Proteïnasen zijn van vitaal belang voor bacteriële pathogenese, waardoor invasie en immuunontwijking mogelijk worden. Extractie in één stap van cytoplasmatische en membraaneiwitten van bacteriën in hun actieve vorm is schrijnend. Dit video-artikel demonstreert de extractie van volledige cellulaire eiwitten van Leptospira voor zymografie-analyse om gelatinasen te detecteren en te karakteriseren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Extractie in één stap en zymografische analyse van bacteriële gelatinasen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Proteïnasen van pathogene bacteriën dragen bij aan invasie en pathogenese door de extracellulaire matrix (ECM)-componenten en cellulaire barrières van de gastheer actief af te breken, de immuunrespons van de gastheer te wijzigen en het afweersysteem van de gastheer aan te tasten. Dit maakt de proteïnasen tot een van de meest virulente moleculen en hun identificatie en karakterisering zijn essentieel voor het voorkomen en beheersen van ziekten. Veel bacteriën bezitten ook aan het buitenste membraan gebonden proteïnasen. Isolatie en karakterisering van buitenmembraaneiwitten in hun actieve vorm vormen aanzienlijke uitdagingen vanwege hun lokalisatie in het buitenmembraan. In deze studie demonstreren we een eenstapsmethode voor het extraheren van zowel cytoplasmatische als buitenmembraan-geassocieerde gelatinasen uit Leptospira en demonstreren we hun enzymatische activiteit met behulp van zymografie. Bij deze methode gebruiken we natriumdeoxycholaat om het celmembraan te verstoren en de gebonden eiwitten en 6-aminocapronzuur vrij te maken om het vrijgekomen membraaneiwit in zijn oorspronkelijke vorm op te lossen. Verder tonen we een zymografische analyse van de leptospiraalgelatinasen. Deze benadering biedt een veelzijdig kader voor het isoleren, zuiveren en karakteriseren van metalloproteasen, collagenasen en gelatinasen van verschillende bacteriële pathogenen.
Inleiding
De meeste bacteriële pathogenen moeten tijdens de invasie de extracellulaire matrix (ECM) van de gastheer tegenkomen en tijdens de pathogenese naar de doelorganen. Collageen vormt het belangrijkste bestanddeel in de ECM van dierlijke weefsels1. Gelatinasen zijn een groep proteasen die inwerken op collageen en de gehydrolyseerde vorm ervan, gelatine. De ECM-afbraak wordt voornamelijk uitgevoerd door een groep proteasen, waaronder collagenasen en gelatinasen 2,3. Bacteriële pathogenen gebruiken collagenasen en gelatinasen om de gastheer-ECM te hermodeller....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Extractie van bacteriële gelatinasen
OPMERKING: Zie tabel 1 voor de bereiding van reagentia en materialen.
- Kweek het organisme in Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) medium dat 10 mg/ml runderserumalbumine bij 30 °C bevat. Neem 10 ml Leptospira-cultuur in het midden van de logfase van de groei met 3,5 × 108 cellen/ml voor de extractieproteïnasen13,14. Gebruik de directe microscopische telling met een Petroff-Hausser-telkamer onder een donkerveldmicroscoop om de mid-log-f....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het resultaat toont het zymogram van leptospiraaleiwit en gelatinasen uit menselijk serum. De resultaten, weergegeven in figuur 1, geven proteasen weer als witte heldere banden tegen een blauwe achtergrond. De banden vertegenwoordigen gebieden waar de gecopolymeriseerde gelatine is afgebroken en dus niet gekleurd, terwijl andere delen van de hele gel blauw zijn gekleurd door de aanwezigheid van gelatine. Verder laat het zien dat, hoewel gelatine ook een eiwi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Tijdens de bereiding van de acrylamidegel co-polymeriseert gelatine met de acrylamidepolymeermatrix. Bijgevolg blijft de gecopolymeriseerde gelatine geïmmobiliseerd in de gel en migreert niet tijdens de elektroforese, ook al is het een eiwit. Na elektroforese scheiden de natuurlijke eiwitten die zijn geëxtraheerd met behulp van deoxycholaat en 6-aminocapronzuurbuffer zich af op basis van hun massa en lading. Na het verwijderen van de SDS worden deze eiwitten gerenatureerd in aanwezigheid.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
De auteurs betuigen hun dankbaarheid aan de SERB Division, Department of Science and Technology, New Delhi, voor hun steun door middel van subsidies No.SR/S0/HS/0108/2012 aan MGM
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 6-Aminocaproicacid | Merck | A2504 | |
| Azijnzuur | Sigma | 695092 | |
| Aceton | Sigma | 32201 | |
| Acrylamid | Sigma | A-3553 | |
| Ammoniumpersulfaat | Sigma | A-3678 | |
| Bis Acrylamide | Sigma | M7279 | |
| Bovine serum albumine fractie V (BSA) | Sigma | A-8022 | |
| Broomfenolblauw | Sigma | B-8026 | |
| CaCl2 | Merck | C4901 | |
| Coomassie briljantblauw | Sigma | 1.12553 | |
| Deoxycholaat | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Ellinghausen–McCullough–Johnson–Harris (EMJH) medium, Difco | Difco | 279410 | |
| Gelatine | Merck | G9382 | |
| Glycerol | Merck | G5516 | |
| Glycine G8790 | Sigma | G-8898 | |
| Leptospira interrogans serovar Copenhageni stam Fiocruz L1-130 (ATCC BAA-1198) , bewaard in het biorepository vanICMR-RMRC Port Blair | Bewaard in het biorepository van ICMR-RMRC Port Blair | Optimale groei temperatuur 30 °C | |
| Magnesiumchloride M8266 | Sigma | M8266 | |
| Methanol | Sigma | 17995-7 | |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing | Sigma | P4417 | |
| Plate separatiefunnel | Wonder Wedgle | ||
| Rotor | Thermoscientific | FIBERLite F15 8x50 cy | |
| Natriumdodecylsulfaat (SDS) | Sigma | L-4396 | |
| TEMED | Sigma | T-9281 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma Base (TRIS) | Sigma | T6066 |
Referenties
- Yue, B. Biology of the extracellular matrix. J Glaucoma. 23 (8 Suppl 1), S20-S23 (2014).
- Cabral-Pacheco, G. A., et al. The roles of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human diseases. Int J Mol Sci. 21 (24), 1-53 (2020).
- Ambili, M., Jayasree, K....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
