Gedragstrainingsprocedures voor op het hoofd gefixeerde virtual reality bij muizen

Samenvatting

Het artikel beschrijft de experimentele procedures voor het veelgebruikte virtual reality (VR)-paradigma (lineaire track) bij muizen en het bepalen van de haalbaarheid van het uitvoeren van complexe VR-taken door een Y-vormige signaaldiscriminatietaak te testen.

Samenvatting

Virtual reality (VR) in combinatie met hoofdfixatie wordt steeds vaker gebruikt in gedragsneurowetenschappelijke studies, omdat het complexe gedragstesten mogelijk maakt om uit te voeren bij muizen die aan het hoofd zijn gefixeerd. Dit maakt nauwkeurige gedragsopnames mogelijk, terwijl verschillende neurofysiologische technieken worden gebruikt die hoofdfixatie vereisen om bewegingsgerelateerde signaalruis tijdens neurale opnames te minimaliseren. Ondanks het toenemende gebruik van VR zijn er echter weinig gepubliceerde gegevens over de gedetailleerde methodologie voor de implementatie ervan. In deze studie wordt een trainingsprotocol ontwikkeld waarbij mannelijke en vrouwelijke C57B16/J-muizen worden getraind om door een virtuele lineaire gang te rennen, waarvan de lengte wordt vergroot van 1-3 m over meerdere trainingssessies. Voortbouwend op deze basis onderzocht deze studie de haalbaarheid van muizen die complex gedrag vertonen binnen VR met behulp van een Y-doolhofparadigma. De taak vereiste het navigeren naar de arm met zwarte muren vanaf het keuzepunt in het Y-doolhof. Na het bereiken van een criterium van twee opeenvolgende dagen gelijk aan of groter dan 70% correct, ontwikkelden de muizen zich tot steeds moeilijkere sensorische discriminatie. De bevindingen bieden belangrijke details over de methodologieën die nuttig zijn voor de succesvolle training van muizen in VR en tonen aan dat muizen leervermogen vertonen bij het navigeren door het Y-doolhof. De gepresenteerde methodologie biedt niet alleen inzicht in de trainingsduur in VR-gebaseerde assays, maar onderstreept ook het potentieel voor het onderzoeken van ingewikkeld gedrag bij muizen, waardoor wegen worden geopend voor uitgebreider neurowetenschappelijk onderzoek.

Inleiding

Virtual reality-taken zijn naar voren gekomen als een krachtige methode voor gedragsbeoordeling bij muizen als gevolg van hoofdfixatie, die mechanische stabiliteit mogelijk maakt die in het gedrang zou komen bij zich vrij gedragende muizen¹. Deze methode maakt verminderde bewegingsartefacten mogelijk in elektrofysiologische opnames ^2,3 en optische beeldvorming ^4,5,6,7. Het vergemakkelijkt ook herhaalbaar gedrag⁸ en nauwkeurige eye-tracking⁹. In de experimentele opstelling is de muis op zijn plaats gefixeerd en bovenop een luchtondersteunde bolvormige loopband geplaatst. Dit apparaat maakt het mogelijk om op ingewikkelde wijze visueel geleid gedrag binnen de VR-omgeving te verkennen. Terwijl de muis op de loopband beweegt, synchroniseert zijn voortbeweging naadloos met zijn navigatie in het virtuele landschap, dat visueel wordt weergegeven op het scherm rond de muis.

Het doel van deze studie is tweeledig: het aanpakken van de belangrijkste uitdagingen binnen de experimentele gedragsneurowetenschappen en het bijdragen aan de vooruitgang van methodologieën op dit gebied. Ten eerste blijft er, ondanks het toegenomen gebruik van VR in academisch onderzoek 10,11,12, een opmerkelijke afwezigheid van uitgebreide methodologieën en trainingsprotocollen, wat de acceptatie van deze technologie door nieuwe onderzoekers belemmert. Het primaire doel was om deze leemte op te vullen door een gedetailleerd trainingsregime af te bakenen voor het lineaire spoorparadigma, zoals afgebeeld in eerdere studies 13,14,15. Om deze operationele procedures te beschrijven wordt een commercieel beschikbaar systeem gebruikt. Als disclaimer bevatten deze procedurele richtlijnen componenten die specifiek zijn voor dit systeem; Echter, voor een bespreking van de generaliseerbaarheid van dit protocol, zie de discussie. Het doel was om de gedragsprocedures te schetsen, de typische tijdlijn voor het uitvoeren van deze procedures en het slagingspercentage voor het trainen van muizen om op een eenvoudig lineair spoor te rennen.

Ten tweede blijft er een gebrek aan documentatie over de implementatie van complexe doolhoftaken binnen dit paradigma bij muizen. Er zijn complexe virtuele tests ontwikkeld bij ratten¹¹. Muizen hebben echter een verminderde gezichtsscherpte in vergelijking¹⁶ en presteren vaak slechter bij complexe taken¹⁷. Hoewel sommige onderzoeken zich hebben gericht op specifieke taken, zoals het verzamelen van bewijsmateriaal of ruimtelijke nieuwigheid¹⁸, lag de focus hier op het ophelderen van de trainingsmethodologieën die nodig zijn voor muizen om deel te nemen aan besluitvormingsparadigma's binnen VR-omgevingen. Om deze uitdaging aan te gaan, werd een taak voor signaaldiscriminatie bedacht waarbij de muizen uitsluitend de taak kregen om te leren de kleur/luminantie (zwart versus wit) van de beloonde arm te associëren met de beloning, bereikt door de zwarte arm te selecteren op het keuzepunt van het Y-doolhof, met de juiste arm gerandomiseerd op elke proef. Deze taak is ontworpen om interactie met de virtuele signalen te vereisen en inzicht te geven in het perceptuele onderscheidingsvermogen van de muizen.

Samenvattend pakt deze studie kritieke lacunes op het gebied van experimentele gedragsneurowetenschappen aan door uitgebreide trainingsprotocollen te bieden voor het gebruik van VR-paradigma's bij muizen en methodologieën voor complexe besluitvormingstaken binnen dit kader te verhelderen. Door gebruik te maken van inzichten uit eerder onderzoek en innovatieve experimentele ontwerpen, heeft deze studie tot doel onderzoekspraktijken te stroomlijnen en het begrip van neurale mechanismen die ten grondslag liggen aan gedrag te vergroten. In de volgende paragrafen wordt dieper ingegaan op de experimentele procedures en resultaten en worden de bevindingen besproken.

Protocol

Alle procedures waarbij dieren betrokken waren, werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de protocollen die zijn opgesteld door de NIEHS Animal Care and Use Committee, waarbij de naleving van ethische normen en welzijnsrichtlijnen werd gegarandeerd. Voor het onderzoek werden C57BL/6Tac-muizen van ongeveer 8 weken oud gebruikt.

1. Chirurgie voor implantatie van de hoofdstang

1. Voorbereiding van de operatie
   1. Verkrijg het gewenste aantal muizen voor iemands cohort, idealiter om ze afzonderlijk te huisvesten om interferentie met het hoofdstangimplantaat te minimaliseren, hoewel dit optioneel is¹⁹. Deze studie gebruikte een steekproefomvang van drie mannelijke en drie vrouwelijke muizen (aanvankelijk evenwichtig, maar één mannetje werd vroeg in de training uitgesloten nadat hij niet op de bal had kunnen rennen)
   2. Verkrijg de materialen die zijn gespecificeerd in de materiaaltabel en pas ze aan volgens de specifieke kenmerken van het onderzoeksontwerp.
   3. Bij het verkrijgen van de muizen, duidt u individuele identificatiegegevens aan en brengt u staarttatoeages of oorgaatjes aan om een ondubbelzinnige identificatie te garanderen. Stel een uitgebreid logboek op om hun gewichten systematisch te registreren, zoals vereist voor de waterbeperkingsprocedure.
2. Toediening van anesthesie
   1. Zorg ervoor dat alle chirurgische instrumenten direct beschikbaar zijn, inclusief geschikte spuiten, een verwarmingskussen, metalen voorwerpen (zoals een pincet, microschaar en hemostaten), jodiumoplossing, oogsmeermiddel en bekers voor zoutoplossing en waterstofperoxide. Om steriele omstandigheden te garanderen, ontsmet u alle chirurgische apparatuur en steriliseert u alle chirurgische instrumenten met behulp van een autoclaaf.
   2. Voordat u overgaat tot de operatie, moet u nauwkeurige gewichtsmetingen van de muizen uitvoeren en het verwarmingskussen activeren tot 34 °C. Noteer alle benodigde informatie in het laboratorium/chirurgisch notitieboekje van de instelling. Controleer de toereikendheid van de zuurstof- en isofluraantankniveaus en bevestig de beschikbaarheid van alle essentiële materialen om ononderbroken chirurgische ingrepen mogelijk te maken.
   3. Krabbel de muis en plaats hem in een neuskegel die is bevestigd aan een verdamper die is ontworpen voor kleine dieren en die 4% isofluraan en een zuurstofdebiet van 3 l/min krijgt om anesthesie op te wekken. Gebruik een aaseter om mogelijk schadelijke afvalgassen op te vangen (aanbevolen).
   4. Dien Petroleum oogheelkundige veterinaire zalf toe aan de ogen van de muis terwijl deze zich onder de neuskegel bevindt om uitdroging van de ogen te voorkomen. Breng in eerste instantie een enkele druppel aan op elk oog en breng indien nodig opnieuw aan. Zorg voor een constante bescherming van de ogen door altijd een laagje van dit glijmiddel aan te houden met periodieke controle.
   5. Bereid de operatieplaats (Figuur 1A) op het hoofd van de muis voor door het gebied te scheren waar de schedel aan de hoofdstang wordt bevestigd.
   6. Plaats de snijtanden van de muis in het stereotactische apparaat onder de neuskegel, stel de zuurstofstroom in op 1 l/min en dien 1%-2% isofluraan toe uit de verdamper. Zorg voor een goede anesthesiestroom door de kleppen aan te passen en dienovereenkomstig te schakelen tussen de inductieneuskegel en het stereotactische apparaat. Strek het achterbeen van de muis uit en oefen stevige druk uit op de teen. Als de voet geen reflexieve terugtrekkingsreactie vertoont, geeft dit aan dat de anesthesie effectief is. Herhaal dit elke 15 minuten, samen met een ademhalingscontrole.
   7. Zet het hoofd van de muis op zijn plaats door chirurgische stabiliteitsstangen in de gehoorgangen te bevestigen, waardoor mogelijke hoofdbewegingen tijdens de operatie tot een minimum worden beperkt.
   8. Voorafgaand aan het maken van incisies of injecties, steriliseert u het geschoren operatiegebied op de bovenkant van het hoofd door het te schrobben met een wattenstaafje gedrenkt in een jodiumantisepticum. Gebruik vanaf dit stadium steriele handschoenen om aseptische omstandigheden te handhaven.
3. Toediening van injectie
   1. Injecteer subcutaan 0,05 ml bupivacaïne (lokale analgesie) met een naald van 25 G in de chirurgische incisieplaats op de hoofdhuid.
   2. Injecteer subcutaan 1 ml zoutoplossing (hydratatie) met een naald van 25 G in één kant van het interscapulaire gebied.
   3. Injecteer subcutaan 0,05 ml buprenorfine (analgesie van het hele lichaam) met een naald van 25 G in de andere kant van het interscapulaire gebied.
4. De schedel blootleggen
   1. Gebruik een microschaar om een incisie te maken van de huid boven de interfrontale en internasale hechtingen van de schedel, beginnend net boven de wenkbrauwrand en doorlopend tot achter de achterhoofdsinkeping (Figuur 1A).
   2. Gebruik hemostaten om de linker- en rechterflap van de huid naar beneden te houden, waardoor de schedel bloot komt te liggen.
   3. Gebruik een droog wattenstaafje om bindweefsel van de hoofdhuid tussen de naar achteren gepinde huidplooien te verwijderen.
   4. Gebruik een wattenstaafje dat bevochtigd (maar niet verzadigd) is met waterstofperoxide om de hoofdhuid te schrobben, zorg ervoor dat de hechtingen zichtbaar zijn en zorg ervoor dat er geen waterstofperoxide op het omliggende weefsel komt.
   5. Herhaal stap 1.4.3 en 1.4.4, 2x-3x, totdat zowel bregma als lambda duidelijk zichtbaar zijn en de hoofdhuid grondig is gereinigd.
5. Chirurgische schroefimplantatie
   1. Bevestig twee schroeven aan de schedel en plaats de ene schroef achter de bregma en de andere vooraan de lambda (Figuur 1B) om het oppervlak voor tandlijm te maximaliseren en de stabiliteit van de hoofdstang te vergroten. Plaats de locatie van de schroeven op doelen op een bepaalde afstand van bregma. Zorg ervoor dat de ene schroef aan de linkerkant en de andere aan de rechterkant is geplaatst (d.w.z. Anterior-Posterior (AP) +1.00, Mediaal-Lateraal (ML) -1.00 en AP -3.00, ML +3.00), zorg ervoor dat er voldoende ruimte is tussen de schroeven om de plaatsing van de kopstang mogelijk te maken en pas de coördinaten aan en nodig.
   2. Boor doelposities en zorg ervoor dat het boren beperkt blijft tot het bot van de schedel en niet in het hersenweefsel doordringt.
   3. Draai met een schroevendraaier ongeveer de helft van de schroef op zijn plaats. Herhaal dit voor de tweede schroef.
6. Het implantaat van de hoofdstang bevestigen
   1. Meng tandcement en breng het aan de onderkant van de hoofdstang aan, met de nadruk op het holle oppervlak, en breng aan langs de interfrontale hechting van de schedel.
   2. Plaats de hoofdstang over de interfrontale hechting om de hechting tussen het tandcement op de hoofdstang en dat op de hechtdraad te vergemakkelijken. Houd het stevig met de hand op zijn plaats in de gewenste hoek gedurende ongeveer 5 minuten totdat het hard wordt. Breng indien nodig extra tandheelkundig cement aan. (Figuur 1C-E)
7. De huid opnieuw bevestigen over de hoofdstang
   1. Laat de hemostaten los en gebruik een pincet om de twee huidflappen te herenigen over de met gedroogd tandcement bevestigde kopstang. Gebruik topische weefsellijm om de huid voorzichtig aan elkaar te bevestigen door het linker- en rechterdeel van de hoofdhuid langzaam aan elkaar te hechten over de hoofdstang, beginnend bij de voorste incisieplaats en eindigend bij de achterste incisieplaats.
   2. Laat de topische weefsellijm uitharden om te bevestigen dat het operatiegebied opnieuw is afgedicht voordat u de muis losmaakt van de chirurgische stabiliteitsbalken en neuskegel.
   3. Breng de muis over naar een kooi met één huis en plaats deze op een verwarmingskussen bij 37.5 °C.
   4. Controleer de muis zorgvuldig op tekenen van ongemak of onregelmatigheden in de ademhaling totdat hij weer bij bewustzijn is. Laat de muis niet zonder toezicht achter totdat hij weer sternaal liggen, alertheid vertoont en ambulant is.
   5. Laat de muizen na chirurgische ingrepen een rustperiode van 1 week ondergaan. Controleer de muizen dagelijks om opmerkelijke gewichtsschommelingen te detecteren en aan te pakken. Geef de muizen 3 dagen na de operatie puree om het herstel te bevorderen. Om interferentie met de hoofdstang te voorkomen, huisvest u deze muizen afzonderlijk.

2. Vloeistof beperking

OPMERKING: Waterbeperking veroorzaakt dorst bij muizen, waardoor hun motivatie voor vloeibare beloningen toeneemt. Een nauwgezette implementatie is echter noodzakelijk om het behoud van het welzijn van muizen^{te garanderen 20}.

1. Stel 1 week na de operatiedag het basisgewicht voor muizen vast.
2. Plak een segment van een klein petrischaaltje (60 mm x 15 mm) met de holle kant naar beneden op de vloer van de kooi, plak een kleiner petrischaaltje (35 mm x 10 mm) concaaf af op het midden van het platte oppervlak van het petrischaaltje dat op de vloer is geplakt, met een ander klein petrischaaltje (60 mm x 15 mm) concaaf dat bovenop het platte oppervlak van de middelste schaal is geplakt om als waterreservoir te dienen (Figuur 2).
3. Zorg ervoor dat de hoogte van de bovenste schaal besmetting door strooisel voorkomt, terwijl muizen gemakkelijk toegang hebben tot water. Voeg de dagelijkse hoeveelheid water met behulp van een pipet toe aan het reservoir.
4. Geef de muizen op dag 1 een dosis van 15 ml water per 100 g lichaamsgewicht.
5. Geef de muizen op dag 2 een dosis van 10 ml water per 100 g lichaamsgewicht.
6. Geef de muizen op dag 3 een dosis van 5 ml water per 100 g lichaamsgewicht. Muizen moeten tijdens het onderzoek een minimale inname van 1 ml water per dag krijgen, ongeacht het lichaamsgewicht.
   OPMERKING: Onderzoekers kunnen ervoor kiezen om het minimale volume gelijkmatig toe te dienen over alle proefpersonen, hoewel dergelijke aanpassingen zorgvuldig moeten worden gemaakt.
7. Houd gedurende de duur van het onderzoek een consistente dosering aan op 5 ml per 100 g lichaamsgewicht (of een uniforme watertoewijzing van 1 ml indien gewenst)
   OPMERKING: Muizen moeten 1-2 dagen per week ad libitum toegang krijgen tot water wanneer muizen geen VR-experiment uitvoeren (d.w.z. tijdens het weekend). Dit zal het herstel van hun natuurlijke hydratatieniveau vergemakkelijken. In gevallen waarin muizen onder 90% van hun geregistreerde basislijngewicht vallen, moeten ze worden overgeschakeld naar ad libitum toegang tot water totdat ze 90% van hun basislijngewicht hebben bereikt. Muizen die onder de 80% van hun geregistreerde basisgewichten vallen, moeten ethisch worden geëuthanaseerd.
8. Stel het toedienen van hun dagelijkse waterdosis ten minste 30 minuten na de gedragsbeoordeling uit om mogelijke interferentie met hun natuurlijke dorstgedrag te verminderen, wat essentieel is voor het nauwkeurig uitvoeren van het experiment.
   OPMERKING: Het verstrekken van vloeibare beloningen onmiddellijk na een proef kan onbedoeld de prestaties van de muizen beïnvloeden, omdat ze kunnen anticiperen op het ontvangen van een onmiddellijke beloning, waardoor de taakbetrokkenheid in gevaar kan komen. Daarom voorkomt het uitstellen van de toegang tot water na de proef gewenning aan onmiddellijke toediening van beloningen en behoudt het de integriteit van de experimentele opstelling.

3. Systeem instellen

1. Vertrouwd raken met apparatuur: Zie de onderstaande stappen voor de hardwarecomponenten en andere overwegingen van de VR-gedragssystemen.
   Zie de discussiesectie voor een onderzoek naar de generaliseerbaarheid van het protocol naar vergelijkbare systeemconfiguraties.
   1. Volledig meeslepend virtueel display of koepel: Dit virtuele display biedt volledige onderdompeling voor een dier in een aanpasbare virtuele omgeving. De beweging binnen de virtuele omgeving wordt gesynchroniseerd met de beweging op de sferische loopband.
   2. Vloeibaar beloningssysteem: Het vloeibare beloningssysteem functioneert door de toediening van vloeistofversterking (water of suikerwater) met behulp van een peristaltische pomp, die de beloningsoplossing door een met plastic beklede metalen buis leidt die zich uitstrekt tot aan de muis wanneer een taak met succes wordt uitgevoerd. Het bevat sensoren die de hoeveelheid beloningen controleren die een muis tijdens een proef heeft verkregen.
      1. Reinig de beloningstube wekelijks met ethylalcohol of een alternatief reinigingsmiddel. Om dit te doen, spoelt u 2-5 ml van het reinigingsmiddel door de buis, vergelijkbaar met de afgifte van vloeibare beloning, gevolgd door een vergelijkbare spoeling met een gelijke hoeveelheid water.
      2. Bepaal bij het starten van het experiment de afgiftesnelheid van de vloeibare beloning uit de beloningsbuis door deze voor een bepaalde duur te activeren en het volume van de afgegeven vloeistof te meten. Met deze procedure kan de vloeistofafgifte van de peristaltische pomp worden bepaald. In dit onderzoek werd een doseersnelheid van ongeveer 0,0083 ml/s gebruikt.
         OPMERKING: De meeste systemen bieden programmeerbare instellingen voor de duur tussen de uitvoering van het gedrag en het vrijgeven van de beloning, waardoor een nauwkeurige planning van het onderzoeksprotocol mogelijk is op basis van het beoogde beloningsvolume per proef. De gebruikte hoeveelheid werd voldoende geacht, omdat de muis voldoende tijd had om de beloning te consumeren, en de hoeveelheid leek motiverend te zijn.
      3. Sommige protocollen kunnen vereisen dat de muis de beloningstuit likt om de beloning te ontvangen. Voor het soort taken dat hier wordt gebruikt, is deze functionaliteit niet gebruikt, maar worden beloningen geleverd die uitsluitend afhankelijk zijn van de succesvolle uitvoering van het gewenste gedrag (d.w.z. het kiezen van de juiste arm in het y-doolhof). Dit helpt om mislukkingen in het begin van de training te voorkomen waarbij de neiging om te likken niet voldoende is vastgesteld en de eerste lik minder waarschijnlijk is. Het kan ook mogelijk zijn om de beloningsverwachting te meten, die onder bepaalde omstandigheden kan worden losgekoppeld van de navigatieprestaties¹¹.
      4. Terwijl sommige experimenten met vloeistofbeperking kiezen voor het gebruik van standaard water via de beloningsbuis, wordt hier suikerwater (10% sucrose v/v) gebruikt als een extra motiverende stimulus binnen het operante paradigma. Met name verbeterde prestaties in meerdere experimentele cohorten werden waargenomen met de introductie van suikerwater.
   3. Piepschuim bal: Deze bal fungeert als een bolvormige loopband. Wanneer ze worden opgevangen met lucht van onderaf, train je de muizen om comfortabel op de bal te rennen of te lopen. Plaats hem bovenop een kogelhouder die is uitgerust met bewegingssensoren die gegevens verzamelen over afstand en snelheid.
   4. Hoofdhouder: Plaats het apparaat achter de muis en zorg voor visuele uitlijning met het VR-scherm bij bevestiging van de hoofdstang aan de houder. Dit apparaat is cruciaal om de muis in een vaste positie met het hoofd te houden, waardoor bewegingsartefacten worden beperkt, vooral wanneer het systeem wordt gebruikt naast optische beeldvorming of elektrofysiologische technieken.
   5. Hardware voor luchtstroom: Configureer de luchtstroom van een persluchtbron naar de bal voor het creëren van een gewichtloze omgeving die bevorderlijk is voor muizen die op de bal rennen. Deze opstelling vereist een debietregelaar om een nauwkeurige regeling te garanderen van de luchtdruk die op de bal wordt uitgeoefend. De bal werkt efficiënt in een gewichtloze omgeving met minimale luchttoevoer. Zorg er daarom tijdens het instellen van het systeem voor dat de minimale hoeveelheid lucht minimaal is die nodig is om een soepele en ongehinderde beweging van de bal in de houder te vergemakkelijken. Een debiet tussen 10-20 L/min wordt aanbevolen.
2. Software-instelling: Zie hieronder voor specifieke details over de werking van het systeem.
   OPMERKING: Net als het ontwerp van videogames²¹, integreert de architectuur van virtuele werelden belangrijke elementen zoals een externe controller, een programmeerbare navigeerbare omgeving en een planningsbestand met een toestandsdiagram waarin dynamische functies worden afgebakend. Deze componenten komen synergetisch samen om een samenhangende interactieve ervaring te creëren voor proefpersonen die zich bezighouden met onderzoeksstudies. De operationele effectiviteit van de software hangt af van de precieze bestandsorganisatie binnen aangewezen mappen. In deze uitleg worden de belangrijkste stappen beschreven die nodig zijn om kant-en-klare sjablonen te vullen, zodat bestaande bestanden eenvoudig kunnen worden aangepast en als nieuwe versies kunnen worden opgeslagen. Deze nieuwe versies zullen dan de basis vormen van het onderzoek.
   1. Gebruik de volgende drie bestanden samen om een operationeel virtueel landschap te configureren.
      1. XML-bestanden: Dit bestandsformaat biedt gebruikers de mogelijkheid om de fototextuur van verschillende elementen, zoals de lucht, vloer en muren, te manipuleren. Plaats de bestanden die voor de afbeeldingen worden gebruikt in de submap Gegevens van de VR-map. Specificeer aan de hand hiervan de afmetingen van het doolhof en bepaal de beginpositie van de muis in het doolhof. Definieer 3D-objecten (visuele aanwijzingen) op bepaalde knooppunten in het doolhof met behulp van deze bestanden. Wijzig deze bestanden met behulp van een teksteditor.
      2. XLSX-bestanden: Deze fungeren als de opdrachtbestanden die alle drie de bestandstypen (XML, XLSX en XAML) samen configureren om een samenhangende en interactieve virtuele presentatie te vormen. Gebruik deze bestanden om de experimentele routines te definiëren die de VR en zijn accessoires uitvoeren, zoals versterkingsgevoeligheid, welke gegevens worden geëxtraheerd en welke bestanden worden gegroepeerd voor een experiment.
      3. XAML-bestanden: De softwaretoepassing biedt een grafische interface voor het maken van experimentele schema's door het gebruik van stroomdiagrammen. Het vergemakkelijkt de definitie van temporele parameters voor de studie, controles voor teleportatie nadat de studie is voltooid en de activeringstiming voor digitale output binnen het onderzoekskader.
   2. Gebruik de volgende toepassingen voor het verkrijgen van gegevens en gebruikerscontrole van het systeem terwijl het in werking is.
      1. [toepassing] VR: Gekoppeld aan het .XML bestand dat het representatieve landschap toont, opent u het bestand om een voorbeeld van het virtuele landschap op de monitoren in statische modus te bekijken. Open de gekoppelde configuratie voor dynamische interactie. XLSX-bestand in de besturingstoepassing.
      2. [application] control: Gekoppeld aan het .XSLX-bestand, open deze applicatie om de accessoire-apparaten te zien die aan het systeem zijn gekoppeld. Men kan de beloningsbuis handmatig uit- en intrekken, een vloeibare beloning uitdelen en vanaf hier realtime gegevensverzameling bekijken.
      3. [application] planning designer: deze applicatie biedt de mogelijkheid om XAML-bestanden aan te passen om een schema op te stellen voor het activeren van gebeurtenissen binnen het experiment. Ontwerp bijvoorbeeld een aanpasbare trigger om de duur van het uitdelen van beloningen te bepalen en de duur van pauzes tussen proeven voor muizen te bepalen.
3. Voorbeeld opstarten: Begin met te beslissen hoe het onderzoeksprotocol eruit zal zien op basis van de instelbare componenten uit de stappen 3.2.1.1-3.2.1.3. Nadat een operant protocol duidelijk is gedefinieerd, opent u een van de sjabloonexperimenten die vooraf zijn ingesteld bij het VR-systeem door de onderstaande stappen te volgen.
   1. Open de VR-toepassing, die wordt geopend naar de submap Gegevens. Sla het virtuele landschap op dat is gemaakt als een XML-bestand. Open dit bestand en het virtuele landschap zou op de VR-monitoren moeten verschijnen.
   2. Open de toepassing Control en navigeer naar het pictogram Map openen in de rechterbovenhoek van het scherm. Klik op het pictogram, dat de map Configuraties zou moeten openen, waar de bijbehorende . De experimentele configuratie van XLSX bevindt zich. Open de . XLSX-bestand met dezelfde naam als het .XML-bestand dat in de VR-applicatie is geopend. De gedefinieerde systeemaccessoires, zoals de pomp en motor voor het uitbreidbare beloningsapparaat, zijn nu zichtbaar onder het bedieningstabblad in de applicatie.
   3. Start de experimentele proef, aangezien de coördinatie tussen deze twee toepassingen het mogelijk maakt om een interactief virtueel landschap te creëren. Uiteindelijk vergemakkelijkt deze integratie het monitoren van essentiële gegevens, waaronder de afstand in het XY-vlak en het verzamelen van beloningen met tijdstempels.
4. Gegevensverzameling: Haal de meest waardevolle gedragsgegevens uit het systeem, dit zijn positionele gegevens en beloningen met tijdstempels. Deze gegevens worden afzonderlijk opgeslagen als logbestanden.
   1. Positiegegevens: Volg de onderstaande stappen om deze te verkrijgen.
      1. Om XY-positiegegevens met tijdstempel van de muizen te verkrijgen, opent u eerst het spreadsheetbestand van het doolhof met de gewenste gegevensverzameling. Plaats in tabel 1 de opdracht WriteVRAndCamInfoToFile in een van de cellen onder de andere in kolom A. Nu worden positiegegevens na een proefperiode automatisch opgeslagen als een gedateerd CSV-bestand (met de naam Log files-MM.DD.YYYY_VRandPathPos.csv) in de map configuraties.
      2. Om de positiegegevens na een proef te exporteren, sluit u de besturingstoepassing en worden de gegevens opgeslagen in een gedateerd CSV-bestand. Dit bestand bevat alle specifieke gegevens voor een bepaalde dag, dus zorg ervoor dat u handmatig noteert wanneer elk onderwerp op en van de bal is gehaald. Open het bestand en importeer het met behulp van de Unicode UTF-8-tekenset. Kolom A is gelabeld DateTime, klik met de rechtermuisknop op het tabblad A en klik op Cellen opmaken. Ga naar de tijd en klik op de optie MM/DD/JJJJ UU:MM: RV: optie. Nu wordt elke systeemgebeurtenis chronologisch gecatalogiseerd voor verdere gegevensanalyse.
   2. Beloningsgegevens: Volg de onderstaande stappen om deze te verkrijgen.
      1. Gegevens over de activering van de pomp (beloningsuitreiking) worden automatisch als gedateerde logbestanden in het systeem opgeslagen, zodat het niet nodig is om een commando in te voeren zoals bij de positiegegevens. Als u deze wilt openen, gaat u naar de submap Logbestanden van de map configuraties.
      2. Herhaal stap 3.4.1 voor positiegegevens voor de beloningsgegevens om de gegevens als een spreadsheetbestand te exporteren. Open de map met configuraties en selecteer het gedateerde beloningsbestand (met de naam Corridor- MM.DD.YYYY of Corridor_Linear_Run- MM.DD.YYYY) wanneer het in de map wordt weergegeven. Dit geeft de datum en tijd aan waarop de muizen de beloningen hebben verkregen, en men kan dit gebruiken bij verdere gegevensanalyse, afhankelijk van het paradigma dat ze hebben gebruikt.

4. Gedragsmatige taken

OPMERKING: In overeenstemming met gevestigde methodologieën in de gedragsneurowetenschappen, maken de geformuleerde taken gebruik van een op beloning gebaseerde associatieve leertechniek. Door onmiddellijke beloningen te gebruiken om specifiek gedrag te versterken, worden dieren effectief getraind om repetitieve taken uit te voeren, gefaciliteerd door de teleportatiemogelijkheid van VR. Binnen een virtueel gedragskader biedt teleportatiefunctionaliteit muizen de mogelijkheid om taken uit te voeren zonder de stress die gepaard gaat met fysieke manipulatie, waardoor tegelijkertijd de installatieduur wordt verkort die nodig is voor analoge taken in de echte wereld. Gebruik tijdens de trainingen gedimd rood bovenlicht binnen de experimentele setting. Deze voorzorgsmaatregel wordt aanbevolen vanwege de verminderde visuele waarnemingsgevoeligheid bij muizen voor rood licht, waardoor mogelijke interferentie met hun perceptie van de virtual reality (VR)-schermen wordt beperkt, in tegenstelling tot het gebruik van wit licht²².

1. Gewenning
   1. Begin de gewenning aan de sferische loopband op hetzelfde moment als hun gewenning aan vloeistofregulatie om de likbuis te associëren met de beloning met behulp van de correct getimede fysiologische motivatie. Een gewenningsperiode van drie dagen is aan te raden voordat u begint met de lineaire baantraining.
   2. Hanteer de muizen op de 1e^{dag gedurende} 5 minuten na het wegen. Tijdens deze interactie wordt geadviseerd om het implantaat van de hoofdstang voorzichtig vast te pakken terwijl de muizen zich in hun kooi bevinden, waardoor vertrouwdheid met dergelijke manipulatie ontstaat. Laat ze kennismaken met het gebied waar de VR op deze dag is gehuisvest, zodat ze kunnen anticiperen op de ruimtelijke omgeving waarin experimentele proeven zullen plaatsvinden. Deze eerste gewenningsdag valt samen met de start van de vochtregulatie van 15 ml per 100 mg lichaamsgewicht.
   3. Op de 2e^dag, die overeenkomt met de overgang naar de stap van 10 ml per 100 mg lichaamsmassa, behandelt u de muizen opnieuw gedurende 5 minuten. Ga door met het herhaaldelijk voorzichtig vastpakken van de hoofdstang terwijl u in de kooi zit. Bevestig de hoofdstang aan de houder terwijl de muizen zich 5-20 minuten vertrouwd kunnen maken met de bolvormige loopband, hetzij op een oneindig herhalende baan, hetzij zonder dat het softwareprogramma is geactiveerd. Dit vergemakkelijkt hun aanpassing aan de hoofdgefixeerde toestand. Er moet rekening mee worden gehouden dat muizen in deze periode afvalstoffen kunnen uitscheiden, die doorgaans afnemen over opeenvolgende sessies.
   4. Op de^3e dag, die overeenkomt met de laatste dag van het vloeistofregulatieparadigma (5 ml per 100 mg lichaamsgewicht), hanteert u de muizen gedurende 5 minuten. Bevestig ze vervolgens stevig aan de bolvormige loopband met luchtkussen en laat ze via de beloningsbuis kennismaken met vloeibare beloningen.
      1. Als je de liktuit aan naïeve muizen introduceert, zullen ze in het begin in verwarring raken, dus zorg ervoor dat de muis zich ervan bewust is dat ze uit de tube moeten drinken.
   5. Zonder al te krachtig te zijn, past u de positionering van de muisrichtlijnen hieronder toe en individualiseert u de positionering van de muis op de bal ten opzichte van de buis op een manier die de beloning op een comfortabele manier aan hen zal opleveren. Zorg er bij het starten voor dat de muizen uit de buis drinken; Dit zal bij de meeste muizen van nature gebeuren onder waterbeperkte omstandigheden wanneer ze vloeistof te drinken krijgen.
2. Positioneren van de muizen
   1. Pre-positionering: Voordat u de muis op de bal plaatst, verlengt u de gecentreerde beloningsbuis met een kleine druppel beloning aan de punt. Verleng de beloningsbuis voordat u de muis op de bal plaatst om mogelijk letsel te voorkomen als gevolg van het per ongeluk te ver naar voren uitschuiven van de buis zodra het hoofd van de muis is bevestigd. Breng de beloningsbuis 5-15 mm boven de sferische loopband omhoog, zodat het likken van de tuit een natuurlijke voorwaartse houding van het hoofd vereist.
   2. Hoofdfixatie: Om de muis met het hoofd te fixeren, plaatst u de muis op de dominante kant van de sferische loopband van de handler. Trek vervolgens, met behulp van de dominante hand van de handler, de muis aan de hoofdstang in de richting van het hoofdbevestigingsplatform. Plaats de hoofdstang in de gleuf die bedoeld is voor bevestiging, waarna u de niet-dominante hand van de handler gebruikt om de hoofdstang op zijn plaats te klikken.
   3. Locatie op de bal: Individualiseer de plaatsing op de bolvormige loopband voor elke muis, maar zorg ervoor dat ze aan de volgende vereisten voldoen om de motivatie voor het proeven van de beloning te garanderen en de algehele stressniveaus te minimaliseren.
      1. Lijn het midsagittale vlak van de muis af met het midden van de sferische loopband. In gevallen waarin de hoofdstang niet recht is, zorg er dan voor dat het midsagittale vlak van de muis, in plaats van de hoofdstang, in lijn is met het midden van de plaatsing. Zie figuur 3C voor visuele duidelijkheid.
      2. Zorg ervoor dat de achterpoten van de muis zich niet meer dan 11 cm van de top van de sferische loopband bevinden en dat het hoofd zich achter de top bevindt. Zorg ervoor dat alle vier de poten de loopband raken en dat de buik de loopband kan raken als de muis in rust is; Dit ondersteunt een goed looppatroon en stabiliteit op de bal om te rennen.
      3. Wanneer muizen niet rennen, wordt dit balweigering genoemd. Als de muizen blijven bevriezen en niet proberen te rennen, ervaren ze waarschijnlijk overmatige angst, en als de onderzoeker ervoor kiest om ze uit te sluiten van het experiment. In deze studie werd een kwantitatieve drempel van 5 dagen balweigering gebruikt om uitsluiting van de gegevens te bepalen.
   4. Zijvooringenomenheid: Wanneer muizen voor het eerst beginnen te wennen aan de trainingsroutine, zullen ze de ene kant boven de andere verkiezen. Dit kan de taakuitvoering verstoren, dus zorg ervoor dat een eventuele zijvoorkeur niet te wijten is aan asymmetrie in de manier waarop het dier op de bal is gemonteerd. De y-doolhoftaak die hier wordt gebruikt, vereist specifiek dat het dier zowel rechts- als linkse keuzes maakt om de beloningsafgifte te optimaliseren, wat het overwinnen van nevenvoorkeuren vergemakkelijkt.
   5. Beloningstuit: Deze benadering omvat een zachte manoeuvre die de kiss it-methode wordt genoemd, waarbij de muis naar de verlengde likbuis wordt geleid totdat zijn mond bijna de punt van de tuit raakt, waardoor een nauwkeurige levering van de beloning wordt gegarandeerd. Stel de duur van de verlengde beloningsbuis in op 1 s wanneer muizen beloningen ontvangen, zodat de muis voldoende tijd heeft om de druppel volledig te consumeren. Individualiseer de positionering van de liktuit voor elke muis, aangezien de grootte en voorkeurspositie voor elke individuele muis kunnen verschillen. Zorg ervoor dat de beloningsbuis gecentreerd blijft tijdens alle proeven voor standaardisatie van likken; De muis mag altijd verwachten de beloning op dezelfde fysieke locatie te ontvangen, ongeacht het ontwerp van het virtuele doolhof.
      OPMERKING: Hoewel de bepaling van deze duur ter beoordeling van de onderzoeker is, geven deze bevindingen aan dat dit tijdsbestek effectief was in het vergemakkelijken van volledige beloningsinname door de muis vóór het terugtrekken van de buis. Figuur 3B geeft een voorbeeld van een voorkeurspositionering voor plaatsing.
   6. Lineair spoor: In overeenstemming met eerdere studies die vergelijkbare methodologieën gebruikten, kunt u een lineaire spoortaak gebruiken om twee belangrijke onderzoeken te onderzoeken: de tijd die nodig is om muizen te trainen om een rechte gang te doorkruisen en het verwachte slagingspercentage van het verwerven van beloningen door muizen.
      1. Zorg ervoor dat muizen zijn gewend aan zowel het vloeistofbeperkingsparadigma als de experimentele hardware.
      2. Voer een dagelijkse sessie van 30 minuten uit om langs een lineaire virtuele gang te bewegen, beginnend met een lengte van 1 m. Als je het einde van de gang bereikt en de beloning voor suikerdruppels ontvangt, teleporteer je de muizen terug naar het startpunt.
      3. Bepaal een op criteria gebaseerde vooruitgang naar langere doolhoven (bijv. 1 m, 2 m, 3 m). Ga de muizen vooruit naar de volgende doolhoflengte nadat ze 2 opeenvolgende dagen gemiddeld 2 beloningen per minuut hebben ontvangen (Figuur 4A).
      4. Documenteer dagelijkse registraties van gegevens met tijdstempel over het ophalen van beloningen en de afstand die muizen op de sferische loopband hebben afgelegd voor verdere analyse (Figuur 4B-D).
      5. Voor muizen die gemiddeld 2 beloningen per minuut ontvangen op de 3 m lineaire sporen, markeer ze dan als bekwaam op het lineaire spoorparadigma. Het wordt aanbevolen dat muizen deze fase bereiken voordat ze overgaan tot complexere gedragstaken die besluitvorming vereisen.
   7. Complexe gedragstaken die besluitvorming vereisen (Y-Maze): Deze fase onderzoekt de haalbaarheid van de overgang van een eenvoudige naar een complexere gedragstaak die besluitvorming vereist. Om dit te bereiken, maakt u een bedachte Y-Maze-taak voor signaaldiscriminatie.
      1. Zorg er in dit Y-doolhofparadigma^23,24 voor dat de muizen naar een keuzepunt navigeren waar twee armen zich 45° in beide richtingen uitstrekken, zoals de vorm van een Y. Deactiveer de rotatie vanaf het startpunt van het doolhof tot het bereiken van het keuzepunt, twee armen van verschillende kleur, en activeer deze vervolgens binnen de beslissingszone om de muis in de gewenste richting te laten draaien.
      2. Bij binnenkomst in de arm die naar de beloningszone leidt, deactiveer je de rotatie opnieuw. Een zwarte arm vertegenwoordigt het juiste pad, terwijl een witte arm het verkeerde pad vertegenwoordigt. Gebruik de zwarte arm en de witte arm als aanwijzingen om rekening te houden met mogelijke beperkingen in de gezichtsscherpte van de muis, aangezien ze gemakkelijk te onderscheiden zijn, waardoor een onderzoek naar hun gebruik van visuele informatie in de eenvoudigste vorm wordt vergemakkelijkt.
      3. Train de muizen om naar de zwarte arm te navigeren om een suikerbeloning te krijgen, waarbij elke proef wordt afgesloten met het terugsturen van de muizen naar de startlocatie. Neem in het experimentele ontwerp een willekeurige verschuiving van de beloningslocatie tussen de linker- en rechterkant op, zodat muizen de beloning associëren met de visuele aanwijzingen in plaats van met de specifieke kant.
      4. Gebruik dezelfde stappen voor het instellen van het Y-doolhof als de lineaire gang. Spiegel de criteria voor progressie in het Y-doolhofparadigma aan die van de lineaire gang: elke proef duurt 30 minuten en muizen moeten gedurende 2 opeenvolgende dagen een vooraf bepaalde beloningsdrempel bereiken. Een drempel van 70% correct verworven beloningen wordt aanbevolen op basis van de gemiddelde prestaties van eerdere pilotcohorten in het Y-doolhof; het ligt boven de kansdrempel (50%) en het vertegenwoordigt een redelijk haalbaar percentage dat aangeeft dat muizen de taak begrijpen (Figuur 5A).
      5. Zorg er bij het bereiken van het keuzepunt voor dat de muis een van de juiste of verkeerde armen selecteert. Aan het einde van de arm teleporteer je hem terug naar het startpunt om het doolhof binnen een tijdsbestek van 30 minuten te herhalen.
      6. Deze benadering maakte gebruik van een op visuele psychofysica geïnspireerde benadering waarbij de doolhoven steeds moeilijker te onderscheiden werden. Volg de beschrijving hieronder voor de progressie in het Y-doolhof paradigma.
         1. Presenteer in het eerste Y-doolhof effen zwart-witte armen op het keuzepunt van het doolhof. Als de muis de zwarte arm correct heeft gekozen voor 70% van de proeven gedurende 2 opeenvolgende dagen, breng deze dan naar een volgend niveau met steeds uitdagendere discriminatietaken. Om dit te bereiken, introduceert u geleidelijk een extra 10% van de contrasterende kleur aan elke arm op elk niveau van progressie. Zet bijvoorbeeld de witte arm over naar een bestaande uit 90% wit en 10% zwart, en vice versa, waardoor discriminatie bij elke vooruitgang veeleisender wordt.
            OPMERKING: Het idee om te verhogen is dat als een 50% wit/zwart kan worden bereikt, dit een effectieve controle zou zijn omdat de armen niet van elkaar te onderscheiden zouden zijn. Het verste dat de muizen visueel konden discrimineren was echter 80%:20% (Figuur 5B).

Resultaten

Deze pilotstudie had tot doel methodologieën te schetsen voor de efficiënte training van muizen in twee verschillende taken: een eenvoudige gang en een complexe besluitvormingstaak (de Y-doolhof visuele discriminatietaak). Deze gegevens dienden als basis voor het opstellen van tijdelijke richtlijnen voor gedragstraining in VR.

De procedurele stappen beginnen met het schetsen van de chirurgische implantatie van de hoofdstang in figuur 1. Dit implantaat dient om de schedel van de muis te stabiliseren tijdens gedragsbeoordelingen, waardoor de precisie van neurale opnames wordt verbeterd, vooral wanneer het wordt gebruikt in combinatie met elektrofysiologie of beeldvormingstechnieken.

Figuur 2 en Figuur 3 illustreren de hardwarecomponenten en de opzet van het experimentele systeem. Figuur 2 geeft een overzicht van het waterafgiftesysteem, dat gebruik maakte van een petrischaalfonteinmethode. Dit omvatte het bevestigen van een petrischaal van 60 mm x 15 mm met de holle kant naar beneden op de vloer van de kooi, het bevestigen van een kleinere petrischaal van 35 mm x 10 mm met de holle kant naar beneden in het midden van de grotere schaal, en het plaatsen van een andere petrischaal van 60 mm x 15 mm met de holle kant naar boven op de kleinere schaal om als waterreservoir te dienen. De hoogte van de bovenste schotel werd zorgvuldig aangepast om besmetting door strooisel te voorkomen en ervoor te zorgen dat muizen gemakkelijk toegang hadden tot water.

Figuur 3 toont de richtlijnen voor systeemhardware en muispositionering. Figuur 3A toont de VR-opstelling, met een array van zes schermen met een bolvormige loopband die centraal was geplaatst. Figuur 3B toont de optimale plaatsing van de muis op de loopband, met het hoofd uitgelijnd in een natuurlijke positie en alle vier de poten in contact met het oppervlak. Figuur 3C vergelijkt de juiste en onjuiste plaatsing van de muis ten opzichte van de hoofdbalk, waarbij wordt benadrukt dat het midsagittale vlak van de muis gecentreerd moet zijn, in plaats van uitgelijnd met de hoofdbalk zelf.

Figuur 4 toont beloningsacquisitiecurves op een lijngrafiek, die de verwachte leerperioden illustreert voor smalle gangen van 1 m, 2 m en 3 m in VR op basis van vooraf gedefinieerde parameters voor voortgang. Het geeft de gemiddelde snelheden van muizen over de respectieve baanlengtes weer, waarbij een geleidelijke toename van de snelheid wordt aangetoond als bewijs van het leren en verbeteren van taken in overeenstemming met de toegenomen moeilijkheidsgraad. Er wordt ook een staafdiagram weergegeven dat het gemiddelde aantal dagen illustreert dat muizen nodig hebben om het criterium voor de lineaire sporen te bereiken, evenals een staafdiagram met de gemiddelde snelheden voor elke baanlengte. Hierna worden ook de progressieve stadia van de lineaire baantaak die de muizen hebben geleerd, geïllustreerd. Deze taken zijn ontworpen om methodologieën te repliceren die in de academische literatuur zijn vastgesteld, terwijl ze zorgen voor een leercurve die haalbaar is voor muizen, waardoor hun vooruitgang door de niveaus wordt vergemakkelijkt.

Ten slotte geeft figuur 5 gegevens met betrekking tot de Y-Maze-taak. De figuur illustreert het progressieve karakter van de taak, te beginnen met een duidelijk onderscheid tussen effen zwarte en witte armen. Deze eerste fase dient als een fundamentele stap, waarbij het vermogen van de muizen wordt vastgesteld om onderscheid te maken tussen contrasterende visuele signalen. Latere niveaus van de taak introduceren toenemende complexiteit door extra percentages van de contrasterende kleur aan elke arm toe te voegen, waardoor het onderscheidingsvermogen van de muizen verder wordt uitgedaagd. De geleidelijke toename van de moeilijkheidsgraad van de taak wordt geïllustreerd door de overgang van effen zwarte en witte armen naar armen die voor 90% uit de ene kleur en 10% uit de andere bestaan. Met name de gegevens in figuur 5 geven aan dat hoewel de nauwkeurigheid van discriminatie verbetert met elk niveau van progressie, sommige muizen consequent een drempel van visueel onderscheidingsvermogen vertonen, met een maximum van 80%/20% blank/zwart discriminatie. Deze observatie onderstreept de beperkingen die inherent zijn aan het visuele onderscheidingsvermogen van de muizen binnen de context van de Y-Maze-taak, en biedt waardevolle inzichten in de haalbaarheid van de taak en de cognitieve capaciteiten van de proefpersonen. Vervolgens worden de progressieve fasen van de Y-doolhofbaantaak, die zijn ontworpen om aan te sluiten bij gevestigde methodologieën in de literatuur, gedetailleerd. Deze fasen zorgden voor een haalbare leercurve voor de muizen en ondersteunden hun geleidelijke vooruitgang door de niveaus.

Figuur 1: Chirurgische instructies voor de implantatie van de hoofdstang. (A) De incisieplaats is gemarkeerd op de schedel van de muis. (B) De schroeven moeten 1 mm links van de interfrontale hechtdraad iets onder het bregma en 3 mm rechts van de interfrontale hechting iets boven de lambda worden geïmplanteerd. (C) De hoofdstang moet langs de interfrontale hechting worden geplaatst. (D) Breng tandheelkundig cement aan op het implantaat van de hoofdstang. (E) Daadwerkelijke visualisatie van de kopstang na het aanbrengen van tandheelkundig cement. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Watertoevoersysteem met behulp van een petrischaalfonteinmethode. Een petrischaal van 60 mm x 15 mm werd concaaf naar beneden op de vloer van de kooi bevestigd. Een kleinere petrischaal van 35 mm x 10 mm was gecentreerd op de grotere schaal, met een andere petrischaal van 60 mm x 15 mm die er concaaf bovenop werd geplaatst om als reservoir te dienen. Deze opstelling zorgde ervoor dat het water niet verontreinigd was door strooisel en toegankelijk was voor de muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Systeemhardware en positionering van de muisrichtlijnen. (A) Dit geeft de gebruikte VR-opstelling weer. Er werd gebruik gemaakt van een opstelling met zes schermen, waarbij de bolvormige loopband in het midden werd geplaatst. (B) Zijaanzicht van optimale muisplaatsing op de sferische loopband. De kop van de muis bevindt zich in een natuurlijke positie, terwijl alle vier de poten op de bolvormige loopband staan. (C) Bovenaanzicht van de juiste versus onjuiste plaatsing van de muis ten opzichte van de hoofdbalk. Voor een correcte plaatsing moet het midsagittale vlak van de muis gecentreerd zijn in plaats van de hoofdstang zelf. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Lineaire spoorgegevens. (A) De gepresenteerde gegevens geven de dagelijkse beloningen weer die binnen elke proefperiode van 30 minuten zijn verzameld. Muizen gingen over op langere baanlengtes zodra ze een gemiddelde van 2 beloningen per minuut behaalden gedurende 2 opeenvolgende dagen, in totaal 60 beloningen (drempel). (B) Naarmate muizen vaardigheid verwierven in de taak, vertoonden hun snelheden een geleidelijke toename, een indicatie van de doeltreffendheid van beloningsversterking. De grafiek illustreert de gemiddelde dagelijkse snelheid van elke muis op de baan in cm/s, en geeft een lineaire progressie in aangeleerd gedrag weer. (C) Dit staafdiagram illustreert de duur die elke muis nodig heeft om vaardigheid te verwerven op individuele spoorlengtes, met de respectieve gemiddelden en standaardfouten weergegeven voor elke spoorlengte. (D) Dit staafdiagram toont de gemiddelde en standaardfout van de gemiddelde dagelijkse snelheden die door elke muis worden bereikt over verschillende baanlengtes. De bijna lineaire progressie suggereert een aangeleerde verbetering van de loopsnelheid. (E) Dit illustreert de voortgang van de lineaire spoortaak, waarvoor 2 opeenvolgende proefdagen van 60 beloningen nodig zijn voordat je naar een langere versie van het doolhof gaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Y-Maze gegevens. (A) Dit toont de verdeling van beloningen die in verschillende stadia van de Y-doolhofprogressie zijn verkregen. Deze analyse richtte zich uitsluitend op een subset van vier muizen die alle fasen van het lineaire traject voltooiden, waardoor een billijke vertegenwoordiging van zowel mannelijke als vrouwelijke deelnemers werd gegarandeerd. (B) Deze visuele weergave illustreert de stadia van de Y-Maze-taak, waarin muizen vooruitgaan na het bereiken van twee opeenvolgende dagen met 70% juiste keuzes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Deze studie maakte gebruik van een alomvattende benadering om de gedragsreacties van muizen in VR-omgevingen te onderzoeken, met de nadruk op de implementatie van chirurgische procedures, vloeistofbeperkingsprotocollen, systeeminstellingen en gedragstaken. Deze bevindingen dragen bij aan het veld door procedurele details, tijdschema's voor training en slagingspercentages te bieden. Dit zal een effectievere acceptatie van VR-procedures bij muizen mogelijk maken en de planning en implementatie vergemakkelijken voor laboratoria die geïnteresseerd zijn in het gebruik van deze procedure in hun onderzoek.

De chirurgische implantatie van hoofdstangen was essentieel voor het faciliteren van gedragsexperimenten met het hoofd in VR-omgevingen. Door de vastgestelde protocollen zorgvuldig te volgen en de juiste postoperatieve zorg te bieden, werd de succesvolle integratie van hoofdstangen verzekerd en werden de nadelige effecten op de gezondheid en het gedrag van de dieren tot een minimum beperkt. Bovendien werden vochtbeperkingsprotocollen geïmplementeerd om de waterinname te reguleren en de hydratatie en dorst van de muizen op peil te houden. Het geleidelijke acclimatiseringsproces en de periodieke toegang tot water waren cruciaal om het welzijn van de dieren te waarborgen en tegelijkertijd de uitvoering van gedragstaken te vergemakkelijken.

De opzet van het VR-gedragssysteem omvatte de integratie van hardware- en softwarecomponenten om meeslepende virtuele omgevingen voor de muizen te creëren. Het gebruik van volledig meeslepende virtuele displays, beloningssystemen voor vloeistoffen, piepschuimballen als bolvormige loopbanden en hoofdhouders maakte nauwkeurige controle over experimentele omstandigheden en gegevensverzameling mogelijk. Gedragstaken, waaronder de paradigma's van het lineaire spoor en het Y-doolhof, zijn zorgvuldig ontworpen om belangrijke aspecten van het gedrag van muizen te onderzoeken, zoals voortbeweging, besluitvorming en beloningsverwerking.

Ondanks de inspanningen om experimentele procedures te optimaliseren, kwamen er tijdens het onderzoek verschillende uitdagingen voor. Variabiliteit in individuele muisreacties en technische problemen met betrekking tot hardware- en software-integratie vormden een uitdaging voor het verzamelen en analyseren van gegevens. Bovendien vereiste het vertrouwen op vochtbeperkingsprotocollen een zorgvuldige monitoring van de hydratatiestatus van het dier en aanpassing van experimentele procedures dienovereenkomstig. Soms hadden muizen moeite als ze op de bal werden geplaatst, dronken ze niet uit de beloningstuit, of bevroor ze en renden ze niet op de bal. Hoewel sommige van deze uitdagingen tijdelijk kunnen zijn, is het van cruciaal belang om de muizen te monitoren om ervoor te zorgen dat ze geen belemmeringen ervaren in hun voortgang. Muizen die geen vooruitgang vertonen in vergelijking met hun leeftijdsgenoten, moeten uit het onderzoek worden teruggetrokken. Bij een soortgelijk experiment werden 4 van de 55 muizen verwijderd vanwege hun onvermogen om het paradigma²⁵ te leren. Muizen die gedurende 5 opeenvolgende dagen consistente immobiliteit op de bal vertoonden, werden uitgesloten van het onderzoek na grondige beoordelingen van hun gewicht, het vermogen om toegang te krijgen tot de beloningstuit om te drinken en positionering op de bal om ervoor te zorgen dat er geen onderliggende problemen aanwezig waren. In deze gevallen is het aan het oordeel van de onderzoeker om te beslissen welke strategie hij moet volgen om het onderzoek efficiënt te hervatten.

Deze trainingsprotocollen zijn ontworpen om de muizen geleidelijk uit te dagen en tegelijkertijd hun vaardigheid in het uitvoeren van gedragstaken te waarborgen. Criteria voor progressie van het lineaire spoor naar het Y-doolhofparadigma waren gebaseerd op het vermogen van de muizen om vooraf bepaalde prestatiedrempels te halen, zoals het behalen van opeenvolgende dagen van succesvolle proeven en het verwerven van beloningen. De implementatie van rigoureuze trainingsprotocollen stelde ons in staat om de gedragscapaciteiten en het aanpassingsvermogen van de muizen aan steeds complexere taken te beoordelen. Deze zorgvuldig gestructureerde protocollen bieden een robuust kader voor onderzoekers op het gebied van gedragsneurowetenschappen en bieden een systematische benadering voor het evalueren en trainen van dieren voor diverse experimentele paradigma's. Door duidelijke criteria voor progressie te schetsen, kunnen onderzoekers de leercurve van proefpersonen efficiënt meten en dienovereenkomstig trainingsparadigma's samenstellen. Bovendien bevordert deze methodologische benadering de reproduceerbaarheid en standaardisatie van experimenten, waardoor vergelijkende analyses worden vergemakkelijkt en het begrip van cognitieve processen en leermechanismen in diermodellen wordt bevorderd.

Bij het ontwerpen van een VR-paradigma voor muizen is het van cruciaal belang om het scala aan beschikbare benaderingen met betrekking tot taakcomplexiteit en trainingsprogressie te herkennen. Dit protocol biedt een breed kader voor het construeren van een experimenteel ontwerp, maar het blijft aan de onderzoeker om specifieke aspecten zoals beloningstoediening, biascontrole, stimulustype, taakprogressie en systeemparameters aan te passen aan de behoeften van het onderzoek. Sommige studies kiezen bijvoorbeeld voor een meer gestroomlijnde aanpak, waarbij de nadruk ligt op onmiddellijke taakbetrokkenheid. Een voorbeeld is Krumin et al. die een enkele, consistente T-doolhoftaak implementeerden in plaats van een progressief leerregime tussen verschillende taken toe te passen. Andere studies bieden daarentegen diverse componenten voor het ontwerpen van onderzoeken, zoals strategieën voor stimulusversterking en auditieve signalen. De studie gebruikte auditieve feedback als straf voor onjuiste proeven en gaf alleen water als beloning voor correcte proeven²⁶. Omgekeerd gebruikten Zhao et al. een sucrose-oplossing van 10% als beloning voor correcte proeven en namen ze geen enkele vorm van straf op voor onjuiste proeven²⁷. In plaats daarvan concentreerden ze zich op het verminderen van onjuiste reacties door middel van methoden zoals anti-bias training, waarbij de kans werd vergroot dat de cue-richting werd gewijzigd van de vorige keuze van het dier en de dagelijkse watertoelage werd aangepast om de motivatie te vergroten. Verschillen in experimenteel ontwerp, zoals de aanwezigheid van ruimtelijke aanwijzingen tijdens de taak, kunnen leiden tot verschillende interpretaties van neurale codering, zoals blijkt uit Zhao et al. het vinden van posterieure pariëtale cortexcelselectiviteit verklaard door trajecten en ruimtelijke voorkeuren, in tegenstelling tot de waargenomen keuze-afhankelijke activeringssequenties van Harvey et al. ^27,28. Het is belangrijk op te merken dat de specifieke hardware die werd gebruikt zes LCD-monitoren, een uitschuifbare liktuit en een loopband van piepschuim met luchtkussen omvatte. Er zijn een aantal verschillen tussen virtual reality-systemen in laboratoria, waaronder het gebruik van projectoren²⁹ versus computermonitoren, niet-sferische loopbanden³⁰ en vaste¹⁰ versus uitschuifbare liktuitten.

Concluderend biedt deze studie waardevolle inzichten in de gedragsreacties van muizen in VR-omgevingen en toont het de haalbaarheid aan van het gebruik van immersieve technologie om complex gedrag te onderzoeken. Toekomstige onderzoeksinspanningen kunnen zich richten op het verfijnen van experimentele protocollen, het verkennen van neurale mechanismen die ten grondslag liggen aan besluitvormingsprocessen en het vertalen van bevindingen naar klinische toepassingen. Door het begrip van muizengedrag te blijven vergroten, kunnen wetenschappers de neurale circuits en cognitieve processen die ten grondslag liggen aan complex gedrag in zowel gezondheid als ziekte verder ophelderen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2.4 mm Schroeven (00-96 X 3/32)	Protech International	8L0X3905202F	Voor extra stabiliteit van de kopbal
Bupivacaine	Hospira	NDC:0409-1162-19	Lokaal anestheticum
Buprenorfine	Wedgewood Pharmaceuticals	SKU: BUPREN-INJ010VC	Analgesie
Buzzers	Wahl	1565q	Voor het scheren van het chirurgische gebied
Boor- en micro-injectierobot	Neurostar	17129-IDA	Stereotaxie
GLUture	Zoetis	32046	Chirurgisch hechtmiddel
Hoofdbal implantaat	Luigs-Neumann	130060	Muis hoofd implantaat
Verwarmingspad (Lectro-Kennel)	K&H Manufacturing	100212933	Postoperatief
Hemostaten	World Precision Instruments	501291	Chirurgisch gereedschap
Waterstofperoxide	Swam	L0003648FB	Reinigingsmiddel
Isofluraan	Dechra	B230008	Chirurgisch inhalatie-anestheticum
Isofluraan/O2-toedieningsapparaat met Nosecomb-bevestigingen	Eagle Eye Anesthesia Inc.	Model 50 Anesthesie	Chirurgisch apparaat
Metabond	Parkell	CB-S380	Klevende cement
Microschaar	Fine Science Tools	15000-08	Chirurgisch gereedschap
Zuurstof	Praxair	UN1072	Chirurgische zuurstof
Povidon-jodium Swabstick	Dynarex	g172095-05	Chirurgisch gereedschap
Saline	Hospira	NDC:0409-1966-02	Hydratiemiddel
Steriele katoenen applicator met punt (Q-tips)	Puritan	25-806 2WC	Chirurgisch gereedschap
Sucrose	Fisher Chemical	CAS 57-50-1	Primaire bekrachtiging/Motivator/Beloning
Pincet	World Precision Instruments	504505	Chirurgisch gereedschap
Virtual Reality Systeem	PhenoSys	JetBall-TFT	De JetBall, een luchtgedempte sferische loopband, laat een dier moeiteloos navigeren in een virtuele wereld die op 6 omringende monitoren wordt geprojecteerd.
Witte vaseline oogzalf oogzalf	AACE Pharmaceuticals	NDC:71406-124-35	Eyelube