De gepresenteerde methode beschrijft het genereren van een CRISPR-gemedieerde gen-knock-out in de menselijke embryonale stamcel (hESC) lijn H9, die sgRNA's gericht op het L2HGDH-gen stabiel tot expressie brengt met behulp van een zeer efficiënt lentiviraal-gemedieerd genafgiftesysteem.
Methodenartikel
CRISPR-Cas9 gemedieerde gendeletie in menselijke pluripotente stamcellen gekweekt onder feedervrije omstandigheden
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het CRISPR-Cas9-systeem voor genoombewerking heeft een revolutie teweeggebracht in genfunctiestudies in zoogdiercellen, waaronder stamcellen. De praktische toepassing van deze techniek, met name in pluripotente stamcellen, brengt echter bepaalde uitdagingen met zich mee, zoals tijd- en arbeidsintensief zijn en een lage bewerkingsefficiëntie hebben. Hier beschrijven we het genereren van een CRISPR-gemedieerde gen-knock-out in een menselijke embryonale stamcel (hESC) -lijn die stabiel sgRNA's tot expressie brengt voor het L2HGDH-gen, met behulp van een zeer efficiënt en stabiel lentiviraal-gemedieerd genafgiftesysteem. De sgRNA's gericht tegen exon 1 van het L2HGDH-gen werden chemisch gesynthetiseerd en gekloond tot de lentiCRISPR v2-puro-vector, die de constitutieve expressie van sgRNA's combineert met Cas9 in een zeer efficiënt single-vectorsysteem om hogere lentivirale titers voor hESC-infectie en stabiele selectie te bereiken met behulp van puromycine. Puromycine-geselecteerde cellen werden verder uitgebreid en eencellige klonen werden verkregen met behulp van de beperkte verdunningsmethode. De enkelvoudige klonen werden uitgebreid en verschillende homozygote knock-out klonen voor het L2HGDH-gen werden verkregen, zoals bevestigd door een vermindering van 100% in L2HGDH-expressie met behulp van Western blot-analyse. Bovendien werd met behulp van MSBSP-PCR de CRISPR-mutatieplaats stroomopwaarts van de PAM-herkenningssequentie van Cas9 in de geselecteerde homozygote klonen in kaart gebracht. Sanger-sequencing werd uitgevoerd om de exacte inserties/deleties te analyseren, en functionele karakterisering van de klonen werd uitgevoerd. Deze methode produceerde een significant hoger percentage homozygote deleties in vergelijking met eerder gerapporteerde niet-virale genafgiftemethoden. Hoewel dit rapport zich richt op het L2HGDH-gen, kan deze robuuste en kosteneffectieve aanpak worden gebruikt om homozygote knock-outs te creëren voor andere genen in pluripotente stamcellen voor genfunctiestudies.
Inleiding
Menselijke embryonale stamcellen (hESC's) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) zijn stamcellen met het potentieel om te differentiëren in alle celtypen in het lichaam. Deze cellen dienen als waardevolle hulpmiddelen voor het bestuderen van de menselijke ontwikkeling, maar ook voor het begrijpen van de onderliggende mechanismen van verschillende ziekten, en bieden zo een enorme belofte voor regeneratieve geneeskunde, ziektemodellering en het ontdekken van geneesmiddelen. Dergelijke studies omvatten het onderzoeken hoe specifieke genen bijdragen aan de ontwikkeling, het functioneren en de regulatie van organismen 1,2.
Er worden verschillende technieken en benaderingen gebruikt om de genfunctie te ontcijferen, waaronder genetische manipulatie, zoals gen-knock-out of overexpressie, en genoombewerking. Hiervan is de CRISPR-Cas9-technologie naar voren gekomen als de meest efficiënte aanpak voor onderzoeken naar gen-knock-out en genbewerking 1,2,3. Het CRISPR-Cas9-systeem werkt door gebruik te maken van een enkel gids-RNA (sgRNA) molecuul dat speciaal is ontworpen om een bepaalde DNA-sequentie van belang te identificeren en eraan te binden. Het sgRNA fungeert als een moleculaire gids en stuurt het Cas9-enzym naar de precieze locatie in het genoom die moet worden gewijzigd. Eenmaal gebonden, initieert Cas9 een dubbelstrengs breuk in het DNA op de aangewezen plaats. Na de splitsing van DNA worden de inherente herstelmechanismen van de cel geactiveerd. Deze omvatten twee belangrijke reparatieroutes: niet-homologe eindverbindingen (NHEJ) en homologiegerichte reparatie (HDR). NHEJ resulteert vaak in inserties of deleties (indels) op de plaats van de pauze, wat leidt tot genverstoring of inactivering. Omgekeerd maakt HDR het mogelijk om nieuwe DNA-sequenties in te voegen op de plaats van de pauze, waardoor de introductie van gerichte genetische veranderingen wordt vergemakkelijkt4.
Gezien het belang van gendeleties in pluripotente stamcellen, zijn er verschillende protocollen gepubliceerd over CRISPR-Cas9-gemedieerde genknock-outs in hESC's/iPSC's. Veel van deze protocollen hebben echter te maken met aanzienlijke beperkingen, zoals extreem tijdrovend, arbeidsintensief en een lage efficiëntie door het gebruik van niet-virale genafgiftemethoden5. Deze uitdagingen zijn nog meer uitgesproken bij hESC's/iPSC's, omdat bekend is dat deze cellen een lagere bewerkingsefficiëntie hebben in vergelijking met andere celtypen5. Sommige van deze beperkingen kunnen worden aangepakt door de efficiëntie van plasmide-afgifte die Cas9 en sgRNA's bevatten, te verhogen. Dit kan met succes worden bereikt met behulp van een lentiviraal vectorsysteem, dat de resultaten van het bewerken van genen aanzienlijk kan verbeteren. Lentivirus-verpakkingsprotocollen zijn goed ingeburgerd en eenvoudig, waardoor ze gemakkelijk in laboratoria kunnen worden toegepast, zelfs door onderzoekers met beperkte ervaring. Lentivirussen vertonen een hoge infectie-efficiëntie in verschillende celtypen, waaronder hESC's en iPSC's. Daarom is het gebruik van een lentiviraal systeem voor Cas9-sgRNA-expressie ideaal voor routinematige experimenten met het bewerken van genen in hESC's/iPSC's voor genfunctiestudies.
Hier bieden we een eenvoudige en ongecompliceerde methode voor zeer efficiënte op CRISPR-Cas9 gebaseerde gendeleties in hESC's in een relatief kortere tijdsduur dan conventionele protocollen (Figuur 1). Hoewel een lentivirale vector met constitutieve expressie van Cas9 en sgRNA is gebruikt, kan deze gemakkelijk worden vervangen door geneesmiddel-induceerbare Cas9-expressie voor controleerbare Cas9-expressie.
Protocol
De details van de gensequenties, reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Ontwerp van enkelvoudig gids-RNA (sgRNA), klonen en productie van lentivirale vectoren
OPMERKING: Er worden twee verschillende sgRNA-sequenties gebruikt die gericht zijn op het exon 1 van het L2HGDH-gen , beide aangepast van Qiu et al.6met PAM-plaatsen van AGG en TGG voor respectievelijk sequenties 1 en 2. Beide sgRNA's waren 20 bp lang en de uiteinden werden gemodificeerd om linkersequenties toe te voegen voor het restrictie-enzym Bsmb1 dat moest worden gekloond in de doelvector (LentiCRISPRv2) zoals beschreven in het vorige rapport6. Linkersequenties werden toegevoegd tijdens het ontwerpen van sgRNA's voor kloondoeleinden.
- Gloeiend chemisch gesynthetiseerd sgRNA's6 en klonen tot Bsmb1 single cut lentivirale vector, LentiCRISPRv2 met behulp van een geoptimaliseerd protocol zoals eerder gerapporteerd7.
- Ga verder met lentivirale verpakking en concentratie met behulp van gestandaardiseerd en geoptimaliseerd protocol7.
- Voor de productie van lentivirus zaait u HEK293T cellen (1 × 105 cellen/cm2) met behulp van DMEM, 10% FBS en 1x penicilline/streptomycine (P/S) en incubeert u 's nachts in een weefselkweekincubator bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2 onder vochtige omstandigheden.
- Wanneer 90% confluent, co-transfect HEK293T cellen met ingangsvector (lege ruggengraat of sgRNA die plasmiden tot expressie brengen) en verpakkingsplasmiden met behulp van goedkoop kationisch polymeer PEI zoals eerder beschreven7.
- Verzamel de geconditioneerde media die Lentiviral supernatans (LVS)-deeltjes bevatten 48 uur en 72 uur na transfectie en ga verder met ultracentrifugatie met behulp van een sucrosekussen en draai de buizen gedurende 2 uur bij 4 °C op 1,25,000 x g.
- Ga verder met de LVS-deeltjesconcentratie tot ten minste 200 keer het oorspronkelijke volume in PBS, aliquot, en bewaar bij -80 °C tot gebruik.
- Bepaal de titer van lentivirale deeltjes met behulp van de qPCR Lentivirus Titer Kit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
2. Lentivirale infecties en klonale voortplanting van eencellige cellen
- Voor infecties met LVS-deeltjes, zaad hESC (H9) celsuspensie met 1 × 105 cellen/0,5 ml hESC-kweekmedia (basale media + P/S + 10 μM gesteenteremmer) op volledige Matrigel (1:50) gecoate P24-putplaten in 500 μL media en 's nachts incuberen om de cellen te laten hechten. Zaad extra putjes die niet geïnfecteerd zouden zijn met LVS, maar behandeld zouden worden met puromycine om te dienen als niet-geïnfecteerde controle.
OPMERKING: Celtelling kan worden uitgevoerd met behulp van een handmatige hemocytometer of geautomatiseerde celteller. - Infecteer de cellen de volgende dag bij Multiplicity of Infection (MOI) van 10 samen met 8 μg/ml polybrene en incubeer bij 37 °C gedurende 8 uur, gevolgd door mediavervanging door verse hESC-media + P/S zonder Rock Inhibitor en ga door met kweken totdat de cellen voor 90% samenvloeien.
- Begin met de selectie van puromycine door de media aan te vullen met een concentratie van 0,8 μg/ml puromycine wanneer cellen 90% confluentie bereiken, wat meestal 48-72 uur na infectie is, en ga door met de selectie totdat alle cellen in de niet-geïnfecteerde cellen afsterven (controlegroep).
- Nadat de selectie is voltooid (meestal 4-6 dagen), splitst u stabiele cellen (1:4) en breidt u deze uit voor cryopreservatie en verdere analyse.
- Voer enkelvoudige celselectie en klonale expansie uit met behulp van cellen die L2HGDH-sgRNA-1tot expressie brengen 6.
- Bereid hiervoor een celsuspensie die overeenkomt met 500 cellen/10 ml volledige groeimedia en zaad 100 μl van deze suspensie in elk putje van een plaat met 96 putjes.
- Laat de cellen 3 dagen met rust en observeer dan.
- Markeer de putten die enkele klonen opleveren en verander de media om de dag totdat een voldoende grootte is bereikt voor de kolonies (meestal 2 weken) om verder uit te breiden, te cryopreservatie en te analyseren.
3. gDNA-extractie, MS-BSP PCR en Sanger-sequencing
- Isoleer gDNA uit cellen met behulp van de genomische DNA-isolatiekit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
- Ga verder met het in kaart brengen van mutatieplaatsen stroomopwaarts van de PAM-herkenningssequenties met behulp van Mutation Sites Based Specific Primers (MS-BSP)-analyse8.
- Hiervoor is een onbevooroordeelde rechter primer L2H-UMSBSP-R1 ontworpen om het gebied buiten de Exon1 te versterken om eventuele doelen te versterken.
- Ontwerp een bevooroordeelde linker primer L2H-BMSBSP-F1 met een identieke sequentie als sgRNA om de doelsequentie te amplificeren die dicht bij PAM-herkenningssequenties ligt.
OPMERKING: Bij zeer hoge strenge PCR-omstandigheden wordt het product waargenomen op de gel in niet-gemuteerde klonen. Er zou geen product worden waargenomen in CRISPR-knock-outklonen die mutaties vertonen die dicht bij stroomopwaarts van PAM-herkenningssequenties liggen. - Om mutaties van enkelvoudige basenparen in kaart te brengen, amplificeert PCR een sequentie van 468 bp die het hele exon 1 van L2HGDH beslaat en onderworpen is aan Sanger-sequencing gevolgd door analyse van meervoudige sequentie-uitlijning met behulp van clustalw8.
4. hESC-differentiatie en embryoïde lichaam (EB) vormingstest
- Ga verder met de gerichte differentiatie van controle en verschillende CRISPR-klonen van hESC's (H9) naar het lot van neuro-ectodermen volgens vastgestelde protocollen zoals eerder beschreven met behulp van dubbele smad-remmingsmethode 9,10,11.
- Wanneer de cellen 90% confluentie hebben, behandel de cellen met LDN193189 (200 nM) en SB431542 (10 μM) gedurende de eerste 24 uur in 100% KSR-media, gevolgd door de toevoeging van XAV939 (2 μM) gedurende nog eens 2 dagen.
- Verlaag na 3 dagen het percentage KSR media (Knockout DMEM aangevuld met 15% (v/v) KSR, 1% (v/v) L-glutamine, 1% (v/v) P/S, 1% (v/v) 10 mM MEM, en 0,1% (v/v) 2-mercaptoethanol (75%, 50%, 25%) door te combineren met N2 media (DMEM/F12 aangevuld met 1x N2 supplement, 1x P/S, ) tot 100% N2-media over een periode van 8 dagen.
- Fixeer aan het begin van dag 12 de cellen voor immunokleuring met PAX6 als neuro-ectoderm-marker.
- Gebruik voor mesoderm- en endodermale lotbepalingsstudies een op kleine moleculen gebaseerde benadering die is gebaseerd op CHIR99021 die in eerdere publicaties is beschreven12,13.
- Hiervoor, wanneer de cellen 70% confluentie bereiken, behandel met 3 μM CHIR99021 in Definitive Endoderm (DE)-media gedurende 24 uur, gevolgd door fixatie voor immunokleuring met behulp van Brachuary als mesoderm-specifieke marker.
- Kweek de cellen voor het endodermale stadium gedurende nog eens 24 uur in DE-media alleen zonder toevoeging van CHIR99021 voordat u fixeert op immunokleuring met behulp van FOXA2.
- Voor de EB-vormingstest zaait u de cellen op celoppervlakken met een lage aanhechting zonder Matrigel te gebruiken om cellen gedurende 24 uur onder suspensieomstandigheden te kweken voordat microfoto's worden gemaakt.
5. Analyse van westerse vlekken
- Was de cellen twee keer met PBS en lyse met 1x RIPA buffer met 1% SDS en 1x protease en fosfataseremmer cocktail.
- Verwijder de lysaten door centrifugeren bij 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C, gevolgd door het verzamelen van de supernatanten.
- Kwantificeer het totale celeiwit met behulp van de BCA-eiwittestkit volgens de instructies van de fabrikant. Stel de monsters in op 2 μg/μL met behulp van 4× laadbuffer voor kleurstofmonsters.
- Denatureer de eiwitmonsters bij 70 °C gedurende 10 minuten, laad gelijke hoeveelheden van elk monster en los op met behulp van SDS-PAGE-gelsmet een gradiënt van 4%-12%, gevolgd door overdracht naar het PVDF-membraan bij een constante spanning van 100 V gedurende 1 uur bij 4 °C.
- Blokkeer de membranen met 5% magere melk en incubeer in primaire antilichaamverdunningen bij 4 °C 's nachts met rotatie.
- Was vervolgens de membranen 5x met behulp van PBST-buffer en incubeer in HRP-geconjugeerde geschikte secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was de membranen opnieuw met PBST 5x, incubeer met chemiluminescent substraat en ontwikkel met behulp van röntgenfilms.
6. Immunokleuring
- Zaai de cellen op P4-putplaten en incubeer gedurende ten minste 24 uur voordat ze worden gefixeerd, zodat de cellen goed aan de oppervlakken kunnen worden bevestigd.
- Was de cellen 3x met PBS om dode cellen en mediacomponenten te verwijderen, gevolgd door fixatie met 4% PFA gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.
- Permeabiliseer de cellen met behulp van 0,3% triton X-100, gevolgd door blokkering voor niet-specifieke binding door 2% BSA in PBS te gebruiken gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer de monsters met primaire antilichamen (OCT4, NANOG, SOX2, KI67, PAX6, Brachuary, FOXA2) verdund in 1% BSA 's nachts bij 4 °C.
- Was de cellen 3x met PBS en incubeer met geschikte secundaire antilichamen (Geit anti-muis 488, Geit anti-konijn 488, Geit anti-muis 546, Geit anti-konijn 546) verdund in 1% BSA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was ten slotte de monsters 3x met PBS en vertoon ze met DAPI en beeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
Resultaten
Klonen van L2HGDH sgRNA's in lentiCRISPRv2 puro
lentiCRISPRv2 puro vector werd commercieel verkregen (zie Tabel met materialen) en verteerd met BsmB1, wat resulteerde in het vrijkomen van een 1,8 Kb stuffer fragment. Zoals te zien is in figuur 2A, werd een volledige vertering van de vector waargenomen. Voor elk construct werden zes klonen gescreend op de aan- of afwezigheid van insert met behulp van omgekeerde sgRNA-sequentie als primer en een voorwaartse primer (U6-459F) vanuit de vectorsequentie. Met deze benadering leverden alleen die klonen met het inzetstuk een PCR-product van 288 bp op, en negatieve klonen die niet de omgekeerde sequentie van sgRNA bevatten, resulteerden in geen PCR-product, zoals weergegeven in figuur 2B.
H9-infecties, stabiele selecties en Western blot
hESC's werden geïnfecteerd met lentivirale deeltjes die twee verschillende sgRNA's tot expressie brachten die gericht waren op het exon 1 van het L2HGDH-gen en geselecteerd met puromycine. Western blot-analyse werd uitgevoerd uit heterogene populaties van stabiel co-expressie van sgRNA- en Cas9-cellen om vast te stellen welke van de twee gebruikte sgRNA's efficiënter was in het induceren van gendeletie. Zoals te zien is in figuur 3A, was L2HGDH-sgRNA-1 efficiënter dan de andere sequentie bij het verminderen van de expressie van L2HGDH in heterogene celpopulaties.
Klonale selectie, expansie en eiwitanalyse
Single-cell selectie en klonale expansie werden gemaakt voor cellen die L2HGDH-sgRNA-1 tot expressie brengen. De putten die enkelvoudige klonen opleverden, werden gemarkeerd en gekweekt totdat een voldoende grootte was bereikt voor de kolonies (meestal 2 weken) om verder uit te breiden, te cryopreservatie en te analyseren (Figuur 3B). In totaal werden 22 klonen geanalyseerd met behulp van Western blot-analyse, wat vijf homozygote knock-outs (23%) opleverde voor L2HGDH. Dit resultaat toont een hoge efficiëntie van gen-knock-out met behulp van lentivirale-gemedieerde genafgifte voor stabiele co-expressie van zowel sgRNA als Cas9 uit een enkele cassette. Figuur 4 toont een Western blot-analyse van de vijf homozygote knock-outklonen samen met controlecellen, die een 100% verminderde expressie laat zien in vergelijking met de controle in de geselecteerde klonen.
Analyse op DNA-niveau
Om de CRISPR-mutatieplaats stroomopwaarts van de PAM-herkenningssequentie van Cas9 in kaart te brengen, werd Mutation Sites Based Specific Primers Polymerase Chain Reaction (MS-BSP PCR) uitgevoerd met behulp van genomisch DNA van controlecellen en van vijf verschillende klonen. Zoals te zien is in figuur 5, hebben twee klonen (A5 en B4) mutaties die direct dicht bij de PAM-herkenningssequentie liggen, terwijl de andere drie klonen (A1, A9 en B12) aantoonden dat de mutatie mogelijk niet erg dicht bij de PAM-plaats ligt en verder stroomopwaarts van de 20bp sgRNA-sequentie binnen het exon 1 van het L2HGDH-gen ligt.
Om de exacte mutaties in het DNA te vinden, werden gezuiverde PCR-producten van controlecellen (alleen vector geïnfecteerd H9) en drie verschillende CRISPR-klonen, A5, A1 en B4, onderworpen aan Sanger-sequencing, en mutatieplaatsen werden in kaart gebracht met behulp van de tool voor meerdere uitlijningen clustalw stroomopwaarts van de PAM-site8. De resultaten toonden deletiemutatie aan in de A5-kloon stroomopwaarts van de PAM-site. De andere twee klonen, A1 en B4, vertoonden insertionele mutatie stroomopwaarts van de PAM-site, zoals aangegeven in figuur 6.
Functionele analyse van klonen
Bij het genereren van CRISPR-knock-outcellijnen in hESC's, is de volgende stap het bevestigen van hun pluripotentie en differentiatiepotentieel. Voor dat doel hebben we verschillende pluripotentiemarkers getest voor drie verschillende klonen, A1, A5 en B4, en de resultaten vergeleken met controlecellen (alleen met vectoren geïnfecteerde H9). De resultaten toonden geen verandering in het pluripotentiepotentieel van knock-out cellijnen zoals bepaald door immunokleuring voor OCT4-, NANOG- en SOX2-markers. Vervolgens werden de controle- en knock-outcellijnen ook gekleurd voor de celproliferatiemarker, KI67, die ook geen verandering in knock-outcellijnen vertoonde in vergelijking met de controlegroep. Deze resultaten tonen aan dat CRISPR-knock-out geen invloed had op de zelfvernieuwende eigenschappen van deze cellen. Daarnaast werden ook EB en kolonievorming niet beïnvloed (Figuur 7). Met behulp van in vitro methoden die in ons laboratorium zijn ontwikkeld, werden alle klonen met succes gedifferentieerd in drie kiemlaagcellen, zoals bevestigd door immunokleuring voor PAX6 (neuro-ectoderm-marker), Brachyury (mesoderm-marker) en FOXA2 (endoderm-marker). Er werd geen verandering waargenomen in het differentiatiepotentieel van knock-outcellijnen in vergelijking met controlecellen, wat aantoonde dat knock-outcellen hun differentiatiepotentieel behielden (Figuur 8).
Figuur 1: Schematisch diagram van de onderzoeksopzet in 5 stappen. Stap 1: Ontwerpen en klonen van sgRNA's in Bsmb1 verteerde V2 CRISPR-vector. Stap 2: Genereren van lentivirale deeltjes met behulp van ingangsvector met sgRNA samen met verpakkingsplasmiden door co-transfectie van HEK293T cellen met behulp van polyfecties en virale concentratie met behulp van ultracentrifugatie. Stap 3: Infectie van hESC's met behulp van lentivirale deeltjes bij MOI van 10-20 en stabiele celselectie met behulp van puromycine, gevolgd door analyse van heterogene celpopulaties om de efficiëntie van sgRNA's te zien. Stap 4: Klonen van enkele cellen door de verdunningsmethode te beperken van de cellen die maximale knockdown vertoonden in heterogene populaties en selectie van enkele klonen. Stap 5: Uitbreiding van enkelvoudige klonen en analyse op DNA-niveau, eiwit- en functionele analyse van klonen op stamheid en differentiatiepotentieel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Klonen van sgRNA's in lentiCRISPR V2.puro vector. (A) Vertering van lentiCRISPR V2.puro vector met het restrictie-enzym, BsmB1. De pijl geeft een stufferfragment van 1,8 Kb aan dat vrijkomt bij de vertering van de vector. (B) Kolonie PCR-analyse voor verschillende klonen van L2HGDH sgRNA constructen 1 en 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Western blots en klonale vermeerdering met behulp van single-cell selectie. (A) Western blot-analyse van twee verschillende biologische replicaten (S1 en S2) van heterogene populaties van stabiel co-expressie sgRNA (L2H-1 en L2H-2) en Cas9 samen met controle (C) H9 hESC's. (B) Single-cell selectie en klonale expansie van H9-cellen die L2HGDH-sgRNA-1 stabiel tot expressie brengen. Pijlen geven putjes van 96 putjes aan met platen die alleen enkele klonen vertonen. Schaalbalk = 100 μM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Western blot analyse van verschillende klonen van H9. (A-C) Western blot analyse van het totale aantal cellysaten van 22 klonen leverde vijf homozygote knockouts (23%) op voor L2HGDH. (D) Bevestiging van L2HGDH-knock-outs van een ander biologisch duplicaatexperiment met behulp van Western blot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: MSBSP PCR-analyse van verschillende H9-klonen. (A) Sequentieanalyse van L2HGDH exon 1 gebruikt voor MSBSP PCR-analyse. (B) Optimalisatie van de gloeitemperatuur voor MSBSP PCR-analyse met behulp van controle en H9 V2 L2HGDH KO Clone B4. Bij 96,8 toont de besturing een band, maar B4 toont geen band, zoals aangegeven door pijlen. (C) Analyse van alle homozygote KO-klonen resulteerde in de onderstaande mapping van de mutatieplaats binnen exon 1. A1 = In/Del niet dicht bij de PAM-site; A5 = In/Del Dicht bij PAM-site; A9 = In/Del Redelijk dicht bij PAM-site; B4 = In/Del Zeer dicht bij PAM-site B12 = In/Del niet dicht bij de PAM-site. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Uitlijning van Sanger-gesequencede PCR-producten met referentie L2HGDH exon 1-sequentie. Meerdere uitlijningen van Sanger-gesequencede PCR-producten van A1, A5 en B4 en controlecellen werden uitgevoerd samen met een referentiesequentie binnen het eerste exon van L2HGDH uit de NCBI-database. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Functionele karakterisering van CRISPR knock-out cellijnen. (A) De cellen waren immunogekleurd voor pluripotentiemarkers (OCT4, NANOG, SOX2), zelfvernieuwing (KI67), EB's en kolonievorming met betrekking tot de controle-geïnfecteerde H9 hESC's. Schaalbalken: 100 μM. (B) Het percentage cellen dat positief (+ve) tot expressie komt, werd berekend ten opzichte van DAPI-kleuring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Differentiatiepotentieel van CRISPR knock-out cellijnen. Functionele karakterisering van CRISPR knock-out cellijnen in termen van hun differentiatiepotentieel met behulp van markers voor PAX6 (neuroectoderm), Brachyury (mesoderm) en FOXA2 (Endoderm) met betrekking tot de controle geïnfecteerde H9-cellen. Schaal balken: 100 μM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Stap van het protocol | Benodigde tijd |
| Klonen van sgRNA's in LentiCRISPRv2 | 4 dagen |
| Productie van lentivirus en bepaling van de titer | 5 dagen |
| hESC-infecties, stabiele celselecties en expansie | 2 weken |
| Enkelvoudige klonale selectie en expansie | 2 weken |
| Functionele analyse van klonen | 2 weken |
Tabel 1: Tijdlijn voor protocolstappen en geschatte benodigde tijd.
Discussie
Deze studie heeft een methode gestandaardiseerd die zeer efficiënte en kosteneffectieve gendeleties in hESC's mogelijk maakt door middel van CRISPR-Cas9-technologie. Deze methode bereikte met succes homozygote deletie van het L2HGDH-gen in hESC's binnen 3-4 weken, beginnend bij hESC-infectie tot single-cell klonale selectie en propagatie (Tabel 1). Hoewel CRISPR-Cas9-gemedieerde genmanipulaties kunnen worden bereikt door voorbijgaande transfecties in de meeste cellen, wordt dit een uitdaging in stamcellen vanwege de slechte transfectie-efficiëntie en hoge celtoxiciteit. Verschillende studies hebben gerapporteerd dat tot 10% van de herstelde klonen deleties vertonen. Mali et al. rapporteerden bijvoorbeeld 2% tot 4% genoombewerkingsefficiëntie in door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen na het richten op AAVS1-locus3. Een andere studie rapporteerde bewerkingsefficiënties van 1,3%-8,4% in naïeve hESC's om zich te richten op TUNA, een lang niet-coderend RNA dat betrokken is bij pluripotentie en neurale differentiatie14. Tot 10% efficiëntie werd gerapporteerd na het richten op het CFTR-gen in menselijke pluripotente stamcellen door Ocana et al.15Er is dus een efficiënte toedieningsmethode van Cas9-gRNA vereist om efficiënte genbewerking te bereiken, en dit geldt met name voor stamcellen, aangezien deze cellen een verhoogd niveau van gevoeligheid en weerstand vertonen tegen voorbijgaande toedieningsmethoden in vergelijking met typische somatische cellen en onsterfelijke cellijnen5.
In de huidige studie wordt een zeer efficiënte manier gerapporteerd om homozygote CRISPR-knock-outcellijnen te krijgen door gebruik te maken van lentivirale-gemedieerde afgifte van sgRNA's in hESC's. Het gebruik van lentivirale vectoren om CRISPR-Cas9 in de hESC's af te leveren, bleek veel efficiënter en minder tijdrovend bij het bereiken van gendeletie dan het gebruik van niet-virale vectortransfecties via chemische of mechanische middelen (gegevens niet getoond). Dit resulteerde in een significant hogere efficiëntie van genoombewerking (~23%) na klonale selectie en vermeerdering van individuele klonen. Door lentivirale gemedieerde afgifte van sgRNA's en Cas9 in hESC's te combineren met een kosteneffectieve aanpak voor de productie van lentivirus, is de huidige methode daarom niet alleen zeer efficiënt en minder tijdrovend, maar ook kosteneffectief.
Hier zijn enkele van de aanbevelingen voor een succesvolle aanpak: (1) Gebruik van een enkel lentiviraal vectorsysteem dat zowel Cas9 als sgRNA's tot expressie brengt. (2) De aanwezigheid van een antibiotische selectiemarker, zoals puromycine, op hetzelfde plasmide dat Cas9 en sgRNA's tot expressie brengt, zorgt ervoor dat bijna 100% van de cellen positief is voor Cas9-sgRNA-expressie. Dit verhoogt de kans op succesvolle genbewerkingen aanzienlijk. (3) Om nuttig te zijn voor infecties in hESC's, is het onontbeerlijk om de lentivirale vectoren te concentreren om hoge titers van virussen te verkrijgen. Van de verschillende technieken die worden gebruikt, is de meest economische benadering het gebruik van grote hoeveelheden LVS en deze 100-500 keer het oorspronkelijke volume te concentreren om titers te bereiken in het bereik van 107 tot 108 IE/ml. (4) Voor de kosteneffectieve en efficiënte methode van HEK293T celtransfecties met de plasmiden is het gebruik van PEI (polyethyleenimine) voor lentivirale vectortransfectie voor virusverpakking even efficiënt en dus kosteneffectief in vergelijking met het veelgebruikte transfectiereagens lipofectamine7. (5) De gemiddelde lentivirale titers moeten tussen 5 × 107 IE/ml liggen. (6) Klonale voortplanting door selectie van eencellige cellen is vereist om homozygote deleties van het gen dat van belang is in deze cellen te bereiken. (7) Hoewel eerdere studies hebben aangetoond dat CRISPR-Cas9-gemedieerde genbewerking in menselijke pluripotente stamcellen resulteert in zeer weinig off-target mutaties 16,17, is het nog steeds verstandig om te controleren op off-target sites. Dit kan worden bereikt door middel van efficiënte gRNA-ontwerptools om off-target effecten te minimaliseren en genoombrede sequencing van bewerkte cellijnen18, vooral voor experimenten van klinisch belang. (8) Ten slotte moet het normale karyotype van geselecteerde klonen worden geverifieerd met behulp van methoden zoals G-banding en analyse met hoge resolutie om ervoor te zorgen dat er geen grootschalige genomische veranderingen optreden. Een micronucleustest kan ook worden uitgevoerd om de frequentie van de vorming van micronuclei te beoordelen, wat kan duiden op genomische instabiliteit.
Een van de belangrijkste beperkingen van deze methode is het gebruik van een lentiviraal vectorsysteem, wat leidde tot de stabiele genomische integratie van Cas9 en sgRNA's, wat leidde tot hun constitutieve expressie na bewerking, wat ongewenst is. In de toekomst kan deze methode worden verbeterd door constitutieve promotors te vervangen door een geneesmiddel-induceerbare promotor die de expressie van het Cas9-gen stimuleert, zoals het Tet-on-systeem met doxycyclinebehandeling voor gecontroleerde expressie van Cas9.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door onderzoeksbeurzen van de Universiteit van de Verenigde Arabische Emiraten (UAEU) - grant #12M105, grant #12R167 (Zayed Center for Health Sciences), 21R105 (Zayed Bin Sultan Charitable and Humanitarian Foundation (ZCHF)) en ASPIRE, de pijler voor het beheer van technologieprogramma's van Abu Dhabi's Advanced Technology Research Council (ATRC), via het ASPIRE Precision Medicine Research Institute Abu Dhabi (ASPIREPMRIAD) toekenningsnummer VRI-20-10.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2-MERCAPTOETHANOL | Invitrogen | 31350010 | |
| 38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem cell technologies | 7920 | |
| bFGF Recombinant human | Invitrogen | PHG0261 | |
| Brachyury Rabbit mAb | Abclonal | A5078 | |
| BsmBI-v2 | NEB | R0739S | |
| chir99021 | Tocris | 4423/10 | |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | |
| Cyclopamine | Stem cell technologies | 72074 | |
| DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM NUTRIENT MIX F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Fetal bovie serum | Invitrogen | 10270106 | |
| FoxA2/HNF3β | CST | 8186 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody | CST | 2118S | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem cell technologies | 7174 | |
| HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100x Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
| Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb | CST | 9129 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| L GLUTAMINE, 100x | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2H-BMSBSP-F1 | Macrogen | CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG | |
| L2HGDH Polyclonal antibody | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH-SgRNA1-F | Macrogen | CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG | |
| L2HGDH-SgRNA1-R | Macrogen | AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC | |
| L2HGDH-SgRNA2-F | Macrogen | CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG | |
| L2HGDH-SgRNA2-R | Macrogen | AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC | |
| L2H-SeqF1 | Macrogen | GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG | |
| L2H-SeqR1 | Macrogen | GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG | |
| L2H-UMSBSP-R1 | Macrogen | GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG | |
| LentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| mTesR1 complete media | Stem cell technologies | 85850 | |
| Nanog Antibody | CST | 3580 | |
| NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 Supplement 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Supplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Oct-4 Antibody | CST | 2750 | |
| Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb | CST | 60433 | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Polybrene infection reagent | Sigma | TR1003- G | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| qPCR Lentivirus Titer Kit | Abm | LV900 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Sox2 Antibody | CST | 2748 | |
| Sucrose | Sigma | 57-50-1 | |
| TRYPSIN.05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| U6-459F | Macrogen | GAGGGCCTATT TCCCATGATTC | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
Referenties
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 structures and mechanisms. Annu Rev Biophys. 46 (1), 505-529 (2017).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Xue, C., Greene, E. C. DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing. Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).
- Zhang, Z., et al. CRISPR/Cas9 genome-editing system in human stem cells: Current status and future prospects. Mol Ther Nucleic Acids. 9, 230-241 (2017).
- Qiu, Z., et al. MYC regulation of D2HGDH and L2HGDH influences the epigenome and epitranscriptome. Cell Chem Biol. 27 (5), 538-550.e537 (2020).
- Sheikh, M. A., Ansari, S. A. Lentiviral mediated delivery of shRNAs to hESCs and NPCs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (PEI). J Vis Exp. (183), e63953(2022).
- Guo, J., et al. A simple and cost-effective method for screening of CRISPR/Cas9-induced homozygous/biallelic mutants. Plant Methods. 14 (1), 40(2018).
- Ardah, M. T., Parween, S., Varghese, D. S., Emerald, B. S., Ansari, S. A. Saturated fatty acid alters embryonic cortical neurogenesis through modulation of gene expression in neural stem cells. J Nutr Biochem. 62, 230-246 (2018).
- Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation. Front Cell Neurosci. 11, 415(2017).
- Parween, S., et al. Nutrient-sensitive protein O-GlcNAcylation modulates the transcriptome through epigenetic mechanisms during embryonic neurogenesis. Life Sci Alliance. 5 (8), e202201385(2022).
- Varghese, D. S., et al. Developmental modeling of hepatogenesis using obese iPSCs-hepatocyte differentiation uncovers pathological features. Cell Death Dis. 13 (7), 670(2022).
- Varghese, D. S., Alawathugoda, T. T., Ansari, S. A. Fine-tuning of hepatocyte differentiation from human embryonic stem cells: Growth factor. Stem Cells Int. 2019 (5), 5968236(2019).
- Jacobs, E. Z., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in naïve human embryonic stem cells. Sci Rep. 7 (1), 16650(2017).
- Cuevas-Ocaña, S., et al. A cell-based optimized approach for rapid and efficient gene editing of human pluripotent stem cells. Int J Mol Sci. 24 (3), 12345(2023).
- Veres, A., et al. Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN-targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing. Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).
- Smith, C., Gore, A., Yan, W., Abalde-Atristain, L., Li, Z., He, C. Whole-genome sequencing analysis reveals high specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-based genome editing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 15 (1), 12-13 (2014).
- Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 4 (7), e264(2015).
Herprints en machtigingen
