We bieden een stapsgewijs protocol voor het beoordelen van populierenresistentie tegen stengelkankerpathogenen met behulp van een in vivo bladinoculatiemethode. Deze methode is vooral geschikt voor grootschalige beoordeling van resistentie tegen de ziekte van Cytospora chrysosperma en Botryosphaeria dothidea kanker bij nageslacht van populierenfokkers in China.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In vivo bladinoculatie: een alternatieve methode om de ziekteresistentie van hybride klonen in de populierenveredeling van stengelkankerziekte te beoordelen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Stamkankerziekten veroorzaakt door de ziekteverwekker Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr.) en Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. & de Not. zijn de twee belangrijkste bosziekten in de populierenplantages in China, die soms alle populierenzaailingen kunnen vernietigen of volwassen populierenbossen ernstig kunnen beschadigen. Hybride veredeling is de meest directe en efficiënte methode om boomziekten te bestrijden en te beheren. Het beoordelen van ziekteresistentie of het selecteren van klonen van ziekteresistentie op basis van in-vitrostaminoculatie is echter inefficiënt, tijdrovend en duur, waardoor de ontwikkeling van hybride veredeling van populierenstengelkankerziekte wordt beperkt. In deze studie hebben we een alternatieve methode voorgesteld om ziekteresistentie tegen stengelkankerpathogenen te beoordelen door middel van in vivo bladinoculatie. Het testmateriaal dat bij deze methode wordt gebruikt, kan worden gebruikt op 1-jarige populierenboompjes of de eenjarige takken van meerjarige populieren in de kas of op het veld. De cruciale stap van deze alternatieve methode is de selectie van inoculerende bladeren: de 5-7epas gerijpte bladeren zijn misschien het meest geschikt. De tweede cruciale stap van de bladinoculatiemethode is het maken van wonden op plantenbladeren door middel van naaldprikken, waardoor voldoende laesies worden verkregen om de ernst van de ziekte te meten. Voor een adequaat aantal bladeren dat in het vroege stadium van de populierenteelt wordt geproduceerd, draagt deze in vivo bladinoculatie bij aan de snelle, nauwkeurige en grootschalige screening van de ziekteresistente populierklonen op stengelkankerpathogenen. Bovendien zal deze bladinoculatiemethode ook dienen als een efficiënte methode voor het screenen van pathotypes van stengelkankerziekteverwekker C. chrysosperma, B.dothidea of andere pathogenen van populierenstengelkanker.
Inleiding
Aften van populierenstam, voornamelijk veroorzaakt door twee necrotrofe pathogenen, Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr. en Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. & de Not., vormen een ernstige bedreiging voor de ontwikkeling en het voortbestaan van populierenplantages in het noordoosten, noorden en noordwesten (drie-noord) van China. Hybride veredeling is de meest directe en efficiënte methode om boomziekten te bestrijden en te beheren; Vergeleken met de vooruitgang in de veredeling van hoogproductieve, snelgroeiende of andere populierenhybride klonen, is onderzoek naar resistentieveredeling tegen populierenkanker echter schaars. Er zijn slechts beperkte studies gerapporteerd naar ziekteresistente hybride veredeling 1,2,3, en er is geen kankerresistente hybride kloon gekweekt in populierenbebossing.
De cruciale stap van reguliere hybride veredeling is de kloonselectie op basis van de fenotype-acquisitie van hybride nakomelingen. Het verwerven van pathologische fenotypes (pathotypes) is echter tijdrovend, arbeidsintensief, vermoeiend, duur en afhankelijk van experts. Voor houtachtige planten is het een grotere uitdaging vanwege de tijd-, arbeids- en zuinige aard die wordt veroorzaakt door hun lange levenscyclus, langzame groei en massieve lichaam. Bij populier bijvoorbeeld werd 5-7 jaar na hybridisatie de screening op kankerresistentie van hybride nakomelingen uitgevoerd met behulp van conventionele in vitro staminoculatiemethoden 1,2,3. Bovendien hebben onderzoekers, beperkt door deze ziekteresistente screeningsmethode met een lage efficiëntie en een hoge consumptie, de kankerresistente klonen opnieuw geselecteerd uit een kleine subgroep (bijvoorbeeld de geselecteerde klonen met een hoge opbrengst of snelgroeiende populier), niet uit alle hybride nakomelingen. Daarom is het met behulp van de reguliere staminoculatiemethoden niet zeker om de authentieke resistente klonen te identificeren en kan het de ziekteresistente diversiteit van het foknageslacht niet onthullen, waardoor de exploratie van ziekteresistentiegerelateerde genen of genmodules wordt beperkt. Vergeleken met de snelle ontwikkeling van populierenveredeling met snelgroeiende/hoogproductieve fokkerij, kunnen die veredelingsprogramma's hybriden verkrijgen door fenotypische selectie of zelfs genomische selectie in de eerste twee jaar van de fokkerij4, de populierenkankerresistentie veredeling ontwikkelde zich langzaam. De ziekteresistente screening (of detectie) van hybride nakomelingen, of de pathogeneninoculatiemethode, is de cruciale snelheidsbeperkende stap geworden in de veredeling van resistentie tegen populierenkanker.
In dit protocol introduceren we een nieuwe inoculatiemethode voor pathogenen van populierenstengelkanker, de in vivo bladinoculatiemethode. Met deze methode kunnen we snel en efficiënt de resistentie tegen kankerziekte van tientallen populierensoorten (cultivars of klonen) binnen 5-7 dagen testen. De validatietest illustreerde dat de in vivo bladinoculatie consistent is met de traditionele in vitro stengelinoculatie op de resistentiedetectie van stengelkankerziekte, wat suggereert dat de bladinoculatiemethode geschikt is voor grootschalige resistentiescreening van populierenkankerziekten, zoals de volledige genotypeselectie van resistentienakomelingen bij de fokkerij van stengelkankerziekte. Deze methode lost het pathologische probleem op van het selecteren van resistente nakomelingen in de hybride veredeling van populierenkankerziekten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Schimmelcultuur voor kankerpathogeen
- Bereid het aardappeldextrose-agar (PDA; aardappelextractie 6,0 g, dextrose 20,0 g, agar 20,0 g) kweekmedium voor schimmelstammen; los de bovenstaande materialen op in water tot 1000 ml, los het medium volledig op bij 100 °C gedurende 10 minuten.
- Giet PDA-medium in buisjes van 25 ml (elk met 15,0 ml); steriliseer alle buisjes bij 121,1 °C gedurende 30 minuten. Giet het medium in kweekplaten (9,0 cm in diameter) en laat de platen afkoelen tot kamertemperatuur (RT).
- Snijd het mycelium van de schimmelziekteverwekker, die gedurende 7 dagen in PDA-medium bij 28 °C wordt gekweekt, in vierkante blokjes van ~0,5 cm; inoculeer de schimmelblokjes in het midden van PDA-platen (de myceliumzijden wijzen naar het medium).
- Kweek de schimmelpathogenen in een thermostatische incubator (28 °C, in het donker) gedurende 7-10 dagen.
- Snijd de PDA medium met schimmelmycelium in vierkante blokjes (zijlengte 1,0-1,2 cm).
2. Voorbereiding van populierenmaterialen
- Voor 1-jarige populierenklonen (gekweekt > 3 maanden), selecteert u de pas gerijpte, volledig uitgestrekte bladeren (altijd 5-7ebladeren, vanaf de bovenkant van het jonge boompje/de takken) van de hoofdtakken als de geënte materialen, zorg ervoor dat ze vrij zijn van plagen, ziekten en mechanische schade.
- Voor 1-jarige takken van meerjarige populierenhybride klonen (gekweekt > 2 maanden), selecteert u de bovenste 5-7e bladeren van de geselecteerde takken als geënt materiaal. Zorg ervoor dat de bladeren gezond zijn en dezelfde lichtconditie (schaduw of licht) hebben als alle geteste populierenklonen.
3. Voorbehandeling van inoculatiebladeren
- Besproei de populierenbladeren met schoon water en veeg de geselecteerde bladeren na het drogen 1 uur of 1 dag voor de inoculatiemanipulaties af met 75% alcohol.
4. In-vivo-bladinoculatie
- Voor kleine bladeren (bladbreedte < 8,0 cm), inoculeert u twee vierkante schimmelmyceliumblokjes en PDA-blokjes (of wateragar, WA) (1,0-1,2 cm in zijlengte) op het bovenoppervlak van de bovenste 5-7 bladeren van populierenklonen; Het mycelium is naar de bladeren gericht. Zorg ervoor dat de inoculatieplaatsen zich in het midden van de halve bladeren bevinden, ~1-2 cm uit elkaar van de centrale nerven, en vermijd het verduisteren van de secundaire nerven. Elke kloon inoculeert 12 plaatsen op 6 bladeren (10 plaatsen voor mycelium en 2 plaatsen voor PDA-inoculatie).
- Voor grote bladeren (bladbreedte ≥ 8,0 cm) inoculeert u vier vierkante schimmelmyceliumblokjes en PDA-blokjes (of WA-blokjes) op de bovenste 5-7 populierenbladeren. Elke kloon inoculeert 12 plaatsen op 3 bladeren (10 plaatsen voor mycelium en 2 plaatsen voor PDA-inoculatie.
- Wikkel de geënte bladeren in met transparant plakband (6,0 cm breed) en druk ze voorzichtig aan om ze aan de bladeren te hechten, zodat de myceliumblokjes (of PDA) tijdens het experiment niet kunnen bewegen en water verloren gaat.
- Prik de bladeren en mycelium (of PDA) blokjes op vijf plaatsen door totdat de naalden de blokjes van de boven- naar de onderkant van de populierenbladeren doordringen. Eén plaats ligt in het midden en de andere vier liggen 1-2 mm in de buurt van de vier hoekpunten van de kubussen.
OPMERKING: Een teamsamenwerking van 3 personen wordt aanbevolen voor manipulatie van schimmelinoculatie. De inoculatiemanipulatie van een populierenhybridepopulatie (>100 genotypen) kan door teamwork in 4 uur worden uitgevoerd. De piercingmanipulaties werden uitgevoerd nadat alle geteste bladeren waren geïnoculeerd en ingepakt om de impact van verschillende piercingtijden op de ernst van de ziekte te verlichten. - Inspecteer de locatieverschuiving en het waterverlies van de myceliuminoculanten en observeer het begin van necrotische laesies rond de doorboorde wondplaatsen vanaf het onderste oppervlak van de bladeren tot de3e dag van inoculatie.
- Observeer binnen 3 dagen na inoculatie de locatieverschuiving en het waterverlies van de myceliumblokjes. Definieer en markeer de verplaatste en gedroogde myceliumblokjes als ineffectieve inoculaties en gooi ze weg van de uiteindelijke identificatie van pathotypes, terwijl u de andere blokjes definieert als effectieve inentingen.
OPMERKING: Dit protocol definieert de geteste populierenklonen met meer dan vijf effectieve inoculatieblokjes als ongeldige geënte klonen; Daarom leverde elke populierenkloon ten minste 30 effectieve inoculatieplaatsen op, die zich zullen ontwikkelen tot 30 onafhankelijke necrotische vlekken.
- Observeer binnen 3 dagen na inoculatie de locatieverschuiving en het waterverlies van de myceliumblokjes. Definieer en markeer de verplaatste en gedroogde myceliumblokjes als ineffectieve inoculaties en gooi ze weg van de uiteindelijke identificatie van pathotypes, terwijl u de andere blokjes definieert als effectieve inentingen.
- Pluk aan het einde van het experiment (~5-7 dagen na inoculatie) alle geënte bladeren af, breng ze terug naar het laboratorium in plastic monsterzakken en bewaar ze bij 4 °C.
5. Verwerving van bladpathotypes en beoordeling van populierenresistentie tegen stengelkankerziekten in het laboratorium
- Verwijder voorzichtig de transparante plakband en mycelium (of PDA) inoculanten van de bladeren.
- Observeer en identificeer de bladpathotypes van elke populierkloon, inclusief de vorm en kleur van necrotische vlekken, en kan de schimmelhyfenachtige structuur, pycnidia en conidia omvatten die zich op het oppervlak van de bladeren rond de doorboorplaatsen hebben gevormd.
- Fotografeer de bladeren (met een extra liniaal) met een camera of scan de bladeren (met een extra liniaal) met een scanner om afbeeldingen met een resolutie van meer dan 300 dpi te verkrijgen en sla de afbeeldingen vervolgens op in JPEG-, TIFF- of PNG-indeling.
6. Identificatie en statistische analyse van het vóórkomen van ziekten
- Open de afbeeldingen van zieke bladeren in de software ImageJ 1.54g (http://imagj.org).
- Stel de schaal in volgens de liniaal in de bladafbeeldingen.
- Identificeer en meet de laesies met de staaf (traceer) tool.
- Registreer en exporteer de oppervlaktewaarden als een spreadsheet nadat de gebieden van alle necrotische plekken zijn gemeten.
- Stel de criteria voor het bepalen van de ziekte vast:
- Als het gebied van de laesie rond de met myceliumblokjes bedekte doorboorplaatsen aanzienlijk groter is dan het gebied dat wordt bedekt door PDA-blokjes, definieer deze plaatsen dan als ziekteplaatsen.
- Als de morfologische kenmerken van de met myceliumblokjes bedekte doorboorplaatsen significant veranderden in vergelijking met de met PDA bedekte plaatsen, inclusief de kleuren van de laesie, die hyfeen achtige structuur produceren, pycnidia en conidiën, definieer de plaats ook als een ziekteplaats.
- Bereken de gemiddelde oppervlakten van de effectieve PDA-laesieplekken van elke populierenhybride kloon. Verdeel volgens de gemiddelde gebieden alle met mycelium geënte plekken van één populierkloon in twee categorieën: begin en niet-begin. Bereken vervolgens de incidentie van de ziekte van de geteste populier-kloon (Formule 1: Ziekte-incidentiepercentage (%) = Aantal zieke prikplaatsen/Totaal aantal efficiënte prikplaatsen × 100).
- Bereken de gemiddelde oppervlakte van de zieke plekken in bladeren (n = 50). Volgens de waarden van de gemiddelde oppervlakten van zieke vlekken van bladeren in alle geteste populierenklonen, stelt u een ziekteclassificatienorm met 5 niveaus in.
- Bereken de ziekte-index van elke populierenkloon (Formule 2) op basis van de bovenstaande ziekteclassificatiestandaard (Formule 2: Ziekte-index = ∑(Aantal prikplaatsen per niveau × Waarden van ernst op alle niveaus)/(Waarde van het hoogste ernstniveau × Totaal aantal efficiënte prikplaatsen) × 100).
- Controleer de normale verdeling van het aantal populierenklonen over verschillende resistentieniveaus met behulp van de Shapiro-Wilk-test met behulp van geschikte gegevensanalysesoftware.
- Identificeer volgens de ziekte-index alle geteste populierenklonen als vijf (of zeven) groepen: zeer hoge resistentie (VHR), hoge resistentie (HR), resistentie (R), geen resistentie en geen gevoeligheid (NRNS), gevoeligheid (S), hoge gevoeligheid (HS) en zeer hoge gevoeligheid (VHS) groep5.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In dit protocol werd de schematische workflow uitgevoerd in 48 populierenhybride klonen die waren geïnfecteerd met de stengelkankerpathogeen C. chrysosperma (Figuur 1). De populierenhybride klonen maken deel uit van de hybridisatie-nakomelingen van P. deltoides, gekweekt in de kwekerij van de Chinese Academy of Forestry (CAF), Beijing.
De stengelkankerpathogeen C. chrysosperma isolaat CZC is een typische...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol biedt een snelle en efficiënte inoculatiemethode voor pathogenen van populierenkankerresistentie, die geschikt is voor de onderzoeksgebieden die grootschalige screening op ziekteresistentie vereisen, zoals hybride veredeling van populierenkankerresistentie en pathogeniteitsscreening van stengelkankerpathogenen.
Het eerste belangrijke punt van de methode is het evalueren van ziekteresistentie door pas gerijpte bladinoculatie in plaats van gerijpte...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gezamenlijk gefinancierd door het Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund of State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding (subsidienummer CAFYBB2020ZY001-2) en de National Natural Science Foundation of China (subsidienummer 32171776) aan Jiaping Zhao.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Aluminiumfolie | Biosharp | BS-QT-027B | |
| C. chrysosperma isolaat | China Forestry Culture Collection Center | CFCC86775 | Isolatie en bewaring door ons laboratorium |
| Cytospora chrysosperma | Plant Physiology Laboratory, Institute of Forestry New Technology, Chinese Academy of Forestry | NCBI toegangsnummer: MK994101 voor rRNA-ITS en MN025273 voor EF1α gen CGMCC nummer:40575 | Isolatie en bewaring door ons laboratorium |
| Epson Perfection V370 Foto | Epson | V370 | Scanner; Scan de bladeren in afbeelding |
| PDA (Potato Dextrose Agar) | Solarbio | P8931 | Voeding leveren voor schimmelgroei |
| PE plasticfolie | Om schimmels op de bladeren te fixeren | ||
| Populus alba var. Pyramidalis | Plant Physiology Laboratory, Institute of Forestry New Technology, Chinese Academy of Forestry | Gecultiveerd door ons laboratorium | |
| SPSS | IBM | Data-analysesoftware | |
| Thermostaat incubator | Shanghai Kuntian Laboratory Instrument Co., Ltd | KTD-6000 | Een omgeving bieden voor schimmelgroei |
| Tough TG-6 camera | OLYMPUS | Om foto's te maken van aangetaste bladeren |
Referenties
- Du, K., et al. Genetic analysis and seedling selection of the poplar progenies of Aigeiros section. Journal of Huazhong Agricultural University. 28 (5), 624-630 (2009).
- Shi, Y. Identification of canker resistance to selection poplar clones [Master's thesis]. , Northwest Agriculture and Forestry University. (2014).
- Zhang, L., Zhang, H., Ou, D., Fan, J. Investigation on the resistance to canker of some new leuce hybrids inoculated with Botryosphaeria dothidea. Journal of Northwest Forestry University. 32 (6), 210-213 (2017).
- Du, C., et al. Genomic selection of seedling growth traits in a poplar hybrid population. For Res. 36 (6), 11-19 (2023).
- Li, Z., et al. A rapid and efficient in vivo inoculation method for introducing tree stem canker pathogens onto leaves: Suitable for large-scale assessment of resistance in poplar breeding progeny. BioRxiv. , (2024).
- Li, P., et al. Fungal canker pathogens trigger carbon starvation by inhibiting carbon metabolism in poplar stems. Sci Rep. 9 (1), 10111(2019).
- Xing, J., et al. Fungal pathogens of canker disease trigger canopy dieback in poplar saplings by inducing functional failure of the phloem and cambium and carbon starvation in the xylem. Physiol Mol Plant Pathol. 112, 101523(2020).
- Xing, J., et al. Comparisons of photosynthetic response and characteristics in leaves of Populus alba var. pyramidalis Infected by the stem canker pathogen Valsa sodida and Botryosphaeria dothidea at early stage. Scientia Silvae Sinicae. 57 (09), 121-129 (2021).
- Li, J., et al. Effects of Valsa sordida infection on photosynthetic characteristics and carbon-water metabolism in Populus alba var. pyramidalis. For Res. 34 (05), 58-68 (2021).
- Balendres, M. A., De Torres, R., Dela Cueva, F. Culture storage age and fungal re-isolation from host-tissue influence Colletotrichum spp. virulence to pepper fruits. J Phytopathol. 167 (9), 510-515 (2019).
- Ward, K. T., Ostry, M. E. Variation in Septoria musiva and implications for disease resistance screening of poplars. Plant Dis. 89 (10), 1077-1082 (2005).
- Asalf, B., et al. Ontogenic resistance of leaves and fruit, and how leaf folding influences the distribution of powdery mildew on strawberry plants colonized by Podosphaera aphanis. Phytopathology. 104 (9), 954-963 (2014).
- Dunnell, K. L., Le Boldus, J. M. The correlation between Septoria leaf spot and stem canker resistance in hybrid poplar. Plant Dis. 101 (3), 464-469 (2017).
- Wei, J., Huang, L., Gao, Z., Ke, X., Kang, Z. Laboratory evaluation methods of apple Valsa canker disease caused by Valsa ceratosperma sensu Kobayashi. Acta Phytopathol Sinica. 40 (1), 14-20 (2010).
- Shen, W., et al. Comparative study on the effectiveness of three inoculation methods for Valsa sordida in Populus alba var. pyramidalis. Biology. 13 (4), 251(2024).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
