Extractie in één stap en zymografische analyse van bacteriële gelatinasen

Samenvatting

Proteïnasen zijn van vitaal belang voor bacteriële pathogenese, waardoor invasie en immuunontwijking mogelijk worden. Extractie in één stap van cytoplasmatische en membraaneiwitten van bacteriën in hun actieve vorm is schrijnend. Dit video-artikel demonstreert de extractie van volledige cellulaire eiwitten van Leptospira voor zymografie-analyse om gelatinasen te detecteren en te karakteriseren.

Samenvatting

Proteïnasen van pathogene bacteriën dragen bij aan invasie en pathogenese door de extracellulaire matrix (ECM)-componenten en cellulaire barrières van de gastheer actief af te breken, de immuunrespons van de gastheer te wijzigen en het afweersysteem van de gastheer aan te tasten. Dit maakt de proteïnasen tot een van de meest virulente moleculen en hun identificatie en karakterisering zijn essentieel voor het voorkomen en beheersen van ziekten. Veel bacteriën bezitten ook aan het buitenste membraan gebonden proteïnasen. Isolatie en karakterisering van buitenmembraaneiwitten in hun actieve vorm vormen aanzienlijke uitdagingen vanwege hun lokalisatie in het buitenmembraan. In deze studie demonstreren we een eenstapsmethode voor het extraheren van zowel cytoplasmatische als buitenmembraan-geassocieerde gelatinasen uit Leptospira en demonstreren we hun enzymatische activiteit met behulp van zymografie. Bij deze methode gebruiken we natriumdeoxycholaat om het celmembraan te verstoren en de gebonden eiwitten en 6-aminocapronzuur vrij te maken om het vrijgekomen membraaneiwit in zijn oorspronkelijke vorm op te lossen. Verder tonen we een zymografische analyse van de leptospiraalgelatinasen. Deze benadering biedt een veelzijdig kader voor het isoleren, zuiveren en karakteriseren van metalloproteasen, collagenasen en gelatinasen van verschillende bacteriële pathogenen.

Inleiding

De meeste bacteriële pathogenen moeten tijdens de invasie de extracellulaire matrix (ECM) van de gastheer tegenkomen en tijdens de pathogenese naar de doelorganen. Collageen vormt het belangrijkste bestanddeel in de ECM van dierlijke weefsels¹. Gelatinasen zijn een groep proteasen die inwerken op collageen en de gehydrolyseerde vorm ervan, gelatine. De ECM-afbraak wordt voornamelijk uitgevoerd door een groep proteasen, waaronder collagenasen en gelatinasen ^2,3. Bacteriële pathogenen gebruiken collagenasen en gelatinasen om de gastheer-ECM te hermodelleren of af te breken voor hun gemak bij invasie en pathogenese ^4,5. Bacteriële ECM-afbrekende enzymen zijn potentiële kandidaten voor het richten op vaccins en geneesmiddelen⁵.

Bacteriële proteasen worden aangetroffen in secretoire en membraangebonden vormen 6,7,8,9. Veel methoden voor cellulaire enzymextractie zijn niet effectief voor het isoleren van membraangebonden bacteriële gelatinasen en collagenasen, omdat deze procedures de oorspronkelijke vorm van membraangebonden eiwitten mogelijk niet efficiënt behouden. Evenzo zijn er membraanspecifieke methoden die alleen membraangebonden proteasen en gelatinasen extraheren. Conventionele extractiemethoden voor totale eiwitten, inclusief membraaneiwitten, bevatten vaak wasmiddelen en chaotropische ionen, die de enzymatische activiteit kunnen beïnvloeden. Een extractieprocedure die de enzymactiviteit en oplosbaarheid in stand houdt, is essentieel voor elektroforetische scheiding en maakt de ontwikkeling van zymografie mogelijk om protease-activiteit te detecteren.

Natriumdeoxycholaat, een ionisch wasmiddel dat cellen kan lyseren door het celmembraan te verstoren, maakt het vrijkomen van de celinhoud en het membraaneiwit mogelijk. Het 6-aminocapronzuur kan het vrijgekomen membraaneiwit in zijn oorspronkelijke vorm oplossen. Oplosbaarheid door 6-aminocapronzuur heeft als voordeel dat het de elektroforese niet beïnvloedt. Hier demonstreren we de extractie van cellulaire en membraangebonden bacteriële proteïnasen met behulp van natriumdeoxycholaat en 6-aminocapronzuur, waardoor ze worden gestabiliseerd in hun oorspronkelijke oplosbare vorm 10,11,12. Deze methode lost effectief eiwitten uit de cel en het membraan op die direct kunnen worden gebruikt zonder storende elektroforese^13,14. Afhankelijk van de toepassing kunnen verschillende enzymatische karakteriseringen worden uitgevoerd door de proteaseremmers en metaalionen die in de activeringsbuffer worden gebruikt, te veranderen.

Protocol

1. Extractie van bacteriële gelatinasen

OPMERKING: Zie tabel 1 voor de bereiding van reagentia en materialen.

1. Kweek het organisme in Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) medium dat 10 mg/ml runderserumalbumine bij 30 °C bevat. Neem 10 ml Leptospira-cultuur in het midden van de logfase van de groei met 3,5 × 10⁸ cellen/ml voor de extractieproteïnasen^13,14. Gebruik de directe microscopische telling met een Petroff-Hausser-telkamer onder een donkerveldmicroscoop om de mid-log-fase van de groei te observeren.
2. Oogst de cellen door centrifugeren bij 6.000 × g gedurende 10 minuten en gooi het bovenstaande weg in een container voor ontsmetting door autoclaveren bij 121 °C gedurende 60 min.
3. Breng de pellet over door deze in 1 ml wasbuffer te suspenderen in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten op 6.000 × g . Herhaal deze wasbeurt.
4. Extraheer het eiwit uit de pellet door 100 μL extractiebuffer toe te voegen voor een Leptospira-pellet van 10 ml cultuur en vortex gedurende 5 minuten. Zet de extractie voort door gedurende 1 uur bij 4 °C te incuberen. Verzamel het geëxtraheerde eiwit door centrifugatie bij 15.00×0 g bij 4 °C gedurende 10 minuten en gooi de pellet weg in een container voor ontsmetting door autoclaveren bij 121 °C gedurende 60 minuten.
5. Gebruik het eiwitextract direct voor zymografie door een gelijk volume van 2x monsterbuffer toe te voegen.
6. Gebruik de Bradford-schattingstest om de eiwitconcentratie te bepalen.
7. Als de eiwitconcentratie laag is, sla het dan neer met aceton door het eiwit te mengen met een 4x volume aceton voor neerslag en incubeer het een nacht bij -20 °C. Centrifugeer het monster de volgende dag gedurende 10 minuten bij 10.000 × g , droog de resulterende pellet aan de lucht en suspendeer deze opnieuw in PBS of los op in de gewenste buffer en bewaar deze maximaal 1 maand bij -20 °C. Gebruik vriesdrogen voor langdurige opslag of transport.
   OPMERKING: Door actieve proteasen in het extract en de afwezigheid van proteaseremmers kunnen eiwitten in het monster worden afgebroken.

2. Zymografie van gelatinasen

1. Bereiding van de gelatine geco-gepolymeriseerde SDS PAGE-gel
   1. Oplossende gel
      1. Maak de oplossende gelmix door de componenten in de vereiste hoeveelheden toe te voegen om de gel te gieten. Voeg aan 3,86 ml water in een bekerglas van 50 ml 2,5 ml Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 ml van de 10% gelatinestockoplossing, 3,34 ml acrylamide-bis acrylamide-oplossing (ABA), 0,1 ml 10% SDS, 0,006 ml TEMED en 0,1 ml 10% ammoniumpersulfaat toe en meng goed zonder schuimvorming en bubbels. Het genoemde systeem (gewone glasplaten; 18 x 8 cm) vereist 10 ml oplossende gelmix.
         OPMERKING: Als de gelatine afkomstig is van een bevroren aliquot, ontdooi deze dan tot hij smelt om de oplossing zonder klontjes te verwijderen. Voeg ammoniumpersulfaat toe vlak voor het gieten, omdat de polymerisatie direct na het toevoegen van ammoniumpersulfaat begint.
      2. Giet het oplossende gelmengsel in de gietkamer tot ~3-5 mm onder de markering voor de bodem van de putjes. Vermijd luchtbellen.
      3. Giet langzaam wat water om een gelijkmatige laag van 1 mm op de bovenkant van de gel te krijgen en verwijder luchtbellen. Laat de gel 1 uur intrekken.
         OPMERKING: Gelvorming kan worden bevestigd door te zoeken naar een fasescheiding tussen de waterlaag en de gel; De gel kan niet worden uitgegoten, zelfs niet als de gelcassette gekanteld is.
   2. Stapelen gel
      1. Bereid de stapelgel voor door de volgende componenten te mengen. Voeg aan 1,84 ml water in een bekerglas van 10 ml 2,5 ml Tris-Cl (pH 6,6), 0,35 ml ABA, 0,03 ml 10% SDS en 0,006 ml TEMED toe. Het systeem van 8 x 10 cm met een dikte van 1 mm vereist 3 ml oplossende gelmix.
      2. Decanteer uit de gelcassette het water dat aan de bovenkant van de gel is gevormd door de gelopstelling naar één kant te kantelen en het opgevangen water uit de hoek te deppen met een smalle strook filterpapier.
      3. Voeg 0,03 ml 10% APS toe aan het mengsel vermeld in stap 2.1.2.1 en meng zonder bubbels te vormen.
      4. Giet de stapelgel op de oplossende gel en plaats de kam onmiddellijk op zijn plaats zonder luchtbellen onder de kamtanden te vormen, zodat er een dikte van 3-5 mm stapelgel overblijft tussen de oplossende gel en de onderkant van de kamtanden. Wacht minstens 3 uur voor volledige polymerisatie en verknoping van de gelatine.
      5. Haal het onderste afstandsstuk eruit en bevestig de gel op het elektroforese-apparaat.
      6. Plaats de gel langzaam in de tank met 1x elektrodebuffer en zorg ervoor dat er geen ingesloten lucht op de bodem van de gel zit.
2. Voorbereiding van het monster
   1. Voeg een gelijk volume monsterbuffer toe aan het extract en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C om het SDS aan het eiwit te laten binden. Gebruik een monster van 2 μl menselijk serum met een gelijk volume monsterbuffer als positieve controle.
3. Het monster laden
   1. Vul het monster voorzichtig in de putjes met een pipet met smalle punt of een Hamilton-spuit (0,5-1 ml). Voeg geleidelijk elektrodebuffer toe om de resterende delen van de putjes, de bovenkant van de gel en de bovenste tank van de elektroforese-eenheid te vullen zonder de geladen monsters te verstoren.
      OPMERKING: De Hamilton-spuit moet grondig worden gewassen tussen de monsters om kruisbesmetting te voorkomen.
4. Lopende elektroforese
   1. Begin de elektroforese bij 6 mA per gel en draai totdat het verffront de oplossende gel binnendringt. Verhoog vervolgens de stroom tot 12 mA per gel en ga door totdat het verffront 1 cm boven de bodem van de gel komt.
      OPMERKING: De looptijd kan veranderen afhankelijk van de gebruikte concentratie ABA en de grootte van het doeleiwit.
5. Markering van de oriëntatie van de banden van de standaard
   1. Na voltooiing van de elektroforese, demonteert u de glasplaten voorzichtig met behulp van een plaatscheidingsgereedschap of een plastic spatel en markeert u de oriëntatie van het monsterladen door de rechterbenedenhoek van de gel af te snijden en markeert u de voorgekleurde markeringsbanden door gaten in de buurt te ponsen of de gel te scannen.
6. Renaturatie van opgeloste enzymen
   1. Dompel de gel onder in een geltray in een renaturerende oplossing met Triton X-100 en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur zonder te schudden.
      OPMERKING: Triton X-100 renatureert de eiwitten, omdat de zymogramgel die opgeloste eiwitten bevat, kan worden gedenatureerd en activiteit kan verliezen in aanwezigheid van SDS.
7. Incubatie voor protease-activiteit
   1. Vervang de renaturerende oplossing door een activeringsbuffer die de gel volledig onderdompelt en incubeer gedurende 18 uur bij 37 °C in een broedmachine.
      OPMERKING: Wijzig de activeringsbuffer door remmers of activatoren van interessante proteïnasen toe te voegen om de proteïnase-activiteit indien nodig te karakteriseren.
8. Kleuring van het zymogram
   1. Verwijder na de incubatie de activeringsbuffer en spoel de gel kort met water gedurende 1 minuut om de resterende Triton X-100 te verwijderen en schuimvorming tijdens het schudden te voorkomen.
   2. Voeg de kleuroplossing toe aan het bakje en zorg ervoor dat de gel volledig ondergedompeld is. Schud de gel voorzichtig op een lage snelheid om schade te voorkomen. Ga door met kleuren totdat de gel helemaal blauw wordt.
   3. Verwijder overtollige vlekken van het geloppervlak door het gedurende 1 minuut met water af te spoelen. Voeg de kleuroplossing toe aan de bak en schud voorzichtig. Vervang de kleuroplossing meerdere keren door verse oplossing totdat het gewenste bandcontrast is bereikt tegen de blauwe achtergrond.
      OPMERKING: Controleer tijdens het uitvoeren van de kleuring de gel continu om er zeker van te zijn dat deze niet volledig verkleurd raakt, zodat de proteolytische banden kunnen worden waargenomen en opgenomen.
   4. Scan de gel in een geldocumentatiesysteem of documentscanner en bepaal de molecuulmassa van de eiwitbanden door ze te vergelijken met de eiwitstandaarden.

Resultaten

Het resultaat toont het zymogram van leptospiraaleiwit en gelatinasen uit menselijk serum. De resultaten, weergegeven in figuur 1, geven proteasen weer als witte heldere banden tegen een blauwe achtergrond. De banden vertegenwoordigen gebieden waar de gecopolymeriseerde gelatine is afgebroken en dus niet gekleurd, terwijl andere delen van de hele gel blauw zijn gekleurd door de aanwezigheid van gelatine. Verder laat het zien dat, hoewel gelatine ook een eiwi...

Discussie

Tijdens de bereiding van de acrylamidegel co-polymeriseert gelatine met de acrylamidepolymeermatrix. Bijgevolg blijft de gecopolymeriseerde gelatine geïmmobiliseerd in de gel en migreert niet tijdens de elektroforese, ook al is het een eiwit. Na elektroforese scheiden de natuurlijke eiwitten die zijn geëxtraheerd met behulp van deoxycholaat en 6-aminocapronzuurbuffer zich af op basis van hun massa en lading. Na het verwijderen van de SDS worden deze eiwitten gerenatureerd in aanwezigheid...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
6-Aminocaproicacid	Merck	A2504
Azijnzuur	Sigma	695092
Aceton	Sigma	32201
Acrylamid	Sigma	A-3553
Ammoniumpersulfaat	Sigma	A-3678
Bis Acrylamide	Sigma	M7279
Bovine serum albumine fractie V (BSA)	Sigma	A-8022
Broomfenolblauw	Sigma	B-8026
CaCl2	Merck	C4901
Coomassie briljantblauw	Sigma	1.12553
Deoxycholaat	Sigma-Aldrich	D6750
Ellinghausen–McCullough–Johnson–Harris (EMJH) medium, Difco	Difco	279410
Gelatine	Merck	G9382
Glycerol	Merck	G5516
Glycine G8790	Sigma	G-8898
Leptospira interrogans serovar Copenhageni stam Fiocruz L1-130 (ATCC BAA-1198) , bewaard in het biorepository vanICMR-RMRC Port Blair	Bewaard in het biorepository van ICMR-RMRC Port Blair		Optimale groei temperatuur 30 °C
Magnesiumchloride M8266	Sigma	M8266
Methanol	Sigma	17995-7
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Sigma	P4417
Plate separatiefunnel	Wonder Wedgle
Rotor	Thermoscientific	FIBERLite F15 8x50 cy
Natriumdodecylsulfaat (SDS)	Sigma	L-4396
TEMED	Sigma	T-9281
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Trizma Base (TRIS)	Sigma	T6066