Methodenartikel

Assemblage en kwantificering van co-culturen die heterotrofe gist combineren met fototrofe suikerafscheidende cyanobacteriën

DOI:

10.3791/67311

⸱

27 december 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Synthetic Microbiology, Heinrich Heine University Düsseldorf, 2Institute of Microbiology, Heinrich Heine University Düsseldorf, 3Department of Microbiology, Genetics, & Immunology, Michigan State University, 4Computational Life Science, Department of Biology, RWTH Aachen University, 5Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een uitgebreide richtlijn voor het opzetten en kwantitatief monitoren van co-culturen, inclusief fotoautotrofe suikerafscheidende cyanobacteriën en heterotrofe gisten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met de toenemende vraag naar duurzame biotechnologieën worden gemengde consortia met een fototrofe microbe en heterotrofe partnersoorten onderzocht als een methode voor bioproductie op zonne-energie. Eén benadering omvat het gebruik van CO2-bindende cyanobacteriën die organische koolstof afscheiden om het metabolisme van een samen gekweekte heterotroof te ondersteunen, die op zijn beurt de koolstof omzet in goederen of diensten met een hogere waarde. In dit protocol wordt een technische beschrijving gegeven om de experimentalist te helpen bij het opzetten van een co-cultuur die een sucrose-afscheidende cyanobacteriële stam combineert met een schimmelpartner(s), zoals vertegenwoordigd door modelgistsoorten. Het protocol beschrijft de belangrijkste voorwaarden voor het opzetten van co-cultuur: het definiëren van de mediasamenstelling, het monitoren van de groeikenmerken van individuele partners en de analyse van gemengde culturen met meerdere soorten gecombineerd in hetzelfde groeivat. Basislaboratoriumtechnieken voor co-cultuurmonitoring, waaronder microscopie, celteller en single-cell flowcytometrie, worden samengevat, en voorbeelden van niet-merkgebonden software die kan worden gebruikt voor gegevensanalyse van standaard FCS-bestanden (raw flowcytometrie) in overeenstemming met FAIR-principes (Findable, Accessible, Interoperable, Reusable). Ten slotte is commentaar op de knelpunten en valkuilen die vaak voorkomen bij het tot stand brengen van een co-cultuur met suikerafscheidende cyanobacteriën en een nieuwe heterotrofe partner. Dit protocol biedt een hulpmiddel voor onderzoekers die proberen een nieuw paar co-gekweekte microben vast te stellen, waaronder een cyanobacterie en een heterotrofe microbe.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met de snelle uitbreiding van genomische instrumenten en DNA-technologieën in de afgelopen jaren, zijn bio-engineeringinspanningen steeds beter in staat om gemengde gemeenschappen van microben als levensvatbaar te beschouwen voor bioproductiestrategieën in plaats van zich alleen te concentreren op axenische culturen. Microbiële consortia hebben meerdere potentiële voordelen ten opzichte van culturen van één soort, waaronder specialisatie en taakverdeling, aanpassingsvermogen en robuustheid, en efficiëntie van substraatgebruik1. De voorspelbare engineering van consortia met meerdere soorten wordt echter bemoeilijkt door onzekerheden die worden veroorzaakt door gedrag van hogere orde dat voortkomt uit interacties tussen soorten2. Soortoverschrijdende signalering en metabolietuitwisseling vormen de kern van het principe van taakverdeling, maar leiden ook tot onverwachte synergieën en antagonismen tussen deelnemers aan de consortia3. Er is een aanzienlijke ontwikkeling in het veld nodig om het volledige potentieel van gemengde microbiële consortia te realiseren, inclusief het gebruik van flexibele co-cultuurplatforms met 2 en 3 partners, die kunnen worden gebruikt om microbiële interactiviteit van "bottom-up" beter te karakteriseren en te begrijpen.

Een paar dominante soorten co-cultuurplatforms zijn momenteel in gebruik in het veld, waaronder complementaire auxotrofe partners en microben die metabolieten afscheiden die over het algemeen gunstig zijn voor een breed scala aan microbiële soorten. In de laatste categorie zijn cyanobacteriën gemanipuleerd om verbeterde primaire producenten te worden door de introductie van routes die leiden tot de afscheiding van gemakkelijk gemetaboliseerde koolhydraten en zijn nu onderzocht in een verscheidenheid aan rationeel ontworpen consortia. Kortom, in dergelijke gemanipuleerde microbiële gemeenschappen is de cyanobacteriële partner in staat om licht en CO2 als primaire inputs te gebruiken, en door het proces van zuurstofrijke fotosynthese kunnen deze stammen centrale koolstofsuikers afscheiden als een publiek goed. Een klasse van dergelijke gemanipuleerde cyanobacteriële stammen zijn die welke zijn gemanipuleerd om de disacharide sucrose4 af te scheiden. Dergelijke stammen hebben waarschijnlijk hun succes gehad omdat sucrose een metaboliet is die voor veel soorten dicht bij het centrale koolstofmetabolisme staat en ook vaak hypergeaccumuleerd is als een zogenaamde "compatibele opgeloste stof" om zich aan te passen aan een verscheidenheid aan abiotische spanningen in het milieu5. Een minimaal aantal genetische ingrepen kan leiden tot efficiënte sucrosesecretie in een reeks cyanobacteriële modelorganismen4.

Sucrose-afscheidende cyanobacteriën zijn een nuttig platform voor het onderzoek naar rationeel ontworpen microbiële consortia, omdat een breed scala aan heterotrofe soorten sucrose kan metaboliseren als hun dominante bron van koolstof en energie. Inderdaad, gebruikmakend van een paar modelcyanobacteriën met sucrose-afscheidende capaciteiten, hebben veel laboratoria rationeel ontworpen gemengde soorten co-culturen en consortia die een of meer heterotrofe microben bevatten en die uiteindelijk worden ondersteund door de primaire input van licht en CO2 zonder aanvulling van organische koolstofgrondstoffen4. De heterotrofe stammen kunnen gewoon bestaan van de van cyanobacteriën afgeleide koolhydraten, of ze kunnen worden gebruikt om de sucrose-grondstof om te zetten in bioproducten met een hogere waarde (bijv. brandstoffen, polymeren, pigmenten, enz.). Dergelijke simplistische co-culturen zijn niet alleen een potentiële strategie voor duurzame bioproductie, maar kunnen ook nuttig zijn als platform voor het onderzoek naar opkomende interacties tussen niet-verwante microbiële soorten.

Dit video-artikel richt zich op methodologieën en voorwaarden voor het gebruik van suikerproducerende cyanobacteriën als een flexibel platform voor het ontwerp van eenvoudige microbiële consortia die stabiel kunnen zijn door alleen lichte en anorganische koolstofinput aan te vullen. Hoewel het opzetten en monitoren van culturen die enkelvoudige gevestigde micro-organismen bevatten, meestal eenvoudig is en gemakkelijk kan worden bereikt met behulp van optische dichtheid (OD) of backscatter-methodologie, is dit niet haalbaar zodra twee of meer organismen in één vat zijn gecombineerd. De belangrijkste reden is dat deze methoden geen onderscheid maken tussen de verschillende micro-organismen, daarom geven ze alleen een algemeen beeld van de cultuur en lossen ze de groei van de individuele organismen niet op. Bovendien hebben cyanobacteriën een breed absorptiespectrum in het bereik van 400-750 nm, dus het meten van de OD600 van een heterotroof zou leiden tot valse resultaten als gevolg van fycocyanine (dat absorbeert in 620 nm). Daarom worden specifieke protocollen voorzien voor het opzetten van cyanobacteriën-heterotroof gemengde gemeenschappen binnen het laboratorium, evenals nuttige generieke protocollen voor de analyse van de prestaties van deze consortia in de tijd. Hoewel de protocollen zich richten op een specifieke koppeling van een model, sucrose-afscheidende cyanobacteriële soorten met een of meer heterotrofe microben, is de bedoeling van dit werk om een hulpmiddel te bieden voor onderzoekers die mogelijk nieuwe soortenparen willen ontwerpen en om de optimalisatiefase voor de oprichting van dergelijke culturen te versnellen. Daarom zijn naast soortspecifieke protocollen ook informatie en strategieën opgenomen die kunnen worden gebruikt om deze protocollen aan te passen en te generaliseren voor aangepaste gemeenschappen, zoals gedefinieerd door de behoeften van de lezer.

Vanwege de flexibiliteit van het hierin beschreven co-cultuurplatform, worden protocollen beschreven voor een aantal verschillende heterotrofe soorten die eerder zijn gerapporteerd in co-teelt met suikerafscheidende cyanobacteriën. Zo wordt bijvoorbeeld het stap-voor-stap protocol voor een co-cultuur van Synechococcus elongatus PCC 7942 met de gangbare laboratoriumgist Saccharomyces cerevisiae verstrekt. Toch bevat het artikel ook protocollen die geschikt zijn voor het testen van de prestaties van co-culturen die andere modelsoorten bevatten, waaronder de gistvorm van Ustilago maydis.

Het artikel richt zich op een kernset van protocollen die nodig zijn om een cyanobacteriën/heterotrofe co-cultuur tot stand te brengen en om basiskarakterisering van de prestaties van deze gemengde consortia in de loop van de tijd uit te voeren. In het bijzonder wordt de nadruk gelegd op eencellige flowcytometrie en methoden voor het tellen van deeltjes die geschikt zijn om een nauwkeurige telling van verschillende soorten uit te voeren, evenals microscopiebenaderingen om de celmorfologie te evalueren. Deze protocollen zijn bedoeld als basis voor aanpassing aan de behoeften en beschikbare apparatuur. Belangrijk is dat er technische nota's en andere overwegingen worden verstrekt die belangrijk zijn voor het opzetten en monitoren van co-culturen binnen het laboratorium. Ten slotte zijn er voorbeelden van niet-propriëtaire alternatieven voor data-analyses van ruwe FCS6-bestanden met behulp van Python-pakketten. Samengevat is het doel om co-cultuurtechnieken op basis van cyanobacteriën toegankelijker te maken voor een breder wetenschappelijk publiek.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Dit protocol bevat gedetailleerde instructies voor het opzetten en kwantificeren van co-culturen van suikerafscheidende S. elongatus en heterotrofe modelgistsoorten. Over het algemeen is het protocol van toepassing op elke gistsoort die vatbaar is voor genetische manipulatie.

1. Oprichting van co-culturen die fototrofe cyanobacteriën en heterotrofe gisten combineren

  1. Voorbereidingen voor co-cultivatie: media en voorteelt
    OPMERKING: Bereid alle media en papieroplossingen met ultrazuiver gefilterd water. Al het glaswerk (maatbekers, maatcilinders, voorraadflessen en kweekkolven) moet worden gereinigd en geautoclaveerd. Steriele media kunnen bij kamertemperatuur (RT) worden bewaard. Er moet een apparaat beschikbaar zijn dat compatibel is met de vereisten van foto-autotrofe teelt.
    1. Bereid het co-cultuurmedium ten minste 3-4 dagen voor de beoogde start van de co-cultuur voor. De meeste recepten voor co-cultuurmedia zijn variaties op het gebruikelijke BG-11 medium7 dat wordt gebruikt voor de routinematige teelt van veel cyanobacteriële modelsoorten. Dit protocol gebruikt het eerder gerapporteerde CoYBG-11-medium als voorbeeld (8; Zie tabel 1). Autoclaaf (121 °C, 20 min) of filtreer het voorbereide medium, indien van toepassing.
      OPMERKING: Zie de sectie Discussie voor suggesties voor het aanpassen van een medium dat geschikt is voor andere soortenparen.
    2. Bereid moleculaire reagentia voor: Voor inductie van cscB-expressie en sucrose-export 9,10,11, bereid een voorraad van 1 M isopropyl-β-thiogalactoside (IPTG).
      LET OP: Het gebruik van antibiotica tijdens de co-cultuur is suboptimaal, maar als alle stammen resistentiecassettes dragen, kunnen deze worden gebruikt. Bereid in dat geval antibioticavoorraden voor op basis van de behoeften van de gebruikte stammen.
    3. Bereid een cyanobacterium-voorcultuur voor: Breng ten minste 3 dagen voor de start van de co-cultuur cellen over van een voorcultuur van de suikerafscheidende stam van cyanobacteriën die in BG-11-medium groeien in een verse verbijsterde kolf met CoYBG-11-medium (Tabel 1).
      OPMERKING: Meerdere soorten en stammen van cyanobacteriën zijn nu gemodificeerd om suikers af te scheiden. Voor een uitgebreid overzicht van de soorten die beschikbaar zijn op het moment van schrijven, zie4. Deze referentie vermeldt ook heterotrofe soorten (zie 1.1.4) waarvoor eerder cocultuur van cyanobacteriën is gerapporteerd.
      1. Meet de OD750 van de precultuur. Bereken het vereiste volume van de precultuur om een streefwaardeOD 750 van 0,3 (C1) te bereiken met behulp van de vergelijking V1 = C2 x V2/C1 waarbij C2 = doel-OD, V2 = doelvolume en V1 = vereiste hoeveelheid voorcultuur. Bijvoorbeeld, bij het inoculeren van een cultuur van 30 ml (V2) is de hoeveelheid x vloeibare cultuur die u moet gebruiken V1 (ml) = (0,3 x 30)/(gemeten OD750).
        OPMERKING: Optische dichtheid is een benadering van de celdichtheid en is afhankelijk van de groeiomstandigheden en de celmorfologie; Daarom is het noodzakelijk voor onderzoekers om methoden te gebruiken om optische dichtheid te correleren met absolute celaantallen (zie secties 2.1, 2.2 en 2.3) voor een goede evaluatie van de co-cultuurprestaties. Voor cyanobacteriën mogen lichtgolflengten binnen het fotosynthetisch actieve spectrum (d.w.z. 400-700 nm) niet worden gebruikt voor het bepalen van de optische dichtheid, omdat ze worden geabsorbeerd door chlorofyl en andere pigmenten; Daarom worden routinematig verrode golflengten gebruikt (bijv. 750 nm).
      2. Incubeer de verdunde cultuur in een geschikte foto-incubator. Typische incubatie
        de omstandigheden voor modelcyanobacteriën zijn als volgt: 30 °C, 150 rpm (25 mm projectie), 2% CO2 headspace, ~200 μmol fotonen m-2·s-1 LED-verlichting, 75% luchtvochtigheid.
        LET OP: Suppletie met CO2 wordt sterk aanbevolen om de hoeveelheid vrijgekomen sucrose te optimaliseren.
      3. Herhaal dit verdunningsproces elke dag gedurende ten minste 3 dagen voorafgaand aan het opzetten van de co-cultuur om ervoor te zorgen dat de cyanobacteriën exponentieel groeien. Dit zal helpen om de consistentie in co-cultuurprestaties tussen experimenten op verschillende dagen te verbeteren.
    4. Bereid ten minste 2 dagen voor de start van de co-cultuur een heterotrofe voorcultuur voor. Zoals opgemerkt, zijn een aantal gistsoorten en substammen eerder gekweekt in co-cultuur met cyanobacteriën 8,12,13.
      1. Breng cellen in een verdunning van 1:100 (250 μl) over van een vloeibare cultuur van de heterotrofe soorten die in een rijke teeltbouillon groeien (zie tabel 1) naar 50 mlCoY BG-11-medium aangevuld met 20 g/l sacharose in een kolf van 250 ml.
      2. Incubeer een nacht bij dezelfde temperatuur als de teeltomstandigheden die voor de cyanobacteriële partner worden gebruikt.
    5. Controleer OD600 ten minste 24 uur vóór het beoogde tijdstip van inoculatie van de cocultuur om er zeker van te zijn dat de heterotrofe stam voldoende is gegroeid voor experimentele behoeften (zie 1.2): verdun indien nodig in vers medium om exponentiële groei te behouden.
  2. Co-cultuur inoculatie en onderhoud
    OPMERKING: Zie het gedeelte Discussie voor overwegingen over de inoculatieverhouding tussen de foto- en heterotrofe micro-organismen.
    1. Voor inoculatie van de co-cultuur worden beide voorculturen verrijkt door centrifugatie.
      1. Bereken het volume van de geconcentreerde celsuspensie om de gewenste startdichtheid voor beide soorten te bereiken met behulp van de standaard C1 x V1 = C2 x V2 vergelijking, waarbij C1 = OD van verrijkte cultuur. Bijvoorbeeld, om een 25 ml cultuur te maken van S. elongatus met een startOD750 van 0,5 (uit een 1,5 OD axenische cultuur) en S. cerevisiae met een beginnende OD600 van 0,05 (uit een 0,7 OD axenische cultuur), op basis van de bovenstaande vergelijking, is 8,33 ml S. elongatus startcultuur, 1,79 ml verrijkte heterotrofe cultuur nodig, en 14,88 ml CoYBG-11 medium.
      2. Centrifugeer de culturen met 13.000 x g gedurende 10 minuten bij RT. Onder steriele omstandigheden decanteren en weggooien van de supernatant.
        OPMERKING: Er kan minder relatieve middelpuntvliedende kracht (RCF; xg) worden gebruikt om S. cerevisiae te pelleteren, aangezien het grotere cellen zijn (2x-3x keer) in vergelijking met S. elongatus, maar zorg ervoor dat het bovenstaande transparant wordt. Voor het verzamelen van de cyanobacteriële biomassa kan ook minder dan 13.000 x g worden gebruikt, maar het zou een langere tijd vergen voor centrifugeren (bijv. 4.000 x g kan 20 minuten worden gebruikt).
      3. Resuspendeer de cyanobacteriënpellet in 25 ml steriel CoYBG-11 medium. Gebruik dezelfde centrifugatieomstandigheden als eerder, gooi daarna supernatant weg en decanteer.
      4. Herhaal dit proces twee keer voor S. elongatus en nog 4 keer voor S. cerevisiae.
        OPMERKING: Het is belangrijk om de korrels van cyanobacteriën en de heterotroof (S. cerevisiae) te wassen om resterende mediumcomponenten te verwijderen. Omdat S. cerevisiae eerder in aanwezigheid van sucrose groeide, zal het verhoogde aantal wasstappen ervoor zorgen dat eventuele restsuiker wordt verwijderd.
      5. Zodra de OD is geverifieerd, combineert u de volumes S. elongatus en S. cerevisiae in een kolf van 250 ml onder steriele omstandigheden en voegt u CoYBG-11 toe aan een eindvolume van 50 ml. Verdun van de eerder bereide voorraad IPTG van 1 M tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM (dit is om de cyanobacteriën ertoe aan te zetten sucrose naar de media te exporteren). Gebruik voor een cultuur van 50 ml 50 μL uit de 1 M IPTG bouillon.
        OPMERKING: Verbijsterde kolven zijn meestal beter omdat ze zorgen voor een betere beluchting en menging van cyanobacteriën.
      6. Plaats de kolf van de vorige stap op 200 μmol fotonen·m-2·s-1 LED-verlichting aangevuld met 2% CO2 bij 30 °C met orbitaal schudden bij 150 tpm (25 mm uitslag) en 75% vochtigheid.
        OPMERKING: De bovengenoemde omstandigheden kunnen variëren en moeten worden geoptimaliseerd op basis van de experimentele uitkomst.
      7. Controleer de groei van de cultuur door steriel te bemonsteren (1 ml) om de 12 uur of 24 uur (zie rubriek 2). Gebruik de monsters optioneel om standaard levende celmicroscopie uit te voeren en om kolonievormende eenheden (CFU14) van gistcellen op een geschikt medium te bepalen om de celmorfologie en fitness te volgen en om de hoeveelheid levende heterotrofe cellen en besmetting te controleren.
        OPMERKING: CFU's worden niet aanbevolen als methode om de precieze celdichtheid van de cyanobacteriële soorten te controleren, die aanzienlijke stress kunnen ervaren bij de overgang van teelt in het vloeibare naar vaste medium. Daarom moet worden gekozen voor agarplaten met een geschikte rijke bodem voor de groei van de gistpartner(s), zoals gistextract pepton dextrose (YEPD)15.
Chemische verbindingBG-11 (concentratie mg/L)CoY BG-11 (concentratie mg/L)
NaNO315001500
K2HPO44040
MgSO4·7H2O7575
CaCl2 · 2H2O3636
Citroenzuur66
IJzerammoniumcitraat66
EDTA (dinatriumzout)11
Na2CO32020
Samenstelling van sporenmetalen
H3BO32.862.86
ZnSO4·7H2O0.2220.222
Co(NO3)2 · 6H2O0.04940.0494
MnCl2·4H2O1.811.81
CuSO4 · 5H2O0.0790.079
NaMoO4·2H2O0.390.39
Aanvullend
HEPPSO71607160
Giststikstofbasis (YNB), zonder aminozuren, zonder ammoniumsulfaat–3608, 120013
pH 8,3 titratiemiddelKOHKOH
KPO3–118
Sucrose (alleen voor heterotrofen)–13690

Tabel 1: Mediasamenstelling van BG-11 enCoY BG-11. Gegeven concentraties van gist-stikstofbase zijn de concentraties in CoYBG-11 afgeleid van gepubliceerde bronnen 8,12,13.

2. Instrumenten en methodologie om de groei van co-culturen te monitoren

OPMERKING: Dit protocol is een richtlijn voor co-cultuuranalyse en -monitoring, van eenvoudige maar werkintensieve technieken zoals microscopie en telkamers tot toepassingen met hoge doorvoer zoals deeltjestellers en single-cell flowcytometrie. Afgezien van de eigenlijke co-cultuur, is het raadzaam om axenische culturen van de afzonderlijke micro-organismen op te nemen om een uitgebreide analyse mogelijk te maken. Als algemeen uitgangspunt voor analytics bepaal je de OD van de culturen. In dit deel worden verschillende methodologieën beschreven die kunnen worden gebruikt om relatieve metingen van celdichtheid (d.w.z. OD) om te zetten in absolute waarden van het aantal cellen per volume. OD750-meting wordt vaak gebruikt om de celdichtheid van cyanobacterieculturen te bepalen (als gevolg van absorptie van golflengten van 400-700 nm), terwijl OD600 wordt gebruikt voor heterotrofe organismen. Beide metingen geven bij benadering richtwaarden met willekeurige eenheden. Merk op dat waarden sterk kunnen verschillen tussen instrumenten.

  1. Microscopische kwantificering met telkamers
    OPMERKING: Telkamers (d.w.z. Neubauer (verbeterd)/hemocytometers) zijn een eenvoudig en goedkoop middel om de samenstelling te bepalen van co-culturen die zijn samengesteld uit cellen die morfologisch gemakkelijk kunnen worden onderscheiden, i.e., door hun celvorm (Figuur 1A). Het bestaat uit een dik glazen microscoopglaasje en een afdekglas. Als het afdekglas correct op de dia is geplaatst, ontstaan er twee precisievolumekamers met gegraveerde roosters (Figuur 1B-D). Door een bepaald gebied van een raster te tellen, kan de celconcentratie van een suspensie worden berekend. Telkamers zijn verkrijgbaar in verschillende dieptes. Afhankelijk van de celdikte moet een geschikte kamerdiepte worden gekozen. Voor schimmelcellen zoals U. maydis of S. cerevisiae, Een diepte van 0,1 mm werkt goed. Deze kamerdiepte is te groot voor kleinere cellen zoals cyanobacteriën, en de cellen zweven in de kamer. Een kamer met een diepte van 0,02 mm is geschikt voor zowel cyanobacteriën als co-culturen van cyanobacteriën en schimmels.
    1. Zorg ervoor dat de telkamer en het afdekglas vrij zijn van stof en cellen.
      OPMERKING: Reiniging met 70% (v/v) ethanol en pluisvrije tissues wordt aanbevolen direct voor gebruik.
    2. Om het afdekglas correct te plaatsen, schuift u het met een beetje druk op de twee steunbalken, maar wees voorzichtig om breuk te voorkomen.
      OPMERKING: Voor deze toepassing is een specifiek, dik dekglas vereist (zie de handleiding van de kamer). Aangezien het afdekglas soms breekt tijdens de montage, is het goed om vervangingen bij de hand te hebben.
    3. Wanneer het dekglas goed is geplaatst, let dan op de zogenaamde Newton-ringen (Figuur 1B) tussen de twee glasoppervlakken en of het dekglas niet meer wegglijdt.
      OPMERKING: Een zachte ademhaling op het dekglas voorafgaand aan de montage verbetert vaak het resultaat.
    4. Meng de celsuspensie grondig en breng een paar microliter (~2-10 μL afhankelijk van de kamerdiepte) van de celsuspensie aan op de rand van de kamer en laat deze volledig vullen via capillaire kracht. Gebruik een geschikte verdunning van de celsuspensie om een betrouwbare telling mogelijk te maken, bijvoorbeeld wat resulteert in 20 tot 200 cellen per groot vierkant (figuur 1D, rode rechthoek).
    5. Gebruik een geschikt (bijv. 10x) objectief van een lichtmicroscoop (helderveld- of fasecontrastmodus) en stel scherp op de rasterlijnen van de telkamer. De oriëntatie wordt verzorgd door het raster. Begin met het tellen van de cellen in de vierkanten die geschikt zijn voor de gegeven celgrootte.
      OPMERKING: Gebruik een technisch hulpmiddel zoals een draagbare teller of een geschikte smartphone-applicatie om te tellen (bijv. algemene "dingteller" of gespecialiseerde hemocytometer-apps die uiterst nuttige functies bieden). Definieer een regel voor het tellen van cellen op de rasterranden om dubbeltellingen te voorkomen. Cellen aan de boven- en linkerrand van elk vierkant kunnen bijvoorbeeld worden meegeteld, terwijl de cellen aan de rechter- en onderrand niet worden meegeteld. Er bestaan alternatieve regels16. Als een fluorescentiemicroscoop wordt gebruikt, kunnen de cellen ook worden onderscheiden op basis van hun autofluorescentie- of fluorescerende markers.
    6. Na het tellen van bijvoorbeeld alle vier de grote vierkanten in de hoeken, bepaal je de gemiddelde waarde voor elk celtype. Bereken aan de hand van deze gemiddelde waarden, de oppervlakte van het gebruikte vierkant en de diepte van de gegeven kamer (raadpleeg de informatie van de fabrikant) de celconcentraties (zie Representatieve resultaten).
      OPMERKING: Afhankelijk van de celgrootte kunnen verschillende vierkanten worden gebruikt om te tellen. Voor gist- en cyanobacteriële cellen werken de vier grote vierkanten in de hoeken goed (Figuur 1D, rode rechthoek).
    7. Reinig de kamer na gebruik rekening houdend met de vereisten van de monsters (bijv. genetisch gemodificeerde organismen op de juiste manier inactiveren).
  2. Kwantificering met behulp van deeltjestellers
    OPMERKING: Afhankelijk van de kenmerken van de cellen in een co-cultuur kan een deeltjesteller worden toegepast om de celaantallen van de partners te bepalen. Voor de toepasbaarheid van deze methode moeten de cellen sterk verschillen in grootte; Er kan bijvoorbeeld onderscheid worden gemaakt tussen bacterie- en gistcellen. Axenische culturen van de afzonderlijke micro-organismen van het consortium moeten worden opgenomen om de interpretatie van de resultaten mogelijk te maken. Coculturen die cellen met vergelijkbare grootte of meer dan 2 partners herbergen, moeten worden geanalyseerd met de methodologie beschreven in secties 2.1 of 2.3.
    1. Voorbereidingen
      1. Stel de OD van de cultuur in op 0,1 en verdun het monster 1.000 keer met een isotone meetbuffer (raadpleeg de handleiding van het apparaat) tot een totaal volume van 10 ml. Bereid technische drievouden voor van alle monsters.
      2. Selecteer een geschikte poriegrootte van het capillair voor het experiment.
        OPMERKING: De poriegrootte moet binnen het bereik van de kleinste cellen in de co-cultuur liggen, maar het moet ook de grotere cellen omvatten. Ga niet te klein, want de porie kan verstopt raken door celaggregatie, die kan optreden als gevolg van celdeling. Beschikbare poriegroottes verschillen. Een capillair van 45 μm begint bijvoorbeeld met het detecteren van cellen met een diameter van 0,7 μm. (U. maydis en S. cerevisiae 3,5 μm-5,5 μm, S. elongatus/Synechocystis sp. ~1-2,5 μm).
    2. Kwantificering van cellen in een deeltjesteller
      1. Start het apparaat op. Voer ten slotte een zelftest uit voor kwaliteitscontrole (raadpleeg de handleiding van het specifieke apparaat).
      2. Doe de monsters in de monsterbekers, sluit het deksel goed af en meng het monster door de beker iets te kantelen.
        OPMERKING: Probeer schuimvorming en luchtbellen te vermijden. Gebruik altijd een kopje voor elke meting. De bekers kunnen meerdere keren worden gereinigd en hergebruikt. Gooi bekers weg als er resten zijn die niet kunnen worden verwijderd. Als het monster langere tijd in de beker blijft, meng het dan opnieuw voordat u het meet.
      3. Registreer in een bereik van 0-30 μm omdat de celaggregaten mogelijk groter zijn dan de afzonderlijke cellen.
        OPMERKING: Gebruik eerst elk van de axenische culturen van de co-cultuurpartners om een idee te krijgen van de grootte van de cellen en om te bepalen of ze kunnen worden onderscheiden door hun grootte.
      4. Bepaal na evaluatie de samenstelling van de co-cultuur op dezelfde manier.
  3. Kwantificering van het consortium met behulp van eencellige flowcytometrie
    OPMERKING: Single-cell flowcytometrie is een high-throughput-methode die kan worden gebruikt om het aantal cellen van individuele partners in de co-cultuur te bepalen, aangezien de partners kunnen worden onderscheiden op basis van grootte/hun lichtverstrooiingseigenschappen en/of fluorescentie. Belangrijk is dat voor het vaststellen van de methode axenische culturen van de co-cultuurpartners nodig zijn om hun eigenschappen in de cytometer te analyseren en de populatiepoorten dienovereenkomstig aan te passen. Voor stammen die een fluorescerende reporter dragen, zijn stammen zonder de fluorescerende reporter nodig als negatieve controles. Een basiskennis van cytometertoepassingen zal de succesvolle implementatie van het onderstaande protocol vergemakkelijken17,18,19,20,21. In dit voorbeeld wordt een kunstmatig mengsel van 3 micro-organismen geanalyseerd (zie Representatieve resultaten): Synechocystis (die een cytosolische reporter fluorofoor, mVenus, tot expressie brengt) en de twee gisten S. cerevisiae en U. maydis. Voor een nauwkeurig onderscheid tussen S. cerevisiae en U. maydiszijn fluorescentiemarkers geïntroduceerd in de vorm van cytoplasmatisch groen fluorescerend eiwit (GFP) (U. maydis eGFP) en rood fluorescerend eiwit (RFP) mKate2 (S. cerevisiae mKate2) met behulp van elementaire moleculaire kloontechnieken. Indien mogelijk verdient de voorkeur aan stammen met genomische integratie van reporters om de vereiste van continue selectiedruk te vermijden.
    1. Voorbereiding van het monster
      1. Meet de OD van de culturen in een bepaald te analyseren groeistadium.
      2. Pas de OD van de monsters aan op een bereik dat geschikt is voor de meting. Gebruik een geschatte OD750 van 0,05-0,5 voor de cyanobacteriën en een OD600 van 0,2-1,5 voor de gist met behulp van vers kweekmedium (eindvolume: ten minste 500 μl). Streef voor co-culturen naar een OD750 tussen ~0,1 en 0,5 en noteer de verdunningsfactor. Pas voor de berekening de formule toe die in stap 1.1.3.1 wordt gegeven. Dit zorgt ervoor dat het celgetal binnen een bereik van 1.000 - 10.000 cellen/s blijft bij een stroomsnelheid van 10 μL/min (gelijk aan 6.000 - 60.000 cellen/μL).
        OPMERKING: Voor verdunning kunnen media of buffer zonder autofluorescentie en deeltjes worden gebruikt (bijv. BG-11). Wees voorzichtig met media die complexe ingrediënten bevatten, zoals gistextract, die als deeltjes in de meting kunnen verschijnen.
      3. Breng 300 μl van elke monstercelsuspensie over naar een afzonderlijk putje in een plaat met 96 putjes (standaard ronde put, doorzichtige, platte bodem).
        OPMERKING: U kunt ook 0.5-2 ml overbrengen naar een fluorescentie-geactiveerde celsorteerbuis (FACS) als de semi-automatische bemonsteringsmodus wordt gebruikt in plaats van de plaatlezermodus.
    2. Cytometrie meting
      1. Start de cytometer en voer het opstartprogramma en de kwaliteitscontrole (QC) uit volgens de instructies van de fabrikant.
      2. Laad (plaatlader of semi-automatische bemonstering) en voer de monsters uit. Begin met de controlemonsters met behulp van de axenische culturen van elke co-cultuurpartner om elke soort te identificeren op basis van hun eigenschappen voordat u ernaar streeft ze te scheiden in een co-cultuurmonster.
      3. Open puntdiagrammen en/of histogrammen voor de fluorescentie- en verstrooiingskanalen (bv. voorwaartse verstrooiing [FSC] of zijverstrooiing [SSC] hoogte [-H] of gebied [-A]) die relevant zijn voor de monsters.
      4. Zoek naar de benodigde celpopulatie(s) en pas de drempel aan om de technische ruis en kleine deeltjes van het medium uit te sluiten.
        OPMERKING: Het wordt aanbevolen om te zoeken naar de celpopulatie in een FSC-H over FSC-breedte of FSC-H over SSC-H dot plot en de schaal aan te passen van lineair naar logaritmisch voor kleine cellen zoals bacteriën (meestal 1-3 μm). Stel de drempel in het FSC-H- of SSC-H-kanaal in. Voor cellen met een diameter van minder dan 1 μm gebruikt u de violette SSC (VSSC) in de violette laser bij 405 nm voor een betere resolutie.
      5. Pas de versterking voor elk interessant kanaal handmatig aan op een bereik van 25-2.500. Pas de versterking zo aan dat de negatieve controle (bijv. zonder de fluorescerende markering) in een bereik van 1 x 102-1 x 103 ligt en de positieve controle (bijv. met de fluorescerende markering) in een bereik van 1 x 105-1 x 106 om de beste scheiding te krijgen en binnen het bereik van 1 x 101-1 x 107 te blijven.
        OPMERKING: De standaardversterkingen van QC kunnen ook als een goede referentie worden bewaard.
      6. Om de celconcentratie in het monster te bepalen, registreert u een gedefinieerd monstervolume met behulp van de registratiefunctie (bijv. 10 μL bij een debiet van 10 μL/min). Deel later het aantal individuele cellen dat voor dit volume is gemeten door het geregistreerde volume om een celtelling per μL voor elke populatie te krijgen.
        OPMERKING: Houd rekening met de initiële verdunningsfactor bij het berekenen van de celconcentratie in de cultuur/het monster.
    3. Gating/selectie van celpopulaties
      OPMERKING: Onafhankelijk van het apparaat dat wordt gebruikt om de metingen uit te voeren, kunnen de analyse en gating worden uitgevoerd in de besturingssoftware van de cytometer of in commerciële analysesoftware, zoals hieronder geïllustreerd22. Bovendien kan het analyseren van flowcytometriegegevens met behulp van niet-merkgebonden software efficiënt worden gedaan met verschillende open-source tools zoals FlowCytometryTools23 of FlowKit, met behulp van FlowUtils24 pakketten in Python. In de geest van open science deelt dit protocol een voorbeeldige JupyterNotebook die het gebruik van deze pakketten voor het verkennen van basisgegevens laat zien. Natuurlijk kan alternatieve software net zo geschikt zijn om bio-informatica van flowcytometrie uit te voeren25.
      1. Selecteer bepaalde celpopulaties door er poortjes omheen te tekenen in een puntdiagram of door scheidings- of lijnsegmenten rond pieken in een histogram in te stellen (Figuur 4).
        OPMERKING: De auto-gate-functie van het programma kan als referentie worden gebruikt.
      2. Scheid de signalen voor foto- en heterotrofe organismen op basis van de autofluorescentie van het fototrofe organisme (voornamelijk veroorzaakt door chlorofyl) in het rode gebied van het spectrum. Voorbeeld: Gebruik het histogram van het APC-H-kanaal (excitatie (bijv.) bij 638 nm, emissie (em.) bij 660/10 nm) en stel een verticale scheidingslijn in tussen de rechter piek (fototroof = chlorofyl autofluorescentie-positieve populatie) en linker piek/s (heterotroof = chlorofyl autofluorescentie-negatieve populatie) (Figuur 4A).
        OPMERKING: Fluorescerende markers kunnen ook worden gebruikt om twee (of meer) fototrofe partners binnen dezelfde cultuur te onderscheiden (bijv. mVenus voor Synechocystis).
      3. Scheid de twee heterotrofe organismen op basis van hun fluorescerende markers of verstrooiingseigenschappen (FSC, SSC, indien mogelijk).
        OPMERKING: Scheiding op basis van verstrooiingseigenschappen is alleen van toepassing als de cellen bijvoorbeeld een verschillende celgrootte of morfologie hebben die resulteert in zichtbare veranderingen in de verstrooiing (bijv. Synechocystis: bolvormige cellen met een diameter van ~1,5-3 μm versus U. maydis langwerpige cellen met een lengte van 10 μm en een diameter van ongeveer 1-2 μm26).
      4. Voorbeeld: Gebruik het histogram van het FITC-H-kanaal (bijv.: 488 nm, em.: 525/40 nm) dat alleen de "heterotrofe" populatie weergeeft om onderscheid te maken tussen de heterotrofe cellen die GFP bevatten (bijv. U. maydis eGFP) en degenen zonder GFP (bijv . S. cerevisiae RFP/mKate2) (Figuur 4B). U kunt ook het histogram van het PC5.5-H-kanaal gebruiken (bijv.: 561 nm, em.: 710/50 nm) dat alleen de "heterotrofe" populatie weergeeft om onderscheid te maken tussen de heterotrofe cellen die RFP bevatten (bijv . S. cerevisiae RFP/mKate2) en degenen zonder RFP (bijv. U. maydis GFP) (Figuur 4C).
        OPMERKING: Houd er rekening mee dat twee (of meer) verschillende celtypen tijdens de meting aan elkaar kunnen "plakken". Deze "doubletten" of "multiplets" kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd in puntplots van beide fluorescerende markers (bijv. APC-H over FITC-H om doubletten van fototrofe en GFP-gelabelde heterotrofe partner te identificeren).
      5. Voor basisgegevensanalyse in Python volgt u de instructies in deze Jupyter (https://git.rwth-aachen.de/computational-life-science/cytoflow).
        OPMERKING: Deze notebook ondersteunt drie stappen voor gegevensanalyse. i) Gegevens importeren: Importeren van FCS-bestanden. ii) Voer kwaliteitscontrole uit: controleer de integriteit van de gegevens en het aantal gebeurtenissen. iii) Visualiseer gegevens: Gebruik grafieken zoals histogrammen, spreidingsdiagrammen en dichtheidsdiagrammen om gegevens te visualiseren. Bovendien wordt de procedure weergegeven voor het uitvoeren van gating om populaties van belang te isoleren die Figuur 4 reproduceren.
        Om de analyse van co-culturen in langetermijnprojecten te vergemakkelijken, wordt de onderzoeker aanbevolen om de bovenstaande methoden te gebruiken om celaantallen te tellen en standaardcurven te maken om OD-waarden te vergelijken met absolute celtellingen. Optische dichtheid is een relatieve meting die kan variëren op basis van soort, stam, groeiomstandigheden en spectrometer. Daarom is het genereren van "in-house" standaardcurven noodzakelijk voor de nauwkeurige conversie van OD-waarden naar celnummers.

figure-protocol-1
Figuur 1: Microscopische kwantificering van morfologisch te onderscheiden cellen. (A) Een Neubauer-telkamer. (B) De ringen van Newton geven de juiste positionering van het speciale dekglaasje aan. (C) Schematische weergave van de kamerarchitectuur met de centrale holte van gedefinieerd volume voor het tellen van cellen. (D) Het raster van de afgebeelde Neubauer telkamer bestaat uit negen grote vierkanten met een grootte van 1 mm2 (rood). De vier grote vierkanten in de hoeken zijn verder onderverdeeld in 16 vierkanten (blauw). Het centrale grote vierkant is verdeeld in 25 groepsvierkanten met een afmeting van 0,04 mm2 (oranje). Elk groepsvierkant bestaat uit 16 kleinste vierkantjes (groen). Het cijfer is gegenereerd op basis van openbaar beschikbare informatie van fabrikanten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vaststelling van co-culturen van fototrofe S. elongatus en heterotrofe gisten
We hebben eerder gedetailleerde resultaten gerapporteerd van de co-teelt van Synechococcus elongatus PCC 7942 met een verscheidenheid aan substammen van S. cerevisiae. Voor een uitgebreide beschrijving van de co-cultuurresultaten met dit cyanobacteriën/gistpaar, zie8. Omwille van de beknoptheid en nauwkeurigheid worden deze resultaten hier niet weergegeven. Kortom, eerdere resultaten geven een aantal overwegingen aan die belangrijk zijn voor het tot stand brengen van langdurige cyanobacteriën-gistcoculturen. Van primair belang is het vermogen van gist om te overleven onder omstandigheden waarin cyanobacteriën de enige vormen van vaste koolstof leveren, sterk afhankelijk van de efficiëntie waarmee de giststam sucrose kan gebruiken. S. cerevisiae-stammen die waren geëvolueerd of gemanipuleerd om sucrose efficiënter te metaboliseren27,28 hadden meer kans om de overgang naar de co-cultuurgroeimodus te overleven, bereikten hogere celdichtheden en vertoonden een hogere robuustheid in langdurige (dagen tot weken) cyanobacteriële co-cultuurexperimenten8. De beginfase van het inoculeren van een co-cultuur was vooral belangrijk voor de levensvatbaarheid van gisten, waarschijnlijk als gevolg van spanningen van kweekverdunning, het veranderen van de samenstelling van de media en/of het terugtrekken van een meer geconcentreerde koolstofbron. Daarom kunnen inspanningen om de overgang van een rijker groeimedium naar minimale beschikbaarheid van koolstof bij de start van de co-cultuur te vergemakkelijken, de experimentele prestaties en consistentie verbeteren (zie stap 1.2.1.1). Bovendien vertoonde S. cerevisiae stressreacties die consistent waren met hyperoxie wanneer ze werden geïnoculeerd in dichte culturen van S. elongatus, consistent met de vorming van O2 als een primair bijproduct van zuurstofrijke fotosynthese. Daarom zouden inspanningen om de overgroei van de cyanobacteriële partner en/of afwisselende "dag/nacht" lichtcycli te voorkomen, de levensvatbaarheid van S. cerevisiae in langdurige co-culturen aanzienlijk kunnen verlengen. Zie de sectie Discussie voor een aanvullende samenvatting van verschijnselen die vaak voorkomen in co-culturen met betrekking tot axenische controlemonsters.

Monitoring van de groei van co-culturen met behulp van verschillende methodologieën
In de volgende paragraaf wordt de voorbeeldige kwantificering beschreven van een kunstmatig gemengd driedelig consortium van Synechocystis en de twee gisten S. cerevisiae en U. maydis met behulp van drie verschillende methoden. Voor het mengsel werd OD750 (voor cyanobacteriën) en OD600 (voor de heterotrofen) van enkelvoudige culturen bepaald en aangepast naar OD 0,1. Enkelvoudige culturen werden gemengd in een verhouding van 1:1:1 met behulp van optische dichtheid (die verschilt van het aantal cellen, zie hierboven). Om de discriminatie van de gisten in de cytometer te vergemakkelijken, moeten reporterstammen van genetisch gemodificeerde S. cerevisiae FY1679-O1B29 die constitutief cytoplasmatisch mKate2 produceren (genotype: URA3Δ/pTDH3::mKate2; stam: S. cerevisiae mKate230) en U. maydis stam AB3331 die constitutief eGFP produceren (genotype: pep4Δ/pRpl40::egfp; stam: U. maydis eGFP32) werden gebruikt. Merk op dat de cyanobacteriële stam was uitgerust met een replicatief plasmide dat de constitutieve, sterke expressie van de gele fluorescerende eiwitversie mVenus (Synechocystis sp. PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenus, stam Synechocystis mVenus, vergelijkbaar met33) en vertoont bovendien de typische sterke autofluorescentie als gevolg van de aanwezigheid van de fotosynthetische machinerie.

Microscopische kwantificering met behulp van telkamers: Alle celtypen in het gebruikte kunstmatige mengsel van drie micro-organismen kunnen gemakkelijk microscopisch worden onderscheiden (Figuur 2A): Synechocystis en S. cerevisiae worden vertegenwoordigd door bolvormige cellen die echter sterk verschillen in hun diameter (Synechocystis: ca. diameter van 1,5-3 μm, S. cerevisiae: ca. diameter van 3-6 μm), terwijl U. maydis-cellen een langwerpige, sigaarvormige morfologie hebben en een lengte van ten minste 10 μm (Figuur 2A). Deze duidelijke morfologische kenmerken maken het mogelijk om elke partner in het mengsel exact te kwantificeren. Als illustratief voorbeeld worden respectievelijk 37, 18, 36 en 21 S. cerevisiae-cellen geteld in de vier grote vierkanten (Figuur 2B). De gemiddelde waarde is 28 cellen. Aangezien een groot vierkant van de gebruikte hemocytometer een oppervlakte heeft van 1 mm2 en de kamerdiepte 0,02 mm was, resulteert dit in 28 cellen per 0,02 μL. Dit komt overeen met 1.400 cellen/μL, wat overeenkomt met 1,4 x 106 cellen/ml. De andere celtypen werden geteld en de concentraties werden dienovereenkomstig bepaald (Figuur 2C, Tabel 2).

figure-results-1
Figuur 2: Microscopische kwantificering van een tripartiet consortium bestaande uit Synechocystis en de gisten S. cerevisiae en U. maydis. (A) Microscopisch differentieel contrast (DIC) beeld van een kunstmatig gecombineerd mengsel van de aangegeven micro-organismen. Alle soorten zijn gemakkelijk te onderscheiden door hun morfologie. Schaal balk: 10 μm. (B) Voorbeeldige telresultaten voor een kunstmatig samengestelde mix van de aangegeven stammen op basis van axenische culturen met een OD van 0,1. De vier grote vierkanten aan de randen van het raster werden geanalyseerd (rode markering in figuur 1D). (C) De gemiddelde waarde van de verschillende cellen geteld in de vier vierkanten werd gebruikt om de concentratie van cellen in de suspensie te berekenen met behulp van de volgende vergelijking: Gemiddelde waarde/(kamerdiepte [0,02 mm] x grootte van het getelde vierkant [1 mm2] x 1.000). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Kwantificering met behulp van deeltjestellers: Deeltjestellers bepalen het aantal deeltjes in een suspensie, afhankelijk van hun grootte. In de voorbeelddataset werd een deeltjesteller met een capillair van 45 μm gebruikt. Omdat S. cerevisiae- en U. maydis-cellen vergelijkbare afmetingen vertonen, kunnen ze niet worden onderscheiden in de deeltjesteller, terwijl de kleinere Synechocystis-cellen duidelijk kunnen worden gescheiden. De analyse van afzonderlijke culturen laat dus pieken op identieke posities zien, verwijzend naar 3 tot 6 μm voor de twee gisten (Figuur 3A). Tijdens de meting wordt er een onderdruk uitgeoefend, waardoor de cellen het haarvaten ingaan. Hierdoor verandert kortstondig de elektrische weerstand, zodat het apparaat op basis van de wijziging de deeltjesgrootte kan bepalen. In de gemengde cultuur kunnen twee verschillende pieken worden gedetecteerd, de ene geassocieerd met de kleinere cyanobacteriële cellen en de andere vertegenwoordigt een gezamenlijke fractie van de twee gistsoorten (Figuur 3B). Belangrijk is dat naast de pieken die de levende cellen weerspiegelen, er extra pieken werden gedetecteerd op ongeveer 1 μm (Figuur 3), wat overeenkomt met celresten en kleinere deeltjes. Signalen die bij grotere diameters verschijnen dan verwacht, kunnen worden veroorzaakt door celaggregaties. Merk op dat de vorm van pieken de homogeniteit van cellen weerspiegelt: een scherpe piek vertoont zeer homogene cellen, wat onwaarschijnlijk is voor een co-cultuur. In een co-cultuur wordt verwacht dat er een zeer brede piek of zelfs twee pieken zijn als de partners van de co-cultuur duidelijk verschillend zijn in grootte. Voor de axenische culturen van heterotrofe schimmels kan de piek een middelbrede piek zijn.

figure-results-2
Figuur 3: Kwantificering van een tripartiet consortium bestaande uit Synechocystis mVenus en de gisten S. cerevisiae mKate2 en U. maydis eGFP met behulp van een deeltjesteller. (A) Visuele output van analyses van axenische culturen van de drie stammen zoals aangegeven in de grafieken (celteller met 45 μm capillair). (B) Voorbeeldig visueel outputbestand voor de analyse van het kunstmatige tripartiete consortium onder identieke omstandigheden. De deeltjesteller ondersteunt niet het onderscheid tussen de twee gistsoorten, die beide worden vertegenwoordigd door de tweede piek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Kwantificering met behulp van eencellige cytometrie: Met behulp van de single-cell flowcytometer kunnen de verschillende celpopulaties eenvoudig worden onderscheiden op basis van hun (auto-)fluorescentie en lichtverstrooiingseigenschappen. Fototrofe cellen (Synechocystis) kunnen worden onderscheiden van heterotrofe cellen (U. maydis en S. cerevisiae) op basis van de rode autofluorescentie van de fotosynthetische pigmenten die wordt gemeten in het APC-H-kanaal (Figuur 4A). Op basis van die initiële scheiding van fototrofe en heterotrofe cellen kunnen de twee heterotrofe populaties worden onderscheiden op basis van hun fluorescerende markers eGFP in het FITC-H-kanaal en mKate2 in het PC5.5-kanaal (Figuur 4B,C). In een dotplot die de verstrooiingseigenschappen van alle drie de populaties (FSC-H en FSC-Width) weergeeft, kunnen de populaties ook worden onderscheiden met slechts enkele kleine overlappingen van de populaties (Figuur 4D).

Met deze methode werd 10 μL van de verdunde monsters geanalyseerd met een debiet van 10 μL/min, waardoor een kwantificering van ongeveer 70.000 cellen in 1 minuut mogelijk was. Ongeveer 60% van die cellen kon worden toegewezen aan Synechocystis (4,23 x 106 cellen/ml), terwijl de resterende 40% gelijk verdeeld was tussen U. maydis (1,35 x 106 cellen/ml) en S. cerevisiae (1,36 x 106 cellen/ml, Figuur 4E, Tabel 2).

figure-results-3
Figuur 4: Kwantificering van een tripartiet consortium bestaande uit de cyanobacterie Synechocystis mVenus en de gisten U. maydis eGFP en S. cerevisiae mKate2 met behulp van eencellige flowcytometrie. Voorbeeldgrafieken verkregen na meting van een gemengde cultuur van Synechocystis mVenus (donkergroen), U. maydis eGFP (lichtgroen) en S. cerevisiae mKate2 (rood) in een verhouding van 1/3 OD750 / 1/3 OD600 / 1/3 OD600 op een cytometer (A) die een histogram toont van het aantal gebeurtenissen en fluorescentie in het APC-H-kanaal (bijv.: 638 nm, em.: 660/10 nm) van alle cellen die worden gebruikt om fototrofe en heterotrofe cellen te differentiëren op basis van hun autofluorescentie. (B) Een histogram van het aantal gebeurtenissen en de fluorescentie in het FITC-H-kanaal (bijv.: 488 nm, em.: 525/40 nm) van alle heterotrofe cellen die worden gebruikt om U. maydis eGFP- en S. cerevisiae mKate2-cellen te differentiëren op basis van hun groene fluorescentie-eigenschappen. (C) Een histogram van het aantal gebeurtenissen en de fluorescentie in het PC5.5-H-kanaal (bijv.: 561 nm, em.: 710/50 nm) van alle heterotrofe cellen die worden gebruikt om U. maydis eGFP- en S. cerevisiae mKate2-cellen te differentiëren op basis van hun rode fluorescentie-eigenschappen. (D) Een puntdiagram van de verstrooiingssignalen in de FSC-breedte over het FSC-H-kanaal dat wordt gebruikt om de celpopulaties zonder fluorescentie-eigenschappen te identificeren. (E) De bevolkingsstatistieken, inclusief het aantal gebeurtenissen, percentages en rekenkundige gemiddelden en standaarddeviaties (SD) van de relevante fluorescentiekanalen. Het totale aantal cellen, samen met hun grootte en fluorescentie, werd bepaald in een volume van 10 μl met een debiet van 10 μl/min. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om de output van de verschillende kwantificeringsmethoden te visualiseren, worden de vastgestelde celaantallen weergegeven in de volgende twee tabellen (Tabel 2 en Tabel 3). De uiteindelijke concentraties van cellen die met behulp van de drie eerder beschreven methoden zijn bepaald, liggen voor alle methoden in een vergelijkbaar bereik. De cytometer biedt de hoogste steekproefomvang, gevolgd door de deeltjesteller en de microscopische kwantificering, met een afname van ongeveer één orde van grootte tussen de methoden.

Co-cultuur 1:1:1FotometerCytometerDeeltjestellerMicroscopie Telkamer
OrganismeUitverkocht750/600Aantal cellencellen/mlAantal cellencellen/mlAantal cellencellen/ml
Saccharomyces cerevisiae mKate20.033313,6181,36 x 1061,546*2,58 x 106*1121.40 x 106
Ustilago maydis eGFP0.033313,5411,35 x 106891,11 x 106
PCC 6803 mVenus0.033342,3304,23 x 1063,0945,16 x 1062713,39 x 106

Tabel 2: Vergelijking van de verschillende kwantificeringsmethoden: Kunstmatige mengcultuur. Merk op dat U. maydis en S. cerevisiae niet kunnen worden onderscheiden met behulp van een deeltjesteller (*).

Individuele cultuurFotometerCytometerDeeltjestellerMicroscopie Telkamer
OrganismeUitverkocht750/600Aantal cellencellen/mlAantal cellencellen/mlAantal cellencellen/ml
Saccharomyces cerevisiae mKate20.138,9363,89 x 1061,9283,21 x 1064034,03 x 106
Ustilago maydis eGFP0.136,9273,69 x 1062,4654,11 x 1063073,07 x 106
PCC 6803 mVenus0.1127,8641,28 x 1078,1861,36 x 1074281,07 x 107

Tabel 3: Vergelijking van de verschillende kwantificeringsmethoden: Kalibratie met enkelvoudige/axenische culturen.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hanteren van micro-organismen in enkelvoudige axenische culturen in een laboratoriumcontext is al tientallen jaren ingeburgerd voor veel microbiële modellen. Maar hoewel de overheersende vorm van leven in de natuur microbiële gemeenschappen zijn, is de combinatie van twee of meer partners in een enkel kweekvat minder ingeburgerd en worden uitdagingen gevormd door hiaten in de bestaande kennis en methodologie. Het is ook moeilijker om het gedrag van cellen in een gemeenschap te voorspellen, omdat er opkomende interacties en metabolietuitwisseling tussen de cellen ontstaan, wat het lot van de co-cultuur sterk beïnvloedt34,35. Het vaststellen van co-cultuur is dus niet triviaal, ook niet op het niveau van de definitie van groeimedia, de identificatie van gemeenschappelijke groeiomstandigheden, de uitwisseling van sporenmetabolieten/signalen tussen soorten en de resulterende co-cultuursamenstelling in de loop van de tijd. De vooruitgang van de afgelopen jaren in de assemblage van fototrofe, suikerafscheidende cyanobacteriën met heterotrofe partners maakt het nu mogelijk om eerste regels en methodologie af te leiden die een nuttige leidraad kunnen bieden voor het ontwerp van nieuwe co-cultivatieparen. Op basis van die kennis wordt in het eerste deel van dit protocol een stap-voor-stap richtlijn gegeven voor de samenstelling van co-culturen met een sucrose-secretie cyanobacterie en een of meer gisten.

Een kritische overweging bij de eerste poging om een co-cultuur tussen niet-verwante microben tot stand te brengen, is de samenstelling van een gemeenschappelijk groeimedium dat voldoet aan alle voedingsbehoeften voor de twee of meer soorten. Vanwege ruimtebeperkingen is het niet haalbaar om hier een volledig gedetailleerd protocol voor dit proces te bieden, dat in sommige gevallen ook een hoge mate van maatwerk kan vereisen, maar in plaats daarvan worden in het volgende belangrijke overwegingen uiteengezet waarmee rekening moet worden gehouden. Een eenvoudige eerste benadering is het vergelijken van het typische cyanobacteriële groeimedium (bijv. BG11; zie tabel 1) met alle gevestigde minimale media die zijn samengesteld voor de heterotrofe soorten van belang. Het aanvullen van het standaard cyanobacteriële medium met eventuele ontbrekende componenten die zich in het heterotrofe minimale medium bevinden, is een goed uitgangspunt voor de eerste tests 8,36. Houd er rekening mee dat, omdat minimale media vaak worden aangevuld met een significante organische koolstofbron voor heterotrofe groei (bijv. 1%-4% glucose), ze vaak zijn ontworpen om een hogere heterotrofe celdichtheid te ondersteunen dan waarschijnlijk zal worden bereikt in initiële co-cultuurexperimenten. Evenzo kunnen sommige veel voorkomende mediumcomponenten ook fungeren als een organische koolstofbron, onafhankelijk van het fotosyntheseaat dat door de cyanobacteriële partner wordt geleverd (bijv. citraat), wat latere analyse van cyanobacteriën/heterotrofe co-culturen kan bemoeilijken. Daarom is het misschien niet nodig om het minimale cyanobacteriële medium aan te vullen met de volledige concentratie van ontbrekende elementen bij het ontwerpen van een co-cultuurmedium. Veel organismen variëren bijvoorbeeld in hun efficiëntie van het gebruik van verschillende vormen van stikstof uit het milieu (bijv. N2, nitraat, nitriet, ureum) en zijn mogelijk helemaal niet in staat om enkele van de meer geoxideerde stikstofbronnen te gebruiken. Evenzo kunnen veel microben suppletie van essentiële vitamines (bijv. vitamine B12), co-factoren of essentiële aminozuren nodig hebben, omdat ze geen volledige biosynthetische routes hebben voor directe synthese van deze verbindingen. Om deze redenen kan het het meest praktisch zijn om te beginnen met het simpelweg "samenvoegen" van het gevestigde minimale medium van de cyanobacteriële partner (bijv. BG11) samen met een goed gedefinieerd minimaal medium van de heterotroof (bijv. synthetisch gedefinieerd [SD]). Latere cycli van het herhaaldelijk verwijderen/verminderen van overbodige componenten kunnen worden gebruikt om het medium te optimaliseren en de overvloed aan verbindingen te verminderen die de groei van een van de partners kunnen remmen. Een nuttig uitgangspunt is om het medium te bufferen met een neutrale of enigszins basische pH, aangezien dit meestal omstandigheden zijn die de voorkeur hebben van de meeste cyanobacteriële modelsoorten.

Op dit punt is het vaak nuttig om voorbereidende tests uit te voeren van de groei van de ondersteunde heterotroof in het nieuwe co-cultuurmedium wanneer een overmaat aan sucrose wordt toegevoerd. Natuurlijk is het bij het selecteren van een potentiële heterotroof belangrijk om er een te kiezen die in staat is om de primaire bron(nen) van organische koolstof die door de cyanobacteriële partner wordt geleverd, te kataboliseren. Het is nuttig om hier op te merken dat sucrose, als het dominante koolhydraat dat wordt geleverd in veel gemanipuleerde cyanobacteriële/heterotrofe culturen4, geen koolhydraat is dat zo universeel wordt gebruikt door heterotrofe microben als glucose: speciale sucrosetransporters moeten worden gecodeerd door de heterotrofe soorten of extracellulaire invertasen kunnen nodig zijn om sucrose om te zetten in fructose en glucose die vaak worden herkend door transporters met een hogere affiniteit8. Een belangrijke observatie die vaak wordt gerapporteerd door meerdere laboratoria die onderzoek doen naar gemengde microbiële gemeenschappen, is dat er synergieën en antagonismen van hogere orde ontstaan tussen de fototrofe en heterotrofe partners 4,8,13. Andere natuurlijk uitgescheiden metabolieten (bijv. organische zuren, gereduceerde vormen van stikstof) of co-factoren (bijv. sideroforen) kunnen bijvoorbeeld hogere groeisnelheden van een of beide partners mogelijk maken wanneer ze in hetzelfde medium worden gekweekt in vergelijking met axenische controles. Omgekeerd is gemeld dat potentieel schadelijke metabole bijproducten, zoals hyperoxygenatie van het medium door fotosynthetische watersplitsing, de groei van een of beide partners tussen soorten veroorzaken8. Daarom kunnen axenische controles een nuttige benchmark zijn, maar de prestaties van de co-cultuur kunnen afwijken van de verwachtingen als gevolg van deze opkomende eigenschappen.

Afhankelijk van de heterotrofe partner en het vermogen van S. elongatus om sucrose uit te scheiden (op basis van het inductieniveau, de gebruikte IPTG-concentratie), moeten verschillende verhoudingen van beide organismen worden getest. Het succes van de culturen hangt voornamelijk af van het vermogen van S. elongatus om de groei van de heterotrofe partner in stand te houden (d.w.z. of deze voldoende koolstofbron kan produceren). Hoewel overgroei van de heterotrofe stam doorgaans wordt beperkt door het gebrek aan organische koolstof in de samenstelling van het co-cultuurmedium, kunnen cyanobacteriën de heterotroof overtreffen, wat kan leiden tot opkomende remmende interacties (bijv. hyperoxische aandoeningen 8,13). Bij het bepalen van de juiste verhoudingen van de celdichtheid voor de cyanobacterie: gist, is een goede benadering dat de cyanobacteriële partner een gelijk celvolume van de begeleidende heterotrofe cellen kan ondersteunen. Aangezien eukaryote gisten doorgaans aanzienlijk grotere celvolumes hebben dan model-sucrose-afscheidende cyanobacteriën, kan dit waarschijnlijk betekenen dat de dichtheid van cyanobacteriële cellen aanzienlijk hoger zal zijn (bijv. 50-100 keer voor S. cerevisiae) in een steady-state. Daarom zou een goed uitgangspunt bij het opzetten van een nieuwe co-cultuur met het onderzoeker-specifieke laboratorium en soortomstandigheden zijn om het gemiddelde celvolume voor zowel de cyanobacterie als de gist te berekenen (op basis van gepubliceerde waarden; zie bijv. B10NUMB3R537) om de volumetrische verhouding te schatten. Initiële kolven kunnen worden gezaaid met deze verhouding van cellen. Om de oplossingsruimte te verkennen, kan de onderzoeker de concentratie van cyanobacteriën constant houden (bijv. OD750 = 0,3) terwijl de concentratie van gistcellen in stappen met ongeveer een orde van grootte omhoog of omlaag wordt gevarieerd op basis van de doorvoer die is toegestaan door de beschikbare fototrofe kweekruimte van de onderzoeker. Natuurlijk is deze volumetrische 'vuistregel' afhankelijk van de snelheid waarmee de fototrofe partner in staat is om organische fotosynthaten (bijv. sucrose) af te scheiden die door de heterotrofe partner kunnen worden gebruikt. Zodra de omstandigheden voor co-teelt zijn vastgesteld, zal een zorgvuldige monitoring van de groeiprestaties van beide partners in de loop van de tijd waardevolle gegevens opleveren over ideale soortenverhoudingen, vooral als vroege co-culturen dagen tot weken kunnen worden volgehouden, waardoor de onderzoeker de steady-state-verhouding kan identificeren die tegen het einde van een co-cultuur wordt bereikt. Deze informatie kan worden gebruikt bij het selecteren van de initiële inoculatiedichtheid voor elke partnersoort in latere experimenten om de cultuur te helpen sneller de zelfbepaalde ideale soortenverhouding te bereiken.

In het tweede deel van het protocol worden gedetailleerde instructies voor co-cultuuranalyse gegeven. Een betrouwbare kwantificering van de co-culturen is de sleutel tot hun succesvolle implementatie: groei (of op zijn minst metabolische activiteit) van de fototrope, koolstofafscheidende partner is essentieel om de heterotrofen in stand te houden. Hoewel de verhouding cyanobacteriën:heterotroof die wordt gebruikt om de cultuur te inoculeren niet altijd van cruciaal belang is om te optimaliseren, aangezien co-culturen op langere termijn de neiging hebben om te convergeren naar stabiele proporties, kan het belangrijk zijn om methoden te integreren om ongebreidelde groei van beide partners te controleren door middel van cultuurverdunning of inkapseling van een of meer soorten 36,38,39,40. Zoals hierboven vermeld, kunnen bijproducten van de cyanobacteriële partner bij hoge concentraties (bijv. O2) remmend zijn voor de heterotrofe vloeistof, en sommige producten van het heterotrofe metabolisme kunnen ook schadelijk zijn voor de gezondheid van cyanobacteriën. De meeste gepubliceerde co-culturen maken gebruik van heterotrofen die een snellere groeisnelheid hebben dan de meeste modelcyanobacteriële soorten; Daarom wordt de heterotrofe groeisnelheid meestal beperkt door de aanvoer van organische koolstof die door de cyanobacterie wordt geproduceerd. Desalniettemin is het bepalen van de dynamiek van de soortenrijkdom in de loop van de tijd een cruciale waarde voor het ophelderen van tekortkomingen in stabiliteit en het optimaliseren voor robuuste co-culturen in langdurige teelt.

Er worden protocollen voor kwantificering verstrekt met behulp van telkamers, deeltjestellers en eencellige flowcytometrie. Alle technieken zijn waardevolle hulpmiddelen voor de karakterisering van co-culturen, maar met verschillende voorwaarden, voordelen en beperkingen. Telkamers zijn zeer breed toepasbaar voor het kwantificeren van co-culturen, op voorwaarde dat alle partners in de cultuur visueel kunnen worden onderscheiden door hun celvormen of andere eigenschappen. Het grote voordeel is de lage prijs van dit apparaat, waardoor het in principe voor elk laboratorium haalbaar is. Naast informatie over de co-cultuursamenstelling en -verhouding van de verschillende partners, kan daarnaast een indruk worden verkregen van de morfologie en fitheid van de cel en kunnen mogelijke contaminanten worden opgespoord. De toepassing van de telkamer is echter ook zeer tijdrovend, gaat gepaard met een hoge werkdruk en kan alleen een lage doorvoer ondersteunen.

Zowel deeltjestellers als eencellige flowcytometrie bieden de enorme voordelen van een hoge doorvoer en een gemakkelijke, tijdbesparende bediening. Terwijl de celteller vertrouwt op duidelijke verschillen in celgroottes van de partners in de co-cultuur, kan eencellige cytometrie ook fluorescentielabels onderscheiden, wat resulteert in het vermogen om co-culturen te kwantificeren met meer dan twee leden van dezelfde grootte of zelfs twee verschillende mutanten van hetzelfde organisme op basis van verschillende fluorescerende markers. In het gegeven voorbeeld van een kunstmatige assemblage van Synechocystis met S. cerevisiae en U. maydis, werden de intracellulaire fluorescentiereporters mKate2 en eGFP gebruikt om de twee gisten te onderscheiden. Dezelfde fluorescerende reporters kunnen ook worden gebruikt om twee genetisch gemodificeerde stammen van hetzelfde organisme (bijv. S. cerevisiae) te onderscheiden die niet kunnen worden gescheiden op basis van hun lichtverstrooiingseigenschappen alleen. Soortgelijke strategieën zijn geïmplementeerd om synthetische bacterieconsortia te volgen41. Afhankelijk van het celtype, het aantal partners in een consortium en hun potentiële bereik van autofluorescentie(s), heeft de selectie van fluorescerende markers extra aandacht nodig om overlapping van spectrale kwaliteiten te voorkomen, vooral gezien de autofluorescerende eigenschappen van cyanobacteriën. 42

We pleiten hier voor het naleven van de FAIR-richtlijnen op het gebied van opslag, beheer en het delen van wetenschappelijke gegevens. FAIR is een acroniem dat staat voor Findable, Accessible, Interoperable en Reusable43. Naarmate deze principes breder worden geaccepteerd, beloven ze het landschap van biologisch onderzoek te transformeren en een meer open, collaboratieve en efficiënte benadering van gegevensbeheer en -gebruik te bevorderen. Hoewel kritieke componenten van toegankelijkheid kunnen worden gewaarborgd door gegevens te deponeren in de geannoteerde onderzoekscontext (ARC)44, is het belangrijk om de reproductie van de gegevensverwerkingsstappen met open access-software mogelijk te maken. Ruwe FCS-bestanden slaan zowel gegevens als metagegevens op (informatie over lasers en detectoren, inclusief golflengten, filters, enz.) over flowcytometrie-experimenten45. Ze kunnen worden geladen en gelezen buiten propriëtaire software die geavanceerde gegevensanalyse mogelijk maakt, er zijn bijvoorbeeld een aantal pakketten beschikbaar om met onbewerkte gegevens te werken binnen de Python-omgeving. Het ontwikkelde pakket laat zien hoe u onbewerkte .fcs-bestanden met cytometriegegevens buiten de propriëtaire software kunt laden, lezen en visualiseren met behulp van een van de vele beschikbare pakketten in Python23. Het gebruik van open software zoals hierboven beschreven elimineert de noodzaak van dure licentiekosten die gepaard gaan met propriëtaire software, biedt volledige controle over gegevensverwerking (bijv. transformatie, compensatie, gating) en maakt bovendien integratie van talloze tools op één plek mogelijk.

Een waardevol extra voordeel van het gebruik van eencellige cytometrie in combinatie met een celsorteerder is de mogelijkheid om ook cellen van een bepaald type te verzamelen door FACS. Dit kan zeer waardevol zijn voor het toepassen van -omics-technologieën voor gedetailleerde inzichten in de soortinteractie binnen de co-cultuur, zoals RNASeq of metabolomics. Het duidelijke nadeel van deze apparaten zijn hun hoge prijzen, dus de betaalbaarheid en beschikbaarheid van dergelijke machines kan in sommige laboratoria een schijnbare beperking zijn.

Interessant is dat een directe vergelijking van de gepresenteerde methoden voor kwantificering van de drie partners in een consortium een zeer goede overeenkomst tussen de verschillende technieken aan het licht bracht, wat aangeeft dat het mengsel dat is samengesteld op basis van OD-metingen betrouwbaar wordt gekwantificeerd door alle beschreven methoden. Interessant is dat het totale aantal cyanobacteriën ongeveer 3-4 keer hoger was dan het aantal van de twee gistsoorten, een fenomeen dat waarschijnlijk te wijten is aan hun kleinere celgrootte. Deze waarneming is in goede overeenstemming met de algemene kennis dat OD's zonder kalibratie geen informatie geven over het werkelijke aantal cellen46. De gisten vertoonden echter tellingen op een vergelijkbaar niveau (Tabel 2 en Tabel 3). Bovendien toont de vergelijking met de kwantificering van de afzonderlijke culturen aan dat alle drie de methoden betrouwbare hulpmiddelen zijn om de celtypen te onderscheiden, met uitzondering van de deeltjesteller die de twee gistsoorten niet scheidde.

In wezen zijn eencellige cytometrietoepassingen duidelijk het krachtigste hulpmiddel om de samenstelling van co-culturen te monitoren, waardoor 1.000-10.000 cellen per seconde kunnen worden geteld. Dit is met name het geval als het aantal partners toeneemt tot meer dan twee of als de partners qua vorm en/of diameter vergelijkbaar zijn. Er zijn met name tal van alternatieven die het mogelijk maken om co-culturen te monitoren. De groei van fluorescerend gelabelde microben in co-culturen kan bijvoorbeeld continu worden gevolgd door fluorimetrie of microbioreactoren47. Deze zijn echter vaak beperkt tot een co-cultuur van twee partners en vereisen een zorgvuldig experimenteel ontwerp, bijvoorbeeld bij de keuze van fluorescentiemarkers. Amplicon-sequencing (16S rRNA-sequencing) en andere sequencingtechnieken van de volgende generatie in combinatie met geavanceerde bio-informatica is een andere optie voor de karakterisering van synthetische gemeenschappen 48,49,50. Deze technieken zijn geschikt voor benaderingen met een hoge doorvoer en kunnen gevestigde interacties in langdurige teelten, evolutionaire vragen of het volgen van mutaties met meerdere microbiële partners aanpakken.

Alles bij elkaar bieden simplistische microbiële co-culturen die rationeel zijn ontworpen een krachtige "bottom-up"-benadering voor het ondervragen van de dynamiek tussen soorten die moeilijker te benaderen kan zijn binnen gemeenschappen met meerdere soorten die de natuurlijke wereld domineren 51,52,53. Hierin wordt een gestroomlijnd protocol geboden dat gemakkelijk door de wetenschappelijke gemeenschap kan worden aangepast voor het vaststellen en analyseren van nieuwe paren cyanobacteriën en heterotrofe partners. Het is duidelijk dat er veel onderzoek nodig is om zowel te profiteren van de potentiële fundamentele inzichten die kunnen worden verkregen uit kunstmatige microbiële co-culturen als om te bepalen of synthetisch ontworpen microbiële consortia kunnen tippen aan het potentieel dat in de literatuur vaak aan hen wordt toegeschreven voor biotechnologische toepassingen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Duitse Onderzoeksstichting) - SFB1535 - Project ID 458090666 (project B03 tot KS, AM en IA) en Major Research Instrumentation INST 208/808-1. DCD bezoekt momenteel HHU Düsseldorf als Mercator Fellow van het SFB1535. Extra ondersteuning voor EJK werd geboden door National Science Foundation Awards #1845463 en #2334680.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10x Ph1 objectiveCarl Zeiss AG46 04 01-9904
525/40 nm Bandpass FilterBeckman Coulter, Inc.A01-1-0051FITC filter (in 488 nm laser)
660/10 nm Bandpass FilterBeckman Coulter, Inc.A01-1-0055APC kanaal (in 638 nm laser)
710/50 nm Bandpass FilterBeckman Coulter, Inc.B71092PC5.5 kanaal (in 561 nm laser)
Accuvettes for Multisizer 4eBeckman Coulter, Inc.A35473Stalen bekers met deksels
Aperture tube 30 μM for Multisizer 4eBeckman Coulter, Inc.C92760Capillair
AutoclaafLab AssociatesEQM-ARBPvoor sterilisatie van materiaal
Baffled flasks ROTILABO®, Straight neck, 250 mlCarl Roth GmbH + Co. KGLY95.1
BG11 / CoYBG11 componentenverschillende leverancierszie Tabel 1 
Flesstop steriele filterSigmaaldrichZ222593voor steriele media als u geen autoclaaf wilt gebruiken
Capillair 45 μmOmni Life ScienceOLS 5651738
CASY Cell Counter Model TTCSchaerfe Systems
CASY cupsOmni Life ScienceOLS 5651794
CASYcleanOmni Life ScienceOLS 5651786Reinigingsoplossing
CASYton oplossingOmni Life ScienceOLS 5651808Isotone oplossing 
Centrifugebuizen (50 mL)SigmaaldrichCLS430828
CO2BOC270182-Lvoor de toevoer van axenische cyanobacteriële culturen en co-culturen
CONTRAD® 70Beckman Coulter, Inc.81911Diep reinigende oplossing
Dekglas 20 × 26 x 0.4 mmVWR International GmbH631-1190Dekglas voor tellingskamer
CuvettesSarstedt67.742
Cyanobacteria BG-11 Freshwater SolutionMerck KGaAC3061
CytExpert Software v. 2.6Beckman Coulter, Inc.Cytometer-applicatiesoftware
CytoFLEX Sheath FluidBeckman Coulter, Inc.B51503Sheathvloeistof
Cytometer CytoFLEX SBeckman Coulter, Inc.BE51180
DxH Cleaner for Multisizer 4eBeckman Coulter, Inc.628022Reinigingsoplossing
Eppendorfbuis centrifuge (klein)LabstacCEN16-15voor centrifugeren van minder dan 2mL van een kweek
EthanolCarl Roth GmbH + Co. KGK928.1
FACS buizenBeckman Coulter, Inc.2523749buizen voor semi-automatische modus
GradeercilindersSigmaaldrichZ131121voor bereiding van media
HEPPSOMerck KGaAR426725
Infors MultiTron foto-incubatorInfors AGwitte LED verlichting
IPTGMerck KGaAI6758Maak aliquots aan, bewaar bij -20°C, ontdooi en houd op ijs 
Isoton II voor Multisizer 4eBeckman Coulter, Inc.8448011Isotone oplossing 
Kaluza v. 2.2Beckman Coulter, Inc.B16406Cytometrie dataanalysesoftware
KimWipesVWR International GmbH115-2221Lintvrije zakdoekjes
KOHMerck KGaA221473
KPO3Noah Chemicals7790-53-6
MaatbekersVWR213-3747
Micro test plaat, 96 well, slip-on deksel, platte basis, PS, transparantSARSTEDT AG & Co. KG82.1581.001
Microscoop basisCarl Zeiss AG47 09 18-9902/16
Microscoop hoofdCarl Zeiss AG47 30 14
Milli-Q waterzuiveringssysteemMerck MilliporeC85358
Multisizer 4e deeltjestellerBeckman Coulter, Inc.B23005Alternatief voor de CASY Cell Counter
Neubauer verbeterd, diepte 0.02 mmAssistent GermanyTellenkamer
Neubauer verbeterd, diepte 0.1 mmPaul Marienfeld GmbH & Co. KG640010Tellenkamer
Ready to Use Daily QC FluorospheresBeckman Coulter, Inc.C65719Referentie voor QC
SCHOTT flessenDutscher90347voor opslag
Specord®200 Plus SpectrophotometerAnalytic Jena GmbHOD600/750
SucroseMerck KGaA84100
Centrifuge op tafel (groot)LabstacCEN18-06RKweekbiomassa verzamelen
Yeast Nitrogen Base, zonder aminozuren, zonder ammoniumsulfaatThermo Fisher Scientific Inc.11743014

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roell, G. W., Zha, J., Carr, R. R., Koffas, M. A., Fong, S. S., Tang, Y. J. Engineering microbial consortia by division of labor. Microb Cell Factories. 18 (1), 35(2019).
  2. Grandel, N. E., Reyes Gamas, K., Bennett, M. R. Control of synthetic microbial consortia in time, space, and composition. Trends Microbiol. 29 (12), 1095-1105 (2021).
  3. Weiland-Bräuer, N. Friends or Foes-Microbial Interactions in Nature. Biology. 10 (6), (2021).
  4. Santos-Merino, M., Yun, L., Ducat, D. C. Cyanobacteria as cell factories for the photosynthetic production of sucrose. Front Microbiol. 14, 1126032(2023).
  5. Klähn, S., Hagemann, M. Compatible solute biosynthesis in cyanobacteria. Environ Microbiol. 13 (3), 551-562 (2011).
  6. Dean, P. N., Bagwell, C. B., Lindmo, T., Murphy, R. F., Salzman, G. C. Introduction to flow cytometry data file standard. Cytometry. 11 (3), 321-322 (1990).
  7. Rippka, R., Stanier, R. Y., Deruelles, J., Herdman, M., Waterbury, J. B. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of Cyanobacteria. Microbiology. 111 (1), 1-61 (1979).
  8. Hays, S. G., Yan, L. L. W., Silver, P. A., Ducat, D. C. Synthetic photosynthetic consortia define interactions leading to robustness and photoproduction. J Biol Eng. 11, 4(2017).
  9. Ducat, D. C., Avelar-Rivas, J. A., Way, J. C., Silver, P. A. Rerouting carbon flux to enhance photosynthetic productivity. Appl Environ Microbiol. 78 (8), 2660-2668 (2012).
  10. Thiel, K., et al. Redirecting photosynthetic electron flux in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 by the deletion of flavodiiron protein Flv3. Microb Cell Factories. 18 (1), 189(2019).
  11. Song, K., Tan, X., Liang, Y., Lu, X. The potential of Synechococcus elongatus UTEX 2973 for sugar feedstock production. Appl Microbiol Biotechnol. 100 (18), 7865-7875 (2016).
  12. Feng, J., et al. Generation and comprehensive analysis of Synechococcus elongatus-Aspergillus nidulans co-culture system for polyketide production. Biotechnol Biofuels Bioprod. 16 (1), 32(2023).
  13. Li, T., et al. Mimicking lichens: incorporation of yeast strains together with sucrose-secreting cyanobacteria improves survival, growth, ROS removal, and lipid production in a stable mutualistic co-culture production platform. Biotechnol Biofuels. 10, 55(2017).
  14. JoVE Science Education Database. Microbiology. Growth Curves: Generating Growth Curves Using Colony Forming Units and Optical Density Measurements. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).
  15. Yeast Extract-Peptone-Dextrose (YEPD). (9), Cold Spring Harb Protoc. (2015).
  16. Zhang, M., et al. Improvement of cell counting method for Neubauer counting chamber. J Clin Lab Anal. 34 (1), e23024(2020).
  17. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. Eu J Immunol. 47 (10), 1584-1797 (2017).
  18. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (third edition). Eu J Immunol. 51 (12), 2708-3145 (2021).
  19. Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , Wiley. (2003).
  20. Tung, J. W., et al. Modern flow cytometry: a practical approach. Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).
  21. JoVE Science Education Database. Flow Cytometry. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).
  22. Cheung, M., Campbell, J. J., Whitby, L., Thomas, R. J., Braybrook, J., Petzing, J. Current trends in flow cytometry automated data analysis software. Cytometry A. 99 (10), 1007-1021 (2021).
  23. Yurtsev, E., Friedman, J., Gore, J. FlowCytometryTools: Version 0.4.5. , Available from: https://pypi.org/project/FlowCytometryTools/ (2021).
  24. White, S., et al. FlowKit: A Python Toolkit for Integrated Manual and Automated Cytometry Analysis Workflows. Front Immunol. 12, 768541(2021).
  25. O'Neill, K., Aghaeepour, N., Spidlen, J., Brinkman, R. Flow cytometry bioinformatics. PLoS Comput Biol. 9 (12), e1003365(2013).
  26. Klement, T., Milker, S., Jäger, G., Grande, P. M., Domínguez de María, P., Büchs, P. Biomass pretreatment affects Ustilago maydis in producing itaconic acid. Microb Cell Factories. 11, 43(2012).
  27. Koschwanez, J. H., Foster, K. R., Murray, A. W. Sucrose utilization in budding yeast as a model for the origin of undifferentiated multicellularity. PLoS Biol. 9 (8), e1001122(2011).
  28. Koschwanez, J. H., Foster, K. R., Murray, A. W. Improved use of a public good selects for the evolution of undifferentiated multicellularity. ELife. 2, e00367(2013).
  29. Winston, F., Dollard, C., Ricupero-Hovasse, S. L. Construction of a set of convenient Saccharomyces cerevisiae strains that are isogenic to S288C. Yeast. 11 (1), 53-55 (1995).
  30. Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
  31. Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 42 (4), 1047-1063 (2001).
  32. Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173 (1 Spec), 33-38 (1996).
  33. Behle, A., Saake, P., Germann, A. T., Dienst, D., Axmann, I. M. Comparative dose-response analysis of inducible promoters in cyanobacteria. ACS Synth Biol. 9 (4), 843-855 (2020).
  34. Lindemann, S. R., et al. Engineering microbial consortia for controllable outputs. ISME J. 10 (9), 2077-2084 (2016).
  35. Duncker, K. E., Holmes, Z. A., You, L. Engineered microbial consortia: strategies and applications. Microb Cell Factories. 20 (1), 211(2021).
  36. Fedeson, D. T., Saake, P., Calero, P., Nikel, P. I., Ducat, D. C. Biotransformation of 2,4-dinitrotoluene in a phototrophic co-culture of engineered Synechococcus elongatus and Pseudomonas putida. Microb Biotechnol. 13 (4), 997-1011 (2020).
  37. Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. BioNumbers-the database of key numbers in molecular and cell biology. Nucleic Acids Res. 38 (suppl_1), D750-D753 (2009).
  38. Tóth, G. S., et al. Photosynthetically produced sucrose by immobilized Synechocystis sp. PCC 6803 drives biotransformation in E. coli. Biotechnol Biofuels Bioprod. 15 (1), 146(2022).
  39. Weiss, T. L., Young, E. J., Ducat, D. C. A synthetic, light-driven consortium of cyanobacteria and heterotrophic bacteria enables stable polyhydroxybutyrate production. Metabol Eng. 44, 236-245 (2017).
  40. Zhang, L., Chen, L., Diao, J., Song, X., Shi, M., Zhang, W. Construction and analysis of an artificial consortium based on the fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973 to produce the platform chemical 3-hydroxypropionic acid from CO2. Biotechnol Biofuels. 13, 82(2020).
  41. Jorrin, B., et al. Stable, fluorescent markers for tracking synthetic communities and assembly dynamics. Microbiome. 12 (1), 81(2024).
  42. Yokoo, R., et al. Live-cell imaging of cyanobacteria. Photosynth Res. 126, 36-46 (2015).
  43. Wilkinson, M. D., et al. The FAIR guiding principles for scientific data management and stewardship. Sci Data. 3, 160018(2016).
  44. Venn, B., et al. Fostering the democratization of research data by using the Annotated Research Context (ARC) as practical implementation. E-Science-Tage 2021: Share Your Research Data. , (2021).
  45. Ortolani, C. The Cytometric File. Flow Cytometry Today: Everything You Need to Know about Flow Cytometry. , Springer. Cham. (2022).
  46. Beal, J., et al. Robust estimation of bacterial cell count from optical density. Communi Biol. 3 (1), 512(2020).
  47. Funke, M., et al. Microfluidic biolector-microfluidic bioprocess control in microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 107 (3), 497-505 (2010).
  48. Zhang, P., Spaepen, S., Bai, Y., Hacquard, S., Garrido-Oter, R. Rbec: a tool for analysis of amplicon sequencing data from synthetic microbial communities. ISME Commun. 1 (1), 73(2021).
  49. Ezzamouri, B., Shoaie, S., Ledesma-Amaro, R. Synergies of systems biology and synthetic biology in human microbiome studies. Front Microbiol. 12, 681982(2021).
  50. Zaramela, L. S., Tjuanta, M., Moyne, O., Neal, M., Zengler, K. synDNA-a synthetic DNA spike-in method for absolute quantification of shotgun metagenomic sequencing. mSystems. 7 (6), e0044722(2022).
  51. Bittihn, P., Din, M. O., Tsimring, L. S., Hasty, J. Rational engineering of synthetic microbial systems: from single cells to consortia. Curr Opin Microbiol. 45, 92-99 (2018).
  52. San León, D., Nogales, J. Toward merging bottom-up and top-down model-based designing of synthetic microbial communities. Curr Opin Microbiol. 69, 102169(2022).
  53. Fedeson, D. T., Ducat, D. C. Symbiotic Interactions of Phototrophic Microbes: Engineering Synthetic Consortia for Biotechnology. Role of Microbial Communities for Sustainability. , Springer. Singapore. (2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Assemblage van co culturensucrose secreterende cyanobacteri nfototrope microbenmicrobi le consortiaflowcytometrieceltellingfluorescentiemarkeringpartikeltellingmicroscopische kwantificering

Gerelateerde artikelen