Het protocol toont een nieuw in vitro experimenteel model dat de biologie van twee soorten aanhangende cellijnen kan samenvatten met een driedimensionale (3D)-geprinte steiger. De constructie van dit model en de operationele procedures, van celvoorbereiding en celcultuur tot analyse en evaluatie, worden beschreven.
Methodenartikel
Co-cultuurmodel met behulp van twee soorten hechtende cellijnen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Embryo-implantatie wordt beïnvloed door de interacties tussen verschillende celtypen in de moeder-embryo-interface. De directe en indirecte communicatie tussen verschillende celtypen binnen de decidua is cruciaal voor het reguleren van de endometriumontvankelijkheid; De moleculaire mechanismen die deze interactie mediëren zijn echter nog onduidelijk. In dit opzicht is een model nodig om het implantatieproces te bestuderen om een uitgebreid in vitro model op te stellen dat de biologie van de interactie tussen endometriumepitheel en stroma kan samenvatten. Dit model is samengesteld uit gewone celkweekplaten en een bijpassende steiger, die wordt gegenereerd door driedimensionaal (3D) printen van goedkope materialen. Hier beschrijven we een reeks protocollen voor modelconstructie, celvoorbereiding, celzaaiing, celcultuur, observatie en evaluatie. Verder hebben we representatieve resultaten met cellen die goede groeicondities vertonen onder de microscoop opgenomen. Deze studie had tot doel in vitro-modellen te ontwikkelen die de interactie tussen endometriumstromale cellen en epitheelcellen zouden nabootsen, evenals tussen trofoblastcellen en endometriumcellen.
Inleiding
Ondanks uitgebreid onderzoek naar menselijke zwangerschap, blijven de moleculaire mechanismen op het raakvlak tussen moeder en foetus tijdens implantatie en vroege zwangerschap slecht begrepen1. Het menselijke endometrium bestaat voornamelijk uit twee celtypen: endometriumepitheelcellen (EEG's) en endometriumstromale cellen (ESC's). Implantatie verloopt in drie fasen: appositie, hechting en invasie, die leiden tot de ontwikkeling van een competent embryo en receptief endometrium2. Gezien de ethische beperkingen van in vivo studies bij menselijke proefpersonen, evenals de moeilijkheden om de menselijke conditie bij dieren volledig te simuleren, is de constructie van in vitro menselijke endometriumcultuurmodellen een effectief middel geworden om de implantatie- en vroege zwangerschapsprocessen te repliceren3. Deze modellen zijn waardevol bij het onderzoeken van zowel normale als pathologische zwangerschappen en bieden een fundamenteel platform voor het voorlopig testen en valideren van therapeutische interventies in de translationele geneeskunde.
Commerciële kamers worden veel gebruikt in cellulair biologisch onderzoek. Deze kamers bieden waardevolle inzichten in celmigratie en de overspraak tussen verschillende soorten cellen. Commerciële kamers zijn echter meestal voor eenmalig gebruik en kunnen duur zijn4.
Een groot aantal in vitro menselijke kweekmodellen, bestaande uit endometrium en blastocyst, of blastocystsurrogaten, is ontwikkeld om het gedetailleerde implantatieproces beter te begrijpen. Deze modellen bevinden zich echter nog in de beginfase van toepassing, aangezien de 3D-structuur een zeer gecompliceerde experimentele opstelling is en bepaalde specifieke differentiatiemedia duur zijn 5,6,7.
Het gebruik van betaalbare 3D-printhardware en een relatief korte productieperiode maakt het mogelijk om structuren aan te passen voor verschillende experimentele doeleinden. 3D-printtechnieken helpen de tijdskosten te verminderen en maken het mogelijk om complexe, op maat gemaakte structuren te creëren. Deze technologie versnelt het ontwerp en de iteratie van prototypes aanzienlijk, waardoor het een waardevol hulpmiddel is voor onderzoekers op verschillende gebieden, waardoor ze hun werk efficiënter kunnen voltooien 8,9,10.
Hier presenteren we een haalbaar en economisch experimenteel protocol voor de constructie van de 3D-structuur en het gebruik ervan als celkweeksysteem, dat de interactie tussen endometriumstromale en epitheelcellen kan simuleren voor onderzoek naar de endometriumontvankelijkheid tijdens embryo-implantatie. Dit biedt een aanpasbaar en goedkoop alternatief voor commercieel wegwerpmateriaal.
Protocol
OPMERKING: Alle reagentia die in dit protocol worden gebruikt, zijn te vinden in de materiaaltabel. Tenzij anders aangegeven, werden alle media voor gebruik voorgebalanceerd op 37 °C.
1. 3D printen van de steiger en modelbouw
LET OP: De stappen zijn hier uitgevoerd volgens het handboek van de commerciële 3D-metaaldrukmachine. De stappen worden hieronder kort beschreven (Aanvullend Dossier 1).
- Nivellering van het printbed
- Tik op het menupictogram op het dashboard en navigeer naar Hulpprogramma's. Selecteer Bedniveau om de nivelleringsroutine te starten.
- Verwijder het afdrukvel van het printbed en selecteer Gereed. Het printbed zal stijgen tot zijn maximale hoogte ter voorbereiding op het egaliseren. Zodra de voortgangsbalk 100% bereikt, drukt u op Start.
- Als de Metal X-printer nog niet eerder waterpas is gezet, selecteert u Resetten. Als dit het geval is, kiest u Overslaan en gaat u direct verder met stap 1.1.5 (de 16-punts scan).
- Gebruik een inbussleutel van 2.5 mm om alle stelschroeven met drie bedden met de klok mee te draaien totdat ze vastzitten. Maak ze vervolgens los door ze twee volledige rotaties tegen de klok in te draaien om ze op een middelhoogte te zetten. Druk op Gereed om door te gaan.
- De printer scant het bed op 16 aangewezen punten. Raak het bed of frame tijdens dit proces niet aan. Zodra de voortgang 100% bereikt, drukt u op Volgende.
- Toepassing voor afdrukbladen
- Verwijder eventueel achtergebleven metaal of ondersteunend vuil. Zet de schuifregelaar Vacuüm op Aan.
- Laat het bed zakken en opwarmen en druk vervolgens op Volgende. Plaats het afdrukvel over het vacuümraster en druk op Volgende.
- Plaats de vellenpers over het drukvel en lijn het uit met de Z-rails aan de achterkant van de kamer.
- Wacht tot het vacuüm aangrijpt en een stabiele afdichting creëert. Zodra de stofzuiger is ingeschakeld, drukt u op Gereed.
- Metaal filament laden
- Plaats de printkop handmatig in het midden van het afdrukgebied. Verwijder de printkopkap door deze omhoog te schuiven en van de montageschroeven te verwijderen.
- Tik op het menupictogram op het optiebord. Selecteer Materialen uit de opties.
- Kies Metaal laden om de laadroutine te starten. Kies Snel laden.
- Selecteer het specifieke type metaal dat moet worden geladen (bijv. aluminium 6061-T6 | 3.3211 | 65028 | AlMg1SiCu).
- Plaats de spoel op de houder en druk op Volgende. Sluit de deur en laat de spoelen opwarmen en druk vervolgens op Volgende.
- Plaats het materiaal in de voorste inlaat van de printkop (met het label M) totdat de extruder het begint door te trekken.
- Bedrukken van metalen onderdelen
- Klik in het deelvenster Afdrukinstellingen op Exporteren Build. Sla het bestand op een USB-station op dat is geformatteerd naar FAT32 en plaats het in de printer.
- Selecteer het menupictogram op het bord. Navigeer naar Opslag en selecteer Afdrukken vanuit opslag. Kies het onderdeelbestand om te beginnen met afdrukken.
- Metalen onderdeel verwijderen
- Schuif het printvel en de geprinte onderdelen voorzichtig van het printbed. Maak de onderdelen voorzichtig los van het afdrukvel. Het flexibele vel zou gemakkelijk moeten loskomen.
2. Voorbereiding op celco-cultuur in het 3D-model
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om hittebestendige materialen te gebruiken als verbruiksartikelen voor het 3D-printen van celdekstrookjes om sterilisatie van autoclaven te vergemakkelijken vóór elk gebruik in celkweekexperimenten. In dit onderzoek werden onsterfelijke menselijke endometriumstromale cellen (HESC) en menselijke endometriumepitheelcellen (Ishikawa) gebruikt. De karakterisering van deze cellijnen is eerder gerapporteerd 5,6.
- Celcultuur en passage
- Bereid 50 ml complementair medium voor hESC voor door DMEM/F12-medium + 2 mM L-glutamine + 10% met houtskool gestript foetaal runderserum (FBS) + 1% penicilline/streptomycine-oplossing toe te voegen.
- Bereid 50 ml aanvullend medium voor Ishikawa door Dulbecco's Modified Eagle Medium + 10% FBS + 1% penicilline/streptomycine-oplossing toe te voegen.
- Cel ontdooien
OPMERKING: De gekochte cellijn is verzonden op droogijs in bevroren toestand. Het moet worden bewaard in de dampfase van vloeibare stikstof of onder -130 °C.- Bereid alle benodigde gesteriliseerde apparatuur en dissociatie-enzymen voor en verwarm het complementaire medium tot 37 °C.
- Ontdooi de cellen snel in een waterbad van 37 °C met af en toe zacht wiegen. Breng de celsuspensie over in een buisje met 5 ml basaal kweekmedium en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g .
- Verwijder voorzichtig het supernatant. Resuspendeer de celpellet in 5 ml bereid volledig kweekmedium en doseer deze in twee T25-kweekkolven. Kweek de cellen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 .
- Bereiding van cellen met een dekglaasje
- Gebruik een vierkant dekglaasje van 18 mm als oppervlak van de celcultuur; Zorg ervoor dat het dekglaasje schoon en steriel is.
- Smeer het dekglaasje in de bodem van een plaat met 12 putjes in met 200 μL extracellulaire matrix (ECM) in een concentratie van 200-300 μg/ml. Bewaar de plaat 1 uur op 37 °C.
- Verwijder de ECM van de plaat. Inspecteer de cellen op de juiste samenvloeiing en zorg ervoor dat de dichtheid van beide cellijnen ongeveer 70%-80% is
- Verwijder het verbruikte medium en was de cellen 2x met 3 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg 2 ml dissociatie-enzym toe en kweek de cellen gedurende 2 minuten bij 37 °C om ze los te maken.
- Neutraliseer met een volledig kweekmedium en creëer een eencellige suspensie door op en neer te pipetteren.
- Neem 100 μL van de celsuspensie en meng met trypan blauw (verdunningsfactor =2).
- Schuif het dekglaasje over de kamer van de hemocytometer. Vul beide zijkamers met de celsuspensie met trypanblauw.
- Tel het aantal cellen in vierkanten aan beide zijden onder een 20x microscoop en bereken de dichtheid van cellen.
- Breng de cellen over op de voorbereide plaat met vers medium en incubeer bij 37 °C met 5% CO2 . Zaai hESC in het putje bij 1 x 105 cellen/ml gedurende 24 uur.
- Voor de Ishikawa-cellijn zaait u de cel de volgende dag zonder dekglaasje in het putje.
3. Opbouw van het co-cultuurmodel
- Week de steigers gedurende 2 dagen grondig met ethylalcohol en dubbel gedestilleerd water (ddw). Steriliseer steigers met een autoclaaf bij 121 °C en droog ze.
- Voeg ongeveer 2 ml aanvullend medium voor de Ishikawa-cellijn toe aan de putculturerende Ishikawa en zorg ervoor dat het vloeistofniveau het dekglaasje bedekt.
- Breng de dekglaasjes met hESC over op de steiger en houd de kant met de cel naar beneden. Steek de steiger in de goed groeiende Ishikawa. Voor de tweede set keert u deze opstelling om door de dekglaasjes met Ishikawa op de steiger over te brengen en de steiger in de goed te kweken hESC. Gebruik de cellen zonder de steigeropstelling voor onafhankelijk groeiende celgroeianalyse.
- Incubeer het co-cultuursysteem bij 37 °C, 5% CO2. De co-cultuurperiode kan variëren afhankelijk van het experimentele ontwerp, maar varieert doorgaans van 24-72 uur.
4. Beeldacquisitie
- Verwijder voorzichtig het kweekmedium en spoel de cellen voorzichtig af met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Verwijder dekglaasjes met aangehechte cellen van kweekschalen met behulp van een fijne tang of pincet. Plaats eventueel dekglaasjes in een nieuwe schaal met PBS om uitdrogen tijdens het overbrengen te voorkomen.
- Neem een schoon microscoopglaasje en plaats een druppel PBS. Breng het dekglaasje met cellen voorzichtig over op de druppel montagemedium en zorg ervoor dat de cellen met de voorkant naar beneden op de slede staan.
- Plaats het voorbereide objectglaasje op de tafel van de omgekeerde microscoop. Selecteer de juiste objectieflens (bijv. 10x, 20x) en pas de scherpstelling aan met behulp van grove en fijne scherpstelknoppen.
- Stel microscoopparameters in, zoals de intensiteit van de verlichting en de camera-instellingen. Maak met behulp van de microscoopsoftware beelden van de cellen met de gewenste vergrotingen en gezichtsvelden. Pas de belichtingstijd en andere beeldinstellingen aan om de beeldkwaliteit te optimaliseren.
5. Beeldverwerking
- Klik op Openen om de afbeelding te openen, klik op > Filters > Verbetering > verwerken om Lokale egalisatie te kiezen en klik op Toepassen.
- Klik op Bewerken > Converteren naar > grijsschaal 8. Klik op Verbeteren en kies Contrast toepassen.
- Klik op Onderwerpen tellen en meten. Klik op Handmatig, selecteer een bereik en pas het histogram aan om ervoor te zorgen dat alle cellen worden bedekt.
- Klik op Masker toepassen, sluit het huidige venster, klik op Automatisch heldere objecten > Meten, selecteer Meting en kies Aera, Dendric, Dichtheid en Grootte.
- Klik op Automatisch heldere objecten en klik vervolgens op Tellen. Klik op Gegevens exporteren om de meetgegevens naar een werkblad te exporteren.
6. Cellen oogsten
- Verwijder de dekglaasjes van het microscoopglaasje en leg ze op een schone en droge put.
- Oogst de Ishikawa-cel met RNA-isolatiereagens voor transcriptomisch of Ripa-lysisreagens voor proteomisch onderzoek.
OPMERKING: Voor hESC was de dekglaasjescultuurmethode effectiever voor het vastleggen van beelden na immuunkleuring. Als alternatief kan de hESC worden geoogst met RNA-isolatiereagens of Ripa-lysisreagens. Cellijnen die op het dekglaasje of het oppervlak van de plaat zijn gekweekt, kunnen worden uitgewisseld; We raden echter aan om de cellen die zijn voorbereid voor beeldvormingsanalyse op het dekglaasje te zaaien.
Resultaten
Figuur 1 toont de zelfgemaakte steiger voor celdia's die in dit proces worden gebruikt, die bestaat uit een bovenste steunring die is afgestemd op bevestiging aan standaard celkweekplaten met 12 putjes, aangevuld met een basale celdiahouder met vier L-vormige staafachtige structuren.
Volgens Figuur 2 bleef de dichtheid van beide celtypen in de co-cultuur conditie (Figuur 2A,B) laag na 72 uur co-cultuur; de dichtheid van beide celtypen die onafhankelijk van elkaar werden gekweekt, nam echter aanzienlijk toe (Figuur 2C,D). Bovendien was de lengte van co-gekweekte hESC korter in vergelijking met onafhankelijk gekweekte hESC (Figuur 2E-G).
Het profiel van Ishikawa-cellen en hESC-cellen wijst op het bestaan van interacties tussen de twee soorten cellen. Tegelijkertijd stelt het systeem ons in staat om vervolgexperimenten te blijven uitvoeren op de afzonderlijke cellijnen, waaronder immunochemische kleuring en western blot.
Figuur 1: 3D-geprinte dekplaatsteiger gebruikt in het experimentele protocol. (A) Steiger in monovorm. (B) Steiger in de binaire vorm. (C) Illustratie die de plaatsing van het dekglaasje op de steiger aantoont. (D) Illustratie die de plaatsing van een steiger in een standaard plaat met 12 putjes demonstreert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Profiel van hESC- en Ishikawa-cellijnen die gedurende 3 dagen onder verschillende omstandigheden zijn behandeld. (A) Het Ishikawa-zaad op het dekglaasje samen met hESC door middel van een steiger (Bar = 200 μm). (B) Het hESC-zaad op het dekglaasje dat samen met Ishikawa is gekweekt met behulp van een steiger. (C) De Ishikawa-cellen werden gekweekt in een complementair medium met 10% FBS. (D) De hESC-cellen werden gekweekt in een complementair medium met 10% FBS. (E) De celdichtheid van hESC's onder co-cultuuromstandigheden is significant lager dan die onder onafhankelijke cultuuromstandigheden. (F) De celdichtheid van ISHIKAWA-cellen onder co-cultuuromstandigheden is significant lager dan die onder onafhankelijke kweekomstandigheden. (G) De duur van hESC onder co-cultuuromstandigheden is aanzienlijk korter. N = 3; , p<0,05, toont de foutbalk standaardfout. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: 3D-printen coderingsbestand. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
Er wordt een vereenvoudigd en kosteneffectief protocol beschreven voor de indirecte co-cultuur van endometrium-, stromale en epitheelcellen. Deze methode maakt gebruik van een zelfgemaakte steiger voor celdia's, die bestaat uit een bovenste steunring die is gemaakt voor bevestiging aan standaard celkweekplaten met 12 putjes, aangevuld met een basale celdiahouder met vier L-vormige staafachtige structuren. Deze opstelling vergemakkelijkt de scheiding van endometrium-, stromale en epitheelcellen, terwijl hun interactie mogelijk is door de uitwisseling van signaalmoleculen in het kweekmedium. Een van de belangrijkste voordelen van deze aanpak is de aanzienlijke vermindering van zowel tijd als kosten in vergelijking met commercieel beschikbare cocultuursystemen11. De zelfgemaakte steiger is gemaakt van gemakkelijk verkrijgbare materialen, waardoor de kosten van de installatie aanzienlijk worden verlaagd. Bovendien is het ontwerp eenvoudig, waardoor onderzoekers de steiger gemakkelijk kunnen monteren en demonteren, wat tijd en moeite bespaart in het laboratorium. Bovendien kan de zelfgemaakte steiger worden gereinigd en gesteriliseerd voor meerdere doeleinden, waardoor het een duurzame en economische optie is voor doorlopend onderzoek. Deze eigenschap is vooral gunstig voor langetermijnstudies, waar consistente en betrouwbare resultaten cruciaal zijn.
Endometriumstromale cellen en epitheelcellen spelen een cruciale rol bij het vergemakkelijken van succesvolle embryo-implantatie. Onder fysiologische omstandigheden hebben endometriumepitheelcellen en stromale cellen in het baarmoederslijmvlies doorgaans geen direct contact. Onderzoek naar decidualisatie van menselijke endometriumstromale cellen heeft aangetoond dat epitheelcellen het deciduale proces beïnvloeden door paracrien. De nabijheid van epitheel- en stromale cellen zorgt voor effectieve communicatie via paracriene signalering12. Deze interactie is van vitaal belang voor het coördineren van de cyclische veranderingen in het endometrium, inclusief de voorbereiding op implantatie en de daaropvolgende weefselafstoting als implantatie niet plaatsvindt11. Zowel epitheelcellen als stromale cellen brengen receptoren voor oestrogeen en progesteron tot expressie, die hun proliferatie, differentiatie en secretoire activiteiten reguleren. De epitheel-stromale overspraak zorgt ervoor dat deze reacties goed gecoördineerd zijn13. De complexe overspraak tussen deze cellen blijft dus een cruciaal onderzoeksgebied, aangezien het essentieel is om de ingewikkelde processen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontvankelijkheid van het endometrium en de implantatie van het embryo14. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in de voortplantingsbiologie zijn de gedetailleerde mechanismen van communicatie tussen deze celtypen tijdens implantatie nog steeds niet volledig opgehelderd15.
De steiger biedt een handige manier om de co-cultuur van twee soorten aanhangende cellen te bereiken. Tijdens het proces van langdurige co-cultuur blijven de dekglaasjes echter in de loop van de tijd groeien en vernieuwen, en de dode cellen zullen vallen en in contact komen met de cellen van de onderste laag, wat van invloed kan zijn op de cellen van de onderste laag. Bovendien worden de cellenzaden op het dekglaasje met de afbeelding naar beneden op de steiger gelegd. Of de zwaartekracht enig effect heeft op de toestand van de cellen is onbekend. In dit onderzoek werden twee cellijnen, hESC en Ishikawa, gebruikt voor demonstratie. De steiger kan op grote schaal worden gebruikt in de co-cultuur van twee verschillende soorten aanhangende cellijnen. Daarnaast kan de steiger ook worden gebruikt als platform voor andere verbindingen of medicijnafgiftemedia en als montageplatform voor verschillende apparaten zoals luminescentie-, verwarmings- en elektrodeapparaten.
Hier presenteren we een betrouwbaar en robuust in vitro celkweeksysteem dat gebruik maakt van de specifieke steiger, wat een nuttig en handig hulpmiddel is om het moleculaire mechanisme van embryo-maternale baarmoedercelinteracties verder te bestuderen. Daarnaast hebben we de haalbaarheid van de gevestigde steiger gekarakteriseerd als model voor blastocyst/trofoblaststudies. Dit protocol maakt het mogelijk om geschikte steigers te bouwen door middel van 3D-printen en hun functie als 3D-structuur voor de migratie- of invasieplatforms in kleine volumes (platen met 12 putjes), waarbij verschillende factoren kunnen worden geëvalueerd met behulp van beeldkwantificeringssystemen.
Het gebruik van cellijnen maakt het mogelijk om het model te standaardiseren om verschillende omstandigheden te vergelijken, iets dat niet van toepassing is met verse primaire villi-weefsels. Elk van de cellijncomponenten kan echter worden vervangen door primaire cultuur voor validatie. Door de cellen en weefsels van interessante patiënten op te nemen, kan het voorgestelde model de demonstratie en modellering vergemakkelijken van verschillende ziekten waarvan bekend is dat ze bijdragen aan onvruchtbaarheid en zwangerschapsfalen.
Kritieke stappen
Ten eerste moet de dichtheid van Ishikawa-cellen voor co-cultuur beperkt zijn, ongeveer 60%-70% confluentie. Ten tweede moet het dekglaasje met cellen naar beneden worden gehouden. Ten derde moet de concentratie ECM lager zijn dan 3 mg/ml om te voorkomen dat er een gel wordt gevormd. Ten vierde moet het vloeistofniveau van het medium in het cocultuursysteem het dekglaasje bedekken.
Beperkingen
Het hierboven genoemde model omvat de endometriumepitheelcellen en de stromale cellen; een beperking van de studie was het gebruik van adenocarcinoom Ishikawa-cellen als epitheelcelsurrogaten in plaats van primaire cellen. Het integreren van primaire epitheel- en stromale cellen van dezelfde patiënt zou de fysiologische omstandigheden van het menselijk baarmoederslijmvlies nabootsen. Voor sommige experimentele toepassingen betreft een mogelijke beperking het ontbreken van andere celtypen, zoals endotheelcellen en immuuncellen, en er is geen karakterisering van de klierstructuur in dit model om de interactieve impact van de endometriumklieren op andere endometriumceltypen te beoordelen. Onder fysiologische omstandigheden vertonen de epitheelcellen echter polariteit, en dit kenmerk simuleert nauwelijks in vitro omstandigheden zonder een uteriene luminale omgeving. De endometriumstromale cellen bevinden zich onder het deciduale proces in de menstruatiecyclus16,17. Het moleculaire mechanisme van decidualisering blijft echter onduidelijk. Verschillende factoren, waaronder immunocyten en endotheelcellen, kunnen een rol spelen bij decidualisatie. Dit model biedt een beperkte manier om de indirecte overspraak tussen stromale en epitheelcellen tijdens het deciduale proces te onderzoeken. Bovendien zijn de niveaus en rollen van de biologische markers tijdens decidualisatie nog onduidelijk, wat verder onderzoek rechtvaardigt
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.
Dankbetuigingen
We willen alle proefpersonen bedanken die bij dit onderzoek betrokken waren. We waarderen ook de beeldvormingshulp van Light Innovation Technology Ltd, Shenzhen. Deze studie werd ondersteund door Natural Science Funding of China (Grant No. 82201851), Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. JCYJ20210324141403009, RCYX20210609104608036), Shenzhen Key Medical Discipline Construction Fund (subsidienr. SZXK028) en het Shenzhen Baoan Women's and Children's Hospital (subsidienr. BAFY 2023003).
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10x Hanks′ Balanced Salt solution | Solarbio | H1046 | 1/10 |
| 12-well Clear TC-treated Plates | Corning | 3513 | - |
| 25 cm² Cell Culture Flask | Corning | 430639 | - |
| Aluminum | Markforged | 6061-T6 | - |
| DMEM/F12 | Sigma-aldrich | D2906 | - |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| FBS | Gibco | 10099141C | 1/10 |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099141C | |
| ITS Premix | Biocoat | 354350 | 1/100 |
| Matrigel Matrix | Corning | 354248 | ECM |
| Metal X | Markforged | M F-PR-5000 | - |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 1/100 |
| Round Coverslip | Biosharp | BS-18-RC | - |
| TrypLE Select (10X) | Gibco | A1217701 | dissociation enzyme |
Referenties
- Iske, J., Elkhal, A., Tullius, S. G. The fetal-maternal immune interface in uterus transplantation. Trend Immunol. 41 (3), 213-224 (2020).
- Dey, S. K., et al. Molecular cues to implantation. Endocrine Rev. 25 (3), 341-373 (2004).
- Li, X., et al. Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation. Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120(2022).
- Goss, S., et al. Mod3d: A low-cost, flexible modular system of live-cell microscopy chambers and holders. PLoS One. 17 (6), e0269345(2021).
- Zheng, J., Liu, L., Wang, S., Huang, X. Sumo-1 promotes Ishikawa cell proliferation and apoptosis in endometrial cancer by increasing sumoylation of histone h4. Int J Gynecol Cancer. 25 (8), 1364-1368 (2015).
- Damdimopoulou, P., et al. Human embryonic stem cells. Best Pract Res Clin Obst Gynaecol. 31, 2-12 (2016).
- Gargett, C. E., Schwab, K. E., Deane, J. A. Endometrial stem/progenitor cells: The first 10 years. Hum Reprod Update. 22 (2), 137-163 (2015).
- Lerman, M. J., Lembong, J., Gillen, G., Fisher, J. P. 3d printing in cell culture systems and medical applications. Appl Phys Rev. 5 (4), 041109(2018).
- Palmara, G., Frascella, F., Roppolo, I., Chiappone, A., Chiadò, A. Functional 3d printing: Approaches and bioapplications. Biosens Bioelectron. 175, 112849(2021).
- Li, S., et al. Multiscale architecture design of 3d printed biodegradable zn-based porous scaffolds for immunomodulatory osteogenesis. Nat Comm. 15 (1), 3131(2024).
- Arnold, J. T., Lessey, B. A., Seppälä, M., Kaufman, D. G. Effect of normal endometrial stroma on growth and differentiation in Ishikawa endometrial adenocarcinoma cells1. Cancer Res. 62 (1), 79-88 (2002).
- Casper, R. F., Yanushpolsky, E. H. Optimal endometrial preparation for frozen embryo transfer cycles: Window of implantation and progesterone support. Fertil Steril. 105 (4), 867-872 (2016).
- Cooke, P. S., et al. Stromal estrogen receptors mediate mitogenic effects of estradiol on uterine epithelium. Proc Natl Acad Sci U S Am. 94 (12), 6535-6540 (1997).
- Owusu-Akyaw, A., Krishnamoorthy, K., Goldsmith, L. T., Morelli, S. S. The role of mesenchymal-epithelial transition in endometrial function. Hum Reprod Update. 25 (1), 114-133 (2019).
- Evans, J., Hutchison, J., Salamonsen, L. A., Azlan, A. Endometrial inflammasome activation accompanies menstruation and may have implications for systemic inflammatory events of the menstrual cycle. Hum Reprod. 35 (6), 1363-1376 (2020).
- Gołąbek-Grenda, A., Olejnik, A. In vitro modeling of endometriosis and endometriotic microenvironment - challenges and recent advances. Cellular Signal. 97, 110375(2022).
- Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G. L., Gemzell-Danielsson, K. Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system. Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).
Herprints en machtigingen
