Methodenartikel

Een toxicologische en ecotoxicologische test op basis van de hemocytenmotiliteit van mossel (Mytilus galloprovincialis)

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67285

⸱

13 december 2024

 ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences and Technologies (DiSTeBA), University of Salento, 2NBFC, National Biodiversity Future Center

In dit artikel

Samenvatting

Het artikel stelt een nieuwe in vitro methode voor voor de snelle en gevoelige beoordeling van de toxiciteit en ecotoxiciteit van polluenten, gebaseerd op de beweeglijkheid van Mytilus galloprovincialis hemocyten. De methode heeft tot doel bij te dragen tot de ontwikkeling van meer ethische en sensitieve toxicologische en ecotoxicologische blootstellingsproeven.

Samenvatting

Hemocyten zijn de circulerende immuuncompetente cellen in tweekleppige weekdieren en spelen een sleutelrol in verschillende belangrijke functies van celgemedieerde aangeboren immuniteit. Tijdens de vroege stadia van de immuunrespons migreren hemocyten actief naar de plaats van infectie. Deze inherente beweeglijkheid is een fundamenteel kenmerk van deze cellen. Het vertegenwoordigt een belangrijke cellulaire functie die meerdere processen integreert, zoals celadhesie, celsignalering, cytoskeletdynamiek en veranderingen in celvolume. Daarom kunnen veranderingen in de celmotiliteit na blootstelling aan geneesmiddelen of verontreinigende stoffen dienen als een nuttig toxicologisch eindpunt. Ondanks de fundamentele rol van celmotiliteit in de cellulaire fysiologie, is het vanuit een toxicologisch perspectief slecht onderzocht. Dit werk stelt een nieuwe in vitro methode voor voor de snelle en gevoelige beoordeling van de toxiciteit en ecotoxiciteit van verontreinigende stoffen, gebaseerd op de evaluatie van de hemocytmotiliteit van Mytilus galloprovincialis. We ontwikkelden een celmotiliteitstest op hemocyten die zich hechten aan de bodem van een polystyreenmicroplaat met 96 putjes. Na blootstelling aan toenemende concentraties geneesmiddelen werden celtrajecten en -snelheden gekwantificeerd door celtracking onder time-lapse-microscopie, waardoor we de effecten op de motiliteit van hemocyten konden meten. Vanwege het gemak waarmee hemocyten op een relatief niet-invasieve manier van de dieren kunnen worden verzameld, biedt de voorgestelde methode een alternatieve test voor het screenen van de effecten en werkingsmechanismen van verontreinigende stoffen en geneesmiddelen. Het sluit aan bij de 3V's (vervanging, vermindering en verfijning) criteria, pakt ethische bezwaren aan en draagt bij aan de vermindering van in vivo dierproeven met gewervelde dieren.

Inleiding

Op effecten gebaseerde methoden, zoals in-vitro- en in-vivo-bioassays, zijn innovatieve instrumenten voor de detectie van de effecten van chemische milieuverontreinigende stoffen in levende organismen en voor het gebruik ervan als instrumenten voor milieumonitoring en risicobeoordeling 1,2,3,4. Ze vormen een aanvulling op de klassieke analytisch-chemische benadering door enkele van zijn beperkingen te overwinnen. Op effecten gebaseerde methoden kunnen bijvoorbeeld de biologische beschikbaarheid van verontreinigende stoffen, hun impact op de gezondheid van organismen en de gecombineerde toxicologische effecten van mengsels beoordelen. Deze gecombineerde effecten zijn mogelijk niet voorspelbaar op basis van alleen chemische analyse5.

In de afgelopen jaren vertegenwoordigt de ecotoxicologie van opkomende verontreinigende stoffen (opkomende verontreinigende stoffen) een gebied waar op effecten gebaseerde methoden nuttige hulpmiddelen kunnen zijn voor het detecteren van blootstelling en het beoordelen van de impact op de biota 1,5,6,7. Verschillende effectgebaseerde methoden gebruiken tweekleppige weekdieren als testorganismen bij milieumonitoring en -beoordeling 8,9. Sommige kenmerken maken deze organismen geschikt voor ecotoxicologisch onderzoek, zoals hun brede verspreiding, hun filtervoedende aard, hun sessiele levensstijl, het vermogen tot bioaccumulatie van een breed scala aan milieuverontreinigende stoffen en het ontwikkelen van detecteerbare reacties op verontreinigende stoffen, de mogelijkheid om met verschillende levensfasen te werken en om onder laboratoriumomstandigheden te handhaven7. Ze zijn zeer gevoelig voor blootstelling aan vervuiling en vertonen een verscheidenheid aan reacties op giftige verontreinigingen, afhankelijk van de soort, de levensfase en de omgevingsomstandigheden 8,9,10. Daarom gebruiken verschillende milieurichtlijnen tweekleppige soorten als gestandaardiseerde testsoorten10,11.

Onder de tweekleppige weekdieren is de wijdverspreide Mytilus galloprovincialis een van de meest gebruikte soorten op ecotoxicologisch gebied vanwege zijn vermogen om vroege detecteerbare reacties te ontwikkelen op blootstelling aan chemische vervuiling, waaronder metallothioneïne-inductie, antioxidant-enzymverandering, lysosomale membraandestabilisatie, lipideperoxidatie, accumulatie van lipofuscine, verhoogde frequentie van micronuclei, koolzuuranhydrase-inductie 12,13,14, 15. okt. Hemocyten, de immunocompetente hemolymfatische cellen, worden veel gebruikt om de toxicologische effecten van milieuverontreinigende stoffen bij tweekleppige weekdieren te bestuderen 4,13,16,17. Deze cellen zijn cruciaal voor de immuunrespons van het organisme en voeren verschillende belangrijke functies van celgemedieerde aangeboren immuniteit uit. Deze omvatten de eliminatie van microben door fagocytose en verschillende cytotoxische reacties, zoals het vrijkomen van lysosomale enzymen, antimicrobiële peptiden en de productie van zuurstofmetabolieten tijdens de respiratoire uitbarsting 18,19,20. Hemocyten zijn intrinsiek beweeglijke cellen 21,22,23 die in staat zijn om tijdens het vroege stadium van de immuunrespons van het organisme naar de plaats van infectie te migreren. Over het algemeen is beweeglijkheid een fundamenteel kenmerk dat alle immuuncellen kenmerkt, omdat het de immunosurveillance van deze cellen mogelijk maakt om het lichaam te beschermen24. Onderzoek bij verschillende soorten weekdieren toont aan dat de beweeglijkheid van hemocyten een cruciaal onderdeel is van hun immuunrespons, wondgenezing en interactie met ziekteverwekkers. Deze beweeglijkheid wordt gereguleerd door specifieke moleculaire routes, wat de complexiteit en specialisatie van hemocytfuncties bij weekdieren benadrukt 21,25,26,27.

Ondanks het fundamentele belang van motiliteit in de fysiologie van hemocyten, hebben zeer weinig studies de gevoeligheid van de motiliteit van hemocyten voor chemische milieuverontreinigende stoffen onderzocht 23,28,29,30. Onlangs heeft onze groep de spontane beweging van Mytilus galloprovincialis-hemocyten gekarakteriseerd in een met weefselkweek behandelde microtiterplaat van polystyreen met 96 putjes en de gevoeligheid van de hemocytmotiliteit voor in vitro blootstelling aan paracetamol23 onderzocht. M. galloprovincialis hemocyten vertoonden een willekeurige-achtige celbeweging op basis van lamellipodia en snelle vormveranderingen, zoals eerder gevonden in een andere mosselsoort, Mytilus edulis 21,22,23,28, en al beschreven in menselijke immuuncellen 31. Van de motiliteit van hemocyten is onlangs aangetoond dat ze gevoelig zijn voor chemische stressoren23,28. Op basis van deze eerdere bevindingen stelt dit werk een nieuwe in vitro methode voor voor de snelle en gevoelige beoordeling van de toxiciteit en ecotoxiciteit van verontreinigende stoffen op basis van het evalueren van de beweeglijkheid van M. galloprovincialis hemocyten en de veranderingen ervan, door middel van velocimetrische analyse van de celmotiliteit (kwantificering van gemiddelde snelheid, gemigreerde afstand, Euclidische afstand en directheid). De methode biedt de mogelijkheid om in vitro de toxiciteit van verschillende stoffen te screenen, hetzij in kortetermijntesten (van 1-4 uur) of in tests met langdurige blootstelling, die 24-48 uur duren.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd onder de Italiaanse wetgeving inzake dierenwelzijn (D.L.26/2014) die de richtlijn van de Raad van het Europees Comité (2010/63 EEG) implementeerde. Mytilus galloprovincialis is een tweekleppige mossel die zich voedt met filters. Het is inheems in de Middellandse Zee en de Atlantische kust van Zuid-Europa. Het werd geïntroduceerd en is wijdverspreid in West-Noord-Amerika, Azië en Zuid-Afrika. Het is een belangrijke commerciële visserijsoort in verschillende delen van de wereld. De details van de gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Bereiding van kunstmatig zeewater (ASTM) of gefilterd natuurlijk zeewater

  1. Voor de bereiding van kunstmatig zeewater ASW volgens ASTM D1141-98 (2021)32, los de volgende zouten op in gedestilleerd water (g voor 1 L): 27,65 NaCl, 0,133 NaHCO3, 3,33 MgCl2· 6H2O, 2.66 Na2SO4, 0.733 CaCl2 · 2H2O, 0.466 KCl, 0.067 KBr, 0.02 H3BO3, 0.013 SrCl2·6H2O, 0.0019 NaF. De ASW-oplossing heeft een pH van 7,80.
  2. Voor de bereiding van gefilterd natuurlijk zeewater (FSW), filtreer natuurlijk zeewater 37 PSU, verzameld van een locatie die niet wordt beïnvloed door antropogene activiteiten met filters van 0,2 μm.

2. Acclimatisering van dieren

  1. Acclimatiseren volwassen mosselspecimens (Mytilus galloprovincialis Lam.) gedurende 24 uur in statische tanks (in hongersnood) met belucht ASW of FSW (1 l/dier) bij 15 °C in een thermostatische ruimte vóór experimenteel gebruik.

3. Reagenspreparaat voor de beoordeling van de motiliteit van hemocyten

  1. Bereid gefilterd zeewater (FSW) zoals hierboven of standaard fysiologische zoutoplossing (SPS). Los HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethaansulfonzuur) op 4,77 g, NaCl 25,48 g, MgSO4 13,06 g, KCl 0,75 g, CaCl2 1,47 g op in ongeveer 800 ml gedestilleerd water, vervolgens aangevuld tot 1 l door toevoeging van meer gedestilleerd water. Pas de pH aan op 7,36 met 1 M NaOH.
  2. Bereid een neutrale rode stamoplossing van 20 mg/ml in dimethylsulfoxide (DMSO).
  3. Bereid de neutrale rode kleuringsoplossing voor: Voeg 5 μl neutraal rode stockoplossing toe aan 995 μl FSW of SPS.
  4. Bereid FSW of SPS aangevuld met 2 mM L-glutamine, 40 IE/ml penicilline G en 100 μg/ml streptomycine als volgt: Voeg 100 μL 2 mM L-glutamine en 100 μL penicilline/Streptomycine mix toe aan 10 ml FSW/SPS.
  5. Bereid 0,4% Trypan blauw in FSW of SPS.
    OPMERKING: Neutrale rode voorraadoplossing werd bereid volgens Martínez-Gómez et al.33. De Neutral Red stockoplossing is ongeveer 2-3 weken houdbaar bij opslag bij 4 °C. Neutrale rode kleuringsoplossing en 0,4% trypanblauw moeten vlak voor de test worden bereid.

4. Bemonstering van hemolymfe

  1. Vul een spuit voor met 0,5 ml gefilterd zeewater FSW of standaard fysiologische zoutoplossing SPS (bij 15 °C).
  2. Wrik de kleppen langs het ventrale oppervlak lichtjes en voorzichtig uit elkaar met een scalpel. Houd het scalpel op zijn plaats of gebruik een pipetpunt. Laat de naald van een injectiespuit in de ruimte tussen de kleppen komen.
  3. Verzamel voorzichtig 0,5 ml hemolymfe uit de achterste adductorspier met de voorgevulde spuit volgens UNEP/RAMOGE34.
  4. Haal de naald uit de spuit en doe de inhoud van de spuit in een microbuisje.
  5. Verzamel de hemolymfe van 3-4 mosselen en bundel de hemolymfemonsters in een buis bij 15 °C met dezelfde verhouding tussen individuen.
    OPMERKING: Het voorvullen van de spuit wordt gebruikt om de hemolymfe tijdens de bemonstering onmiddellijk 1:1 te verdunnen. De verdunning van de hemolymfe met FSW of SPS in een verhouding van 50:50 wordt vaak gebruikt om hemocytenaggregatie te voorkomen, volgens Martínez-Gómez et al.33.

5. Hemocytenbeplating en cultuur

  1. Tel de cellen met een hemocytometer.
  2. Verdun de hemolymfe in een concentratie van 1 × 106 cellen/ml met FSW of SPS.
  3. Evalueer de levensvatbaarheid van hemocyten in suspensie door trypanblauwe kleuring: Voeg 100 μl 0,4% trypanblauw opgelost in FSW of SPS toe aan 100 μl hemocytensuspensie. Incubeer gedurende 5 minuten bij 15 °C.
  4. Voeg vervolgens een druppel suspensie toe aan een hemocytometer en tel de ongekleurde (levensvatbare) en gekleurde (niet-levensvatbare) cellen onder microscopieobservatie.
  5. Beoordeel de levensvatbaarheid van hemocyten als het percentage levensvatbare cellen berekend op het totale aantal getelde cellen35.
  6. Gebruik de volgende formule voor de beoordeling van de levensvatbaarheidvan cellen 35:
    Levensvatbare cellen (%) = [aantal levensvatbare cellen/totaal aantal cellen (levensvatbaar + niet-levensvatbaar)] x 100
  7. Zorg ervoor dat de levensvatbaarheid van de hemocyten hoger is dan 95% om verder te gaan in het protocol.
  8. Voeg 50 μL verdunde hemolymfe toe aan elk putje van een celcultuur 96-well polystyreen TC-behandelde microplaat met 96 putjes. Dek het bord af met het deksel.
  9. Laat de hemocyten zich gedurende 30 minuten bij 15 °C aan de bodem van de putjes hechten om een monolaag te vormen.
  10. Verwijder de overtollige hemolymfe door voorzichtig op te zuigen met een micropipet.

6. Test op korte termijn

  1. Voor kortetermijntests (binnen 1-4 uur) worden de cellen die aan de bodem van de putjes vastzitten, onmiddellijk geïncubeerd met 100 μl van de in FSW of SPS opgeloste stof in verschillende concentraties bij 15 °C. Gebruik ten minste drie putjes voor drie replicatiebepalingen van elke experimentele toestand.
  2. Beoordeel na de incubatie de beweeglijkheid van de cellen volgens stap 8.

7. Test op langdurige blootstelling

  1. Bij langdurige blootstelling, d.w.z. 24-48 uur blootstellingstests, worden de gekweekte adherente cellen geïncubeerd met toenemende concentraties van de teststof opgelost in de kweekbodem (FSW of ASW) aangevuld met 2 mM L-glutamine 40 IE/ml penicilline G en 100 μg/ml streptomycine) bij 15 °C. Gebruik ten minste drie putjes voor drie replicatiebepalingen van elke experimentele toestand.
  2. Beoordeel na de incubatie de beweeglijkheid van de cellen volgens stap 8.

8. Beoordeling van de celmotiliteit door middel van time-lapse-microscopie

  1. Plaats de multiwell-plaat met de aanhangende levende hemocyten in een multimode-lezer.
  2. Beoordeel de beweeglijkheid van de aanhangende levende cellen door middel van real-time beeldvorming op de plaat door middel van time-lapse-microscopie: leg beelden vast van hetzelfde interessegebied (ROI) (dimensie van de gebruikte ROI: 720 μm x 720 μm) in elk putje met een snelheid van 1 beeld elke 1 minuut gedurende 10 minuten met behulp van de multimode-lezer onder een vergroting van 20x en helderveldvisualisatie in kleur.
  3. Voor een betere visualisatie van de hemocyten, kleurt u de cellen met de vitale kleurstof Neutral Red vlak voor de time-lapse-microscopie als volgt:
    1. Verwijder het incubatiemedium uit elk putje.
    2. Voeg 100 μl kleuringsoplossing van Neutral Red, opgelost in standaard fysiologische zoutoplossing met de betreffende stof, toe aan de putjes van de plaat met de aanhangende cellen.
    3. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij 15 °C. Was de overtollige kleurstof eruit.
    4. Voeg 100 μL van de in FSW of SPS opgeloste stof toe. Visualiseer de cellen voor motiliteitsbeoordeling.
      OPMERKING: Het gebruik van een multimode-lezer maakt het mogelijk om gelijktijdig beelden te verkrijgen van een groot aantal putten, waardoor gelijktijdige motiliteitsdetectie van alle experimentele omstandigheden en replica's in de put mogelijk is. De neutrale rode kleurstof wordt vastgehouden in de lysosomen, die verschijnen als kleine oranje vlekjes in het cytoplasma, terwijl de kern verschijnt als een doorschijnend gat omdat de vitale kleurstof acidophilus deze niet kleurt. De beeldacquisitie werd gedurende 10 minuten gedaan bij een kamertemperatuur van 20 °C.

9. Berekening van celtracking en velocimetrische parameters

  1. Analyseer de frames van hetzelfde interessegebied verkregen onder time-lapse-microscopie door afbeelding J voor elke put.
  2. Sla de afbeeldingen op in een map zonder spaties in de naam. De afbeeldingen kunnen in JPEG- of PNG-formaat zijn.
  3. Open afbeeldingJ. Klik op Bestand > Importeer > afbeeldingsreeks.
  4. Voer celtracering uit op afzonderlijke cellen met behulp van de plug-in Handmatige tracking van ImageJ. De posities van individuele cellen zijn gemarkeerd in opeenvolgende afbeeldingen, waardoor positieveranderingen in de loop van de tijd kunnen worden gevolgd.
  5. Analyseer ten minste 40 cellen per put, met uitzondering van cellen die uit het geregistreerde veld ontsnappen uit de analyse.
  6. Importeer datasets van de ImageJ-plug-in, "Manual Tracking", in de gratis beschikbare Chemotaxis en Migration Tool-software.
  7. Kwantificeer velocimetrische parameters zoals gemiddelde snelheid, Euclidische afstand, gemigreerde afstand en directheid met behulp van de Chemotaxis and Migration Tool-software volgens de gedetailleerde instructies die worden gerapporteerd in de gratis beschikbare gebruikershandleiding van de software36of de onderstaande stappen:
    1. Importeer datasets van de ImageJ-plug-in "Manual Tracking" in de Chemotaxis and Migration Tool-software.
    2. Selecteer het gewenste aantal segmenten (bijvoorbeeld het aantal afbeeldingen dat is gebruikt voor tracking).
    3. Kalibreer de software door de x/y-pixelgrootte en het tijdsinterval in te stellen. De x/y-kalibratie geeft de randlengte van een pixel aan in μm, terwijl het tijdsinterval de duur tussen elke plak weergeeft.
    4. Klik na het aanpassen van de waarden en parameters op Instellingen toepassen.
    5. Plot trajecten en exporteer als afbeelding. Klik op de knop Gemeten waarden om de gemeten waarden te zien. Sla het op.
    6. Klik op de knop Statistieken en sla de snelheid en directheid van de baanserie op.
  8. Vergelijk de velocimetrische parameters die voor controlecellen zijn berekend met die van hemocyten die in verschillende concentraties aan de teststof zijn blootgesteld.
    OPMERKING: De gemigreerde afstand (gemeten in μm) verwijst naar de lengte van het migratiepad tijdens de observatieperiode (10 min). De Euclidische afstand (ook gemeten in μm) geeft de afstand in rechte lijn weer tussen het beginpunt en het eindpunt van de cel. De gemiddelde snelheid (uitgedrukt in μm min-1) wordt berekend als de verhouding tussen de gemigreerde afstand en de duur van het volgen van de cel voor elke cel. Directheid wordt gedefinieerd als de verhouding tussen de Euclidische afstand en de geaccumuleerde afstand voor elk traject.

Resultaten

De studie introduceert een nieuwe in vitro methode voor het snel en gevoelig beoordelen van de toxiciteit en ecotoxiciteit van verontreinigende stoffen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de beweeglijkheid van Mytilus galloprovincialis hemocyten. Figuur 1A-C toont representatieve time-lapse-beeldvorming van hemocyten na 30 minuten bevestiging aan de bodem van de put. De cellen in de figuur werden vlak voor de motiliteitsbeoordeling gekleurd met neutraal rood. Celbewegingen werden gevolgd met behulp van optische microscopie met een snelheid van één beeld per minuut gedurende 10 minuten, onder een vergroting van 20x, met een multimode-lezer. Afbeelding 1A-C toont drie van de 11 frames die zijn vastgelegd vanuit hetzelfde interessegebied (ROI) op 0 min, 5 min en 10 min. Dezelfde cellen zijn genummerd in alle drie de figuren om hun beweging te markeren, en de nummering blijft consistent over de figuren om hun banen duidelijk te illustreren.

De cellen vertonen eencellige bewegingen op basis van lamellipodia-activiteit en snelle vormveranderingen. De cellen werden gelabeld met de vitale kleurstof Neutral Red om hun visualisatie tijdens het volgen te verbeteren. Neutraal rood is een amfifiele en zwakke kationische kleurstof die gemakkelijk het celmembraan kan doordringen. Eenmaal in de cellen komt de kleurstof vast te zitten in de lysosomen als gevolg van protonering. Mosselhemocyten, met name granulocyten, vertonen een goed ontwikkeld lysosomaal systeem; daarom worden ze goed gevisualiseerd door neutrale rode kleuring, waarbij het cytoplasma rijk is aan verschillende rood gelabelde lysosomen en de kern (niet gemarkeerd door de kleurstof) verschijnt als een doorschijnend gat.

Door de toepassing van het protocol kunnen volgens Udayan et al.23 twee belangrijke hemocytmorfotypes worden waargenomen: (1) verspreide cellen met een bipolaire boonvorm en soms een amoeboïde omtrek, en kleinere ronde stervormige cellen (cellen n = 3 en 10). In beide celtypen werd beweging gekenmerkt door continue vormveranderingen, met voortdurende uitbreiding en intrekking van pseudopodia en filopodia.

De protocoltoepassing maakt een succesvolle beoordeling van de hemocytmotiliteit mogelijk door trajectdiagrammen te construeren, zoals gerapporteerd in figuur 2, en door de belangrijkste velocimetrische parameters zoals gemiddelde snelheid en directheid te berekenen. Deze kwamen respectievelijk overeen met 6,46 ± 0,2 μm/min en 0,56 ± 0,02 (gemiddelde ± SEM) voor verspreide cellen en 5,18 ± 0,34 μm/min en 0,37 ± 0,03 voor kleine cellen, respectievelijk onder basale fysiologische omstandigheden na 30 minuten hechting aan de bodem van de put. Daarom maakt het protocol de classificatie van verschillende hemocytenpopulaties mogelijk op basis van velocimetrische parameters.

Door de toepassing van het protocol kunnen veranderingen in de velocimetrische parameter van de motiliteit van hemocyten worden gedetecteerd na blootstelling aan geneesmiddelen of verontreinigende stoffen. Figuur 3A-D toont representatieve resultaten van de in vitro blootstelling van mosselhemocyten aan paracetamol, een van de geneesmiddelen die in het milieu (PiE) vrijkomen met de hoogste concentratie en de hoogste detectiefrequenties in rivieren over de hele wereld31.

Volgens Udayan et al.23 werd in controlecellen een significante toename van de snelheid in de loop van de tijd waargenomen in beide celmorfotypes, wat wijst op activering van hemocyten tijdens de 24-uurs kweek, vermoedelijk suggestief voor de ontstekingsreactie die experimenteel wordt geïnduceerd door terugtrekking en plating in de kweekomgeving. Wanneer de cellen werden blootgesteld aan het geneesmiddel, was de motiliteitsactivering van de hemocyten significant verminderd in gespreide cellen (Figuur 3A) na 24 uur, maar niet in kleine ronde cellen (Figuur 3C), gekenmerkt door een lagere gemiddelde basale snelheid (zoals beoordeeld op tijdstip 0). Bovendien maakte het protocol de detectie van veranderingen in de celbaan na blootstelling aan geneesmiddelen mogelijk, zoals blijkt uit de significante toename van de directheid van kleine cellen na 24 uur en de afname van de directheid na blootstelling van 1 uur in verspreide cellen (Figuur 3C,D).

figure-results-1
Figuur 1: Representatieve time-lapse-beeldvorming van neutrale rood gekleurde hemocyten na 30 minuten bevestiging aan de bodem van de put. De cellen werden vlak voor de motiliteitsbeoordeling gekleurd met de vitale kleurstof Neutral Red. Celbewegingen werden gevolgd met behulp van optische microscopie met een snelheid van één beeld per minuut gedurende 10 minuten bij een vergroting van 20x. Kortheidshalve geven de panelen A, B en C drie van de 11 frames weer die zijn vastgelegd uit hetzelfde interessegebied (ROI) op 0 min, 5 min en 10 min. Dezelfde cellen zijn genummerd in alle drie de figuren om hun beweging te illustreren, en pijlen geven de tijdsintervallen aan. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Representatieve trajectplot van M. galloprovincialis hemocyten. De getoonde trajecten komen uit een enkele put. De banen van 25 cellen worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Effect van blootstelling aan paracetamol (24 uur) op de snelheid en directheid van verspreide cellen (A,B) en kleine ronde stervormige cellen (C,D). De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. De statistische significantie van de gegevens werd beoordeeld door middel van eenrichtingsverkeer ANOVA en Tukey's post-test. *p < 0,05 vs. controle (p < 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het protocol dat in dit werk wordt beschreven, vertegenwoordigt een nieuwe in vitro methode die geschikt is voor de snelle en gevoelige beoordeling van de toxiciteit van geneesmiddelen en verontreinigende stoffen op basis van het evalueren van de beweeglijkheid van M. galloprovincialis hemocyten en de veranderingen ervan. Motiliteit is een eigenaardig aspect van de immuunfunctie van deze cellen 21,22,23,37,38, daarom kan elke verandering in de celmotiliteit veranderingen in de immuunfunctie van deze cellen voorspellen. Motiliteit is een essentiële cellulaire functie die verschillende cellulaire processen integreert, zoals celadhesie, celsignalering, cytoskeletactiviteit, intracellulaire signalering en regulering van het celvolume, en vereist de integratie en coördinatie van complexe biochemische en biomechanische signalen 39,40,41. Elk van deze processen of de componenten van elk proces kunnen potentiële doelwitten zijn van de toxische werking van medicijnen en verontreinigende stoffen. Daarom vertegenwoordigen veranderingen in beweeglijkheid in de celsnelheid en/of het traject gevoelige eindpunten die de effecten op meerdere cellulaire doelen integreren.

Het protocol is geschikt voor de in vitro beoordeling van de effecten van teststoffen, hetzij in kortetermijntesten (die 1-4 uur duren) of langdurige blootstellingstests die 24-48 uur duren, waardoor verontreinigende stoffen en geneesmiddelen snel kunnen worden gescreend op mogelijke toxische effecten. Door gebruik te maken van een plaat met 96 putjes, maakt de methode het mogelijk om gelijktijdig meerdere stoffen of verschillende concentraties van een enkele stof te testen, waardoor tijd en reagentia worden bespaard. Daarnaast kan het protocol ook worden aangepast om te worden gebruikt met andere apparatuur, zoals een fasecontrastmicroscoop of fluorescentiemicroscoop. In dit geval kunnen cellen worden afgebeeld zonder enige vlek of met behulp van fluorescerende vitale kleurstoffen.

Hoewel de methode nieuwe en gevoelige alternatieven biedt voor toxicologische screening, moet met enkele beperkingen van de methode rekening worden gehouden voor bredere toepassingen. Ten eerste is temperatuur een cruciaal aspect van de protocoltoepassing. Het is bekend dat mosselhemocyten gevoelig zijn voor temperatuurveranderingen. De effecten van temperatuur op hemocyten zijn complex, waarbij hoge en lage temperaturen een negatieve invloed hebben op hun immuunfuncties 42,43,44. Zoals waargenomen tijdens het instellen van de methode, is de kritieke fase met betrekking tot het effect van temperatuur op de celmotiliteit de voorbereidende fase van celoogst, adhesie en teelt op het substraat, die de acclimatisatietemperatuur van de organismen moet volgen. Temperatuurstijgingen van enkele graden tijdens deze eerste fase boven de acclimatisatietemperatuur kunnen van cruciaal belang zijn voor het verkrijgen van de vorm en beweeglijkheid van de verspreide cel. Daarom wordt een temperatuur van 15 °C aanbevolen voor het kweken van hemocyten. De time-lapse-beeldacquisitie voor de beoordeling van de motiliteit werd gedurende 10 minuten uitgevoerd bij een kamertemperatuur van 20 °C. Op basis van voorlopige observatie tijdens het opzetten van de methode, verandert de blootstelling van gekweekte cellen gedurende dit tijdsinterval bij 20 °C de hemocytmotiliteit niet significant. Een andere beperking van de methode is het handmatig volgen van hemocyten, wat gebruikersafhankelijke variabiliteit kan introduceren en veel tijd en aandacht voor detail vereist. Het gebruik van de vitale kleurstof neutraal rood verbetert echter de visualisatie van de cellen en op zijn beurt de celtracering door de visualisatie van het goed ontwikkelde lysosomale systeem. De kern is niet gekleurd door de kleurstof en verschijnt als een leeg gat dat gemakkelijk herkenbaar en gemakkelijk aan te wijzen is tijdens het handmatig volgen van cellen. Een andere beperking van de methode heeft te maken met het in vitro karakter ervan. Hoewel de in vitro conditie een gecontroleerde omgeving biedt voor het beoordelen van de beweeglijkheid, is het mogelijk dat deze de complexe interacties en reacties die in vivo optreden niet volledig repliceert, met name binnen immuunresponsen van het hele organisme.

In de afgelopen jaren zijn nieuwe benaderingen en methodologieën gemeengoed geworden in de biowetenschappen, met als doel de resultaten te verbeteren en de afhankelijkheid van dierproeven te verminderen45. Het protocol biedt een alternatieve gevoelige test voor in vitro screening van de effecten en werkingsmechanismen van verontreinigende stoffen en geneesmiddelen om snel de toxicologische effecten te screenen van chemische contaminanten die, individueel of in mengsels, aanwezig zijn in milieumatrices. Het richt zich op een nieuw eindpunt, de beweeglijkheid van cellen van het immuunsysteem, die een geïntegreerd antwoord kunnen bieden op de toxicologische effecten die worden uitgeoefend door medicijnen en verontreinigende stoffen op verschillende cellulaire doelen. In die zin breidt het het scala aan in vitro tests uit dat in de literatuur beschikbaar is, ook vanuit het perspectief van een geïntegreerde multi-assay-benadering voor toepassing in milieubiomonitoring. Sommige kenmerken van het protocol sluiten aan bij de 3R-criteria (vervanging, vermindering en verfijning), wat bijdraagt aan de vermindering van in vivo dierproeven met gewervelde dieren en aan de ontwikkeling van een meer ethische en efficiënte toxicologische en ecotoxicologische blootstellingstoxiciteitstest. Deze kenmerken omvatten de gemakkelijke hemolymfe verzameling van mosselen op een nederig invasieve manier, de kleine hoeveelheid hemolymfe die nodig is voor het testen en het gebruik van een multiwell-plaat, die gelijktijdige blootstelling van meerdere toxische concentraties en replicaten mogelijk maakt, wat aanzienlijke besparingen in tijd en reagentia oplevert.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door het project "Dipartimento di Eccellenza" dat aan DiSTeBA werd toegekend door het Italiaanse Ministerie van Universiteit en Onderzoek, CUP: F85D18000130001, en door NBFC (National Biodiversity Future Center), gefinancierd door NextGenerationEU van de Europese Unie, PNRR, project n. CN00000033. We danken ook de BIOforIU-infrastructuur van het Department of Biological and Environmental Sciences and Technologies van de Universiteit van Salento.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 µm filter (diameter 25 mm)ABLUO labware
2.5 ml hypodermic syringe needdle 22GRays2522CM32labware
96-well flat-bottom polystyrene TC-treated microplateCorning3916labware
CaCl2.2H2OMerk (Sigma - Aldrich) C3881-1KGChemisch
Chemotaxis and Migration Tool software (Ibidi GmbH)software
Cytation 5 Agilent BioTeckCytation 5Equipment: Cel imaging multimode reader
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merk (Sigma - Aldrich) 472301Solvent
Falcon 15 mL Tube Conical BottomCorning352196labware
H3BO3Merk (Sigma - Aldrich) B0394Chemisch
Hemocytometer Fast read 102BiosigmaBVS100labware
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid)Merk (Sigma - Aldrich) H3375-500GChemisch
ImageJ softwareNIHsoftware
KBrMerk (Sigma - Aldrich) P9881Chemisch
KClMerk 104936Chemisch
L-glutamineMerk (Sigma - Aldrich) G7513Essentiële aminozuur voor celcultuurmedium
MgCl2·6H2OMerk (Sigma - Aldrich) M2670Chemisch
MgSO4Merk (Sigma - Aldrich) M7506Chemisch
Microscope Nikon Eclipse E600NikonEquipment: Cel imaging 
Na2SO4Riedel-de Haen31481Chemisch
NaClMerk (Sigma - Aldrich) 31434-1KG-RChemisch
NaFFluka71519 500gChemisch
NaHCO3Merk (Sigma - Aldrich) S5761-1KGChemisch
Neutral RedMerk (Sigma - Aldrich) N4638-1GVitaal celkleurstof
Penicillin/StreptomycinMerk (Sigma - Aldrich) P0781-100MLAntibiotica voor celcultuur
SrCl2·6H2OMerk (Sigma - Aldrich) 255521Chemisch
Trypan blue Merk (Sigma - Aldrich) T8154Celkleurstof

Referenties

  1. Di Paolo, C., et al. Bioassay battery interlaboratory investigation of emerging contaminants in spiked water extracts - Towards the implementation of bioanalytical monitoring tools in water quality assessment and monitoring. Water Res. 104, 473-484 (2016).
  2. Brack, W., et al. Effect-based methods are key. The European Collaborative Project SOLUTIONS recommends integrating effect-based methods for diagnosis and monitoring of water quality. Environ Sci Eur. 31 (1), 10(2019).
  3. Lionetto, M. G., Caricato, R., Erroi, E., Giordano, M. E., Schettino, T. Potential application of carbonic anhydrase activity in bioassay and biomarker studies. Chem Ecol. 22 (sup1), S119-S125 (2006).
  4. Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E. Pollution biomarkers in the framework of marine biodiversity conservation: State of art and perspectives. Water. 13 (13), 1847(2021).
  5. Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment. Sensors. 12 (9), 12741-12771 (2012).
  6. Fabbri, E., Valbonesi, P., Moon, T. W. Pharmaceuticals in the marine environment: Occurrence, fate, and biological effects. Contaminants of Emerging Concern in the Marine Environment. León, V. M., Bellas, J. Chapter 2, Elsevier. Amsterdam. 11-71 (2023).
  7. Lionetto, F., et al. Autofluorescence of model polyethylene terephthalate nanoplastics for cell interaction studies. Nanomaterials. 12 (9), 1560(2022).
  8. Damiens, G., Gnassia-Barelli, M., Loquès, F., Roméo, M., Salbert, V. Integrated biomarker response index as a useful tool for environmental assessment evaluated using transplanted mussels. Chemosphere. 66 (3), 574-583 (2007).
  9. Ogidi, O. I., Onwuagba, C. G., Richard-Nwachukwu, N. Biomonitoring tools, techniques and approaches for environmental assessments. Biomonitoring of Pollutants in the Global South. Izah, S. C., Ogwu, M. C., Hamidifar, H. , Springer. Singapore. (2024).
  10. Rosner, A., et al. A broad-taxa approach as an important concept in ecotoxicological studies and pollution monitoring. Biol Rev. 99 (1), 131-176 (2024).
  11. Gagné, F., Burgeot, T. Bivalves in ecotoxicology. Encyclopedia of Aquatic Ecotoxicology. , 247-258 (2013).
  12. Caricato, R., et al. Carbonic anhydrase integrated into a multimarker approach for the detection of the stress status induced by pollution exposure in Mytilus galloprovincialis: A field case study. Sci Total Environ. 690, 140-150 (2019).
  13. Calisi, A., et al. Morphological and functional alterations in hemocytes of Mytilus galloprovincialis exposed in high-impact anthropogenic sites. Mar Environ Res. 188, 105988(2023).
  14. Viarengo, A., Burlando, B., Evangelisti, V., Mozzone, S., Dondero, F. Sensitivity and specificity of metallothionein as a biomarker for aquatic environment biomonitoring. Biomarkers in Marine Organisms. Garrigues, F., Barth, H., Walker, C. H., Narbonne, J. F. , Elsevier Science. Amsterdam. 29-43 (2001).
  15. Bocchetti, R., et al. Contaminant accumulation and biomarker responses in caged mussels, Mytilus galloprovincialis, to evaluate bioavailability and toxicological effects of remobilized chemicals during dredging and disposal operations in harbor areas. Aquat Toxicol. 89 (3), 257-266 (2008).
  16. Calisi, A., Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E., Schettino, T. Morphometric alterations in Mytilus galloprovincialis granulocytes: A new biomarker. Environ Toxicol Chem. 26 (6), 1435-1441 (2007).
  17. Burgos-Aceves, M. A., Faggio, C. An approach to the study of the immunity functions of bivalve haemocytes: Physiology and molecular aspects. Fish Shellfish Immunol. 67 (6), 513-517 (2017).
  18. Canesi, L., et al. Tyrosine kinase-mediated cell signaling in the activation of Mytilus hemocytes: Possible role of STAT-like proteins. Biol Cell. 95 (9), 603-613 (2003).
  19. Novas, A., Barcia, R., Ramos-Martínez, J. I. Nitric oxide production by hemocytes from Mytilus galloprovincialis shows seasonal variations. Fish Shellfish Immunol. 23 (4), 886-891 (2007).
  20. Pruzzo, C., Gallo, G., Canesi, L. Persistence of vibrios in marine bivalves: The role of interactions with hemolymph components. Environ Microbiol. 7 (5), 761-772 (2005).
  21. Le Foll, F., et al. Characterization of Mytilus edulis hemocyte subpopulations by single-cell time-lapse motility imaging. Fish Shellfish Immunol. 28 (2), 372-386 (2010).
  22. Rioult, D., Lebel, J. -M., Le Foll, F. Cell tracking and velocimetric parameters analysis as an approach to assess activity of mussel (Mytilus edulis) hemocytes in vitro. Cytotechnology. 65 (5), 749-758 (2013).
  23. Udayan, G., Giordano, M. E., Pagliara, P., Lionetto, M. G. Motility of Mytilus galloprovincialis hemocytes: Sensitivity to paracetamol in vitro exposure. Aquat Toxicol. 265, 106779(2023).
  24. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
  25. Ivanina, A., Falfushynska, H., Beniash, E., Piontkivska, H., Sokolova, I. Biomineralization-related specialization of hemocytes and mantle tissues of the Pacific oyster Crassostrea gigas. J Exp Biol. 220 (18), 3209-3221 (2017).
  26. Furukawa, F., et al. Hemocyte migration and expression of four Sox genes during wound healing in Pacific abalone, Haliotis discus hannai. Fish Shellfish Immunol. 117, 24-35 (2021).
  27. Lau, Y., Gambino, L., Santos, B., Espinosa, E., Allam, B. Regulation of oyster (Crassostrea virginica) hemocyte motility by the intracellular parasite Perkinsus marinus: A possible mechanism for host infection. Fish Shellfish Immunol. 78, 18-25 (2018).
  28. Gendre, H., et al. Modulation of hemocyte motility by chemical and biological stresses in Mytilus edulis and Dreissena polymorpha. Fish Shellfish Immunol. 139, 108919(2023).
  29. Kaloyianni, M., et al. Oxidative effects of inorganic and organic contaminants on haemolymph of mussels. Comp Biochem Physiol C: Toxicol Pharmacol. 149 (4), 631-639 (2009).
  30. Sendra, M., et al. Nanoplastics: From tissue accumulation to cell translocation into Mytilus galloprovincialis hemocytes. Resilience of immune cells exposed to nanoplastics and nanoplastics plus Vibrio splendidus combination. J Hazard Mater. 388, 121788(2020).
  31. Pizzagalli, D. U., Pulfer, A., Thelen, M., Krause, R., Gonzalez, S. F. In vivo motility patterns displayed by immune cells under inflammatory conditions. Front Immunol. 12, 804159(2021).
  32. ASTM D1141-98. Standard Practice for Preparation of Substitute Ocean Water. , (2021).
  33. Martínez-Gómez, C., Bignell, J., Lowe, D. Lysosomal membrane stability in mussels. ICES Techniques in Marine Environmental Sciences. 56, 1-41 (2015).
  34. UNEP/RAMOGE. Manual on the biomarkers recommended for the MED POL Biomonitoring Programme. UNEP. , Athens. (1999).
  35. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  36. Asano, Y., Horn, E. Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0 Version 1.1. , (2013).
  37. Wilkinson, J. L., et al. Pharmaceutical pollution of the world's rivers. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (8), e2113947119(2022).
  38. Parisi, M. G., Pirrera, J., La Corte, C. Effects of organic mercury on Mytilus galloprovincialis hemocyte function and morphology. J Comp Physiol B. 191 (1), 143-158 (2021).
  39. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  40. Bailly, M., Condeelis, J. Cell motility: Insights from the backstage. Nat Cell Biol. 4 (5), E292-E294 (2002).
  41. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol Rev. 94 (1), 235-263 (2014).
  42. Mosca, F., et al. Effects of high temperature and exposure to air on mussel (Mytilus galloprovincialis, Lmk 1819) hemocyte phagocytosis: Modulation of spreading and oxidative response. Tissue Cell. 45 (3), 198-203 (2013).
  43. Beaudry, A., et al. Effect of temperature on immunocompetence of the blue mussel (Mytilus edulis). J Xenobiot. 6 (1), 5889(2016).
  44. Wu, F., et al. Combined effects of seawater acidification and high temperature on hemocyte parameters in the thick shell mussel Mytilus coruscus. Fish Shellfish Immunol. 56, 554-562 (2016).
  45. Schmeisser, S., et al. New approach methodologies in human regulatory toxicology - Not if, but how and when. Environ Int. 178, 108082(2023).

Herprints en machtigingen

Tags

Mobiliteit van hemocytenmosselhemocytentoxiciteitsassayecotoxicologische assayceltrackingtime-lapse microscopiemilieubiomonitoringcelmigratieimmuunrespons
Een toxicologische en ecotoxicologische test op basis van de hemocytenmotiliteit van mossel (Mytilus galloprovincialis)
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.