Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vivo Confocale fluorescentiebeeldvorming van neurale activiteit geïnduceerd door sensorische stimulatie bij gedeeltelijk ingeperkte larvale zebravissen

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67301

⸱

18 april 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of California, Santa Barbara, 2Department of Integrative Biology and Physiology, University of California, Los Angeles, 3Department of Psychology, California State University at Fullerton, 4Department of Neuroscience, University of California, Riverside, 5Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 6Integrative Center for Learning and Memory, Brain Research Institute, David Geffen School of Medicine at UCLA

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om neurale activiteit te onderzoeken in hersengebieden van transgene zebravissen die GCaMP-calciumindicatoren tot expressie brengen met behulp van confocale microscopie.

Samenvatting

Zebravislarven zijn een veelbelovend modelsysteem voor gewervelde dieren voor het bestuderen van de neurale mechanismen van gedrag. Hun doorschijnendheid en relatief eenvoudige neurale circuits vergemakkelijken het gebruik van optogenetische technieken bij cellulaire analyses van gedrag. Fluorescerende indicatoren van in vivo neurale activiteit, zoals GCaMP6's, zijn op grote schaal gebruikt om de neurale activiteit te bestuderen die verband houdt met eenvoudig gedrag bij larvale zebravissen. Hier presenteren we een protocol voor het detecteren van sensorische geïnduceerde activiteit in semi-ingeperkte zebravislarven met behulp van de transgene lijn Tg(elav3:GCaMP6s). In het bijzonder gebruiken we het chemische middel allylisothiocyanaat om een robuuste, reproduceerbare fluorescentierespons te induceren in een hersengebied op de grens van de achterhersenen en het ruggenmerg. We bespreken de mogelijke toepassingen van GCaMP6's voor optische monitoring van neurale activiteit tijdens een reeks gedragsparadigma's en de beperkingen van deze techniek. Ons protocol schetst een toegankelijke aanpak voor het monitoren van dynamische, gedragsgerelateerde in vivo neurale activiteit in de hersenen van de larvale zebravis.

Inleiding

Zebravissen vertegenwoordigen een diermodel van gewervelde dieren met traceerbaarheid voor gedetailleerd cellulair-moleculair neurobiologisch onderzoek. Larvale zebravissen bezitten ~100.000 neuronen 5 dagen na de bevruchting (dpf), aanzienlijk minder dan de hersenen van zoogdieren. Bovendien zijn zebravissen relatief doorschijnend, een eigenschap die optische studies van neurale structuur en functie mogelijk maakt 1,2,3,4,5. Er zijn verschillende optogenetische hulpmiddelen ontwikkeld voor gebruik in zebravissen, waaronder high-fidelity calciumindicatoren6, spanningssensoren 7,8 en activiteitsafhankelijke markers van neurale activiteit 9,10,11,12,13. Deze tools zijn complementair aan andere voordelen van dit model, zoals de ontvankelijkheid voor genetische modificaties 14,15,16,17 en de bereidheid waarmee zebravislarven chemicaliën absorberen die aanwezig zijn in badoplossingen 18,19,20,21.

Een verscheidenheid aan methoden is nuttig voor de optische fysiologie van zebravissen, met name twee-foton-, lichtblad- en confocale microscopie. Elk van deze technologieën moet twee gerelateerde resolutieproblemen in evenwicht brengen: optische toegang, inclusief lichtverstrooiing door omringend weefsel, en bemonsteringssnelheid, vooral voor het vastleggen van actiepotentiaalkinetiek op de schaal van minder dan milliseconden22. Er zijn dramatische verbeteringen opgetreden in in vivo calciumbeeldvorming met behulp van twee-fotonmicroscopie, maar deze methode is vaak beperkt tot een gezichtsveld van <1 mm2, en meestal kan slechts een enkel dieptevlak worden verkregen, waardoor het vastleggen van activiteit in grote delen van neurale circuits wordt beperkt22. Voor lichtbladmicroscopie lost het potentieel om de activiteit van bijna alle neuronen in de hersenen vast te leggen de gezichtsveldbeperking van twee-fotonmicroscopie op, maar de huidige camerasnelheden beperken het vastleggen fysiek tot ongeveer drie hersenvolumes per seconde bij 40 vlakken per hersenvolume in de larvale zebravis 1,23. Confocale microscopie is inferieur in zowel diepteresolutie als opnamesnelheid aan twee-foton- en lichtplaatmicroscopie. Confocale microscopie heeft de voordelen van wijdverbreide toegankelijkheid voor laboratoria over de hele wereld en het vermogen om reconstructies van het hele brein van neurale activiteit te maken met behulp van reporters van neurale activiteit, zoals cFos en p-ERK9. Bovendien, als kleine hersengebieden het doelwit zijn, kan de confocale microscoop een adequate temporele resolutie van neurale activiteit bieden.

Dit artikel beschrijft een methode die gebruik maakt van confocale microscopie om neurale activiteit vast te leggen in transgene zebravissen die GCaMP6's pan-neuronaal tot expressie brengen. Er zijn verschillende vergelijkbare protocollen ontwikkeld met behulp van zebravislarven om de functie van neurale paden te begrijpen 24,25,26,27,28,29. De belangrijkste kenmerken van verschillende van deze protocollen, zoals time-lapse-beeldvorming, fluorescerende indicatoren van calciumdynamiek en live beeldvorming, zijn gecombineerd om neurale activiteit te meten in een kleine populatie neuronen in het centrale zenuwstelsel van de zebravis als reactie op allylisothiocyanaat (AITC), een aversieve chemische irriterende stof 11,26,27,29,30,31 . AITC lokt een hersenbrede respons uit die gericht is op het achterhersengebied11. Een cluster van neuronen net caudaal naar de achterhersenen speelt een rol bij de voortbeweging en een langdurige reactie op AITC. Deze respons duurt langer dan de verwijdering van de aversieve stimulus30. Door het gezichtsveld te beperken, zijn we erin geslaagd om neurale activiteit in deze neurale cluster te detecteren, zoals weerspiegeld door de fluorescentieverandering in neuronen die GCaMP6's tot expressie brengen. We bieden technieken, richtlijnen en best practices om voldoende spatiotemporele resolutie te bereiken met behulp van confocale microscopie. Daarnaast bespreken we de beperkingen van onze optische opnamemethode. Ondanks deze beperkingen zou de methode het mogelijk moeten maken om een verscheidenheid aan neurobiologische verschijnselen te onderzoeken, waaronder geheugen en sensomotorische verwerking.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures waarbij dieren worden gebruikt, zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care Use Committee van de California State University, Fullerton (Protocol # 2023-1310).

1. Statiefzetten van larvale zebravissen in agarose met een laag smeltpunt

  1. Fok volwassen transgene dieren van pan-neuronaal die Tg(elav3:GCaMP6s)6 tot expressie brengen met twee mannetjes op twee vrouwtjes in overeenstemming met de richtlijnen voor institutionele dierenverzorging. Volwassen dieren worden in speciale broedkamers geplaatst, zodat vrijgelaten eieren worden gevangen in een onderste kamer met een dubbele bodem die niet toegankelijk is voor volwassenen. Bij het eerste licht of wanneer een scheidingswand wordt verwijderd, laten vrouwtjes eieren los en bevruchten mannetjes eieren die in de dubbele bodem zijn gevangen.
  2. Verwijder volwassenen en verzamel bevruchte eieren met behulp van een eierzeef en plaats ze in embryomedium (E3) (5 mM NaCl, 0,33 mM MgSO4, 0,33 mM CaCl2, 0,17 mM KCl, 1 mM HEPES, 0,00001% methyleenblauw, pH 7,0)30 met 14 uur licht/10 uur donker bij 28,5 °C in een broedmachine
    OPMERKING: Het gebruikte E3-recept heeft een lage concentratie methyleenblauw die geen invloed heeft op de fluorescentie of leidt tot een significant autofluorescentiesignaal. We vereisen het gebruik van 1-fenyl-2-thiourea (PTU) niet op de ontwikkelingsleeftijden die in het protocol zijn gespecificeerd vanwege de natuurlijke doorschijnendheid die wordt geboden door de transgene lijn GCaMP6s.
  3. Monteer dieren 2-7 dagen na de bevruchting (dpf) met 3% agarose met een laag smeltpunt, opgelost in E3-medium. Warmte ontstond tot een temperatuur waarbij de zebravis kan worden gemanipuleerd zonder schade aan het organisme. Voordat het lage smeltpunt agarose afkoelt en stolt (<1 min), plaatst u de larven met de dorsaliteit naar boven in een petrischaaltje met een glazen bodem zodat het te inspecteren hersengebied zo dicht mogelijk bij het doel ligt, zoals weergegeven in figuur 1. Afhankelijk van het experiment is meestal 8 tot 10 zebravissen per experimentele groep voldoende.
    OPMERKING: Dieren werden in dit protocol niet verdoofd.
  4. Nadat de agarose is uitgehard met de larve op zijn plaats (ongeveer 2 tot 3 minuten), voegt u 5 ml E3-oplossing toe. Snijd vervolgens de agarose met een scalpel zoals vereist door het experimentele protocol.
    OPMERKING: Verschillende delen van de agar moeten worden weggesneden, afhankelijk van welke delen van de zebravis moeten worden bevrijd van fixatie en/of een ander type stimulus moeten krijgen.
  5. Verplaats het petrischaaltje met de zebravis naar het confocale microscoopstadium en laat de vissen 20 minuten acclimatiseren.

2. Opzetten en beeldvorming onder confocale microscopie met stimulustoepassing

  1. Centreer de vissen na de acclimatiseringsperiode onder het 40x (NA 1.0) wateronderdompelingsdoel bij kamertemperatuur met behulp van een helder veld met een lichtbron (~475 nm).
  2. De instellingen voor confocale microscoopacquisitie zijn afhankelijk van de kwaliteiten en het expressieniveau van het fluorescerende molecuul, de diepte en optische eigenschappen van het weefsel, de grootte van het gezichtsveld en de opnamesnelheid. Bepaal de juiste instellingen met behulp van de bereikindicator om een optimale opvang van uitgestraald licht te garanderen volgens de experimentele behoeften.
  3. Zorg voor een juiste afstelling van het laservermogen en de masterversterking om fluorescerend licht in het optimale bereik op te vangen, waardoor onnodig verlies van het GCaMP6s-afhankelijke fluorescentiesignaal wordt voorkomen. Gebruik de onderstaande lijst met belangrijke confocale instellingen en factoren om de juiste instellingen te bepalen.
    1. Pinhole-grootte: Bepaal dit aan de hand van het gebruikte doel en stel in om een enkel brandpuntsvlak te accepteren en andere brandpuntsvlakken te beperken. Voor dit protocol wordt een pinhole van 32 μm gebruikt.
    2. Laservermogen en golflengte: Pas het laservermogen aan op basis van het expressieniveau van het fluorescerende molecuul en de diepte en optische eigenschappen van het weefsel. Gebruik de bereikindicator om ervoor te zorgen dat de laser het bereik van de fotodetector niet overschrijdt. Stel de excitatiegolflengte in op de golflengte van het licht dat het fluorescerende molecuul optimaal exciteert. Gebruik voor dit experiment, omdat de vissen heterozygoot waren voor het transgen van de GCaMP6's en de expressieniveaus laag waren, 5% laservermogen bij een golflengte van 488 nm, 650 masterversterking. Bij sterke transgenexpressie varieert het laservermogen van 1,5% tot 3%, wat meestal voldoende is.
      OPMERKING: Als het laservermogen te laag is ingesteld, gaat informatie (licht gedetecteerd door de fotomultiplicatorbuis) verloren. Als het laservermogen te hoog is ingesteld, kan het uitgezonden licht het bereik van de detector overschrijden of het monster beschadigen (fotobleekmiddel).
    3. Masterversterking: De masterversterking bepaalt de gevoeligheid van de fotodetector. Gebruik de bereikindicator om ervoor te zorgen dat de masterversterking niet te hoog is ingesteld, waardoor het bereik van de fotodetector wordt overschreden. Voor dit experiment is de masterversterking ingesteld op 650.
    4. Gezichtsveld: Zorg ervoor dat het gezichtsveld voldoende groot is om het weefsel van interesse vast te leggen. Dit is een grote beperking voor confocale microscopen in het algemeen, omdat de grootte van het gezichtsveld de opnamesnelheid beperkt, zoals weergegeven in figuur 2. Stel voor de experimenten met AITC het gezichtsveld in op 79,86 μm2.
    5. Snelheid van vastleggen: Naarmate de opnamesnelheid wordt verhoogd, wordt de hoeveelheid licht die door de fotodetector wordt opgevangen, verminderd. Naarmate er minder licht wordt opgevangen, gaat de beeldkwaliteit achteruit. Zorg ervoor dat de opnamesnelheid een evenwicht biedt tussen de kwaliteit van het beeld en de snelheid die nodig is om de fysiologische gebeurtenis van belang vast te leggen. Hier is de opnamesnelheid ingesteld op 1.20 f/s.
  4. Centreer het gezichtsveld op een neuronale cluster caudaal ten opzichte van de commissura infima Halleri in het rostrale deel van het ruggenmerg30. Dit cluster is vrij klein met ~2,5 dpf, maar is later in de ontwikkeling veel groter (7 dpf).
    OPMERKING: Als de montage van agarose in stap 1 niet optimaal is, dat wil zeggen dat het dier schuin of te diep in de agarose wordt geplaatst, zal de beeldkwaliteit nadelig worden beïnvloed. Een afbeelding van het ruggenmerg van de zebravis bij een goed geplaatst dier en een contrasterend beeld van het ruggenmerg bij een suboptimaal geplaatste zebravis zijn te zien in figuur 3.
  5. Voer een tijdreeksscan uit met een gezichtsveld van 79,86 μm2 bij 1,20 frames per s (fps) met een ruimtelijke resolutie van 0,119 μm2 per pixel. Pas de grootte van het gezichtsveld en de snelheid van beeldacquisitie aan volgens de gewenste toepassing.
  6. Voeg 2 minuten na het begin van de beeldvorming met een pipet 41,67 μl van een stockoplossing van AITC (10 μM eindconcentratie) of E3-oplossing toe aan het schaaltje. Ga door met opnemen gedurende ~30 s om eventuele veranderingen in de GCaMP6s-activiteit in het interessegebied te observeren met time-lapse-beeldvorming. Nadat de opname is voltooid, bevrijdt u het dier van de agarose en euthanaseert u het volgens de richtlijnen voor dierenverzorging van de instelling.
    OPMERKING: Tijdens het opnemen van GCaMP6s-activiteit kan het confocale licht zelf een stimulus zijn. Hiermee moet rekening worden gehouden bij de analyse van de beeldvormingsresultaten. De opnametijd is een functie van het aantal frames en de opnamesnelheid van elk frame, die naar behoefte kan worden aangepast voor de gewenste tijd.

3. Analyse van het GCaMP-signaal met behulp van FIJI

  1. Als de uitvoer na het opnemen niet in het .tif-bestandsformaat is voor downstream FIJI-analyse, exporteert u de afbeeldingsbestanden als .tif bestanden uit de microscoopsoftwaresuite.
  2. Download FIJI voor analyse van neurale sporen. Open FIJI, importeer de .czi-bestanden in het programma en gebruik desgevraagd de standaardinstellingen in de BioFormats-plug-in.
  3. Markeer een gebied/neuron van interesse met behulp van de Cirkel- of Freehand-tools door op hun respectievelijke pictogrammen te klikken. (Als u de muisaanwijzer op de pictogrammen plaatst, knippert de naam van de tool in het programma.)
    LET OP: Omdat het interessegebied in grootte varieert, zijn vaste gebieden/cirkels niet mogelijk. Software die het mogelijk maakt om fluorescerende veranderingen in de loop van de tijd als voxels te registreren, zoals het Thunder-pakket32, zou de detectie van individuele neuronen mogelijk kunnen maken; Voor de ~20 neuronen in het huidige experiment zou detectie van de membraangrenzen door een blinde waarnemer echter waarschijnlijk superieur zijn aan een geautomatiseerd detectiesysteem.
  4. Nadat een ROI is geselecteerd, klikt u op de FIJI-werkbalk op Hulpprogramma's > ROI-beheer analyseren > analyseren. Klik daarna op Toevoegen [t] en de geselecteerde ROI wordt toegevoegd aan het ROI Manager-venster.
  5. Klik in de ROI-manager op Meer > Multi Measure. Laat de instellingen op standaard staan en klik op OK. FIJI produceert onbewerkte gegevens die kunnen worden gemanipuleerd als een CSV-bestand met behulp van Python of als onbewerkte gegevens in een spreadsheet.
  6. Om de onbewerkte gegevens te normaliseren en weer te geven als een neuraal spoor voor een bepaald interessegebied, neemt u het gemiddelde van de laatste ~30 s-waarden van het venster van 2 minuten vóór de stimulus en normaliseert u alle waarden na de stimulus naar die gemiddelde basislijnwaarde:
    Genormaliseerde fluorescentie-intensiteit = (Onmiddellijke fluorescentie van een bepaald interessegebied na stimulus)/(Gemiddelde fluorescentie van ~30 s van een interval van 2 minuten vóór de stimulus)
  7. Plot de gegevens als neurale sporen, zoals weergegeven in afbeelding 4.
    OPMERKING: In sommige soorten microscopieën, zoals light sheet-microscopie, waarbij een volume van de hersenen wordt geregistreerd, worden bewegingsartefacten via nabewerking ruimtelijke registratie geadresseerd naar een referentiehersenvolume 1,11. Omdat we echter alleen vanaf één vlak opnemen, kunnen er geen aanpassingen worden gemaakt voor bewegingsartefacten. Daarom zijn er voor de hier getoonde resultaten geen frames verwijderd. Als bewegingsartefacten de resultaten echter aanzienlijk veranderen, kunnen geautomatiseerde systemen frames met bewegingsartefacten1, 11 identificeren en corrigeren, of een geblindeerde waarnemer kan dergelijke frames verwijderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Toediening van allylisothiocyanaat veroorzaakt een calcium-geassocieerd neuraal signaal bij larvale zebravissen
De toediening van AITC (stap 2.6) veroorzaakt een wijdverbreide toename van GCaMP6s-geassocieerde neurale activiteit in de hersenen van de larvale zebravis11,30. We zagen een verhoogd fluorescerend signaal in een klein deel van de hersenen na het toepassen van AITC, zoals weergegeven in

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We hebben aangetoond dat neurale activiteit kan worden geregistreerd in de hersenen van zebravislarven met behulp van GCaMP6's in combinatie met confocale microscopie; de lagere opnamesnelheden die nodig zijn als gevolg van de langzamere kinetiek van GCaMP's kunnen worden gecompenseerd door het waargenomen hersengebied te verkleinen6. Reporters met snellere temporele dynamiek (d.w.z. GCaMP6f) zijn beschikbaar, maar de superieure temporele resolutie gaat meestal te...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een subsidie aan ACR van de National Institutes of Health (SC2GM1304854) en een subsidie aan DLG van de National Science Foundation (2050850).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Low Melting Point AgaroseInvitrogen16520-100Verdund tot 3%
Allyl Isothiocyanate (AITC)Sigma Aldrich377430Chemische stimulator
E3N/AN/AWater-medium voor zebravislarven
Glass Bottom DishesThermo Fisher Scientific12-567-400Gebalikt voor zebravissen tijdens beeldvormingsexperimenten
Micropipette (10-100 uL)Cole-Parmer21600-14Apparaat gebruikt voor het maken van AITC-verdunningen
Microscope SlidesFisherbrand12-550-A3Gebalikt om naar fenotype te screenen
Mirror Finish ForcepsDUMONT11251-23Gebalikt om zebravissen in agarose te oriënteren
myTEMP Mini Digital IncubatorsBenchmarkH2200-HCOpvangruimte voor zebravissen; ingesteld op 28,5°C
Nitrile GlovesMedPRIDEMPR-50504Basis-PPE
Petri DishesVWR89107-632Container voor zebravissen
Posi-Click TubesDENVILLEC-2171Gebalikt voor AITC-verdunning
Samco Polyurethane Transfer PipettesThermo Fisher Scientific225Apparaat gebruikt om dier te selecteren/toegediend verdunde bolus van AITC
Stemi SV11 Apo MicroscopeZeiss1.25496E+11Gebalikt om zebravissen te plaatsen
Transgenic Larval Zebrafish (2 tot 7 DPF)N/AN/ADierlijke testsubjects; Tg(elav3:GCaMP6s)-stam
Zeiss Confocal Microscope (Model LSM9)Zeiss3523004097Beeldvorming van vissen

Referenties

  1. Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy. Nat Method. 10 (5), 413-420 (2013).
  2. Meyer, M. P., Smith, S. J. Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms. J Neurosci. 26 (13), 3604-3614 (2006).
  3. Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Curr Biol. 15 (9), 804-814 (2005).
  4. Son, J. H., et al. Transgenic FingRs for live mapping of synaptic dynamics in genetically-defined neurons. Sci Rep. 6, 18734(2016).
  5. Zada, D., Tovin, A., Lerer-Goldshtein, T., Vatine, G. D., Appelbaum, L. Altered behavioral performance and live imaging of circuit-specific neural deficiencies in a zebrafish model for psychomotor retardation. PLoS Genet. 10 (9), e1004615(2014).
  6. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  7. Abdelfattah, A. S., et al. and photostable chemigenetic indicators for extended in vivo voltage imaging. Science. 365 (6454), 699-704 (2019).
  8. Abdelfattah, A. S., et al. Sensitivity optimization of a rhodopsin-based fluorescent voltage indicator. Neuron. 111 (10), 1547-1563.e9 (2023).
  9. Gao, Y. J., Ji, R. R. c-Fos and pERK, which is a better marker for neuronal activation and central sensitization after noxious stimulation and tissue injury. Open Pain J. 2, 11-17 (2009).
  10. Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Front Neural Circuits. 8, 37(2014).
  11. Randlett, O., et al. Whole-brain activity mapping onto a zebrafish brain atlas. Nat Methods. 12, 1039-1046 (2015).
  12. Reijmers, L. G., Perkins, B. L., Matsuo, N., Mayford, M. Localization of a stable neural correlate of associative memory. Science. 317 (5842), 1230-1233 (2007).
  13. Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nature Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
  14. Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
  15. Wyart, C., Del Bene, F. Let there be light: zebrafish neurobiology and the optogenetic revolution. Rev Neurosci. 22 (1), 121-130 (2011).
  16. Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons. Curr Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).
  17. Portugues, R., Severi, K. E., Wyart, C., Ahrens, M. B. Optogenetics in a transparent animal: circuit function in the larval zebrafish. Curr Opinion Neurobiol. 23 (1), 119-126 (2013).
  18. Best, J. D., Alderton, W. K. Zebrafish: An in vivo. model for the study of neurological diseases. Neuropsychiat Dis Treatment. 4 (3), 567-576 (2008).
  19. Goldsmith, P. Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when. Curr Opinion Pharmacol. 4 (5), 504-512 (2004).
  20. Roberts, A. C., et al. Habituation of the C-start response in larval zebrafish exhibits several distinct phases and sensitivity to NMDA receptor blockade. PloS One. 6 (12), e29132(2011).
  21. Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15468-15473 (2011).
  22. Ji, N., Freeman, J., Smith, S. L. Technologies for imaging neural activity in large volumes. Nat Neurosci. 19 (9), 1154-1164 (2016).
  23. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using selective plane illumination microscopy. Front Neural Circuits. 7, 65(2013).
  24. Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. CSH Protoc. 2007, (2007).
  25. Liu, T. T., Hou, H., Du, J. L. A protocol for simultaneous Ca2+ and morphology imaging of brain endothelial tip cells in larval zebrafish. STAR Protoc. 2 (1), 100388(2021).
  26. Wong, H. C., Drerup, C. M. Using fluorescent indicators for in vivo quantification of spontaneous or evoked motor neuron presynaptic activity in transgenic zebrafish. STAR Protoc. 3 (4), 101766(2022).
  27. Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. J Vis Exp. (26), e1217(2009).
  28. Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. J Vis Exp. (119), e55210(2017).
  29. Renaud, O., Herbomel, P., Kissa, K. Studying cell behavior in whole zebrafish embryos by confocal live imaging: application to hematopoietic stem cells. Nat Protoc. 6 (12), 1897-1904 (2011).
  30. Roberts, A. C., et al. Induction of short-term sensitization by an aversive chemical stimulus in zebrafish larvae. eNeuro. 7 (6), (2020).
  31. Prober, D. A., et al. Zebrafish TRPA1 channels are required for chemosensation but not for thermosensation or mechanosensory hair cell function. J Neurosci. 28 (40), 10102-10110 (2008).
  32. Freeman, J., et al. Mapping brain activity at scale with cluster computing. Nat Methods. 11, 941-950 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Beeldvorming van neurale activiteitGCaMP6s-fluorescentiein vivo beeldvormingFiji-analyseanalyse van neurale sporenneuronen in het ruggenmergtime-lapse beeldvorming
In vivo Confocale fluorescentiebeeldvorming van neurale activiteit geïnduceerd door sensorische stimulatie bij gedeeltelijk ingeperkte larvale zebravissen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.