Methodenartikel

Het opzetten van een model voor ernstige hoornvliesontsteking bij ratten op basis van hoornvliesepitheelcurettage in combinatie met hoornvlieshechtingen

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67305

⸱

22 november 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, 2School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University, 3The Second People's Hospital of Guiyang City, 4Department of Biomedical Sciences, School of Infection, Inflammation and Immunology, College of Medicine and Health, University of Birmingham

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We ontwikkelden een rattenmodel van ernstige hoornvliesontsteking door middel van hoornvliesepitheelcurettage in combinatie met hoornvlieshechtingen. De studie evalueerde ontstekingspatronen van het hoornvlies, epitheliale proliferatie en veranderingen in limbale stamcellen onder ontstekingsomstandigheden.

Samenvatting

Hoornvliesontsteking, met name ernstige hoornvliesontsteking, speelt een belangrijke rol bij de ontwikkeling van disfunctie van limbale stamcellen van het hoornvlies. Het construeren van geschikte diermodellen kan ons helpen ons te concentreren op de effecten van ernstige ontsteking op limbale stamcellen van het hoornvlies. Een roestverwijderaar van 2 mm werd gebruikt om het centrale hoornvliesepitheel van Sprague Dawley (SD) ratten te verwijderen om een verwonding te veroorzaken. Vervolgens werd het centrale stroma van het hoornvlies gehecht met nylon hechtingen om aanhoudende ontsteking te veroorzaken. Op deze manier werd een hoornvliesontstekingsmodel met centrale hoornvliesepitheelslijtage en centrale stromahechting geconstrueerd, die ernstige hoornvliesontsteking veroorzaakte. De veranderingen in hoornvliesontsteking en de toestand van de limbale stamcellen 1, 3 en 7 dagen na modellering werden waargenomen. Op de 3edag na modellering was de hoornvlieslimbus van de ratten ernstig oedemateus, met duidelijke neovascularisatie en lokale hyperplasie, wat typische tekenen zijn van limbale stamceldeficiëntie. Tegen de 7edag verslechterde het hoornvliesoedeem geleidelijk en bleef de neovascularisatie toenemen. Door middel van kwantitatieve reverse transcriptie polymerasekettingreactie (RT-qPCR) en immunofluorescentiekleuring ontdekten we dat de cornea-epitheliale ontstekingsfactoren significant opgereguleerd waren, de differentiatie van het hoornvliesepitheel abnormaal was, de hoornvliesepitheelstamcellen significant waren verminderd en de celproliferatie en stamheid ook waren afgenomen. Daarom toont dit model aan dat ernstige ontsteking limbale stamcelbeschadiging kan veroorzaken zonder de limbale stamcellen direct te beschadigen. Het model is gunstig voor het observeren van de effecten van ernstige ontsteking op de biologische mechanismen van stamcellen en biedt een ideaal platform voor het bestuderen van de mechanismen van disfunctie van hoornvliesepitheliale stamcellen veroorzaakt door ontsteking.

Inleiding

Limbale stamceldisfunctie (LSCD) wordt gekenmerkt door aanhoudende epitheeldefecten, vascularisatie van het hoornvlies, chronische ontsteking, littekens en conjunctivalisatie van het hoornvlies 1,2. Het kan het gevolg zijn van de uitputting of disfunctie van limbale stamcellen na ernstige aandoeningen van het oogoppervlak, zoals chemische brandwonden, thermische brandwonden, het Stevens-Johnson-syndroom en iatrogeen letsel veroorzaakt door oogoperaties 2,3,4. De pathogene mechanismen van LSCD omvatten voornamelijk veranderingen in stamcellen en verstoringen in de micro-omgeving van de stamcellen 5,6, die de homeostase van het hoornvliesepitheel beïnvloedt 2,7. Er zijn twee primaire soorten lotsveranderingen in limbale stamcellen bij LSCD: 1) Het directionele differentiatiepotentieel van hoornvliesepitheelstamcellen wordt abnormaal, wat leidt tot hun differentiatie in huidepitheelcellen. Dit blijkt uit een afname van de expressie van hoornvliesepitheelcelspecifieke transcriptiefactor Pax6 en hoornvliesspecifieke keratines Krt12 en Krt3, naast een significante toename van de expressie van huidgerelateerde plaveiselepitheliale metaplasiemarkers Krt10, Krt1 en Sprr1b8; 2) Beschadiging van het oogoppervlak vernietigt direct limbale stamcellen van het hoornvlies, wat resulteert in necrose of apoptose, en vervolgens conjunctivale weefselproliferatie veroorzaakt die het hoornvlies bedekt9. Er is gemeld dat tijdens de ontwikkeling van LSCD ontstekingscellen zoals macrofagen, neutrofielen en dendritische cellen aanzienlijk toenemen in de micro-omgeving van hoornvliesepitheliale stamcellen. Dienovereenkomstig vertonen cytokines zoals interferon-gamma (IFN)-γ, tumornecrosefactor (TNF)-α, interleukine (IL)-1β en macrofaag-ontstekingseiwitten (MIP)-1α/β ook significante verhogingen10.

Er zijn verschillende LSCD-modellen opgesteld, waaronder modellen die worden veroorzaakt door hechtingen, chemische verwondingen en benzalkoniumchloride-spotting11. Elk van deze modellen heeft zijn voor- en nadelen. Chemische verwondingen kunnen het hele oogoppervlak beschadigen en limbale stamcellen direct vernietigen12. Benzalkoniumchloride werkt op dezelfde manier als chemische verwondingen, maar heeft een relatief traag effect13. Het hoornvlieshechtingsmodel kan een stabiele en langdurige ontstekingsreactie induceren, maar de ontstekingsreactie is relatief mild en kan geen LSCD veroorzaken.

Om de rol en mechanismen van ontsteking bij de ontwikkeling van hoornvlies-LSCD te onderzoeken, werd een diermodel opgesteld dat curettage van het centrale hoornvliesepitheel combineert met hoornvlieshechtingen. Dit model induceert aanhoudende ontsteking van het hoornvliesepitheel zonder direct schade aan limbale stamcellen.

Protocol

Alle procedures voldeden aan de ARVO-richtlijnen voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en gezichtsonderzoek en werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Guizhou Medical University (goedkeuring nr. 2305192). De ratten werden gehuisvest in het dierencentrum van de Guizhou Medical University, in overeenstemming met de relevante voorschriften voor dierbeheer.

1. Selectie van dieren

  1. Gebruik vrouwelijke Sprague-Dawley (SD) ratten van 7-8 weken. Zorg ervoor dat er geen laesies van het oogoppervlak zijn onder onderzoek van de spleetlamp.
  2. Steriliseer de instrumenten met behulp van een snelle sterilisator. Vereiste instrumenten zijn onder meer het verwijderen van roestringen aan het hoornvlies, een huidbemonsteringsmarker van 2 mm, naaldhouders, plaatlaagmessen, oogheelkundige chirurgische scharen en pincetten.
  3. Verdoof ratten met 1,25% tribroomethanol via intraperitoneale injectie in een dosis van 0,3 ml per 100 g lichaamsgewicht. Beoordeel de anesthesiediepte door in de teen te knijpen. Druppel één druppel tropicamide oogdruppels in voor pupilverwijding. Breng bupivacaïne hydrochloride oogdruppels aan op het oog. Gebruik oculair smeermiddel zalf op het contralaterale oog om vocht vast te houden.
  4. Desinfecteer de huid en het haar rond de ogen met jodofoor.
  5. Stel het ontstekingsmodel vast.
    1. Plaats de rat in de laterale decubituspositie. Belicht de oogbol onder een operatiemicroscoop.
    2. Het centrale hoornvlies werd gelabeld met behulp van een huidbemonsteringsmarker van 2 mm en het gelabelde centrale hoornvliesepitheel werd geschraapt met behulp van een roestringverwijderaar van het hoornvlies.
    3. Plaats drie 120° hoornvlieshechtingen met behulp van 10-0 nylondraad, naaldhouder en oogheelkundige chirurgische schaar en tang op ongeveer 3 mm van de limbus, dring niet door het hoornvlies14,15.
  6. Breng Ofloxacine oogzalf aan het einde van de procedure aan om infectie te voorkomen.
  7. Observeer en fotografeer het hoornvlies op de1e, 3e en 7e dag na de operatie met behulp van een spleetlamp vergrote 10x lens. Noteer de symptomen zoals genezing van het hoornvliesepitheel, conjunctivale hyperemie, hoornvliesoedeem, limbale hyperemie en neovascularisatie van het hoornvlies.

2. Berekening van de ontstekingsindex

  1. Bereken de ontstekingsindex van het oogoppervlak na het opstellen van het diermodel.
    1. Scoor ciliaire lichaamscongestie als volgt: geen congestie (0 punten); de aanwezigheid van congestie van minder dan 1 mm (1 punt); hyperemie tussen 1 mm en 2 mm (2 punten); hyperemie tussen 1 mm en 2 mm (3 punten).
    2. Scoor centraal hoornvliesoedeem als volgt: geen oedeem (0 punten); oedeem met duidelijke zichtbaarheid van de iris (1 punt); oedeem met onduidelijke zichtbaarheid van de iris (2 punten); oedeem met de iris niet zichtbaar (3 punten).
    3. Scoor paracentraal hoornvliesoedeem als volgt: geen oedeem (0 punten); oedeem met duidelijke zichtbaarheid van de iris (1 punt); oedeem met onduidelijke zichtbaarheid van de iris (2 punten); oedeem met de iris niet zichtbaar (3 punten).
    4. Bereken de ontstekingsindex door alle scores bij elkaar op te tellen en te delen door 9.

3. Beoordeling van neovascularisatie van het hoornvlies

  1. Observeer de neovascularisatie van het hoornvlies met een spleetlamp.
    1. Analyseer en verwerk afbeeldingen met behulp van beeldverwerkingssoftware voor spleetlampen16.
    2. Noteer de groei van neovascularisatie van het hoornvlies op elk observatietijdstip, waarbij de langste neovascularisatie van het hoornvlies naar het centrale hoornvlies wordt gemeten met minimale kromming.
    3. Beoordeel ze als volgt: Graad 0: Avasculair; Graad 1: Micro (<1 mm); Graad 2: Mild (1 mm tot 1,5 mm); Graad 3: Matig (>1,5 mm tot 2 mm); Graad 4: Ernstig (>2 mm).

4. Analyse van de biologie van het model

  1. Bereid bevroren oogmonsters voor.
    1. Verdoof de rat met 4-5% isofluraan en euthanaseer hem door cervicale dislocatie.
    2. Til in de laterale decubituspositie de oogbol van de rat naar buiten met een micropincet en knip het bindvlies langs de bovenste en onderste oogkoepel open met een oogschaar.
    3. Snijd de oogzenuw door en let op het behoud van de integriteit van het hoornvliesepitheel.
    4. Droog de bloedvlekken en het water op het oogboloppervlak af met filtreerpapier en doe ze in de inbeddingsdoos met een optimaal snijtemperatuur (OCT) inbeddingsmedium.
    5. Verwijder de belletjes in de inbeddingsdoos met een pipet van 200 μL, vries deze in met vloeibare stikstof en bewaar de ingebedde monsters vervolgens in de koelkast met ultralage temperatuur.
  2. Bereid bevroren delen van de oogbollen voor.
    1. Voordat u het bevroren gedeelte bereidt, koelt u de cryostaat voor tot ongeveer -28 °C en de preparaathouder tot -26 °C.
    2. Haal de bevroren preparaten uit de vrieskist en plaats ze ongeveer 1 uur in de cryotoom.
    3. Koel het bevroren monster 10 minuten voor in een cryotoom. Markeer het sample met een potlood, bevestig het op het samplepad met OCT en bevestig ze na afkoeling aan elkaar op het sectierek.
    4. Pas de positie en richting van het bevroren monster aan en fixeer het. Snijd eerst 20 μm secties af totdat het centrale hoornvlies te zien is. Verkrijg vervolgens 6 μm secties door continu te snijden en verzamel de secties op de vooraf voorbereide hechtingsdia's.
    5. Markeer de naam, het materiaal, de doorsnedetijd, de naam en het nummer van het weefsel op de objectglaasjes. Zet het ongeveer 30 minuten op kamertemperatuur (RT).
    6. Na het drogen van de secties, doe je ze in een doos en bewaar je ze in de koelkast met ultralage temperatuur voor reserve.
  3. Voer hematoxyline- en eosinekleuring uit.
    1. Haal de kant-en-klare diepvriessecties uit de ultra-lage temperatuur koelkast en plaats ze in de zuurkast bij RT om te drogen.
    2. Fixeer de secties met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij RT. Spoel de samples 5 minuten af met 1x PBS.
    3. Plaats de preparaatsecties met objectglaasjes op een objectglaasje en dompel ze 5 minuten onder in de verfcilinder met hematoxyline-kleurstofoplossing bij RT.
    4. Spoel het monster met objectglaasjes langzaam af met kraanwater om de drijvende kleurstof af te wassen, doe ze in de verftank met 0,1% zoutzuuralcohol en verwijder ze snel na 1-2 s.
    5. Spoel het preparaat langzaam af met kraanwater gedurende 15 minuten.
    6. Haal het monster uit het water en dompel de dia's onder in de eosineverftank; laat 3 minuten op RT staan.
    7. Spoel het monster langzaam af met kraanwater, spoel de overtollige kleurstof weg en voer gradiëntalcoholdehydratatie uit met 75% alcohol, 80% alcohol, 95% alcohol, 100% alcohol (één) en 100% alcohol (twee). Immsere de secties in elke concentratie gedurende 2 min.
    8. Maak de preparaten 2 minuten transparant in respectievelijk xyleen (1) en xyleen (2).
    9. Droog het sample in de zuurkast, dicht de secties af met een afdichtmiddel en pas op dat er geen luchtbellen ontstaan.
    10. Plaats de dia's in een diadoos bij RT. Maak een afbeelding van de secties met een microscoop.
  4. Voer immunofluorescentiekleuring uit.
    1. Verwijder de bevroren delen en plaats ze in een doos bij RT in de zuurkast om te drogen.
    2. Markeer de naam van het antilichaam dat moet worden gekleurd in het glasplaatje van het bevroren monster.
    3. Fixeer de preparaten met 4% paraformaldehyde op RT gedurende 15 min. Een kleine hoeveelheid kraanwater werd aan de doos toegevoegd om te voorkomen dat het exemplaar uitdroogde.
    4. Verwijder het paraformaldehydefixeermiddel en was het preparaat driemaal met 1x PBS-buffer. Pas op dat u het monster niet wegspoelt.
    5. Droog de vloeistof rond het weefselgedeelte, bedek het monster met celmembraanoplossing (0,2% TritonX-100) en incubeer gedurende 20 minuten bij RT.
    6. Verwijder de celmembraanoplossing en was de secties drie keer gedurende 5 minuten elk met 1x PBS-buffer.
    7. Droog de weefselsecties, bedek het monster met immunofluorescentieblokkerende oplossing (2% BSA) en incubeer gedurende 1 uur bij RT.
    8. Bereid het primaire antilichaam en verdunningsmiddel (1% BSA) tijdens de incubatie volgens de instructies van de fabrikant.
    9. Verwijder de blokkeervloeistof en droog het monster af met een zuigpomp. Voeg het bereide primaire antilichaam toe, dek de doos af en incubeer het een nacht in een koelkast van 4 °C (incubeer ongeveer 12-16 uur) uit de buurt van licht.
    10. Gooi het primaire antilichaam weg en was het monster vier keer gedurende 10 minuten in PBS.
    11. Bereid tijdens de reinigingsstap de verdunning van secundaire antilichamen voor volgens de instructies van de fabrikant.
    12. Verwijder PBS, droog het monster en voeg het voorbereide secundaire antilichaam toe aan het monster. Bedek het exemplaar en broed 1 uur bij RT uit de buurt van licht.
    13. Verwijder het secundaire antilichaam, was het monster 4 keer met 1x PBS-buffer gedurende elk 10 minuten en bedek het hele glaasje met 1x PBS-buffer.
    14. Verwijder PBS, droog het monster en dicht de secties af met een montagemedium dat DAPI bevat, zodat er geen luchtbellen zijn. Wikkel de dia's in aluminiumfolie en houd ze op 4 °C uit de buurt van licht.
    15. Maak foto's met een confocaal lasermicroscoopsysteem of met een rechtopstaande fluorescentiemicroscoop camerasysteem (scansnelheid: 4 μs/pixel, scanresolutie: 1024 x 1024).
  5. Eencellig suspensiepreparaat van het hoornvliesepitheel van de rat
    1. Verwijder na euthanasie de oogbollen met een pincet gedrenkt in 75% alcohol en doe ze in de 1x Hanks' gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) met 10% foetaal runderserum (FBS) en 10% penicilline-streptomycine die van tevoren is bereid.
    2. Reinig de oogbollen en gebruik 1x HBBS met 10% FBS en 10% penicilline-streptomycine tweemaal gedurende 5 minuten elk.
    3. Verwijder het bindvlies langs de sclerale rand; Laat de sclerale rand op ongeveer 1 mm over. Nogmaals, was het hoornvliesweefsel twee keer met 1x HBBS met 10% FBS en 10% penicilline-streptomycine.
    4. Breng het schone hoornvliesweefsel over naar een aangevuld hormonaal epidermaal medium (SHEM) dat 2U/ml Dispase II bevat. Sluit de afdichting en plaats deze 14-16 uur op 4°C.
    5. Houd een pincet, een tandeloos pincet, een irisherstelapparaat en een chirurgische sterilisator bij de hand.
    6. Scheid onder een chirurgische microscoop voorzichtig het hoornvliesepitheel langs de rand van het hoornvlies.
    7. Was het hoornvliesepitheel met 1x HBSS met 10% penicilline-streptomycine gedurende 5 min.
    8. Breng het hoornvliesepitheelweefsel over in een centrifugebuis van 1,5 ml met 200 ml trypsine en incubeer in een incubator met 5% CO2, 37 °C. Schud elke 5 minuten de centrifugebuis drie keer om het hoornvliesepitheelvel te verteren tot een eencellige suspensie.
    9. Voeg een gelijke hoeveelheid SEM-medium toe om de werking van de trypsine-digestieoplossing te stoppen en plaats deze bij RT.
  6. Klooncultuur van hoornvliesepitheelcellen
    1. Bereid trofoblastcellen voor.
      1. Wanneer de groeidichtheid van NIH 3T3-muiscellen 80-90% bereikt, gooi het celkweekmedium weg. Voeg vooraf bereid 10 mg/ml NIH 3T3 mitomycine-kweekmedium toe en incubeer gedurende 2,5 uur bij 37 °C.
      2. Verwijder het medium, spoel de cellen met 1x HBSS, vervang ze door het nieuwe NIH 3T3-celmedium en ga verder met de incubatie in een CO2 -incubator (5% CO2, 37 °C).
    2. Bereid de cornea-epitheelcelsuspensie voor en tel de cellen volgens de vereiste verhouding.
    3. Tijdens het bereiden van de cornea-epitheelcelsuspensie, verwerk NIH 3T3-cellen die zijn behandeld met mitomycine.
      1. Gooi het supernatant weg, spoel de cellen met 1x HBSS, voeg 1 ml trypsine-EDTA-oplossing toe en incubeer 2-3 minuten bij RT.
      2. Voeg een gelijke hoeveelheid aanvullend hormonaal epitheelmedium toe (SEM-medium: DMEM/F12, 10 ng/ml epidermale groeifactor [EGF] bij muizen, 10 μg/ml insuline-transferrine-selenium [ITS], 5% FBS, 1% penicilline-streptomycine, 0,5% dimethylsulfoxide [DMSO], 0,5 mg/ml hydrocortison), pipetteer voorzichtig om een celsuspensie te maken en tel de cellen.
    4. Gebruik een plaat met 12 putjes en voeg 0,5 ml SEM-medium toe aan elk putje.
    5. Meng hoornvliesepitheelcellen met NIH 3T3-cellen met een dichtheid van 500 hoornvliesepitheelcellen/cm2 en 5 x 105 NIH 3T3-cellen/cm2. Voeg 1 ml SEM-medium toe aan elk putje.
    6. Voeg 1 ml van het celmengsel toe aan elk putje en pipetteer voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verdelen.
    7. Incubeer in een broedmachine (5% CO2, 37 °C) en vervang het medium om de 2-3 dagen. Cultuur voor 12-14 dagen.
  7. Kristalviolette kleuring
    1. Na ongeveer 12 dagen, wanneer hoornvliesepitheelklonen op het punt staan te versmelten, verwijdert u het kweekmedium en voegt u 1 ml 4% paraformaldehyde-oplossing toe aan elk putje, waarbij de cellen volledig worden bedekt. Fixeer de cellen gedurende 15 minuten op RT.
    2. Verwijder 4% paraformaldehyde en was de putjes drie keer met 1x PBS gedurende 5 minuten elk.
    3. Verwijder 1x PBS-buffer en voeg 0,4% kristalviolette kleurstofoplossing toe aan elk putje. Vlek gedurende 30 minuten bij RT.
    4. Verwijder of recycle de kristalviolette kleurstofoplossing en was deze drie keer met 1x PBS gedurende 10 minuten elk.
    5. Laat de putjes bij RT aan de lucht drogen tot ze goed droog zijn.
    6. Gebruik een gewoon rechtopstaand microscoopfotografiesysteem (scansnelheid: 4 μs/pixel, scanresolutie: 1024 x 1024).
  8. Extractie van cornea-mRNA
    1. Verzamel een oogheelkundige schaar, een hoornvliesschaar, een tandtang, een elektrische hoornvliesepitheelschraper, Trizol, RNase-vrije centrifugebuisjes van 1,5 ml en een ijskast.
    2. Epitheliale acquisitie
      1. Verdoof de rat met 4-5% isofluraan en euthanaseer hem na cervicale dislocatie. Plaats het dier in een zijligging. Knip de snorharen van de muis af met een oogschaar om te voorkomen dat het zicht wordt geblokkeerd.
      2. Plaats de rat onder een chirurgische microscoop en stel deze in op een geschikte hoogte om op de oogbol scherp te stellen. Gebruik een tandtang om de oogbol voorzichtig te duwen en bloot te leggen. Til het bindvlies van de rat op en gebruik een schone elektrische hoornvliesepitheelschraper om het centrale gebied van 2 mm van het hoornvliesepitheel te schrapen.
      3. Verzamel het geschraapte hoornvliesepitheel met een schone, getande tang die met alcohol is besproeid. Plaats het verzamelde weefsel in een centrifugebuis met 1 ml Trizol.
      4. Spoel het verzamelde weefsel zo snel mogelijk af in een centrifugebuis van 50 ml met dubbel gedeïoniseerd water. Absorbeer overtollig water met filtreerpapier. Spray met 75% alcohol en ga door naar de volgende stap.
      5. Til het bindvlies van de rat weer op met een tandtang. Gebruik een hoornvliesschaar met de holle kant naar boven om het bindvlies langs de limbus af te knippen, zodat er ongeveer 0,5 mm wit bindvlies overblijft.
      6. Schraap het hoornvliesepitheel binnen een bereik van 2 mm bij de hoornvlieslimbus met behulp van de elektrische schraper. Verzamel het weefsel zoals eerder beschreven. Verzamel het centrale hoornvliesepitheel van drie oogbollen en het limbale epitheel van drie oogbollen.
      7. Plaats de verzamelde weefsels in afzonderlijke 1 ml Trizol RNA-extractiereagensbuisjes. Voer de hele operatie op ijs uit om de RNA-integriteit te behouden. Ga direct verder met de volgende stappen of bewaar de monsters in een vriezer met ultralage temperatuur bij -80 °C voor later gebruik.
    3. Ontdooi het monster op ijs, gebruik een ultrasone weefselhomogenisator om de cellen te lyseren. Stel het vermogen van de ultrasone homogenisator in op 25%, de tijd op 2 s per burst, de intervaltijd op 5 s en de totale tijd op 2 min. Laat het 10 minuten op ijs staan.
    4. Voeg chloroform (1/5 van het totale volume, ongeveer 200 μl) toe aan elk monster, meng grondig door 30 s om te keren en centrifugeer bij 400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    5. RNA-precipitatie
      1. Na het centrifugeren wordt de vloeistof in de centrifugebuis in drie delen gelaagd. De bovenste heldere laag is RNA, de middelste witte troebele laag is DNA en eiwitten en de onderste laag is Trizol. Piteer voorzichtig ongeveer 500 μl van de bovenste heldere laag in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml, zorg ervoor dat het witte neerslag in de middelste laag niet wordt opgezogen. Als het per ongeluk wordt aangezogen, herhaal dan de centrifugatie om de heldere laag opnieuw op te vangen.
      2. Voeg een gelijke hoeveelheid voorgekoeld isopropanol toe aan de centrifugebuis met de heldere laag, ongeveer 500 μL, keer de buis meerdere keren om om goed te mengen en plaats deze vervolgens onmiddellijk in een vriezer van -80 °C met ultralage temperaturen gedurende 20-30 minuten. Deze stap is bedoeld om de neerslag van RNA te versnellen.
    6. Neem het monster eruit en centrifugeer onmiddellijk gedurende 10 minuten bij 400 x g bij 4 °C. Een kleine hoeveelheid wit, schilferig neerslag is te zien op de bodem van de centrifugebuis; Gooi het supernatant weg.
    7. Voeg kant-en-klare en ijsgekoelde 70% ethanol toe aan elke buis. Centrifugeer onmiddellijk bij 4 °C in een gekoelde centrifuge bij 400 x g gedurende ongeveer 10 minuten; Herhaal de bovenstaande stappen één keer om het neerslag grondig te wassen. Steriliseer bij deze stap de zuurkast gedurende 15 minuten voor met UV-licht.
    8. Nadat de centrifugebuisjes zijn verwijderd en het bovenstaande is weggegooid, centrifugeert u opnieuw gedurende 2 minuten bij 4 °C bij ongeveer 250 x g . Gebruik een pipetpunt van 200 μl om de overtollige alcohol voorzichtig op te zuigen vanaf de kant tegenover het neerslag en droog zo goed mogelijk. Plaats in een voor-UV-gesteriliseerde zuurkast om te drogen, laat het neerslag ongeveer 15 minuten aan de lucht drogen.
    9. Bereid de oplossing voor door 1 ml RNaseremmer toe te voegen aan 40 ml diethylpyrocarbonaat (DEPC) water. Voeg een geschikte hoeveelheid DEPC-water/RNaseremmermengsel toe, ongeveer 20-30 μL, om het monster op te lossen. Als er veel neerslag valt, voeg dan 30-50 μL toe. Ga onmiddellijk verder met reverse transcriptie PCR.
  9. Omgekeerde transcriptie PCR
    1. Zorg ervoor dat de volgende items aanwezig zijn: PCR-machine, RNase-vrije centrifugebuisjes van 1.5 ml, PCR-buisjes van 0.2 ml, ijsbad of ijskast, pipet en RNase-vrije tips.
    2. Meet de RNA-concentratie met behulp van de microvolumespectrofotometer. Zorg ervoor dat voor elk monster 1 μg RNA aan het reactiesysteem wordt toegevoegd.
    3. Het reverse transcriptiesysteem heeft een totaal volume van 20 μL. Bereken de totale hoeveelheid benodigde reagentia op basis van het aantal monsters. Meng volgens de verhouding die in de instructies wordt aangegeven.
    4. Bereid het reactiesysteem voor op ijs, draai het voort en centrifugeer het kort. Incubeer gedurende 15 minuten bij 42 °C en gedurende 30 s bij 90 °C.
    5. Gebruik het cDNA dat is verkregen uit het reverse transcriptieproces rechtstreeks voor real-time kwantitatieve PCR-analyse of bewaar het in een koelkast van -80 °C.
  10. Real-time kwantitatieve PCR-reactie
    1. Gebruik een real-time kwantitatieve PCR-reagenskit17 met een reactiesysteem van 10 μL. Gebruik de primersequenties die worden weergegeven in tabel 1.
    2. Voeg het hierboven beschreven reactiesysteem toe aan een plaat met 96 putjes of een buis met acht strips, speciaal voor RT-PCR. Zorg ervoor dat de monsters goed gemengd zijn. Controleer op luchtbellen in de buisjes voordat u ze op de PCR-machine plaatst.
    3. Amplificeer het gen met behulp van de PCR-cyclus (95 °C gedurende 5 min), 40 cycli (95 °C gedurende 10 s, 60 °C gedurende 30 s) en vul de gegevens in om de 2-ΔΔ Ct-waarde te berekenen. Verwerk, analyseer en plot de gegevens met behulp van de juiste software voor gegevensanalyse.

Resultaten

Zoals te zien is in figuur 1A, ontdekten we door observatie met een spleetlamp dat de genezing van het hoornvliesepitheel was verstoord. Onder normale omstandigheden zou het centrale hoornvliesepitheel binnen 24-48 uur na verwijdering volledig genezen, maar in de excisie van het centrale hoornvliesepitheel in combinatie met een hechtmodel bleven nieuwe bloedvaten bestaan. Op de derde dag nadat het model was opgesteld, werden significant limbaal oedeem en neovascularisatie van het hoornvlies waargenomen, met typische tekenen van limbale stamceldeficiëntie van het hoornvlies die lokaal verschenen. Na verloop van tijd, op de7e dag, was de genezing nog steeds niet voltooid. De hoornvliesontstekingsindex werd beoordeeld aan de hand van ciliaire congestie, paracentraal hoornvliesoedeem en centraal hoornvliesoedeem. Het hoornvliesoedeem verergerde geleidelijk en de ontsteking van het hoornvlies (figuur 1A) bleef verslechteren. Bovendien is neovascularisatie van het hoornvlies een indicator van ontsteking. Met de progressie van de ontsteking vertoonden de neovascularisatie van het hoornvlies (Figuur 1B) en de ontstekingsindex (Figuur 1C) een continue toename.

We voerden cryoembedding uit op de oogweefsels 7 dagen na het maken van het model. Hematoxyline- en eosinekleuring (Figuur 2A) toonde verdikking van het epitheel aan de limbus en het centrale hoornvlies, waarbij de epitheelopstelling zijn normale morfologie verloor, wat wijst op atypische hyperplasie. Het hoornvliesstroma leek oedemateus, met significante infiltratie van ontstekingscellen. Met behulp van PMN- en ED1-immunofluorescentiekleuring (Figuur 2B) werd een duidelijke toename van de infiltratie van neutrofielen en macrofagen waargenomen. De studie beoordeelde ontstekingsfactoren met behulp van IL-1β (Figuur 2C) en MIP-1α (Figuur 2D), waarbij werd vastgesteld dat IL-1β een piek bereikte op dag 3 en daarna geleidelijk afnam, terwijl MIP-1α in de loop van de tijd continu toenam.

Chronische ontsteking leidt meestal tot een reeks limbale stamceldeficiënties, zoals Pax6-downregulatie, verminderde Krt12-expressie en plaveiselmetaplasie van het hoornvliesepitheel. Om na te gaan of het in deze studie ontwikkelde model deze veranderingen in het fenotype van het hoornvliesepitheel zou kunnen induceren, werd immunofluorescentiekleuring voor Krt12 (Figuur 3A) en Pax6 (Figuur 3B) op het hoornvliesepitheel uitgevoerd. De expressie van Krt12 nam af bij langdurige ontsteking, waarbij slechts enkele Krt12-positieve cellen werden waargenomen op dag 7, en de expressie van Pax6 was significant verminderd in het hoornvliesepitheel. Op mRNA-niveau waren de expressieniveaus van normale cornea-epitheelmarkers Krt12 (Figuur 3C) en Pax6 (Figuur 3D) significant verminderd op dag 7. De expressieniveaus van plaveiselmetaplasiemarkers Krt10 (Figuur 3E) en Sprr1b (Figuur 3F) waren echter significant verhoogd op dag 7.

We gebruikten de proliferatiemarker Ki67 om het hoornvliesepitheel te kleuren, en de resultaten toonden een significante afname van het aantal Ki67-positieve hoornvliesepitheelcellen op dag 7 (Figuur 4A). De status van hoornvliesepitheliale stamcellen werd beoordeeld met behulp van de corneale limbale stamcelspecifieke marker ABCG2 (Figuur 4B) en de epitheliale voorlopercelmarker P63 (Figuur 4C). ABCG2- en P63-spiegels waren significant lager dan die in de normale groep. Daarnaast hebben we de gouden standaard voor stamcellen, de klonale kweekmethode, gebruikt om veranderingen in limbale stamcellen van het hoornvlies tijdens dit proces te beoordelen. We zagen dat de klonale vormingssnelheid van limbale stamcellen van het hoornvlies (Figuur 4D) afnam op dag 3 en aanzienlijk afnam op dag 7, waarbij het gemiddelde gebied van klonen kleiner werd en slechts een paar holoklonen zichtbaar waren op dag 7. De kolonievormende efficiëntie (CFE) werd verkregen door het tellen van de celklonen die zichtbaar waren in het microscoopveld van de kweekschaal. De CFE (Figuur 4E) duidde op een geleidelijke vermindering van het aantal limbale stamcellen van het hoornvlies onder ontstekingsomstandigheden. Dit suggereert dat ernstige ontsteking in dit model leidt tot de uitputting van corneale limbale epitheliale stamcellen, en dit proces induceert geen fenotypische transformatie van de corneale limbale stamcellen, maar levert eerder problemen op bij differentiatie of zelfvernieuwing.

Het ontstekingsmodel dat in deze studie werd gebruikt, resulteerde in veranderingen in het hoornvlies die kenmerkend zijn voor LSCD, waaronder uitgebreide infiltratie van ontstekingscellen in het hoornvlies, dysplasie van het hoornvliesepitheel en verstoorde of verminderde expressie van Pax6 en Krt12 in het normale fenotype van het hoornvliesepitheel. Bovendien was er een significante toename van Krt10-mRNA-expressie. Samenvattend is dit experimentele model zeer geschikt voor het bestuderen van de abnormale differentiatie van hoornvliesepitheliale stamcellen veroorzaakt door ontsteking.

figure-results-1
Figuur 1: Vaststelling van het ontstekingsmodel. Om de effecten van ernstige ontsteking op hoornvliesepitheliale stamcellen te bestuderen, werd een model voor ernstige ontsteking opgesteld. (A) Na het induceren van het model werd het hoornvlies geobserveerd met behulp van spleetlampfotografie. Drie dagen na modellering was de cornea-limbus van de rat ernstig oedemateus, met duidelijke neovascularisatie en gelokaliseerde hyperplasie, wat typische tekenen zijn van corneale limbale stamceldeficiëntie. Tegen de zevende dag verslechterde het hoornvliesoedeem geleidelijk en bleef de neovascularisatie groeien. Met de progressie van de ontsteking vertoonden (B) neovascularisatie van het hoornvlies en (C) ontstekingsindex een continue toename. *p < 0,05, ****P < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: De ontstekingsreactie na het modelleren. De ontstekingsreactie die door het model in het hoornvlies werd geïnduceerd, werd geëvalueerd. (A) Hematoxyline- en eosinekleuring van de oogbol toonde aan dat tijdens het ontstekingsproces zowel het limbale als het centrale hoornvliesepitheel verdikt werden en de opstelling van het hoornvliesepitheel zijn normale morfologie verloor en tekenen van atypische hyperplasie vertoonde. (B) De macrofaagmarker ED1 (groen) en de neutrofielenmarker PMN (rood) waren significant verhoogd. RT-qPCR toonde een significante verhoging van cornea-epitheliale ontstekingsfactoren (C) IL-1β en (D) MIP-1α. Blauw staat voor nucleaire kleuring met DAPI, schaalbalk = 50 μm; p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Fenotypische veranderingen van cellen onder inflammatoire omstandigheden. Immunokleuring voor (A, rood) KRT12 in het limbale epitheel en (B) PAX6. (C) KRT12-mRNA-expressieniveaus vertonen een significante vermindering naarmate de ontsteking vordert. (D) PAX6-mRNA-expressie vertoont een abnormale verdeling en een duidelijke afname van het limbale epitheel onder ontstekingsomstandigheden. Omgekeerd neemt de mRNA-expressie van (E) Krt10 en de abnormaal gedifferentieerde hoornvliesepitheliale marker (F) Sprr1b significant toe tijdens ontsteking. Blauw staat voor nucleaire kleuring met DAPI, schaalbalk = 50 μm; **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Veranderingen van limbale stamcellen in een inflammatoire toestand. Immunofluorescentiebeelden van (A, rood) Ki67 illustreren veranderingen in prolifererende cellen na de inductie van ontsteking. De mRNA-expressie van de stamcelmarker (B) ABCG2 is significant verminderd. De voorlopercelmarker (C) p63 wordt ook tot expressie gebracht. (D) Kristalviolette kleuringsbeelden en (E) CFE tonen een afname van het aantal limbale stamcellen onder inflammatoire omstandigheden. Blauw geeft kernen aan die gekleurd zijn met DAPI; schaalbalk is 50 μm; *p < 0,05, **p < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naam van de primerInleiding volgorde
TNF-aVoorwaarts5'-TCAGTTCCATGGCCCAGAC-3'
Omkeren5'-GTTGTCTTTGAGATCCATGCCATT-3'
IL-1βVoorwaarts5'-CCTCGTCCTAAGTCACTCGC-3'
Omkeren5'-GGCTGGTTCCACTAGGCTTT-3'
Pax6Voorwaarts5'-GTGTTCAGTGCAGAGCCTTC-3'
Omkeren5'-TTCACCGTTGCTGTTCACTG-3'
Krt12Voorwaarts5'-AGCTAACGCGGAACTGGAAA-3'
Omkeren5'-CTCTCCGCTCTTGGTGAGGT-3'
Krt10Voorwaarts5'-TCCGGGATCTGGAAGAGTCAA-3'
Omkeren5'-TTGGGTAAGCTTTGCTAAGTGGAA-3'
Sprr1bVoorwaarts5'-CCATCCCAAGGCACCTGAG-3'
Omkeren5 '-TGCTGGTATGGTGATGGAGT-3'
ActinVoorwaarts5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'
Omkeren5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'

Tabel 1: Volgorde van de primers die worden gebruikt voor kwantitatieve RT-PCR.

Discussie

Ontsteking speelt een sleutelrol bij de ontwikkeling van limbale stamceldeficiëntie18, maar de specifieke mechanismen en effecten ervan vereisen verder onderzoek. Om dit probleem aan te pakken, hebben we LSCD geïnduceerd door het centrale hoornvliesepitheel te schrapen en het centrale hoornvliesstroma te hechten om ernstige hoornvliesontsteking te veroorzaken. We observeerden de evolutie van hoornvliesontsteking en de status van de limbale stamcellen op dag 1, 3 en 7 na de modellering. Op de derde dag na de modellering werden significant oedeem van de limbus van de rat, duidelijke neovascularisatie en verhoogde lokale weefselproliferatie waargenomen, wat typische kenmerken zijn van limbale stamceldeficiëntie. Op dag 7 was het hoornvliesoedeem verder geïntensiveerd en bleef het aantal nieuwe bloedvaten toenemen. Door middel van RT-qPCR en immunofluorescentiekleuringstechnieken hebben we waargenomen dat op dag 7 na modellering de expressieniveaus van macrofaagmarker ED1, neutrofiele marker PMN en centrale cornea-epitheliale ontstekingsfactoren MIP-1α en IL-1β significant verhoogd waren. Tijdens de progressie van de ontsteking waren de immunokleuringsbeeldvorming en gerelateerde mRNA-expressieniveaus van hoornvliesepitheelcelspecifieke transcriptiefactor Pax6 en hoornvliesspecifieke keratine Krt12 significant verminderd. De mRNA-expressie van huidgerelateerde plaveiselepitheliale metaplasiemarker Krt10 en hoornvliesepitheelmarker Sprr1b nam toe tijdens de progressie van ontsteking, wat wijst op abnormale differentiatie. De mRNA-expressie van stamcelmarker ABCG2 nam significant af. Voorlopercelmarker p63 werd ook tot expressie gebracht. Kristalviolette kleuringsbeelden en CFE toonden aan dat onder ontstekingsomstandigheden het aantal limbale stamcellen afnam. Een uitgebreide analyse gaf aan dat zeven dagen na de modellering de ontstekingsfactoren in het hoornvliesepitheel significant toenamen, de differentiatie van het hoornvliesepitheel abnormaal was, het aantal hoornvliesepitheelstamcellen aanzienlijk afnam en de cellulaire proliferatiecapaciteit en stamcelkenmerken afnamen.

Dit model induceert hoornvliesontsteking zonder de limbale epitheliale stamcellen direct te beschadigen, waardoor het onderzoek naar de effecten en mechanismen van hoornvliesontsteking op limbale epitheliale stamcellen wordt bevorderd. In epitheelweefsels, waaronder het hoornvliesepitheel, manifesteert stamcelherprogrammering zich als epitheliale transdifferentiatie. Dit proces is nauw verwant aan ontsteking en wordt gekenmerkt door abnormale differentiatie veroorzaakt door verschillende cytokines, groeifactoren en andere oplosbare factoren in de micro-omgeving 19,20,21,22. In een inflammatoire toestand, vooral bij langdurige aanhoudende ontstekingstoestanden, zoals het droge-ogensyndroom en andere aandoeningen van het oogoppervlak 23,24,26, kan het hoornvliesepitheel worden geherprogrammeerd tot huidepitheel, een aandoening die bekend staat als plaveiselmetaplasie. Deze overgang omvat de verzwakking of het verlies van hoornvliesepitheelspecifieke markers Krt12, die worden vervangen door huidspecifieke markers Krt10 en Sprr1b27,28. Het model dat in dit protocol wordt beschreven, vertoont soortgelijke verschijnselen. Aanvankelijk worden limbale stamcellen geactiveerd en vervolgens, bij aanhoudende ontsteking, treedt hoornvliesepitheliale plaveiselcelmetaplasie op. We observeerden typische plaveiselepitheelcellen in het hoornvliesepitheel, gekenmerkt door verminderde expressie van Krt12 en Pax6 en verhoogde expressie van Krt10 en Sprr1b (markers van plaveiselmetaplasie). Vroege ontsteking versterkte de proliferatie van het hoornvliesepitheel, terwijl in latere stadia de proliferatie afnam. In overeenstemming met wat we vonden in onze studies over LSCD veroorzaakt door het Stevens-Johnson-syndroom of congenitale aniridie, waren de limbale stamcelmarkers ABCG2 en de gouden standaard voor het beoordelen van stamcellen, de kolonievormende efficiëntie, aanzienlijk verminderd. De klonale cellen behielden echter het vermogen om te differentiëren tot volwassen hoornvliesepitheelcellen. In eerdere studies werd plaveiselmetaplasie van het hoornvliesepitheel waargenomen in lucht-vloeistofinterfaceculturen, maar de hoornvliesepitheelstamcellen vertoonden nog steeds het potentieel om te differentiëren tot een normaal fenotype van het hoornvliesepitheel en een verhoogde proliferatieve capaciteit. Dit lijkt erg op ons huidige onderzoek29.

Daarom bevestigt het in dit protocol ontwikkelde onderzoeksmodel dat ernstige ontsteking kan leiden tot schade aan limbale stamcellen zonder de limbale stamcelniche direct te beschadigen. Deze bevinding is zeer gunstig voor het observeren van de effecten van ernstige ontsteking op de biologische mechanismen van limbale stamcellen en biedt een ideaal experimenteel platform voor het bestuderen van de mechanismen van LSCD veroorzaakt door hoornvliesontsteking.

Dit model heeft echter zijn beperkingen. Verdoofde ratten ondergaan mechanisch schrapen van het hoornvliesepitheel, gevolgd door het hechten van het hoornvlies, beide invasieve procedures met een hoog risico op intraoperatieve en postoperatieve infectie30. Bovendien maakt de dunheid van het hoornvlies van de rat het vatbaar voor perforatie tijdens het hechten, wat een hoge vaardigheid van de operator vereist.

Daarom moeten we tijdens de procedure op de volgende punten letten: (i) reinheid en desinfectie: Alle instrumenten moeten vóór de operatie worden gesteriliseerd. Antibiotische oogdruppels moeten de dag vóór en op de dag van de procedure worden toegediend om het risico op infectie te verminderen. Aangezien de hechting van het hoornvlies een vreemd lichaam is dat ontstekingen en infecties kan veroorzaken, moet een strikte aseptische techniek worden gevolgd en moeten antibiotische oogdruppels gedurende drie dagen na de operatie worden voortgezet. (ii) Omgaan met het hoornvlies van de rat: Het hoornvlies van de rat is relatief dun en vatbaar voor perforatie tijdens het hechten. Gebruik een tandtang om het bindvlies aan de andere kant van de hechtplaats vast te houden om de oogbol te stabiliseren en de operatie te vergemakkelijken. Plaats de hechtdraad op ongeveer 1,5-2 mm van de limbus van het hoornvlies, waar het hoornvlies dikker is en minder vatbaar voor perforatie, terwijl schade aan de limbale stamcellen wordt voorkomen. (iii) Verwijdering van hoornvliesepitheel: De hoornvliestrephine en hoornvliesepitheelschraper kunnen het hoornvliesepitheel snel verwijderen en zijn eenvoudig te bedienen, maar het is vrij scherp en kan het stroma beschadigen of perforatie veroorzaken. Regel de intensiteit van de kracht tijdens het verwijderen om perforatie te voorkomen. Om uniformiteit in het verwijderingsgebied te garanderen, gebruikt u een cirkelvormige marker om het gebied te markeren voordat u het hoornvliesepitheel verwijdert.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de Guizhou Provincial Science and Technology Projects (QKHJC-ZK [2024]ZD043), Fujian Provincial Science Fund for Distinguished Young Scholars (2023J06053 [tot S.O]); de Natural Science Foundation of China (No.82101084 [aan S.O.] en China Scholarship Council (CSC, 202306310049 [aan Y.W.]).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10-0 suture lineAlcon, Inc., USA8065698001
2 mm corneal trephineSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
20 μ L, 100 μ L, 1 mL pipette gun heads, cell culture plate culture plates, centrifuge tubesGuangzhou Jiete Biological Co., Ltd., Chinahttps://www.jetbiofil.com/index.html
-20/-80 °C fridgeQingdao Haier Company, Chinahttps://www.haier.com/cn/
A 10-mL syringe Zhejiang Condelai Medical Device Co., Ltd., Chinahttps://en.kdlchina.com/zhejiang/25.html
Adhere to the slideShiTai Company188105
Amylene alcoholShanghai. Macklin Biochemical, Chinahttp://www.macklin.cn/products/
Anti-CytokertinAbcam, United Kingdomab76318
Anti-Keratin 12 antibody EPR17882Abcam, United Kingdomab185627
Anti-PAX6 antibodyAbcam, United Kingdomab195045
Anti-stripping slides, cover slipsJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd., Chinahttps://cn.citotest.com/
AutoclaveHirayama, Japanhttps://hirayama.com.cn/about/
AvertinShanghai Aladdin Biochemical Technology, Chinahttps://www.aladdin-e.com/zh_cn/A111225.html
ChloroformShanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinahttps://www.siobp.com/web
CO2 Oven incubator, ultrasonic crusher, centrifugeThermo Fisher Technologies Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
Confocal microscopeShanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd., Chinahttps://www.clinx.cn/about
Corneal epithelial forcepsSuzhou XVI Vision Company, China53418D
DAPIVector. Inc., USAH-1000
DEPC water Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinahttps://www.siobp.com/web
Dicuro eye cream (ofloxacin eye cream)Santian Pharmaceutical Corporation, Japanhttps://www.santen.com/asia
D-KSFM, culture medium, double antibody, and PBSThermo Fisher Scientific, Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
ED1AbD Serote c, United Kingdom MCA341GA
Electronic balanceShanghai Ohaus Biotechnology Company, Chinahttp://shbio.com/company
Enclosure of the membraneParafilm, Inc., USAhttps://www.sigmaaldrich.cn
Fluorescein sodium test strip was used in ophthalmologyTianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd., Chinahttps://www.eworldtrade.com/c/jingmingtechnological/
Fluorescent inverted phase-contrast micrographic systemTE-2000U, Nikon, Japanhttps://www.microscopyu.com/museum/eclipse-te2000-inverted-microscope
Frozen table-top centrifugeEppendorf, Germanyhttps://www.eppendorf.sh.cn 
Glass sheet frameXiamen Tianjing Biotechnology Co., Ltd., Chinahttp://www.tagene.net/
H-1200 with DAPI sealagentXiamen Juin Biotechnology Co., Ltd., Chinahttps://www.bosonbio.com.cn/
HE staining kitAuragene, Chinahttp://jushengwu.com/a048/
Hematoxylin-eosin dye solution kitAURAGEN, United StatesP032IH
High and low precision electronic balanceSdolis, Germanyhttps://www.solisinverters.com/global
IsopropanolShanghai Sinopharm Chemical Reagents Co., Ltd., Chinahttps://en.reagent.com.cn/
Ki-67 antibodyAbcam, United Kingdomab16667
liquid nitrogenXiamen Yidong Gas Co., Ltd., Chinahttps://www.china.tdk.com.cn/tdk_chn_en/tdk_xiamen/
Microhand holderSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Multiformaldehyde powderSigm, Americahttps://www.sigmaaldrich.cn
Normal temperature centrifuge 46Eppendorf, Germanyhttps://www.thermofisher.cn
OCTShanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., China4583
Ordinary biological micrographic systemEclipse 50i, Nikon, Japanhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/upright-microscopes/eclipse-ni-series
PBSShanghai Anjin Biotechnology Co., Ltd, ChinaSH30256.01
PCR, and the reactor apparatusBiometra Thermocycler, Germanyhttps://www.analytik-jena.com/products/life-science/pcr-qpcr-thermal-cycler/thermal-cycler-pcr/biometra-tone-series/
Pipettes of various specificationsEppendorf Company, Germanyhttps://www.eppendorf.com/cn-zh/
Primers for Rt-PCRShanghai Bio-Tech Co., Ltd.
Promeaine hydrochloride 0.5% eye dropsAlcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Rat PMN antibodyFitzgerald, United States20R-PR020
Real time fluorescence quantitative PCRApplied Biosystems, United Stateshttps://www.thermofisher.cn
Reverse transcription kitTAKARA, Japanhttps://www.takarabiomed.com.cn/
Slit lampTOPCON, Japanhttps://topconchina.cn/
Smooth forcepsSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Specimen-boxLambolid (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd., Chinahttp://chuangdianbio.com/
Superclean benchNew Plus Pi Art High Technology Company Limited, Singaporehttps://www.hi-p.com/
Toothed forcepsSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Toppicamide eye drops (Medol)Alcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Trace nucleic acid protein concentration testerThermo Fisher Technologies Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
TrizolInvitrogen The United Stateshttps://www.fishersci.com/us/en/brands/IIAM0WMR/invitrogen.html

Referenties

  1. Ang, L. P., Tan, D. T. Ocular surface stem cells and disease: Current concepts and clinical applications. Ann Acad Med Singap. 33 (5), 576-580 (2004).
  2. Mao, Y., et al. Downregulation of p38 MAPK signaling pathway ameliorates tissue-engineered corneal epithelium. Tissue Eng Part A. 28 (23-24), 977-989 (2022).
  3. Sprogyte, L., Park, M., Di Girolamo, N. Pathogenesis of alkali injury-induced limbal stem cell deficiency: A literature survey of animal models. Cells. 12 (9), 1294(2023).
  4. He, X., et al. Lacrimal gland microenvironment changes after obstruction of lacrimal gland ducts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 63 (3), 15(2022).
  5. Le, Q., Chauhan, T., Deng, S. X. Diagnostic criteria for limbal stem cell deficiency before surgical intervention- A systematic literature review and analysis. Surv Ophthalmol. 65 (1), 32-40 (2020).
  6. Li, W., Hayashida, Y., Chen, Y. T., Tseng, S. C. Niche regulation of corneal epithelial stem cells at the limbus. Cell Res. 17 (1), 26-36 (2007).
  7. Ou, S. K., et al. The role of ectodysplasin a on the ocular surface homeostasis. Int J Mol Sci. 23 (24), 12(2022).
  8. Lin, S., et al. Limbal stem cell dysfunction induced by severe dry eye via activation of the p38 MAPK signaling pathway. Am J Pathol. 193 (11), 1863-1878 (2023).
  9. Jiang, G. J., Li, B. B., Fan, T. J. Timolol induces necroptosis, apoptosis and senescence concentration-dependently in rabbit limbal stem cells in vitro. Life Sci. 277, 119453(2021).
  10. Castro-Munozledo, F. Review: Corneal epithelial stem cells, their niche and wound healing. Mol Vis. 19, 1600-1613 (2013).
  11. Atalay, E., et al. Animal models for limbal stem cell deficiency: A critical narrative literature review. Ophthalmol Ther. 13 (3), 671-696 (2024).
  12. Delic, N. C., Cai, J. R., Watson, S. L., Downie, L. E., Di Girolamo, N. Evaluating the clinical translational relevance of animal models for limbal stem cell deficiency: A systematic review. Ocul Surf. 23, 169-183 (2022).
  13. Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
  14. Ye, J., et al. Biomimetic nanocomplex based corneal neovascularization theranostics. J Control Release. 374, 50-60 (2024).
  15. Zhu, H. M., et al. A synergistic therapy with antioxidant and anti-VEGF: Toward its safe and effective elimination for corneal neovascularization. Adv Healthc Mater. 13 (5), 10(2024).
  16. Yu, J. W., et al. In vivo assembly drug delivery strategy based on ultra-small nanoparticles: Toward high drug permeation and accumulation for CNV treatment. Chem Eng J. 450, 137968(2022).
  17. Wu, H., et al. A SU6668 pure nanoparticle-based eyedrops: Toward its high drug accumulation and long-time treatment for corneal neovascularization. J Nanobiotechnol. 22 (1), 290(2024).
  18. Long, Q., et al. A novel tissue-engineered corneal epithelium based on ultra-thin amniotic membrane and mesenchymal stem cells. Sci Rep. 14 (1), 17407(2024).
  19. Giroux, V., Rustgi, A. K. Metaplasia: Tissue injury adaptation and a precursor to the dysplasia-cancer sequence. Nat Rev Cancer. 17 (10), 594-604 (2017).
  20. Herfs, M., Hubert, P., Delvenne, P. Epithelial metaplasia: Adult stem cell reprogramming and (pre)neoplastic transformation mediated by inflammation. Trends Mol Med. 15 (6), 245-253 (2009).
  21. Slack, J. M. Metaplasia and transdifferentiation: From pure biology to the clinic. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 369-378 (2007).
  22. Slack, J. M., Tosh, D. Transdifferentiation and metaplasia--switching cell types. Curr Opin Genet Dev. 11 (5), 581-586 (2001).
  23. Wang, S., et al. Impact of chronic smoking on meibomian gland dysfunction. PLoS One. 11 (12), e0168763(2016).
  24. Wu, Y., et al. Evolution of therapeutic strategy based on oxidant-antioxidant balance for fuchs endothelial corneal dystrophy. Ocul Surf. 34, 247-261 (2024).
  25. Li, Y., et al. Meibomian gland alteration in patients with systemic lupus erythematosus. Lupus. 31 (4), 407-414 (2022).
  26. Zhang, Y., et al. Histopathology-based diagnosis of Mooren's ulcer concealed beneath the pterygium on eye. J Histotechnol. 45 (4), 195-201 (2022).
  27. Tseng, S. C., Hatchell, D., Tierney, N., Huang, A. J., Sun, T. T. Expression of specific keratin markers by rabbit corneal, conjunctival, and esophageal epithelia during vitamin A deficiency. J Cell Biol. 99 (6), 2279-2286 (1984).
  28. Espana, E. M., et al. Characterization of corneal pannus removed from patients with total limbal stem cell deficiency. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (9), 2961-2966 (2004).
  29. Li, W., et al. Air exposure induced squamous metaplasia of human limbal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (1), 154-162 (2008).
  30. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Exp Eye Res. 161, 101-105 (2017).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Limbaire stamcellencorneale neovascularisatieratcorneamodelimmunofluorescentiekleuringRT qPCR analysecorneaal oedeemstamceldisfunctie
Het opzetten van een model voor ernstige hoornvliesontsteking bij ratten op basis van hoornvliesepitheelcurettage in combinatie met hoornvlieshechtingen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.