Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Verrijken van subcellulaire eiwitten in leptospira met behulp van een op Triton X-114 gebaseerde fractioneringsbenadering

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67298

⸱

8 augustus 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, ICMR - Regional Medical Research Centre, 2Department of Chemistry & Molecular Biology, University of Gothenburg

In dit artikel

Samenvatting

Hoewel prokaryoten geen organellair systeem hebben, zijn er subcellulaire regio's met gelokaliseerde eiwitten. Kwantitatieve en kwalitatieve analyse van de enzymen en eiwitten in de subcellulaire regio's is belangrijk voor het ontwikkelen van medicijn- en vaccindoelen. Hier illustreren we de subcellulaire fractionering van leptospiraaleiwitten met behulp van Triton X-114 en de analyse ervan.

Samenvatting

Prokaryoten hebben geen precieze subcellulaire organellen, maar vertonen verschillende regio's zoals cytoplasma, binnenmembraan, periplasma en buitenmembraan, waar de meeste biochemische en fysiologische functies zijn georganiseerd. Om de functionele kenmerken van eiwitten te begrijpen, moet dus hun subcellulaire lokalisatie worden opgehelderd. Het extraheren van subcellulaire eiwitten uit gramnegatieve bacteriën brengt echter uitdagingen met zich mee vanwege hun complexe fosfolipidedubbellaag. Hoewel Triton X-114 veelbelovend is gebleken bij de extractie van buitenmembraaneiwit (OMP), blijft een beknopt protocol ongrijpbaar. Dit protocol demonstreert een stapsgewijze workflow voor het extraheren van subcellulaire eiwitten met behulp van de spirocheet Leptospira als model. Deze techniek, met subcellulaire fractionering en fasescheiding, levert verschillende fracties op voor cytoplasmatische, buitenste en binnenste membraaneiwitten. Het reinigingsmiddel Triton X-114 is zeer geschikt voor fasescheiding vanwege de optimale troebelingspunttemperatuur (~22 °C) en de lage kritische micelconcentratie (CMC), waardoor een efficiënte extractie en zuivering van natuurlijke eiwitten met minimale denaturatie mogelijk is. De analyse onthult met name de efficiëntie bij het onderscheiden van eiwitten uit de binnen- en buitenmembranen die verschillen van het cytoplasma.

Inleiding

Subcellulaire proteomische (SCP) analyses spelen een cruciale rol bij het ophelderen van bacteriële pathogenese door het proteoom binnen specifieke subcellulaire compartimenten van bacteriële cellen te analyseren. Deze subcellulaire proteomics-benadering kenmerkt bacteriële eiwitten binnen verschillende compartimenten, waardoor de complexiteit wordt verminderd door zeer overvloedige eiwitten uit te sluiten en inzicht te geven in hun organisatie en proportionele overvloed 1,2. Bijvoorbeeld, met behulp van subcellulaire fractionering en LC-MS/MS-technieken, onthulde een studie over Shewanella oneidensis een aanzienlijk deel van zijn proteoom, wat cruciale details opleverde met betrekking tot de compartimentarchitectuur van cel- en eiwitovervloed. Deze studie dient als een fundamenteel kader voor later onderzoek naar subcellulaire organisatie binnen gramnegatieve bacteriën3. Op het gebied van bacteriële pathogenese is het afbakenen van het bacteriële proteoom tijdens in vivo infectie noodzakelijk om de mechanismen te begrijpen die de pathogeniteit aansturen4. Het onderzoeken van het proteoom van intracellulaire Salmonella in epitheelcellen in verschillende infectiestadia heeft een belangrijke rol gespeeld bij het onthullen van de adaptieve strategieën die door bacteriële pathogenen in hun intracellulaire omgeving worden gebruikt 4,5. SCP-strategieën bieden uitgebreide inzichten in de cellulaire dynamiek door de overvloed en translocatie van eiwitten binnen verschillende cellulaire compartimenten te beoordelen. Deze methode vergemakkelijkt de uitgebreide identificatie van eiwitten uit diverse bacteriële compartimenten, waardoor de grondige analyse van bacteriële proteomen wordt verbeterd 6,7.

De subcellulaire distributie van eiwitten dicteert niet alleen hun functionele activiteit, maar verbetert ook hun functionele diversiteit8. Enzymen vertonen bijvoorbeeld verschillende regulerende mechanismen en activiteitsniveaus, afhankelijk van hun subcellulaire lokalisatie. Transglutaminasen (TGases) vertonen bijvoorbeeld verschillende rollen of regulerende mechanismen in verschillende subcellulaire compartimenten in stuifmeelbuisjes: cytoplasmatische TGases nemen primaire amines op in cytosolische eiwitten (bijv. actine en tubuline) op een Ca(2+)-afhankelijke manier, in interactie met het cytoskelet; membraan-TGases zijn geassocieerd met Golgi en plasmamembranen, wat wijst op een rol bij exocytotische toediening; en celwand-geassocieerde TGases reguleren de apicale groei door te colokaliseren met celwandmarkers. Deze functionele verschillen worden gemedieerd door compartimentspecifieke rollen9. Bovendien onderstreept het herstel van geoxideerde eiwitten in de bacteriële envelop de cruciale rol van enzymsystemen binnen specifieke cellulaire compartimenten die worden blootgesteld aan reactieve zuurstofsoorten10. Overweeg endotheliaal stikstofmonoxidesynthase (eNOS), waarvan de subcellulaire lokalisatie wordt gemoduleerd door lipidemodificaties, waardoor de interactie met diverse cellulaire membranen wordt beïnvloed11. Enzymcompartimentalisatie handhaaft verschillende omgevingen die bevorderlijk zijn voor interacties tussen enzymen en substraten, waardoor compartimentspecifieke metabolische processen worden vergemakkelijkt12.

Bacteriën en andere prokaryoten hebben geen duidelijke subcellulaire organellen; Er zijn verschillende regio's, waaronder cytoplasma, binnenmembraan, periplasma en buitenmembraan. De meeste biochemische en fysiologische functies in het organisme zijn georganiseerd in verschillende subkeldercompartimenten13. Subcellulaire lokalisatie van eiwitten is dus belangrijk om hun functionele kenmerken te voorspellen. Het extraheren van subcellulaire eiwitten uit gramnegatieve bacteriën vormt echter een uitdaging vanwege hun complexe dubbelmembraan fosfolipidedubbellaag. Conventionele extractiemethoden, waarbij gebruik wordt gemaakt van reinigingsmiddelen zoals natriumdodecylsulfaat (SDS) en additieven zoals ureum, brengen vaak de integriteit van membraaneiwitten in gevaar, wat gevolgen heeft voor stroomafwaartse analyses14,15. Bovendien speelt de lipidensamenstelling een belangrijke rol bij het vormgeven van de conformationele veranderingen van membraaneiwitten. Het succes van oplosbaarheid hangt af van factoren zoals de verhouding tussen wasmiddel en lipide en eiwit, aangezien het proces bestaat uit het inbrengen van wasmiddel in de lipidedubbellaag, gevolgd door eiwitoplosbaarheid16. De keuze van het wasmiddel is van cruciaal belang voor het effectief oplossen van membraaneiwitten, rekening houdend met factoren zoals de temperatuur van het troebelpunt en de incubatietijd17. De lipidenomgeving kan de conformatieveranderingen van membraaneiwitten beïnvloeden18,19.

Detergenten zijn essentieel voor het extraheren van membraaneiwitten uit biologische membranen en het waarborgen van hun oplosbaarheid in waterige oplossingen, een voorwaarde voor latere eiwitzuivering. Het zuiveren van membraaneiwitten is echter vaak een uitdaging omdat ze uit hun oorspronkelijke lipidemembraanomgeving worden verwijderd en in een wasmiddelbuffer worden geplaatst, die de fysische en chemische eigenschappen van het membraan slechts gedeeltelijk repliceert20. Na extractie worden membraaneiwitten doorgaans gezuiverd in daaropvolgende processen met behulp van dialyse, eiwitprecipitatie en sommige chromatografiemethoden als oplosbare eiwitten20,21. Fasescheiding biedt een krachtig alternatief of aanvulling op op chromatografie gebaseerde zuiveringsprotocollen en kan rechtstreeks worden toegepast op opgeloste eiwitten. Kortom, fasescheiding zorgt ervoor dat integrale membraaneiwitten zich kunnen verdelen in de detergent-verrijkende fase en cytosolische eiwitten in de detergent-verarmde waterige fase20,22. In eerdere studies is beschreven dat verschillende detergentia worden gebruikt bij de oplosbaarheid van membraaneiwitten20. Deze omvatten de Triton-familie (Triton X-100 en Triton X-114), de Tleen-familie (Tween-20 en -80), anionische wasmiddelen, kationische wasmiddelen, polyoxyethyleenglycol-monoether-wasmiddelen enz., maar ze hebben voor- en nadelen op het gebied van eiwitstructuur en -functie20. De fysisch-chemische eigenschappen van deze detergenten hebben een grote invloed op de faseverdeling en oplosbaarheid van membraaneiwitten20. Detergenten zijn amfipathische moleculen met een polaire kopgroep en een hydrofobe koolwaterstofketen. Bij lage concentraties bestaan ze als monomeren in water. Boven de kritische micelconcentratie (CMC) vormen ze micellen waarvan de grootte afhangt van het type wasmiddel, waarbij het aggregatiegetal het aantal moleculen per micel aangeeft (ook wel molecuulgewicht van de micel genoemd). Een andere belangrijke factor is het "troebelingspunt", dat kan worden bereikt door de temperatuur van een waterige micellaire wasmiddeloplossing te veranderen die troebel wordt en uiteindelijk twee verschillende fasen vormt. Dit proces staat bekend als fasescheiding of troebelingspuntextractie. Een hoge CMC kan meer membraaneiwitten opleveren die overeenkomen met hoge concentraties wasmiddel met een zwakkere binding, die kunnen worden gedialyseerd tegen een buffer met een gedefinieerde wasmiddelconcentratie20. Het bereiken van een hoge CMC in de meeste wasmiddelen vereist echter een hoge temperatuur van het troebelingspunt, wat de geëxtraheerde eiwitstructuur en -functie kan beïnvloeden en stroomafwaartse processen kan beïnvloeden. Zelfs de hoge concentratie wasmiddel in deze fase kan schadelijk zijn voor eiwitten en problemen veroorzaken bij de behandeling van vloeistoffen voor het pipetteren van precieze volumes vanwege de hoge viscositeit. Triton X-100 heeft bijvoorbeeld een hoge opbrengst aan membraaneiwitten in de detergentmicel boven de troebelpunttemperatuur van 64-65 °C. Om de werktemperatuur te behouden, 9%-23% (NH4)2DUS4 of 16%-25% NaCl-toevoeging kan worden teruggebracht tot kamertemperatuur (RT), wat resulteert in een hoge concentratie wasmiddel, wat waarschijnlijk de eiwitstabiliteit beïnvloedt. Evenzo gebruikt extractie op basis van tween een hoge temperatuur van het wolkenpunt (76 °C voor tween 20 en 93 °C voor tween 80). Anionisch wasmiddel SDS wordt vaak gebruikt in eiwittoepassingen, maar denatureert meestal eiwitten20. Onderzoekers, met als doel membraaneiwitten efficiënt te extraheren, identificeerden Triton X-114 als een klassiek wasmiddel vanwege de optimale troebelpunttemperatuur van ongeveer 22 °C, ideaal voor membraaneiwitstudies. Triton X-114 werd voor het eerst geïntroduceerd door Bordier in 1981 en wordt sindsdien op grote schaal gebruikt voor de extractie en zuivering van membraaneiwitten in diverse bronnen, waaronder dierlijke en plantaardige weefsels en micro-organismen20,22. De lage CMC van Triton X-114 voorkomt verwijdering door dialyse; Het milde karakter minimaliseert echter de denaturatie van membraaneiwitten in de met wasmiddel verrijkte fase. Bovendien vormt Triton X-114 kleinere micellen (n = 7-8) in vergelijking met Triton X-10020. Het studieprotocol van James G. Pryde maakte gebruik van Triton X-114 voor membraaneiwitextractie uit gekweekte zoogdiercellen. Door gebruik te maken van een wolkpunttemperatuur boven 20 °C (incubatie bij 30 °C gedurende 3 min), werden integrale membraaneiwitten verdeeld in de met wasmiddel verrijkte fase, terwijl perifere en cytosolische eiwitten werden teruggewonnen uit de met wasmiddel verarmde waterige fase22. Verder gebruikten David A. Haake et al. Triton X-114 om buitenmembraaneiwitten (OMP's) uit te extraheren Leptospira interrogans, met en zonder CaCl2 als additief23,24. Latere studies bevestigden dat Triton X-114 effectief OMP's uit subcellulaire compartimenten extraheert zonder toevoegingen zoals glycerol of CaCl225,26. De opname van zouten kan echter de concentratie van wasmiddelen verhogen, wat van invloed kan zijn op grootschalige proteoomstudies met behulp van high-throughput massaspectrometrie20. In ons werk aan subcellulaire proteoomanalyse hebben we Triton X-114 gebruikt in combinatie met tandem-massaspectrometrie, waardoor een aanzienlijke verrijking werd bereikt in alle subcellulaire compartimenten, inclusief cytoplasmatische, binnenmembraan- en buitenmembraaneiwitten25,26. Het primaire doel van het huidige protocol is het efficiënt verrijken van subcellulaire compartimenten van een typische gramnegatieve bacteriële cel en het minimaliseren van problemen in stroomafwaartse processen. Bovendien is het protocol ontworpen om kosteneffectief en tijdbesparend te zijn. Hier gaan we dieper in op het in het laboratorium ontwikkelde geoptimaliseerde protocol voor subcellulaire eiwitisolatie en bespreken we elk knelpunt dat zich tijdens het extractieproces voordoet.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van Leptospira interrogans voor het subcellulaire eiwitextractie-experiment. Hoewel dit protocol kan worden aangepast voor gebruik met andere gramnegatieve bacteriën, kan optimalisatie nodig zijn, afhankelijk van de specifieke onderzoeksdoelstellingen. Tabel met materialen en tabel 1 geven de lijst van chemicaliën en apparatuur, samen met de samenstellingen van respectievelijk buffers en reagensoplossingen, terwijl tabel 2 de laboratoriumfaciliteiten schetst.

1. Leptospira-stam en kweekomstandigheden

  1. Verkrijg de L. interrogans serogroep Icterohaemorrhagiae serovar Copenhageni stam Fiocruz L1-130.
    OPMERKING: Deze stam is verkregen van de Indian Council of Medical Research - Regional Medical Research Centre in Port Blair, India, een samenwerkingscentrum van de WHO dat gespecialiseerd is in diagnose, referentie, onderzoek en training van leptospirose.
  2. Kweek Leptospira (inoculum met ~1 × 106 cellen/ml) in 50 ml Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) medium aangevuld met 1% runderserumalbumine (BSA).
  3. Incubeer bij 30 °C totdat de cultuur de groeifase halverwege de log bereikt (3,5 × 108 cellen/ml). Test aliquots van het gekweekte medium op voedingsagarplaten om er zeker van te zijn dat het medium onbesmet blijft.
    OPMERKING: Gebruik donkerveldmicroscopie en een Petroff-Hausser-telkamer om de cellen te tellen. Zie voor meer informatie een eerder gepubliceerd artikel27.

2. Cellen oogsten

  1. Breng na een incubatietijd van 7 dagen drie biologische replicaten van de L. interrogans-cultuur over in centrifugebuisjes in gelijke hoeveelheden (elk 25 ml).
    OPMERKING: Leptospira-cultuur werd tijdens de overdracht behandeld in een laminaire luchtstroomkap in een BSL-2-laboratoriumfaciliteit.
  2. Centrifugeer alle buisjes bij 2500 × g gedurende 45 minuten bij 4 °C. Giet het bovenstaande voorzichtig over in een bekerglas met ontsmettingsmiddel en gooi het weg. Gebruik de celkorrel voor de volgende stap.
  3. Was de celpellets driemaal met een fosfaatgebufferde zoutoplossing (telkens 1 ml) aangevuld met 5 mM MgCl2 en centrifugeer na elke wasbeurt gedurende 10.000 × g bij 4 °C.
    OPMERKING: Met deze stap wordt de ongewenste BSA die aanwezig is in het EMJH-medium van het oppervlak van de celpellet verwijderd.

3. Subcellulaire eiwitextractie

  1. Triton X-114 extractie
    1. Behandel de Leptospira-celpellet , verkregen na het oogsten, met een extractiebuffer die 10 mM Tris-Cl (pH 8), 1% Triton X-114 en 150 mM NaCl bevat met een snelheid van 1 ml per geoogste pellet (Tabel 1) (Optioneel - een proteaseremmercocktail kan worden toegevoegd volgens experimentele doeleinden).
      OPMERKING: De procedure omvat het eenvoudig blootstellen van bacteriën aan een wasmiddeloplossing door de extractiebuffer toe te voegen om membraaneiwitten te extraheren.
    2. Meng de extractiebuffer voorzichtig met de pellet met behulp van een micropipet onder 25 °C totdat de oplossing visueel troebel wordt.
    3. Incubeer het mengsel een nacht bij 4 °C.
    4. Meng het resulterende extract opnieuw met een micropipet en centrifugeer het gedurende 30 minuten bij 15.000 × g bij 4 °C.
    5. Decanteer het bovenstaande in een andere injectieflacon en bewaar de celpellet voor latere extractieprocessen.
      OPMERKING: Dit supernatans bevat een mengsel van hydrofiele en hydrofobe eiwitten die overvloedig afkomstig zijn uit het cytoplasma en het buitenmembraan en wordt gebruikt voor fasescheiding.
    6. Voeg 50 μL buffer met 10 mM Tris-Cl (pH 8), 8 M ureum, een proteaseremmercocktail en 1% natriumdodecylsulfaat (SDS) toe aan de celpellet.
    7. Draai het mengsel gedurende 5 minuten continu na het toevoegen van de extractiebuffer en incubeer vervolgens nog eens 5 minuten bij 4 °C.
    8. Centrifugeer het mengsel opnieuw bij 15.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C en noem het resulterende bovenstaande middel de pelletfractie (P).
      OPMERKING: De pelletfractie bleek een hoge overvloed aan inwendige membraaneiwitten te bevatten in Leptospira25,26.
  2. Fase partitie
    1. Stel de Triton X-114-concentratie van het bovenstaande verkregen uit de extractie in op 2%. Als het bovenstaande volume bijvoorbeeld 900 μl is, voeg dan 9 μl Triton X-114 wasmiddel toe om de gewenste concentratie te bereiken.
    2. Incubeer het mengsel gedurende 1 uur bij 37 °C en centrifugeer vervolgens 5 minuten bij 2000 × g bij 30 °C. Deze centrifugatie met lage snelheid kan de scheiding van fasen versnellen.
    3. Laat het mengsel in twee verschillende fasen uiteenvallen: waterig en afwasmiddel. Zorg voor een goede centrifugatie bij lage snelheid om zichtbare scheiding te bereiken. Laat het indien nodig 1 minuut zitten voordat u het afzonderingt. Als er geen scheiding optreedt, herhaalt u stap 3.2.2 indien nodig.
      OPMERKING: Fasescheiding kan visueel worden waargenomen door troebelheidsmetingen met behulp van een spectrofotometer of door statische lichtverstrooiing. Om de nauwkeurigheid van de wolkenpunttest te vergroten, voegt u een hydrofobe kleurstof (5-hexadecanoyl-aminoeosie) met een concentratie van 500 nM toe aan de oplossing en analyseert u deze met ultraviolet-zichtbare spectroscopie (UV-VIS).
    4. Isoleer de bovenste waterige fase door het grensvlak met een steriele spuit te doorboren en over te brengen naar een aparte injectieflacon. Isoleer de onderste wasmiddelfase met behulp van een micropipet en bewaar deze in een aparte injectieflacon.
      OPMERKING: Behandel de injectieflacon met beide fasen voorzichtig tijdens het scheidingsproces. Voordat u de injectieflacon met een spuit doorboort, moet u het deksel openen om te voorkomen dat de naald breekt of dat het moeilijk wordt om de bovenste waterige fase te extraheren. Het gebruik van een spuit zorgt voor een nauwkeurigere volumemeting van elke fase na scheiding en minimaliseert kruisbesmetting van eiwitten tussen de fasen.
    5. Label de fasen als waterig (A) en wasmiddel (D) en bewaar ze bij -20 °C voor toekomstig gebruik.

4. Schatting van eiwitten

  1. Beoordeel de eiwitconcentraties van elke Triton X-114-fractie (waterig, wasmiddel en pellet) met behulp van de bicinchonine-assay28 of een andere geschikte methode.

5. Natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) gelelektroforese

OPMERKING: Eiwitten uit elke fractie (waterig, wasmiddel, pellet) moeten worden behandeld met bèta-mercaptoethanol om ze te verminderen en vervolgens worden gescheiden met 10% SDS-PAGE (drie biologische replicaten). Het recept voor de 10% SDS-PAGE is te vinden in Tabel 1. Voor het targeten van eiwitmonsters moeten alle enzymactiviteitsanalyses worden uitgevoerd in een native vorm die kan worden opgelost in native PAGE.

  1. Resuspendeer het eiwitmonster in ijskoude aceton en gebruik vier keer het volume van het monster. Incubeer het mengsel minimaal 2 uur bij -20 °C en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 14.000 × g . Resuspendeer bovendien de pelletfractie in 80% ijskoude aceton en incubeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 4 °C. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 14.000 × g om overtollige ureumzoutkristallen te verwijderen.
  2. Verwijder na het centrifugeren voorzichtig het bovenstaande en plaats de eiwitkorrel in een droog bad totdat alle resterende aceton uit de injectieflacons is verdampt.
  3. Incubeer de eiwitmonsters in een monsterbuffer van 20 μl die bèta-mercaptoethanol bevat en verwarm ze vervolgens gedurende 10 minuten bij 95 °C in een waterbad of droogbad.
    OPMERKING: Hier vertegenwoordigen de eiwitmonsters de waterige (A) fractie die cytoplasmatische eiwitten bevat, de detergent (D) fractie die de buitenste membraaneiwitten bevat en de pellet (P) fractie die de binnenste membraaneiwitten bevat.
  4. Laad de monsters met A, D en P in elk putje van de 10% SDS-PAGE-gel naast een voorgekleurde eiwitmarker (M) en totaal eiwit (T).
    OPMERKING: Het totale eiwit kan worden bereid door alle drie de fracties samen te trekken in een enkele injectieflacon met behulp van 20 μL monsterbuffer.
  5. Gebruik 1x elektrodebuffer in het elektroforese-apparaat (Tabel 1). Stel de loopparameters van de gel in op 6 mA voor de stapelgel en 12 mA voor de oplossende gel. Voer de elektroforese uit bij RT.
  6. Bevlek de gel met Coomassie Brilliant Blue G of andere eiwitvlekken die in het lab verkrijgbaar zijn.

6. Immunoblotting

  1. Incubeer na het scheiden van de gel de ongekleurde gel gedurende 5 minuten in een transferbuffer (25 mM Tris-basis, 190 mM glycine, 20% methanol).
  2. Incubeer vloeipapier van de juiste grootte gedurende 5 minuten in de immunoblot-overdrachtsbuffer en monteer ze vervolgens als de onderste laag van de sandwich.
  3. Gebruik polyvinylideenfluoride (PVDF)-membranen of nitrocellulosemembranen om eiwitten uit de ongekleurde gels over te brengen. Begin met het onderdompelen van het PVDF-membraan in absolute methanol gedurende 30 s, gevolgd door een week van 5 minuten in de immunoblot-overdrachtsbuffer. Integreer het vervolgens in de blotting sandwich.
  4. Plaats nu de onbevlekte gel die uit de transferbuffer is verwijderd en gebruik deze in de transferblotting sandwich.
  5. Dek ten slotte de sandwich af door deze op ander vloeipapier erop te leggen, verwijder eventuele ingesloten luchtbellen met een veegrol en voer de overdracht uit met behulp van een halfdroge overdrachtsmethode.
    OPMERKING: Andere benaderingen, waaronder droge en natte overdracht, kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de laboratoriumfaciliteiten.
  6. Dompel het membraan onder in een blokkerende buffer (8% magere melk in TBS-0,1% Tween 20 [TBS-T]) gedurende 2 uur, gevolgd door een nacht incubatie bij 4 °C met monospecifieke antisera* gericht tegen Leptospira-lipoproteïne LipL41 (1:5000), of flagellair filament 35 kDa kerneiwit (FlaB) (1:4000) (*aangepast antilichaam). Spoel het membraan drie keer met TBS-T, zodat elke spoeling 5 minuten kan doorgaan.
    OPMERKING: Gebruik een antilichaam dat van belang is. De verdunningsfactor van antilichamen kan variëren.
  7. Incubeer het membraan met een secundair anti-konijn-antilichaam van muizen, geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP) IgG (verdunning 1:20000) gedurende 2 uur bij RT.
  8. Stel het membraan bloot aan het elektrochemiluminescentie (ECL) reagens om eiwitbanden te visualiseren.
  9. Plaats het membraan onder blauwgevoelige röntgenfilm in een donkere kamer.
    OPMERKING: Alle andere ontwikkelingsmethoden kunnen ook worden gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit experiment gebruikten we de spirocheet Leptospira als modelorganisme om subcellulaire compartimenten te extraheren. We hebben een strategische methodologie toegepast die is verankerd in troebelingspunt en kritische myceliumconcentratie (CMC), waarbij we gebruik hebben gemaakt van de effectiviteit van Triton X-114, een niet-ionisch reinigingsmiddel (Figuur 1). Alvorens verder te gaan, werd een eiwitschatting uitgevoerd om de concentratie in el...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Subcellulaire fractioneringstechnieken spelen een cruciale rol bij de isolatie van discrete cellulaire bestanddelen voor latere analyse. Triton X-114, een niet-ionisch wasmiddel, wordt vaak gebruikt in deze technieken vanwege het vermogen om monsters in verschillende fasen te verdelen, waardoor de scheiding van verschillende cellulaire componenten mogelijk is32. Triton X-114 is bijzonder nuttig geweest bij het extraheren van membraaneiwitten (in inheemse vorm) uit...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben verklaard dat zij geen tegenstrijdige financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs betuigen hun oprechte dankbaarheid aan de Indian Council of Medical Research, New Delhi, India, voor de financiële steun die wordt verleend via Grant No. Leptos/22/2013-ECD-I-2012-2400 en het Department of Science and Technology, Science and Engineering Research Board, New Delhi, India, voor hun financiële steun via subsidienr. SR/SO/HS/0108/2012 aan M.G.M. Bovendien spreken de auteurs hun waardering uit voor de Indian Council of Medical Research, New Delhi, India, voor het toekennen van een Senior Research Fellowship via Grant No. ICMR-SRF 2020-0756/PROTEOMICS-BMS, Fellowship/131/2022-ECD-II-2021-8230 naar respectievelijk HP en AS en Department of Science and Technology, Science and Engineering Research Board, New Delhi, India, subsidienr. PDF/2017/000343 naar S.A.D.C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Azijnzuur  Sigma 695092
Aceton  Sigma 32201
Acrylamid  Sigma A-3553
Ammoniumpersulfaat  Sigma A-3678
Balans SHIMADUZ Z741079
Bis Acrylamide  Sigma M7279
Rundserumalbumine fractie V (BSA)  Sigma A-8022
Broomfenolblauw  Sigma B-8026
Centrifugebuis (50 mL)Tarsons500020
Conische fles met dop (150 mL)Tarsons431030
Koelcentrifuge Eppendorf 5355316200
Coomassie briljantblauw  Sigma1.12553
Donkerveldmicroscoop ZEISS GmbH37081
Delicate Task WipesKimtech Science34155
Droogbad Eppendorf 535531620
Ellinghausen–McCullough–Johnson–Harris (EMJH) medium, Difco Difco 279410
Gellades: Gellades moeten minimaal 2 cm breder zijn in afmetingen en een glad en vlak oppervlak hebben met deksel.  Hoefer Niet van toepassing
Glasbeker (150 mL)Tarsons421030
Glycine G8790  Sigma G-8898
Immobilon Blotting Filter PaperMilliporeIBFP0813C
Immunoblot semi-droge opstelling ATTA AE-6675
Incubator - Voor het incuberen van de gellades gedurende 18 uur bij 37°C. EYELA SLI-700
Laminale luchtstroom Niet van toepassing Niet van toepassing
Luminol  Sigma 09253
Magnesiumchloride M8266  Sigma M8266
Magneetschep TARSONS 6040
Methanol  Sigma 17995-7
Micropipettipjes (10 µL–10 mL)AxygenT-10, T-200-C,T-1000-C, T-10ML-C
Micropipetten Eppendorf EP2231300010
Microtubes (1,5 mL Safe-Lock)EppendorfEP022363212
Mini spin Genaxy GEN-MINI-6K
Multimode readerBMG LABTECH S/N 413-3877
Vrij van vet droge melk, rundSigma-AldrichM7409
P-Coumaric acid  Sigma C9008
Fosfaat gebufferde zoutoplossing  SigmaP4417 
Koelkast LG GC-B217BLJ2
Rocker - Roterende schudler met lage snelheid voor het kleuren van de gel.  TARSONS 4080
SDS-PAGE SETUP- Electroforese Apparatuur Hoefer, Inc. SE300-10A-1.0 Hoefer model ‘miniVE’ die 10 cm x 8 cm grote gel van dikte 1 mm kan gieten. 
Natriumchloride   Sigma 5886
Natriumdodecylsulfaat (SDS)  Sigma L-4396
TEMED  Sigma T-9281
Triton X-114  Sigma648468
Trizma Base (TRIS) T6066  Sigma T6066
Vortex TARSONS 3020

Referenties

  1. Curreem, S. O. T., Watt, R. M., Lau, S. K. P., Woo, P. C. Y. Two-dimensional gel electrophoresis in bacterial proteomics. Protein Cell. 3 (5), 346-363 (2012).
  2. King, B. R., Latham, L., Guda, C. Estimation of subcellular proteomes in bacterial species. Open Appl Informatics J. 3 (1), 1-11 (2009).
  3. Brown, R. N., Romine, M. F., Schepmoes, A. A., Smith, R. D., Lipton, M. S. Mapping the subcellular proteome of Shewanella oneidensis MR-1 using Sarkosyl-based fractionation and LC−MS/MS protein identification. J Proteome Res. 9 (9), 4454-4463 (2010).
  4. Cash, P. Investigating pathogen biology at the level of the proteome. Proteomics. 11 (15), 3190-3202 (2011).
  5. Liu, Y., et al. Temporal regulation of a Salmonella Typhimurium virulence factor by the transcriptional regulator YdcR. Mol Cell Proteomics. 16 (9), 1683-1693 (2017).
  6. Rey, S., Gardy, J. L., Brinkman, F. S. Assessing the precision of high-throughput computational and laboratory approaches for the genome-wide identification of protein subcellular localization in bacteria. BMC Genomics. 6 (1), 162(2005).
  7. Lietzén, N., et al. Quantitative subcellular proteome and secretome profiling of influenza A virus-infected human primary macrophages. PLoS Pathog. 7 (5), e1001340(2011).
  8. Arioka, Y., Watanabe, A., Saito, K., Yamada, Y. Activation-induced cytidine deaminase alters the subcellular localization of Tet family proteins. PLoS One. 7 (9), e45031(2012).
  9. Del Duca, S., Faleri, C., Iorio, R. A., Cresti, M., Serafini-Fracassini, D., Cai, G. Distribution of transglutaminase in pear pollen tubes in relation to cytoskeleton and membrane dynamics. Plant Physiol. 161 (4), 1706-1721 (2013).
  10. Gennaris, A., et al. Repairing oxidized proteins in the bacterial envelope using respiratory chain electrons. Nature. 528 (7582), 409-412 (2015).
  11. Schilling, K., et al. Translocation of endothelial nitric-oxide synthase involves a ternary complex with caveolin-1 and NOSTRIN. Mol Biol Cell. 17 (9), 3870-3880 (2006).
  12. Mintz-Oron, S., Aharoni, A., Ruppin, E., Shlomi, T. Network-based prediction of metabolic enzymes' subcellular localization. Bioinformatics. 25 (12), i247-i252 (2009).
  13. Phukan, H., Sarma, A., Rex, D. A. B., Rai, A. B., Prasad, T. S. K., Madanan, M. G. Unique posttranslational modification sites of acetylation, citrullination, glutarylation, and phosphorylation are found to be specific to the proteins partitioned in the Triton X-114 fractions of Leptospira. ACS Omega. 7 (22), 18569-18576 (2022).
  14. Tinrat, S. Preliminary phytochemical analysis, antibacterial and anti-biofilm activities of Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe extracts. Malaysian J Microbiol. 18 (4), 344-353 (2022).
  15. Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), a000414-a000414 (2010).
  16. Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Curr Protoc Protein Sci. 53 (1), ps0408s53(2008).
  17. Santos, H. deL., Ciancaglini, P. A practical approach to the choice of a suitable detergent and optimal conditions for solubilizing a membrane protein. Biochem Educ. 28 (3), 178-182 (2000).
  18. Picard, M., Duval-Terrié, C., Dé, E., Champeil, P. Stabilization of membranes upon interaction of amphipathic polymers with membrane proteins. Protein Sci. 13 (11), 3056-3058 (2004).
  19. Rice, A. J., Alvarez, F. J., Davidson, A. L., Pinkett, H. W. Effects of lipid environment on the conformational changes of an ABC importer. Channels. 8 (4), 327-333 (2014).
  20. Arnold, T., Linke, D. Phase separation in the isolation and purification of membrane proteins. BioTechniques. 43 (4), 427-440 (2007).
  21. Fricke, B. Phase separation of nonionic detergents by salt addition and its application to membrane proteins. Anal Biochem. 212 (1), 154-159 (1993).
  22. Pryde, J. G. Partitioning of proteins in Triton X-114. In: Methods in Molecular Biology. , Humana Press. Totowa. (2000).
  23. Haake, D. A., Walker, E. M., Blanco, D. R., Bolin, C. A., Miller, J. N., Lovett, M. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59 (3), 1131-1140 (1991).
  24. Haake, D. A., et al. The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection. Infect Immun. 68 (4), 2276-2285 (2000).
  25. Thoduvayil, S., et al. Triton X-114 fractionated subcellular proteome of Leptospira interrogans shows selective enrichment of pathogenic and outer membrane proteins in the detergent fraction. Proteomics. 20 (19-20), (2020).
  26. Phukan, H., et al. Physiological temperature and osmotic changes drive dynamic proteome alterations in the leptospiral outer membrane and enhance protein export systems. J Proteome Res. 22 (11), 3447-3463 (2023).
  27. Murray, G. L., King, A. M., Srikram, A., Sermswan, R. W., Adler, B. Use of luminescent Leptospira interrogans for enumeration in biological assays. J Clin Microbiol. 48 (6), 2037-2042 (2010).
  28. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  29. Shang, E. S., Summers, T. A., Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding LipL41, a surface-exposed lipoprotein of pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 64 (6), 2322-2330 (1996).
  30. Evangelista, K. V., Hahn, B., Wunder, E. A. Jr, Ko, A. I., Haake, D. A., Coburn, J. Identification of cell-binding adhesins of Leptospira interrogans. PLoS Negl Trop Dis. 8 (10), e0003215(2014).
  31. Picardeau, M. Virulence of the zoonotic agent of leptospirosis: still terra incognita. Nat Rev Microbiol. 15 (5), 297-307 (2017).
  32. Hu, S., et al. Purification and identification of membrane proteins from urinary extracellular vesicles using Triton X-114 phase partitioning. J Proteome Res. 17 (1), 86-96 (2018).
  33. Radolf, J. D., Chamberlain, N. R., Clausell, A., Norgard, M. V. Identification and localization of integral membrane proteins of virulent Treponema pallidum subsp. pallidum by phase partitioning with the nonionic detergent Triton X-114. Infect Immun. 56 (2), 490-498 (1988).
  34. Nally, J. E., Whitelegge, J. P., Bassilian, S., Blanco, D. R., Lovett, M. A. Characterization of the outer membrane proteome of Leptospira interrogans expressed during acute lethal infection. Infect Immun. 75 (2), 766-773 (2007).
  35. Crother, T. R., Nally, J. E. Analysis of bacterial membrane proteins produced during mammalian infection using hydrophobic antigen tissue Triton extraction (HATTREX). Curr Protoc Microbiol. 9 (1), mc1201s9(2008).
  36. Casey, T. M., Meade, J. L., Hewitt, E. W. Organelle proteomics. Mol Cell Proteomics. 6 (5), 767-780 (2007).
  37. Bell, A. W., et al. Proteomics characterization of abundant Golgi membrane proteins. J Biol Chem. 276 (7), 5152-5165 (2001).
  38. Boonciew, P., et al. Improved antibody detection for canine leptospirosis: ELISAs modified using local leptospiral serovar isolates from asymptomatic dogs. Animals. 14 (6), (2024).
  39. Nogueira, S. V., et al. Leptospira interrogans enolase is secreted extracellularly and interacts with plasminogen. PLoS One. 8 (10), e0078150(2013).
  40. Riazi, M., Zainul, F. Z., Bahaman, A. R., Amran, F., Khalilpour, A. Role of 72 kDa protein of Leptospira interrogans. as a diagnostic marker in acute leptospirosis. Indian J Med Res. 139 (2), 308-313 (2014).
  41. Domingos, R. F., et al. Features of two proteins of Leptospira interrogans with potential role in host-pathogen interactions. BMC Microbiol. 12, 50(2012).
  42. Dhandapani, G., et al. Proteomic approach and expression analysis revealed the differential expression of predicted leptospiral proteases capable of ECM degradation. Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics. 1866 (5-6), 712-721 (2018).
  43. Matsunaga, J., Werneid, K., Zuerner, R. L., Frank, A., Haake, D. A. LipL46 is a novel surface-exposed lipoprotein expressed during leptospiral dissemination in the mammalian host. Microbiology. 152 (12), 3777-3786 (2006).
  44. Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4 (6), e6071(2009).
  45. Madathiparambil, M. G., Cattavarayane, S., Perumana, S. R., Manickam, G. D., Sehgal, S. C. Presence of 46 kDa gelatinase on the outer membrane of Leptospira. Curr Microbiol. 62 (5), 1478-1482 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Subcellulaire fractioneringTriton X 114 extractieLeptospira eiwittenbuitenmembraaneiwittenbinnenmembraaneiwittenfasescheidingeiwitlokalisatieSDS PAGEimmunoblottingmassaspectrometrie
Verrijken van subcellulaire eiwitten in leptospira met behulp van een op Triton X-114 gebaseerde fractioneringsbenadering
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.