kleuring en flowcytometrie zijn de meest gebruikte methoden voor het identificeren van immuuncellen, elk met zijn eigen sterke punten en beperkingen¹⁹. Hoewel conventionele IHC veel wordt gebruikt in klinische omgevingen vanwege de gemakkelijke toegankelijkheid, staat het voor uitdagingen bij het gelijktijdig detecteren van meerdere antigenen en het kwantificeren van positieve signalen. Dit vormt een belangrijke hindernis bij het nauwkeurig karakteriseren van fenotypes van immuuncellen, waarvoor vaak het gebruik van meerdere markers nodig is voor nauwkeurige metingen. Aan de andere kant is flowcytometrie in staat om tegelijkertijd meerdere celmarkers te detecteren, maar het vereist een groot aantal verse monsters en geeft geen ruimtelijke informatie over de cellocatie in het weefsel. Met name endometrium-immuuncellen zijn niet uniform verspreid over het endometriumweefsel; uNK-cellen zijn bijvoorbeeld dichter geaggregeerd in de buurt van de basale laag van het baarmoederslijmvlies in vergelijking met gebieden in de buurt van de luminale holte²⁰. Deze beperkingen van conventionele IHC en flowcytometrie kunnen worden aangepakt door middel van m-IHC en het beeldanalyseplatform dat is geconjugeerd met machine learning-algoritmen om weefselsegmentatie, celsegmentatie en de identificatie van positieve cellen te bereiken. Deze aanpak verbetert de efficiëntie door tienduizenden cellen binnen enkele minuten te analyseren, minimaliseert de vooringenomenheid van waarnemers door automatisch positieve cellen te identificeren en maakt een nauwkeurigere analyse mogelijk met behulp van meerdere markers. Bovendien zijn er geen verse monsters nodig en kunnen batchexperimenten of herhaalde analyses worden uitgevoerd wanneer dat nodig is.

Het uitvoeren van een uitgebreide beoordeling van uNK-celfenotypes met behulp van de m-IHC-techniek kan een beter begrip geven van de correlatie tussen uNK-cellen en embryo-implantatie, evenals hun veranderingen bij vrouwen met RIF. Afgezien van uNK-cellen dragen ook andere endometrium-immuuncellen bij aan lokale immuunhomeostase. Regulerende T-lymfocyten (Treg-cellen) houden bijvoorbeeld de immuuntolerantie in stand door remmende factoren vrij te geven, zoals IL-10 en TGF-β, die de activiteit van Th1- en Th2-cellen onderdrukken²¹. De differentiatie van M2-macrofagen, gereguleerd door steroïden en Th2-cytokines, draagt bij aan de immunotolerante status door de arginaseactiviteit te verhogen en de productie van stikstofmonoxide te remmen²². Bovendien differentiëren dendritische cellen (DC's) tot volwassen tolerogene cellen in de baarmoeder, waardoor factoren zoals sFLT1 en TGF-β1 vrijkomen die vasculaire neogenese reguleren en de functie van CD8+ T-cellen remmen, waardoor de immuunhomeostase wordt gehandhaafd en de ontwikkeling van het embryo wordt ondersteund¹⁸. Net als uNK-cellen zijn deze immuuncellen ook heterogeen en kan een enkele marker hun fenotypes niet nauwkeurig identificeren. De toepassing van m-IHC voor het beoordelen van uNK-celsubsets illustreert het potentieel voor het identificeren van subsets van deze endometrium-immuuncellen.

Naast het baarmoederslijmvlies kan deze methode worden toegepast op verschillende weefsels voor het identificeren van fenotypes van immuuncellen. Bij het aanbrengen op andere weefsels zijn slechts kleine aanpassingen nodig om een optimale kleuring te garanderen. Bovendien, als onderzoekers van plan zijn bepaalde markers te vervangen, kan het originele paneel worden aangepast om aan de specifieke experimentele vereisten te voldoen. De veelzijdigheid en flexibiliteit van dit paneel maken het een aanpasbaar hulpmiddel voor het bestuderen van verschillende weefsels of verschillende celsubsets.

Deze technologie vergemakkelijkt niet alleen het begrijpen van de gedetailleerde veranderingen in endometriumimmuuncellen om het onderliggende mechanisme van endometrium-niet-ontvankelijkheid te ontleden, maar biedt ook potentieel voor de ontwikkeling van diagnostische tests. Het relatieve gemak waarmee paraffineblokken en -profielen kunnen worden verkregen en bewaard, heeft de weg vrijgemaakt voor het wijdverbreide gebruik van deze techniek. Met gestandaardiseerde kleurplaten kunnen ziekenhuizen gebruikmaken van geautomatiseerde kleuringstechnologie in combinatie met geavanceerde software-algoritmen om de efficiëntie van hun analyseprocedures aanzienlijk te verbeteren. De voordelen van m-IHC-technologie maken het een haalbare optie voor klinische praktijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CD49a	Novus Biologicals	NBP2-76478	Primaire antilichamen
CD56	Leica	NCL-L-CD56-504	Primaire antilichamen
CD16	abcam	ab183354	Primaire antilichamen
CXCR4	R&D	MAB172	Primaire antilichamen
Amplificatiediluent	Akoya Biosciences	FP1498 series	Fluorofoorverdunningsbuffer
Antilichaamverdunningen	Akoya Biosciences	ARD1001EA	Diluteer het antilichaam
Citraat gebufferde oplossing, pH 6,0 /9,0(10x)	Akoya Biosciences	A6001/A9001	Antigeenherstel oplossing
inForm geavanceerde beeldanalysesoftware	Akoya Biosciences	inForm Tissue Finder Software 2.2.6	Gegevensanalysesoftware
Mantra Workstations	Akoya Biosciences	CLS140089	Spectraal beeldvorming
Microgolfoven	Akoya Biosciences	omvormer	Microgolfstrippen
TSA 520	Akoya Biosciences	FP1487001K	Geschikt voor tyraamide-gebaseerde fluorescente reagentia
TSA 620	Akoya Biosciences	FP1495001K	Geschikt voor tyraamide-gebaseerde fluorescente reagentia
TSA 650	Akoya Biosciences	FP1496001K	Geschikt voor tyraamide-gebaseerde fluorescente reagentia
TSA 570	Akoya Biosciences	FP1488001K	Geschikt voor tyraamide-gebaseerde fluorescente reagentia
Poly-L-lysine gecoate slides	Fisher Technologies	120-550-15	Slides voor routinematig histologisch gebruik
PolyHRP Breed Spectrum	Perkin Elmer	ARH1001EA	Secundaire antilichamen
Invitrogen™ Fluoromount-G™ Montagemedium	ThemoFisher Science	495802	Installatie
Spectral DAPI	Akoya Biosciences	FP1490A	Nukleinzuurkleuring