De gepresenteerde methode beschrijft het genereren van een CRISPR-gemedieerde gen-knock-out in de menselijke embryonale stamcel (hESC) lijn H9, die sgRNA's gericht op het L2HGDH-gen stabiel tot expressie brengt met behulp van een zeer efficiënt lentiviraal-gemedieerd genafgiftesysteem.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
CRISPR-Cas9 gemedieerde gendeletie in menselijke pluripotente stamcellen gekweekt onder feedervrije omstandigheden
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het CRISPR-Cas9-systeem voor genoombewerking heeft een revolutie teweeggebracht in genfunctiestudies in zoogdiercellen, waaronder stamcellen. De praktische toepassing van deze techniek, met name in pluripotente stamcellen, brengt echter bepaalde uitdagingen met zich mee, zoals tijd- en arbeidsintensief zijn en een lage bewerkingsefficiëntie hebben. Hier beschrijven we het genereren van een CRISPR-gemedieerde gen-knock-out in een menselijke embryonale stamcel (hESC) -lijn die stabiel sgRNA's tot expressie brengt voor het L2HGDH-gen, met behulp van een zeer efficiënt en stabiel lentiviraal-gemedieerd genafgiftesysteem. De sgRNA's gericht tegen exon 1 van het L2HGDH-gen werden chemisch gesynthetiseerd en gekloond tot de lentiCRISPR v2-puro-vector, die de constitutieve expressie van sgRNA's combineert met Cas9 in een zeer efficiënt single-vectorsysteem om hogere lentivirale titers voor hESC-infectie en stabiele selectie te bereiken met behulp van puromycine. Puromycine-geselecteerde cellen werden verder uitgebreid en eencellige klonen werden verkregen met behulp van de beperkte verdunningsmethode. De enkelvoudige klonen werden uitgebreid en verschillende homozygote knock-out klonen voor het L2HGDH-gen werden verkregen, zoals bevestigd door een vermindering van 100% in L2HGDH-expressie met behulp van Western blot-analyse. Bovendien werd met behulp van MSBSP-PCR de CRISPR-mutatieplaats stroomopwaarts van de PAM-herkenningssequentie van Cas9 in de geselecteerde homozygote klonen in kaart gebracht. Sanger-sequencing werd uitgevoerd om de exacte inserties/deleties te analyseren, en functionele karakterisering van de klonen werd uitgevoerd. Deze methode produceerde een significant hoger percentage homozygote deleties in vergelijking met eerder gerapporteerde niet-virale genafgiftemethoden. Hoewel dit rapport zich richt op het L2HGDH-gen, kan deze robuuste en kosteneffectieve aanpak worden gebruikt om homozygote knock-outs te creëren voor andere genen in pluripotente stamcellen voor genfunctiestudies.
Inleiding
Menselijke embryonale stamcellen (hESC's) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) zijn stamcellen met het potentieel om te differentiëren in alle celtypen in het lichaam. Deze cellen dienen als waardevolle hulpmiddelen voor het bestuderen van de menselijke ontwikkeling, maar ook voor het begrijpen van de onderliggende mechanismen van verschillende ziekten, en bieden zo een enorme belofte voor regeneratieve geneeskunde, ziektemodellering en het ontdekken van geneesmiddelen. Dergelijke studies omvatten het onderzoeken hoe specifieke genen bijdragen aan de ontwikkeling, het functioneren en de regulatie van organismen 1,2.
Er worden verschillende technieken en benaderingen gebruikt om de genfunctie te ontcijferen, waaronder genetische manipulatie, zoals gen-knock-out of overexpressie, en genoombewerking. Hiervan is de CRISPR-Cas9-technologie naar voren gekomen als de meest efficiënte aanpak voor onderzoeken naar gen-knock-out en genbewerking 1,2,3. Het CRISPR-Cas9-systeem werkt door gebruik te maken van een enkel gids-RNA (sgRNA) molecuul dat speciaal is ontworpen om een bepaalde DNA-sequentie van belang te identificeren en eraan te binden. Het sgRNA fungeert als een moleculaire gids en stuurt het Cas9-enzym naar de precieze locatie in het genoom die moet worden gewijzigd. Eenmaal gebonden, initieert Cas9 een dubbelstrengs breuk in het DNA op de aangewezen plaats. Na de splitsing van DNA worden de inherente herstelmechanismen van de cel geactiveerd. Deze omvatten twee belangrijke reparatieroutes: niet-homologe eindverbindingen (NHEJ) en homologiegerichte reparatie (HDR). NHEJ resulteert vaak in inserties of deleties (indels) op de plaats van de pauze, wat leidt tot genverstoring of inactivering. Omgekeerd maakt HDR het mogelijk om nieuwe DNA-sequenties in te voegen op de plaats van de pauze, waardoor de introductie van gerichte genetische veranderingen wordt vergemakkelijkt4.
Gezien het belang van gendeleties in pluripotente stamcellen, zijn er verschillende protocollen gepubliceerd over CRISPR-Cas9-gemedieerde genknock-outs in hESC's/iPSC's. Veel van deze protocollen hebben echter te maken met aanzienlijke beperkingen, zoals extreem tijdrovend, arbeidsintensief en een lage efficiëntie door het gebruik van niet-virale genafgiftemethoden5. Deze uitdagingen zijn nog meer uitgesproken bij hESC's/iPSC's, omdat bekend is dat deze cellen een lagere bewerkingsefficiëntie hebben in vergelijking met andere celtypen5. Sommige van deze beperkingen kunnen worden aangepakt door de efficiëntie van plasmide-afgifte die Cas9 en sgRNA's bevatten, te verhogen. Dit kan met succes worden bereikt met behulp van een lentiviraal vectorsysteem, dat de resultaten van het bewerken van genen aanzienlijk kan verbeteren. Lentivirus-verpakkingsprotocollen zijn goed ingeburgerd en eenvoudig, waardoor ze gemakkelijk in laboratoria kunnen worden toegepast, zelfs door onderzoekers met beperkte ervaring. Lentivirussen vertonen een hoge infectie-efficiëntie in verschillende celtypen, waaronder hESC's en iPSC's. Daarom is het gebruik van een lentiviraal systeem voor Cas9-sgRNA-expressie ideaal voor routinematige experimenten met het bewerken van genen in hESC's/iPSC's voor genfunctiestudies.
Hier bieden we een eenvoudige en ongecompliceerde methode voor zeer efficiënte op CRISPR-Cas9 gebaseerde gendeleties in hESC's in een relatief kortere tijdsduur dan conventionele protocollen (Figuur 1). Hoewel een lentivirale vector met constitutieve expressie van Cas9 en sgRNA is gebruikt, kan deze gemakkelijk worden vervangen door geneesmiddel-induceerbare Cas9-expressie voor controleerbare Cas9-expressie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De details van de gensequenties, reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Ontwerp van enkelvoudig gids-RNA (sgRNA), klonen en productie van lentivirale vectoren
OPMERKING: Er worden twee verschillende sgRNA-sequenties gebruikt die gericht zijn op het exon 1 van het L2HGDH-gen , beide aangepast van Qiu et al.6met PAM-plaatsen van AGG en TGG voor respectievelijk sequenties 1 en 2. Beide sgRNA's waren 20 bp lang en de uiteinden werden gemodificeerd om linkersequenties toe te voegen voor het restrictie-enzym Bsmb1 dat moest worden gekloond in de doelvector (LentiCRISPRv2) zoals beschreven in het vorige rapport6. Linkersequenties werden toegevoegd tijdens het ontwerpen van sgRNA's voor kloondoeleinden.
- Gloeiend chemisch gesynthetiseerd sgRNA's6 en klonen tot Bsmb1 single cut lentivirale vector, LentiCRISPRv2 met behulp van een geoptimaliseerd protocol zoals eerder gerapporteerd7.
- Ga verder met lentivirale verpakking en concentratie met behulp van gestandaardiseerd en geoptimaliseerd protocol7.
- Voor de productie van lentivirus zaait u HEK293T cellen (1 × 105 cellen/cm2) met behulp van DMEM, 10% FBS en 1x penicilline/streptomycine (P/S) en incubeert u 's nachts in een weefselkweekincubator bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2 onder vochtige omstandigheden.
- Wanneer 90% confluent, co-transfect HEK293T cellen met ingangsvector (lege ruggengraat of sgRNA die plasmiden tot expressie brengen) en verpakkingsplasmiden met behulp van goedkoop kationisch polymeer PEI zoals eerder beschreven7.
- Verzamel de geconditioneerde media die Lentiviral supernatans (LVS)-deeltjes bevatten 48 uur en 72 uur na transfectie en ga verder met ultracentrifugatie met behulp van een sucrosekussen en draai de buizen gedurende 2 uur bij 4 °C op 1,25,000 x g.
- Ga verder met de LVS-deeltjesconcentratie tot ten minste 200 keer het oorspronkelijke volume in PBS, aliquot, en bewaar bij -80 °C tot gebruik.
- Bepaal de titer van lentivirale deeltjes met behulp van de qPCR Lentivirus Titer Kit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
2. Lentivirale infecties en klonale voortplanting van eencellige cellen
- Voor infecties met LVS-deeltjes, zaad hESC (H9) celsuspensie met 1 × 105 cellen/0,5 ml hESC-kweekmedia (basale media + P/S + 10 μM gesteenteremmer) op volledige Matrigel (1:50) gecoate P24-putplaten in 500 μL media en 's nachts incuberen om de cellen te laten hechten. Zaad extra putjes die niet geïnfecteerd zouden zijn met LVS, maar behandeld zouden worden met puromycine om te dienen als niet-geïnfecteerde controle.
OPMERKING: Celtelling kan worden uitgevoerd met behulp van een handmatige hemocytometer of geautomatiseerde celteller. - Infecteer de cellen de volgende dag bij Multiplicity of Infection (MOI) van 10 samen met 8 μg/ml polybrene en incubeer bij 37 °C gedurende 8 uur, gevolgd door mediavervanging door verse hESC-media + P/S zonder Rock Inhibitor en ga door met kweken totdat de cellen voor 90% samenvloeien.
- Begin met de selectie van puromycine door de media aan te vullen met een concentratie van 0,8 μg/ml puromycine wanneer cellen 90% confluentie bereiken, wat meestal 48-72 uur na infectie is, en ga door met de selectie totdat alle cellen in de niet-geïnfecteerde cellen afsterven (controlegroep).
- Nadat de selectie is voltooid (meestal 4-6 dagen), splitst u stabiele cellen (1:4) en breidt u deze uit voor cryopreservatie en verdere analyse.
- Voer enkelvoudige celselectie en klonale expansie uit met behulp van cellen die L2HGDH-sgRNA-1tot expressie brengen 6.
- Bereid hiervoor een celsuspensie die overeenkomt met 500 cellen/10 ml volledige groeimedia en zaad 100 μl van deze suspensie in elk putje van een plaat met 96 putjes.
- Laat de cellen 3 dagen met rust en observeer dan.
- Markeer de putten die enkele klonen opleveren en verander de media om de dag totdat een voldoende grootte is bereikt voor de kolonies (meestal 2 weken) om verder uit te breiden, te cryopreservatie en te analyseren.
3. gDNA-extractie, MS-BSP PCR en Sanger-sequencing
- Isoleer gDNA uit cellen met behulp van de genomische DNA-isolatiekit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
- Ga verder met het in kaart brengen van mutatieplaatsen stroomopwaarts van de PAM-herkenningssequenties met behulp van Mutation Sites Based Specific Primers (MS-BSP)-analyse8.
- Hiervoor is een onbevooroordeelde rechter primer L2H-UMSBSP-R1 ontworpen om het gebied buiten de Exon1 te versterken om eventuele doelen te versterken.
- Ontwerp een bevooroordeelde linker primer L2H-BMSBSP-F1 met een identieke sequentie als sgRNA om de doelsequentie te amplificeren die dicht bij PAM-herkenningssequenties ligt.
OPMERKING: Bij zeer hoge strenge PCR-omstandigheden wordt het product waargenomen op de gel in niet-gemuteerde klonen. Er zou geen product worden waargenomen in CRISPR-knock-outklonen die mutaties vertonen die dicht bij stroomopwaarts van PAM-herkenningssequenties liggen. - Om mutaties van enkelvoudige basenparen in kaart te brengen, amplificeert PCR een sequentie van 468 bp die het hele exon 1 van L2HGDH beslaat en onderworpen is aan Sanger-sequencing gevolgd door analyse van meervoudige sequentie-uitlijning met behulp van clustalw8.
4. hESC-differentiatie en embryoïde lichaam (EB) vormingstest
- Ga verder met de gerichte differentiatie van controle en verschillende CRISPR-klonen van hESC's (H9) naar het lot van neuro-ectodermen volgens vastgestelde protocollen zoals eerder beschreven met behulp van dubbele smad-remmingsmethode 9,10,11.
- Wanneer de cellen 90% confluentie hebben, behandel de cellen met LDN193189 (200 nM) en SB431542 (10 μM) gedurende de eerste 24 uur in 100% KSR-media, gevolgd door de toevoeging van XAV939 (2 μM) gedurende nog eens 2 dagen.
- Verlaag na 3 dagen het percentage KSR media (Knockout DMEM aangevuld met 15% (v/v) KSR, 1% (v/v) L-glutamine, 1% (v/v) P/S, 1% (v/v) 10 mM MEM, en 0,1% (v/v) 2-mercaptoethanol (75%, 50%, 25%) door te combineren met N2 media (DMEM/F12 aangevuld met 1x N2 supplement, 1x P/S, ) tot 100% N2-media over een periode van 8 dagen.
- Fixeer aan het begin van dag 12 de cellen voor immunokleuring met PAX6 als neuro-ectoderm-marker.
- Gebruik voor mesoderm- en endodermale lotbepalingsstudies een op kleine moleculen gebaseerde benadering die is gebaseerd op CHIR99021 die in eerdere publicaties is beschreven12,13.
- Hiervoor, wanneer de cellen 70% confluentie bereiken, behandel met 3 μM CHIR99021 in Definitive Endoderm (DE)-media gedurende 24 uur, gevolgd door fixatie voor immunokleuring met behulp van Brachuary als mesoderm-specifieke marker.
- Kweek de cellen voor het endodermale stadium gedurende nog eens 24 uur in DE-media alleen zonder toevoeging van CHIR99021 voordat u fixeert op immunokleuring met behulp van FOXA2.
- Voor de EB-vormingstest zaait u de cellen op celoppervlakken met een lage aanhechting zonder Matrigel te gebruiken om cellen gedurende 24 uur onder suspensieomstandigheden te kweken voordat microfoto's worden gemaakt.
5. Analyse van westerse vlekken
- Was de cellen twee keer met PBS en lyse met 1x RIPA buffer met 1% SDS en 1x protease en fosfataseremmer cocktail.
- Verwijder de lysaten door centrifugeren bij 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C, gevolgd door het verzamelen van de supernatanten.
- Kwantificeer het totale celeiwit met behulp van de BCA-eiwittestkit volgens de instructies van de fabrikant. Stel de monsters in op 2 μg/μL met behulp van 4× laadbuffer voor kleurstofmonsters.
- Denatureer de eiwitmonsters bij 70 °C gedurende 10 minuten, laad gelijke hoeveelheden van elk monster en los op met behulp van SDS-PAGE-gelsmet een gradiënt van 4%-12%, gevolgd door overdracht naar het PVDF-membraan bij een constante spanning van 100 V gedurende 1 uur bij 4 °C.
- Blokkeer de membranen met 5% magere melk en incubeer in primaire antilichaamverdunningen bij 4 °C 's nachts met rotatie.
- Was vervolgens de membranen 5x met behulp van PBST-buffer en incubeer in HRP-geconjugeerde geschikte secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was de membranen opnieuw met PBST 5x, incubeer met chemiluminescent substraat en ontwikkel met behulp van röntgenfilms.
6. Immunokleuring
- Zaai de cellen op P4-putplaten en incubeer gedurende ten minste 24 uur voordat ze worden gefixeerd, zodat de cellen goed aan de oppervlakken kunnen worden bevestigd.
- Was de cellen 3x met PBS om dode cellen en mediacomponenten te verwijderen, gevolgd door fixatie met 4% PFA gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.
- Permeabiliseer de cellen met behulp van 0,3% triton X-100, gevolgd door blokkering voor niet-specifieke binding door 2% BSA in PBS te gebruiken gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer de monsters met primaire antilichamen (OCT4, NANOG, SOX2, KI67, PAX6, Brachuary, FOXA2) verdund in 1% BSA 's nachts bij 4 °C.
- Was de cellen 3x met PBS en incubeer met geschikte secundaire antilichamen (Geit anti-muis 488, Geit anti-konijn 488, Geit anti-muis 546, Geit anti-konijn 546) verdund in 1% BSA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was ten slotte de monsters 3x met PBS en vertoon ze met DAPI en beeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Klonen van L2HGDH sgRNA's in lentiCRISPRv2 puro
lentiCRISPRv2 puro vector werd commercieel verkregen (zie Tabel met materialen) en verteerd met BsmB1, wat resulteerde in het vrijkomen van een 1,8 Kb stuffer fragment. Zoals te zien is in figuur 2A, werd een volledige vertering van de vector waargenomen. Voor elk construct werden zes klonen gescreend op de aan- of afwezigheid van insert met behulp van omgekeerde sgRNA-seque...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze studie heeft een methode gestandaardiseerd die zeer efficiënte en kosteneffectieve gendeleties in hESC's mogelijk maakt door middel van CRISPR-Cas9-technologie. Deze methode bereikte met succes homozygote deletie van het L2HGDH-gen in hESC's binnen 3-4 weken, beginnend bij hESC-infectie tot single-cell klonale selectie en propagatie (Tabel 1). Hoewel CRISPR-Cas9-gemedieerde genmanipulaties kunnen worden bereikt door voorbijgaande transfecties in de meeste cellen, wo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door onderzoeksbeurzen van de Universiteit van de Verenigde Arabische Emiraten (UAEU) - grant #12M105, grant #12R167 (Zayed Center for Health Sciences), 21R105 (Zayed Bin Sultan Charitable and Humanitarian Foundation (ZCHF)) en ASPIRE, de pijler voor het beheer van technologieprogramma's van Abu Dhabi's Advanced Technology Research Council (ATRC), via het ASPIRE Precision Medicine Research Institute Abu Dhabi (ASPIREPMRIAD) toekenningsnummer VRI-20-10.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2-MERCAPTOETHANOL | Invitrogen | 31350010 | |
| 38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem cell technologies | 7920 | |
| bFGF Recombinant human | Invitrogen | PHG0261 | |
| Brachyury Rabbit mAb | Abclonal | A5078 | |
| BsmBI-v2 | NEB | R0739S | |
| chir99021 | Tocris | 4423/10 | |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | |
| Cyclopamine | Stem cell technologies | 72074 | |
| DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM NUTRIENT MIX F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Fetal bovie serum | Invitrogen | 10270106 | |
| FoxA2/HNF3β | CST | 8186 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody | CST | 2118S | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem cell technologies | 7174 | |
| HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100x Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
| Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb | CST | 9129 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| L GLUTAMINE, 100x | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2H-BMSBSP-F1 | Macrogen | CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG | |
| L2HGDH Polyclonal antibody | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH-SgRNA1-F | Macrogen | CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG | |
| L2HGDH-SgRNA1-R | Macrogen | AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC | |
| L2HGDH-SgRNA2-F | Macrogen | CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG | |
| L2HGDH-SgRNA2-R | Macrogen | AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC | |
| L2H-SeqF1 | Macrogen | GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG | |
| L2H-SeqR1 | Macrogen | GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG | |
| L2H-UMSBSP-R1 | Macrogen | GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG | |
| LentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| mTesR1 complete media | Stem cell technologies | 85850 | |
| Nanog Antibody | CST | 3580 | |
| NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 Supplement 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Supplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Oct-4 Antibody | CST | 2750 | |
| Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb | CST | 60433 | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Polybrene infection reagent | Sigma | TR1003- G | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| qPCR Lentivirus Titer Kit | Abm | LV900 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Sox2 Antibody | CST | 2748 | |
| Sucrose | Sigma | 57-50-1 | |
| TRYPSIN.05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| U6-459F | Macrogen | GAGGGCCTATT TCCCATGATTC | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
Referenties
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 structures and mechanisms. Annu Rev Biophys. 46 (1), 505-529 (2017).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Xue, C., Greene, E. C. DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing. Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).
- Zhang, Z., et al. CRISPR/Cas9 genome-editing system in human stem cells: Current status and future prospects. Mol Ther Nucleic Acids. 9, 230-241 (2017).
- Qiu, Z., et al. MYC regulation of D2HGDH and L2HGDH influences the epigenome and epitranscriptome. Cell Chem Biol. 27 (5), 538-550.e537 (2020).
- Sheikh, M. A., Ansari, S. A. Lentiviral mediated delivery of shRNAs to hESCs and NPCs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (PEI). J Vis Exp. (183), e63953(2022).
- Guo, J., et al. A simple and cost-effective method for screening of CRISPR/Cas9-induced homozygous/biallelic mutants. Plant Methods. 14 (1), 40(2018).
- Ardah, M. T., Parween, S., Varghese, D. S., Emerald, B. S., Ansari, S. A. Saturated fatty acid alters embryonic cortical neurogenesis through modulation of gene expression in neural stem cells. J Nutr Biochem. 62, 230-246 (2018).
- Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation. Front Cell Neurosci. 11, 415(2017).
- Parween, S., et al. Nutrient-sensitive protein O-GlcNAcylation modulates the transcriptome through epigenetic mechanisms during embryonic neurogenesis. Life Sci Alliance. 5 (8), e202201385(2022).
- Varghese, D. S., et al. Developmental modeling of hepatogenesis using obese iPSCs-hepatocyte differentiation uncovers pathological features. Cell Death Dis. 13 (7), 670(2022).
- Varghese, D. S., Alawathugoda, T. T., Ansari, S. A. Fine-tuning of hepatocyte differentiation from human embryonic stem cells: Growth factor. Stem Cells Int. 2019 (5), 5968236(2019).
- Jacobs, E. Z., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in naïve human embryonic stem cells. Sci Rep. 7 (1), 16650(2017).
- Cuevas-Ocaña, S., et al. A cell-based optimized approach for rapid and efficient gene editing of human pluripotent stem cells. Int J Mol Sci. 24 (3), 12345(2023).
- Veres, A., et al. Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN-targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing. Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).
- Smith, C., Gore, A., Yan, W., Abalde-Atristain, L., Li, Z., He, C. Whole-genome sequencing analysis reveals high specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-based genome editing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 15 (1), 12-13 (2014).
- Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 4 (7), e264(2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
