Methodenartikel

Goedkope Polyethyleentereftalaat Laminering Microfluidics Ontwerpen voor Gemultiplexte Zebravis Beeldvorming

DOI:

10.3791/67313

⸱

27 september 2024

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Bindley Bioscience Center, Purdue University, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een innovatieve methode voor het vervaardigen van microfluïdische apparaten met behulp van polyethyleentereftalaat (PET) laminering vermindert de kosten en complexiteit van het vangen en afbeelden van meerdere levende zebravisembryo's aanzienlijk.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebravisembryo's zijn transparant en dus bij uitstek geschikt voor niet-invasieve intravitale beeldvorming van fundamentele processen, zoals wondgenezing en migratie van immuuncellen. Microfluïdische apparaten worden gebruikt voor insluiting ter ondersteuning van langdurige beeldvorming van meercellige organismen, waaronder zebravissen. De fabricage van deze apparaten met behulp van zachte lithografie vereist echter gespecialiseerde faciliteiten en competentie op het gebied van 3D-printen, die mogelijk niet voor elk laboratorium toegankelijk zijn. Onze aanpassing van een eerder ontwikkelde, goedkope lamineermethode voor polyethyleentereftalaat voor het bouwen van microfluïdische apparaten verhoogt de toegankelijkheid door ontwerp, fabricage en iteratie mogelijk te maken voor een fractie van de technische investering van conventionele technieken. We gebruiken een apparaat dat met deze methode is gemaakt, de Rotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing (RADISH), voor medicamenteuze behandeling, handmatige verwonding en langdurige beeldvorming van maximaal vier embryo's in hetzelfde gezichtsveld. Met dit nieuwe ontwerp leggen we met succes de grove morfologische kenmerken vast van het calciumsignaal rond laserablatie en handmatige transsectiewonden voor meerdere embryo's in de 2 uur onmiddellijk na het letsel, evenals de rekrutering van neutrofielen naar de wondrand gedurende 24 uur.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen om adequaat te reageren op letsel is van cruciaal belang voor het voortbestaan van elk organisme op elke schaal, van een enkele cel tot meerdere weefsels. Verwonding en de daarmee samenhangende reacties, zoals rekrutering van fagocyten naar beschadigde gebieden1 zijn daarom belangrijke onderwerpen in de cel- en weefselbiologie. Wonden worden onmiddellijk gedetecteerd nadat de weefselbarrière is doorbroken, waardoor een weefselgradiëntrespons ontstaat met wondcontractie 2,3 die wondgenezing en daaropvolgende hergroei coördineert4. Vanwege de mechanische aard van deze samentrekking mogen gereedschappen die tijdens het experimenteren worden gebruikt, de beweging van cellen in de buurt van de plaats van de verwonding niet fysiek belemmeren.

Zebravisembryo's zijn een uitstekend model voor het bestuderen van ontwikkeling en ziekte, inclusief de wondrespons van gewervelde dieren, vanwege hun onderhoudsgemak, genetische traceerbaarheid en optische transparantie 5,6. Het is echter nodig om het hele organisme voor een langere periode te immobiliseren om het gedrag van cellen in de buurt van een verwondingsplaats op langere termijn te bestuderen. Het inbedden van embryo's in agarose met een laag smeltpunt is voldoende voor kortstondige beeldvorming van niet-gewond weefsel. De omringende gelmatrix beperkt echter de samentrekking en ontspanning van wonden en belemmert de groei van de zich ontwikkelende embryo's in de loop van de tijd 7,8,9.

Microfluïdische apparaten kunnen zebravisembryo's immobiliseren in verschillende ontwikkelingsstadia 10,11,12,13,14,15,16, en sommige, zoals de zWEDGI 7, zijn geschikt voor handmatige verwonding. Er zijn echter verschillende nadelen aan beschikbare apparaatontwerpen. Veel apparaten die rechtstreeks op plastic zijn geprint, zijn bijvoorbeeld niet compatibel met beeldvorming op omgekeerde microscoopsystemen vanwege de slechte optische transparantie. Bovendien maken parallelle kanalen multipositionele beeldvorming mogelijk10,11, maar de fysieke beweging van de microscooptrap zorgt voor vertraging in de beeldacquisitie. Herhaalde iteratie en optimalisatie om deze problemen op te lossen zijn moeilijk als we kijken naar de financiële en technische investeringen die nodig zijn voor elk nieuw ontwerp, vooral voor de huidige gouden standaardmethoden voor de fabricage van apparaten met behulp van polydimethylsiloxaan (PDMS) zachte lithografie. De allereerste stap, het maken van een mastermatrijs, vereist vaak kennis van 3D-modelleringssoftware, toegang tot gespecialiseerde fabricageapparatuur en (afhankelijk van het gebruikte materiaal) een aanvullende antiadhesiebehandeling zoals silanisatie voordat de mal ooit wordt gebruikt. Het uitharden van de PDMS na het gieten duurt minstens een uur bij hoge temperaturen en moet over het algemeen onder een vacuüm of met een klem worden gedaan voor het beste resultaat, vaak in een cleanroom 7,17,18. Net als in de ontwikkelingsbiologie kunnen deze kosten snel onbetaalbaar blijken te zijn voor experimenten die veel unieke microfluïdische omgevingen in meerdere modellen vereisen.

Van de beschikbare alternatieve bouwmaterialen is polyethyleentereftalaat (PET) duurzaam, niet-toxisch en gemakkelijk te manipuleren. PET-vellen zijn algemeen verkrijgbare plastic lamineerzakjes die in de meeste winkels voor kantoorbenodigdheden worden gedragen, met vooraf aangebrachte thermisch geactiveerde lijm (meestal ethyleenvinylacetaat). Door deze PET-platen vorm te geven met behulp van in de handel verkrijgbare ambachtelijke snijders (d.w.z. computergestuurde snijplotters die zijn ontworpen voor hobbygrafen) en de lagen aan elkaar te hechten met behulp van standaard thermische lamineerapparatuur, kan een breed scala aan potentiële ontwerpen snel worden gegenereerd en herhaald. Daarom hebben wij een eerder beschreven ontwerp- en constructiemethode met gestapeld PET18 aangepast om het Rotationele Asistant te creëren voor de productie van Subsequent Healing (RADIS) (Figuur 1A,B). Een roterende opstelling van verschillende ongeveer wigvormige beperkende kanalen optimaliseert de nabijheid en biedt ruimte voor handmatige overdracht van de staartvin, waardoor beeldvorming onmiddellijk na verwonding mogelijk is en gelijktijdige langdurige beeldvorming van meerdere gewonde zebravisembryo's binnen hetzelfde gezichtsveld. Bovendien vermindert deze constructiemethode de initiële kapitaalkosten en de tijd die nodig is voor de constructie van het apparaat drastisch, terwijl de herbruikbaarheid behouden blijft.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie gebruikte embryo's van 3 dagen na de bevruchting (dpf), maar kan worden ontworpen om embryo's van 2-14 dpf te gebruiken. Het zebravisexperiment werd uitgevoerd volgens internationaal aanvaarde normen. Het protocol voor dierenverzorging en -gebruik is goedgekeurd door het Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), in overeenstemming met de richtlijnen voor het gebruik van zebravissen in het NIH Intramural Research Program (protocolnummer: 1401001018).

1. Assemblage van het PET-microfluïdische apparaat

OPMERKING: Elk deel van dit protocol kan op elk moment worden gepauzeerd, met uitzondering van de stappen 1.8 en 1.9, die gevoelig zijn voor de droogtijd van cyanoacrylaat.

  1. Ontwerp het patroon voor het apparaat in de software van uw keuze (bijv. Adobe Illustrator, Figuur 1A). Afhankelijk van de leeftijd en grootte van het embryo, past u de breedte van het kanaal en de grootte van de centrale beeldvormingskamer aan voor de beste pasvorm.
    1. Sla elke laag op als een afzonderlijk afbeeldingsbestand met identieke afmetingen. Geef elk bestand een naam zodat de dikte van de te gebruiken plaat en de volgorde van montage duidelijk zijn.
  2. Initialiseer de snijmachine volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Upload elk ontworpen patroon naar de ontwerpsoftware om te snijden.
    1. Selecteer in de ontwerpwerkruimte de nieuw geüploade ontwerpen. Groepeer patronen bedoeld voor dezelfde dikte PET-plaat samen in dezelfde snede (Figuur 2A). Pas indien nodig de grootte van de patronen in de ontwerpsoftware aan op de juiste afmetingen.
    2. Bevestig het aantal en het type patronen in de snede en selecteer vervolgens het gesneden materiaal.
      OPMERKING: PET-vellen zijn mogelijk geen materiaalkeuze in de ontwerpsoftware, ook niet onder namen als 'plastic lamineerzak'. In plaats daarvan kan elk materiaal met een vergelijkbare dikte en textuur (bijv. transparantievellen of niet-klevend vinyl) worden geselecteerd.
    3. Bevestig de PET-vellen aan de snijmat, druk stevig aan om luchtbellen te verwijderen en laad de mat in de snijmachine. Volg de instructies op het scherm om de snijmachine te vragen met knippen.
    4. Verwijder de voltooide sneden van de snijmat. Pas indien nodig snijpatronen aan met een hobbymes of scalpelmes.
      OPMERKING: De afbeeldingsbestanden die zijn gebruikt om het RADISH-ontwerp te maken (Afbeelding 1A) kunnen worden gedownload als vector- en PNG-bestandsindelingen (aanvullend bestand 1). Als de snijmachine de PET-plaat optilt, scheurt of niet netjes snijdt, overweeg dan om de snijmat te vervangen.
  4. Lijn de lagen uit op dekglaasglas, zonder hulp of met voorgesneden registratiemarkeringen. Als meerdere lagen op hun plaats kunnen worden bevestigd voordat ze worden gelamineerd, lijnt u ze tegelijkertijd uit.
  5. Zet de lagen vast met kantoortape om verschuiven tijdens het lamineren te voorkomen (Figuur 2B). Afhankelijk van de grootte van het apparaat en de capaciteit van de lamineermachine, monteert u kleine ontwerpen op een grotere achterkant met meer tape om te voorkomen dat de lamineermachinetoevoer vastloopt of verstopt raakt (Afbeelding 2C).
    OPMERKING: De achterkant die bij het lamineren wordt gebruikt, is NIET hetzelfde als de snijmat en dient voornamelijk om tractie voor de lamineermachine te bieden. Elk hittebestendig materiaal van verwaarloosbare dikte zal als drager werken (inclusief, maar niet beperkt tot, karton, gevouwen kantoorpapier of een groter PET-vel).
  6. Zet de lamineermachine en het laminaat aan volgens de instructies van de fabrikant. Verwijder de kantoortape voordat u de volgende laag uitlijnt (Figuur 2D).
  7. Herhaal stap 1.4 tot en met 1.6 totdat alle lagen zijn vastgeplakt.
  8. Bevestig het apparaat op een schaal van 35 mm die is geboord met een gat van 3/4" met cyanoacrylaatlijm (Figuur 2E,F). Pas de vorm en het type van de schaal aan volgens de experimentele behoeften (bijv. elke container die groot genoeg is om het apparaat te huisvesten - één putje in een bord met 24 putjes of een grotere petrischaal). Gebruik voldoende lijm om het apparaat volledig af te dichten op de schaal zonder deze onder water te zetten.
    NOTITIE: Het bevestigen van het apparaat aan een houderschaal is niet vereist voor de werking van het apparaat. LET OP: Cyanoacrylaat verbindt huid en ogen binnen enkele seconden en irriteert de luchtwegen, ogen en huid. Draag hand- en oogbescherming en werk in een goed geventileerde ruimte.
  9. Maak het PET-laminaat waterdicht door de buitenste randen van het apparaat grondig te coaten met cyanoacrylaatlijm (Afbeelding 2F). Gebruik voldoende lijm om de buitenranden volledig te bedekken. Laat de lijm minimaal 2 uur uitharden voor gebruik.
    NOTITIE: Zorg voor voldoende ruimte voor cyanoacrylaatdampen om te ontsnappen. Door de ophoping van dampen kan cyanoacrylaat zich op het apparaat afzetten, waardoor optisch transparant materiaal wordt verborgen.

2. Positionering van de embryo's in de radijs en voorbereiding op beeldvorming

  1. Kweek zebravisembryo's op in het standaard embryo-opfokmedium E319. Indien nodig, dechorionaat embryo's ten minste 1 uur voor de beeldvorming om ze plat te laten maken. Dit experiment gebruikte embryo's van 3 dpf, maar embryo's kunnen tot 14 dpf zijn (Figuur 1E).
  2. Kleuring of behandel de embryo's volgens experimentele behoeften.
    OPMERKING: In deze experimenten werden celmembranen van de buitenste epitheellaag waar relevant gekleurd door te incuberen met 100 nM MemGlow 560.
  3. Verdoof embryo's met 164 mg/L MS-22220.
    OPMERKING: De exacte concentratie en het gebruikte anestheticum kunnen worden aangepast aan de voorkeur van de onderzoeker. De anesthesieconcentratie kan worden verlaagd om een succesvolle ontwikkeling tijdens langetermijnbeelden mogelijk te maken (zie stap 4.1).
  4. Vul de houderschaal met het gemonteerde apparaat met 5 ml E3 met 164 mg/l MS-222.
  5. Breng met behulp van een transferpipet een verdoofd embryo aan in elke bewaarkamer van het apparaat. Zorg ervoor dat de embryo's tijdens de beeldvorming ondergedompeld blijven in vloeistof.
    OPMERKING: Het radijsontwerp kan 1-4 embryo's immobiliseren.
  6. Richt de embryo's met behulp van een haarlus zo dat de staart van het embryo in de centrale beeldkamer uitsteekt en de dooier stevig wordt geïmmobiliseerd in het wigvormige kanaal (Figuur 1C).
    OPMERKING: Het oriënteren van embryo's kan onder een stereomicroscoop worden uitgevoerd om manipulatie te vergemakkelijken.
  7. Zet desgewenst de kop van het embryo vast door met een micropipet 1,5% laagsmeltende agarose in de bewaarkamer toe te voegen.
  8. Verplaats het apparaat met embryo's naar het beeldvormingssysteem van uw keuze om de beeldvorming te starten.

3. Beeldvorming van calciumtransiënten na verwonding

OPMERKING: Dit gedeelte en hoofdstuk 4 zijn optioneel en worden geleverd als mogelijke voorbeeldexperimenten.

  1. Selecteer het juiste systeem en doel voor beeldvorming.
    OPMERKING: Hier was een omgekeerde laserscanning confocaal uitgerust met een 20x objectief.
  2. Pas de focus- en beeldvormingsparameters van het monster aan (bijv. laservermogen: 5, versterking: 90, pinhole-grootte: 2 AU, belichtingstijd [scansnelheid: 1 frame/s]) voor een optimale signaal-ruisverhouding en acquisitiesnelheid.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om monsters vooraf te scherpstellen en de parameters voor elk kanaal op het beeldvormingssysteem van keuze aan te passen voordat ze worden verwond om de vertraging tussen wondvorming en beeldacquisitie te verminderen.
  3. Wond een Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt1821,22 embryo.
    1. Om het embryo via handmatige transsectie te wonden, oefent u onder een stereomicroscoop druk uit met een scalpelmes over het staartvinweefsel aan het uiteinde van het notochord (Video 1) en brengt u het apparaat vervolgens terug naar het podium.
      LET OP: Als u overmatige druk uitoefent met het scalpelmes, kan het onderliggende glas barsten. Als het glas barst, gooit u het apparaat weg en start u opnieuw vanaf stap 1.2.
    2. Om het embryo via laserstimulatie te wikkelen, definieert u een interessegebied (ROI) nabij de rand van de staartvinvouw en stimuleert u dit op basis van het beschikbare laservermogen.
      OPMERKING: Hier was een laservermogen van 2,4 W gedurende 30 s bij 800 nm voldoende om een wond over de volledige dikte te veroorzaken.
  4. Beeld bij kamertemperatuur met behulp van GFP (excitatie 488 nm, emissie 510 nm) en RFP- (excitatie 561 nm, emissie 610 nm) kanalen met een frame-interval van 1 minuut voor een totaal van 1 uur.
  5. (Optioneel): Indien nodig, laat de embryo's vrij voor het ophalen na beeldvorming via zachte afzuiging in de buurt van het hoofd met behulp van een transferpipet of het ronddraaien van de schaal.

4. Beeldvorming van de rekrutering van neutrofielen na verwonding

  1. Breng de embryo's ten minste 1 uur voor de beeldvorming over naar E3 met de helft van de standaardconcentratie anesthesiemiddel, in dit geval 82 mg/L MS-222.
  2. Selecteer het juiste objectief voor beeldvorming (hier een omgekeerde laserscanning confocaal uitgerust met een 10x objectief).
  3. Pas de focus- en beeldvormingsparameters van het monster aan (bijv. laservermogen: 5, versterking: 90, pinhole-grootte: 2 AU, belichtingstijd [scansnelheid: 0,5 frame/s])) voor een optimale signaal-ruisverhouding en acquisitiesnelheid.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om monsters vooraf te scherpstellen en de parameters voor elk kanaal op het beeldvormingssysteem van keuze aan te passen voordat ze worden verwond om de vertraging tussen wondvorming en beeldacquisitie te verminderen.
  4. Wikkel vier Tol2(mpx:Dendra2)23 embryo's via handmatige transsectie door met een scalpelmes druk uit te oefenen op het staartvinweefsel onder een stereomicroscoop en breng het apparaat vervolgens terug naar het podium.
  5. Leg het beeld vast op het GFP-kanaal (excitatie 488 nm, emissie 510 nm) bij kamertemperatuur met een frame-interval van 5 minuten gedurende 24 uur.
  6. Indien nodig, laat de embryo's vrij voor verwijdering na beeldvorming via zachte afzuiging in de buurt van het hoofd met behulp van een transferpipet of het ronddraaien van de schaal.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor vergelijking van de beeldkwaliteit geproduceerd door een laserscanning confocaal met en zonder de hulp van de radijs, werden embryo's die de intensiometrische calciumbiosensor GCaMP6f22,24 in de buitenste epitheellaag tot expressie brengen, gekleurd met MemGlow 560 en afgebeeld met een omgekeerde laserscanning confocaal die de gehele dikte van de staartvinplooi bedekte met een tijdsinterval van 1 minuut per frame (Video 2). Zonder het apparaat (Figuur 3A) dreven de samples aanzienlijk af en vertoonden ze banding-artefacten, als gevolg van het beperken van de Z-stack tot 25 plakjes om binnen de gespecificeerde temporele resolutie te passen in vergelijking met beeldvorming met het apparaat (Figuur 3B). De radijs werd verder gebruikt om calciumtransiënten onmiddellijk na verwonding te onderzoeken in embryo's die Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt1821 tot expressie brachten, waarbij endogeen E-cadherine in rood en cytoplasmatisch calcium in het apicale epitheel in groen werd benadrukt. Embryo's werden evenwijdig aan de zijkanten van de centrale kamer gewond met behulp van een scalpelmes (Figuur 4A en Video 3) of door directe laserablatie met een IR-laser (Figuur 4B), en vervolgens in beeld gebracht door de volledige dikte van de staartvinplooi.

Om de effectiviteit van de radijs voor beeldvorming op langere termijn aan te tonen, onderzochten we de rekrutering van immuuncellen naar de wondrand gedurende 24 uur na verwonding. Vier zebravisembryo's op 3 dpf die Tol2 (mpx:Dendra2) tot expressie brengen om neutrofielen in groen23 te labelen, raakten gewond door staartdoorsnijding en werden gedurende 24 opeenvolgende uren in beeld gebracht (Figuur 5). Beeldvormingsartefacten die doorgaans worden geassocieerd met late embryo's van 3 dpf tot 4 dpf, zoals kantelen en zweven, waren met name afwezig (video 4) en de hergroei van weefsel ging ongehinderd door voor het experiment. De rekrutering van neutrofielen naar de wondrand gaat door gedurende het hele beeld (Figuur 5B), waarbij de meeste migrerende cellen 24 uur na de verwonding vertrekken (Figuur 5C), in overeenstemming met de verwachte ontstekingsresolutie25,26.

figure-results-1
Figuur 1: Ontwerp en gebruik van het microfluïdische apparaat van PET-laminaat (RADISH). (A) Schematisch beeld van de opstelling en dikte, de assemblage en de montage en het gebruik van het apparaat van de afzonderlijke PET-lagen. (B) Eindproduct, gemonteerd in een 3/4" uitsparing in een 35 mm schaal. (C) 3 dpf-embryo's, (D) 5 dpf-embryo's, (E) 14 dpf-embryo's die in het apparaat zijn ondergebracht. Schaalbalken = 1.000 μm (C,D,E). Afkortingen: PET = polyethyleentereftalaat; RADISJ = Rotatie-assistent voor Danio-beeldvorming van daaropvolgende genezing; DPF = dagen na de bevruchting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Stapsgewijze fotografische illustratie van de assemblage van PET-apparaten. (A) Individuele PET-lagen vóór het lamineren. (B) PET-laag bevestigd op een dekglaasje van 25 mm met kantoortape. (C) Apparaat in uitvoering bevestigd aan een plastic achterkant voor laminering. (D) Voltooid PET-laminaatapparaat. (E) Gemodificeerde schotel van 35 mm vóór montage van het apparaat. (F) Voltooid apparaat. Afkorting: PET = polyethyleentereftalaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Afbeelding 3: Verbeterde kwaliteit van het laserscannen van confocale beelden van 3 dpf-embryo's in het RADISH-ontwerp. (A) Representatief beeld van 3 dpf Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) embryo gekleurd met MemGlow 560 zonder gebruik te maken van de radijs. (B) Representatief beeld van Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) embryo gekleurd met MemGlow 560 gemonteerd in de RADIS. Schaal balk = 100 μm. Afkortingen: RADISH = Rotational Assistant voor Danio beeldvorming van latere genezing; DPF = dagen na de bevruchting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Compatibiliteit van het RADISH-ontwerp met meerdere wondtechnieken. (A) 3 dpf Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt18 embryo gewond via handmatige staartvintranssectie. (B) Embryo gewond via laserablatie. (C,D) Dezelfde embryo's 4 minuten later, die de progressie van calciumtransiënten na verwonding vertonen. Schaalbalken = 100 μm. Afkortingen: RADISH = Rotational Assistant voor Danio beeldvorming van latere genezing; DPF = dagen na de bevruchting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Langdurige insluiting van embryo's voor beeldvorming van de migratie van fagocyten. (A) Tol2(mpx:Dendra2) embryo's onmiddellijk na verwonding, en dezelfde embryo's (B) 25 min, (C) 12 uur en (D) 24 uur later. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Vector- en PNG-bestanden voor het ontwerp van het RADISH-apparaat zoals weergegeven in afbeelding 1A. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Video 1: Brightfield-video van handmatige oversnijding van de staartvin met behulp van het ontwerp van het RADISH-apparaat. Afkorting: RADISH = Rotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 2: Vergelijking van niet-gemonteerde versus gemonteerde 3 dpf Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) embryo's uit figuur 3, verkregen met 1 frame/min. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 3: Calciumtransiënten in Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt18 embryo's gewond via scalpeltranssectie of laserablatie van Figuur 4, verkregen met 1 frame/min. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 4: Langetermijnbeeldvorming van de rekrutering van leukocyten en de regeneratie van de staartvin in Tol2(mpx:Dendra2) embryo's. Afkortingen: RADISH = Rotational Assistant voor Danio beeldvorming van latere genezing; HPW = uur na verwonding. Klik hier om deze video te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het uitgangspunt van de PET-lamineermethode is kostenreductie en minimalisering van technische toetredingsbarrières in vergelijking met traditionele middelen voor het maken van microfluïdische apparaten, zoals zachte lithografie of PDMS-gieten. Als zodanig zijn de enige kritieke stappen in dit protocol de nauwkeurige uitlijning van PET-lagen tijdens het lamineren en het waterdicht maken van de apparaatranden na de constructie. Alle andere delen van de methode kunnen worden aangepast aan de experimentele behoeften (bijv. als immobilisatie van jongere of oudere embryo's vereist is, kan de dikte van de PET-lagen worden aangepast om het kanaal dienovereenkomstig te versmallen of te verbreden). Ontwerpen kunnen in elke vorm worden gemaakt en op elk basismateriaal worden gelamineerd, zolang het materiaal maar hittebestendig en dun genoeg is om door de lamineermachine te worden gestuurd18,27. Aangezien PET-vellen worden gesneden met behulp van in de handel verkrijgbare ambachtelijke snijders, die tweedimensionale in plaats van driedimensionale beeldbestanden lezen, vereisen het ontwerp en de iteratie van een bepaald apparaat alleen de mogelijkheid om zwart-witte vormen in een beeldbewerkingsprogramma te manipuleren, waardoor de moeilijkheidsgraad drastisch wordt verminderd. Deze flexibiliteit in softwarekeuze en de commerciële beschikbaarheid van gebruikte materialen vertegenwoordigen een dramatische toename van de toegankelijkheid van microfluïdische apparaten in het algemeen, waardoor ze in elk laboratorium of klaslokaal kunnen worden gebruikt voor een initiële kostprijs van minder dan $ 500 op het moment van schrijven van dit artikel, vergeleken met meer dan $ 2000 aan startapparatuurkosten voor PDMS-matrijsfabricage17.

Bovendien wordt de tijd die nodig is om met deze methode een enkel bruikbaar apparaat te maken, drastisch verminderd in vergelijking met typische zachte lithografie. Ervan uitgaande dat men bekend is met de vereiste software, kan één uniek microfluïdisch apparaat van PET-laminaat worden geconceptualiseerd, vervaardigd en onmiddellijk worden gebruikt in ~3 uur, inclusief de uithardingstijd van cyanoacrylaat. Iteratie kost nog minder, afhankelijk van de schaal van bewerkingen die nodig zijn voor de originele ontwerpbestanden, en meerdere variantapparaten kunnen parallel worden gemaakt met minimale extra tijdsinvestering en zonder extra apparatuur. Hoewel apparaten die met deze methode zijn gemaakt om verschillende redenen minder duurzaam zijn dan apparaten die met PDMS zijn gemaakt (waaronder lijmfalen en interne spanningen voor vormen met veel lagen en lange beeldverhoudingen), betekenen hun goedkope aard en schaalbare fabricage dat ze veel gemakkelijker kunnen worden vervangen. Aangezien commerciële ambachtelijke snijders op de markt worden gebracht met de mogelijkheid om dezelfde precieze snede keer op keer te herhalen en PET geen houdbaarheidsdatum heeft, kunnen de afzonderlijke lagen van een voltooid ontwerp in bulk worden voorbereid voor assemblage en gebruik op elk moment in de toekomst, waardoor de totale tijdsinvestering die nodig is, verder wordt verminderd.

Snelheid en variabiliteit gaan echter ten koste van precisie. De belangrijkste beperking van PET-laminering in vergelijking met traditioneel PDMS-gieten is de ruimtelijke resolutie. Commerciële ambachtelijke snijders hebben vaak moeite met scherpe hoeken op vormen kleiner dan ongeveer 500 μm, en PET-lamineervellen zijn niet verkrijgbaar bij diktes onder de 33 μm (exclusief de dikte van de lijm zelf, die niet is opgenomen in de meting op de verpakking), waardoor de schaal waarop deze techniek kan worden toegepast, aanzienlijk wordt beperkt. Het maximale aantal lagen wordt ook beperkt door de grootte van de lamineermachine, die van fabrikant tot fabrikant kan verschillen.

De definitieve versie van het protocol, inclusief variaties in registratie- en uitlijntechniek, materiaalleveranciers en software, zal grotendeels afhangen van de voorkeur van de gebruiker. De toegankelijkheid en algehele flexibiliteit van de methode verlagen echter de kosten van aanpassing. Individuele gebruikers worden aangemoedigd om zoveel als nodig te itereren om de aanpak aan te passen aan hun unieke behoeften.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk werd ondersteund door onderzoeksfinanciering van de National Institutes of Health (R35GM119787 tot QD). Dit werk is gebaseerd op inspanningen die worden ondersteund door EMBRIO Institute, NSF-contract #2120200, een National Science Foundation (NSF) Biology Integration Institute. Confocale beeldvorming werd uitgevoerd in de Purdue Imaging Facility. We danken Dr. Guangjun Zhang (Purdue University) voor het verstrekken van de Tg(UAS:GCaMP6f)-lijn. We danken Dr. David Tobin (Duke University) voor het verstrekken van de (cdh1-tdtomato)xt18-lijn.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
25 mm diameter round coverglass #1 thicknessChemglass Life SciencesCLS-1760-025Basismontagemateriaal. De dikte is gekozen op basis van de specificaties van de microscooplens.
Adobe Illustrator v28.5AdobeN/AVectoreditor voor het ontwerpen van het apparaatpatroon.
Calcium Chloride DihydrateFisherC79Voor het maken van E3-medium.
Design PNG Files (Online Mirror)N/AN/Ahttps://i.ibb.co/QPYj7BL/multipositionalv7-1.png
https://i.ibb.co/FDpQYXc/multipositionalv7-2.png
https://i.ibb.co/5TG4SB6/multipositionalv7-3.png
Design Space for Desktop v8.39CricutN/APropriëtaire software om de knipmachine aan te drijven.
Fusion Plus 7000LGBC1703098Thermische lamineerder. Dit specifieke model werd geselecteerd vanwege kwaliteitsfuncties, zoals maximale vouwformaat.
German Carbide Premium BladeCricut10396595Vervangende mes voor de knipmachine.
Gray Basic Tool SetCricut10307854Gereedschapsset voor het verwijderen van sneden, het schoonmaken van matten en het monteren van PET-platen. Optioneel. 
Magnesium Chloride HexahydrateAcros Organic223211000Voor het maken van E3-medium.
Maker 3Cricut10669040Knipmachine. De Cricut Maker 3 werd geselecteerd boven de Silhouette Cameo 4 voor de gebruiksvriendelijkheid van de software, maar elke knipmachine die zwart-wit afbeeldingen kan lezen, zal werken.
MemGlow 560CytoskeletonMG02-10Rode levende celaankleurmiddel voor celmembranen. Geen wassing nodig. Gebruikt in Figuur 3. 
No. 22 Carbon Scalpel BladeSurgical Design

22-079-697		Mes voor handmatige snijcorrecties. Elke vergelijkbare knipmes (bijv. X-acto #2 mes) zal ook werken.
Potassium ChlorideFisherBP366Voor het maken van E3-medium.
Sodium ChlorideFisherBP358Voor het maken van E3-medium.
StandardGrip Adhesive Cutting MatCricut10138842Montagemat voor knipmachine. De LightGrip snijmat zal ook werken, maar vermijd de StrongGrip en FabricGrip snijmatten, omdat de kracht van de kleefstof het uiteindelijke snijden kan vervormen tijdens het onkruid wieden en verwijderen. De kleefstof op matten zal uiteindelijk slijten bij voortgezet gebruik; vervang matten indien nodig.
Stationery Tape 12 mmDeli30014Kantoortape. Deli-merk werd gekozen na testen op gemak van verwijdering na lamineren.
Super glue, liquidLoctite1364076Cyanoacrylaatlijm. Gebruikte lijm moet vloeibaar zijn. Gelformuleringen zullen de randen van het apparaat niet voldoende afdichten of waterdicht maken.
PET Thermal Laminating Pouches, 3 milScotchTP3854PET-platen met thermische kleefstof. Platen komen aan als gesandwichde paren en moeten voor gebruik worden gescheiden. Snijd met de kleefzijde naar beneden.
PET Thermal Laminating Pouches, 5 milScotchTP5854PET-platen met thermische kleefstof. Platen komen aan als gesandwichde paren en moeten voor gebruik worden gescheiden. Snijd met de kleefzijde naar beneden.
Tricaine (MS-222)SyndelIC10310680Visanestheticum.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nat Rev Immunol. 16 (6), 378-391 (2016).
  2. Xu, S., Hsiao, T. I., Chisholm, A. D. The wounded worm. Worm. 1 (2), 134-138 (2012).
  3. Belacortu, Y., Paricio, N. Drosophila as a model of wound healing and tissue regeneration in vertebrates. Dev Dyn. 240 (11), 2379-2404 (2011).
  4. Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J Cell Biol. 199 (2), 225-234 (2012).
  5. Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev Dyn. 231 (4), 693-699 (2004).
  6. Gault, W. J., Enyedi, B., Niethammer, P. Osmotic surveillance mediates rapid wound closure through nucleotide release. J Cell Biol. 207 (6), 767-782 (2014).
  7. Huemer, K., et al. zWEDGI: Wounding and entrapment device for imaging live zebrafish larvae. Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).
  8. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
  9. Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. J Vis Exp. (119), e55210(2017).
  10. Wielhouwer, E. M., et al. Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system. Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).
  11. Khalili, A., Rezai, P. Microfluidic devices for embryonic and larval zebrafish studies. Brief Funct Genomics. 18 (6), 419-432 (2019).
  12. Choudhury, D., et al. Fish and Chips: a microfluidic perfusion platform for monitoring zebrafish development. Lab Chip. 12 (5), 892-900 (2012).
  13. An integrated microfluidic system for zebrafish larva organs injection. Zhang, G., et al. Proceedings IECON 2017 - 43rd Annual Conference of the IEEE Industrial Electronics Society, 2017-January, , 8563-8566 (2017).
  14. Erickstad, M., Hale, L. A., Chalasani, S. H., Groisman, A. A microfluidic system for studying the behavior of zebrafish larvae under acute hypoxia. Lab Chip. 15 (3), 857-866 (2015).
  15. Mani, K., Hsieh, Y. C., Panigrahi, B., Chen, C. Y. A noninvasive light driven technique integrated microfluidics for zebrafish larvae transportation. Biomicrofluidics. 12 (2), 021101(2018).
  16. Lee, Y., Seo, H. W., Lee, K. J., Jang, J. W., Kim, S. A microfluidic system for stable and continuous EEG monitoring from multiple larval zebrafish. Sensors (Basel). 20 (20), 5903(2020).
  17. Sonnen, K. F., Merten, C. A. Microfluidics as an emerging precision tool in developmental biology. Dev Cell. 48 (3), 293-311 (2019).
  18. Levis, M., et al. Microfluidics on the fly: Inexpensive rapid fabrication of thermally laminated microfluidic devices for live imaging and multimodal perturbations of multicellular systems. Biomicrofluidics. 13 (2), 024111(2019).
  19. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
  20. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
  21. Cronan, M. R., Tobin, D. M. Endogenous tagging at the cdh1 locus for live visualization of E-cadherin dynamics. Zebrafish. 16 (3), 324(2019).
  22. Thiele, T. R., Donovan, J. C., Baier, H. Descending control of swim posture by a midbrain nucleus in zebrafish. Neuron. 83 (3), 679-691 (2014).
  23. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J Leukoc Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
  24. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  25. Li, L., Yan, B., Shi, Y. -Q., Zhang, W. -Q., Wen, Z. -L. Live imaging reveals differing roles of macrophages and neutrophils during zebrafish tail fin regeneration. J Biol Chem. 287 (30), 25353-25360 (2012).
  26. Mathias, J. R., et al. Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish. J Leukoc Biol. 80, 1281-1288 (2006).
  27. Levis, M., Ontiveros, F., Juan, J., Kavanagh, A., Zartman, J. J. Rapid fabrication of custom microfluidic devices for research and educational applications. J Vis Exp. 2019, (2019).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ontwerp van microfluidische apparatengemultiplexte beeldvormingwondgenezingneutrofielenmigratiecalciumsignaleringhandmatige dissectielaserablatieembryo invang

Gerelateerde artikelen