Het protocol toont een nieuw in vitro experimenteel model dat de biologie van twee soorten aanhangende cellijnen kan samenvatten met een driedimensionale (3D)-geprinte steiger. De constructie van dit model en de operationele procedures, van celvoorbereiding en celcultuur tot analyse en evaluatie, worden beschreven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Co-cultuurmodel met behulp van twee soorten hechtende cellijnen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Embryo-implantatie wordt beïnvloed door de interacties tussen verschillende celtypen in de moeder-embryo-interface. De directe en indirecte communicatie tussen verschillende celtypen binnen de decidua is cruciaal voor het reguleren van de endometriumontvankelijkheid; De moleculaire mechanismen die deze interactie mediëren zijn echter nog onduidelijk. In dit opzicht is een model nodig om het implantatieproces te bestuderen om een uitgebreid in vitro model op te stellen dat de biologie van de interactie tussen endometriumepitheel en stroma kan samenvatten. Dit model is samengesteld uit gewone celkweekplaten en een bijpassende steiger, die wordt gegenereerd door driedimensionaal (3D) printen van goedkope materialen. Hier beschrijven we een reeks protocollen voor modelconstructie, celvoorbereiding, celzaaiing, celcultuur, observatie en evaluatie. Verder hebben we representatieve resultaten met cellen die goede groeicondities vertonen onder de microscoop opgenomen. Deze studie had tot doel in vitro-modellen te ontwikkelen die de interactie tussen endometriumstromale cellen en epitheelcellen zouden nabootsen, evenals tussen trofoblastcellen en endometriumcellen.
Inleiding
Ondanks uitgebreid onderzoek naar menselijke zwangerschap, blijven de moleculaire mechanismen op het raakvlak tussen moeder en foetus tijdens implantatie en vroege zwangerschap slecht begrepen1. Het menselijke endometrium bestaat voornamelijk uit twee celtypen: endometriumepitheelcellen (EEG's) en endometriumstromale cellen (ESC's). Implantatie verloopt in drie fasen: appositie, hechting en invasie, die leiden tot de ontwikkeling van een competent embryo en receptief endometrium2. Gezien de ethische beperkingen van in vivo studies bij menselijke proefpersonen, evenals de moeilijkheden om de menselijke conditie bij dieren volledig te simuleren, is de constructie van in vitro menselijke endometriumcultuurmodellen een effectief middel geworden om de implantatie- en vroege zwangerschapsprocessen te repliceren3. Deze modellen zijn waardevol bij het onderzoeken van zowel normale als pathologische zwangerschappen en bieden een fundamenteel platform voor het voorlopig testen en valideren van therapeutische interventies in de translationele geneeskunde.
Commerciële kamers worden veel gebruikt in cellulair biologisch onderzoek. Deze kamers bieden waardevolle inzichten in celmigratie en de overspraak tussen verschillende soorten cellen. Commerciële kamers zijn echter meestal voor eenmalig gebruik en kunnen duur zijn4.
Een groot aantal in vitro menselijke kweekmodellen, bestaande uit endometrium en blastocyst, of blastocystsurrogaten, is ontwikkeld om het gedetailleerde implantatieproces beter te begrijpen. Deze modellen bevinden zich echter nog in de beginfase van toepassing, aangezien de 3D-structuur een zeer gecompliceerde experimentele opstelling is en bepaalde specifieke differentiatiemedia duur zijn 5,6,7.
Het gebruik van betaalbare 3D-printhardware en een relatief korte productieperiode maakt het mogelijk om structuren aan te passen voor verschillende experimentele doeleinden. 3D-printtechnieken helpen de tijdskosten te verminderen en maken het mogelijk om complexe, op maat gemaakte structuren te creëren. Deze technologie versnelt het ontwerp en de iteratie van prototypes aanzienlijk, waardoor het een waardevol hulpmiddel is voor onderzoekers op verschillende gebieden, waardoor ze hun werk efficiënter kunnen voltooien 8,9,10.
Hier presenteren we een haalbaar en economisch experimenteel protocol voor de constructie van de 3D-structuur en het gebruik ervan als celkweeksysteem, dat de interactie tussen endometriumstromale en epitheelcellen kan simuleren voor onderzoek naar de endometriumontvankelijkheid tijdens embryo-implantatie. Dit biedt een aanpasbaar en goedkoop alternatief voor commercieel wegwerpmateriaal.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Alle reagentia die in dit protocol worden gebruikt, zijn te vinden in de materiaaltabel. Tenzij anders aangegeven, werden alle media voor gebruik voorgebalanceerd op 37 °C.
1. 3D printen van de steiger en modelbouw
LET OP: De stappen zijn hier uitgevoerd volgens het handboek van de commerciële 3D-metaaldrukmachine. De stappen worden hieronder kort beschreven (Aanvullend Dossier 1).
- Nivellering van het printbed
- Tik op het menupictogram op het dashboard en navigeer naar Hulpprogramma's. Selecteer Bedniveau om de nivelleringsroutine te starten.
- Verwijder het afdrukvel van het printbed en selecteer Gereed. Het printbed zal stijgen tot zijn maximale hoogte ter voorbereiding op het egaliseren. Zodra de voortgangsbalk 100% bereikt, drukt u op Start.
- Als de Metal X-printer nog niet eerder waterpas is gezet, selecteert u Resetten. Als dit het geval is, kiest u Overslaan en gaat u direct verder met stap 1.1.5 (de 16-punts scan).
- Gebruik een inbussleutel van 2.5 mm om alle stelschroeven met drie bedden met de klok mee te draaien totdat ze vastzitten. Maak ze vervolgens los door ze twee volledige rotaties tegen de klok in te draaien om ze op een middelhoogte te zetten. Druk op Gereed om door te gaan.
- De printer scant het bed op 16 aangewezen punten. Raak het bed of frame tijdens dit proces niet aan. Zodra de voortgang 100% bereikt, drukt u op Volgende.
- Toepassing voor afdrukbladen
- Verwijder eventueel achtergebleven metaal of ondersteunend vuil. Zet de schuifregelaar Vacuüm op Aan.
- Laat het bed zakken en opwarmen en druk vervolgens op Volgende. Plaats het afdrukvel over het vacuümraster en druk op Volgende.
- Plaats de vellenpers over het drukvel en lijn het uit met de Z-rails aan de achterkant van de kamer.
- Wacht tot het vacuüm aangrijpt en een stabiele afdichting creëert. Zodra de stofzuiger is ingeschakeld, drukt u op Gereed.
- Metaal filament laden
- Plaats de printkop handmatig in het midden van het afdrukgebied. Verwijder de printkopkap door deze omhoog te schuiven en van de montageschroeven te verwijderen.
- Tik op het menupictogram op het optiebord. Selecteer Materialen uit de opties.
- Kies Metaal laden om de laadroutine te starten. Kies Snel laden.
- Selecteer het specifieke type metaal dat moet worden geladen (bijv. aluminium 6061-T6 | 3.3211 | 65028 | AlMg1SiCu).
- Plaats de spoel op de houder en druk op Volgende. Sluit de deur en laat de spoelen opwarmen en druk vervolgens op Volgende.
- Plaats het materiaal in de voorste inlaat van de printkop (met het label M) totdat de extruder het begint door te trekken.
- Bedrukken van metalen onderdelen
- Klik in het deelvenster Afdrukinstellingen op Exporteren Build. Sla het bestand op een USB-station op dat is geformatteerd naar FAT32 en plaats het in de printer.
- Selecteer het menupictogram op het bord. Navigeer naar Opslag en selecteer Afdrukken vanuit opslag. Kies het onderdeelbestand om te beginnen met afdrukken.
- Metalen onderdeel verwijderen
- Schuif het printvel en de geprinte onderdelen voorzichtig van het printbed. Maak de onderdelen voorzichtig los van het afdrukvel. Het flexibele vel zou gemakkelijk moeten loskomen.
2. Voorbereiding op celco-cultuur in het 3D-model
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om hittebestendige materialen te gebruiken als verbruiksartikelen voor het 3D-printen van celdekstrookjes om sterilisatie van autoclaven te vergemakkelijken vóór elk gebruik in celkweekexperimenten. In dit onderzoek werden onsterfelijke menselijke endometriumstromale cellen (HESC) en menselijke endometriumepitheelcellen (Ishikawa) gebruikt. De karakterisering van deze cellijnen is eerder gerapporteerd 5,6.
- Celcultuur en passage
- Bereid 50 ml complementair medium voor hESC voor door DMEM/F12-medium + 2 mM L-glutamine + 10% met houtskool gestript foetaal runderserum (FBS) + 1% penicilline/streptomycine-oplossing toe te voegen.
- Bereid 50 ml aanvullend medium voor Ishikawa door Dulbecco's Modified Eagle Medium + 10% FBS + 1% penicilline/streptomycine-oplossing toe te voegen.
- Cel ontdooien
OPMERKING: De gekochte cellijn is verzonden op droogijs in bevroren toestand. Het moet worden bewaard in de dampfase van vloeibare stikstof of onder -130 °C.- Bereid alle benodigde gesteriliseerde apparatuur en dissociatie-enzymen voor en verwarm het complementaire medium tot 37 °C.
- Ontdooi de cellen snel in een waterbad van 37 °C met af en toe zacht wiegen. Breng de celsuspensie over in een buisje met 5 ml basaal kweekmedium en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g .
- Verwijder voorzichtig het supernatant. Resuspendeer de celpellet in 5 ml bereid volledig kweekmedium en doseer deze in twee T25-kweekkolven. Kweek de cellen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 .
- Bereiding van cellen met een dekglaasje
- Gebruik een vierkant dekglaasje van 18 mm als oppervlak van de celcultuur; Zorg ervoor dat het dekglaasje schoon en steriel is.
- Smeer het dekglaasje in de bodem van een plaat met 12 putjes in met 200 μL extracellulaire matrix (ECM) in een concentratie van 200-300 μg/ml. Bewaar de plaat 1 uur op 37 °C.
- Verwijder de ECM van de plaat. Inspecteer de cellen op de juiste samenvloeiing en zorg ervoor dat de dichtheid van beide cellijnen ongeveer 70%-80% is
- Verwijder het verbruikte medium en was de cellen 2x met 3 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg 2 ml dissociatie-enzym toe en kweek de cellen gedurende 2 minuten bij 37 °C om ze los te maken.
- Neutraliseer met een volledig kweekmedium en creëer een eencellige suspensie door op en neer te pipetteren.
- Neem 100 μL van de celsuspensie en meng met trypan blauw (verdunningsfactor =2).
- Schuif het dekglaasje over de kamer van de hemocytometer. Vul beide zijkamers met de celsuspensie met trypanblauw.
- Tel het aantal cellen in vierkanten aan beide zijden onder een 20x microscoop en bereken de dichtheid van cellen.
- Breng de cellen over op de voorbereide plaat met vers medium en incubeer bij 37 °C met 5% CO2 . Zaai hESC in het putje bij 1 x 105 cellen/ml gedurende 24 uur.
- Voor de Ishikawa-cellijn zaait u de cel de volgende dag zonder dekglaasje in het putje.
3. Opbouw van het co-cultuurmodel
- Week de steigers gedurende 2 dagen grondig met ethylalcohol en dubbel gedestilleerd water (ddw). Steriliseer steigers met een autoclaaf bij 121 °C en droog ze.
- Voeg ongeveer 2 ml aanvullend medium voor de Ishikawa-cellijn toe aan de putculturerende Ishikawa en zorg ervoor dat het vloeistofniveau het dekglaasje bedekt.
- Breng de dekglaasjes met hESC over op de steiger en houd de kant met de cel naar beneden. Steek de steiger in de goed groeiende Ishikawa. Voor de tweede set keert u deze opstelling om door de dekglaasjes met Ishikawa op de steiger over te brengen en de steiger in de goed te kweken hESC. Gebruik de cellen zonder de steigeropstelling voor onafhankelijk groeiende celgroeianalyse.
- Incubeer het co-cultuursysteem bij 37 °C, 5% CO2. De co-cultuurperiode kan variëren afhankelijk van het experimentele ontwerp, maar varieert doorgaans van 24-72 uur.
4. Beeldacquisitie
- Verwijder voorzichtig het kweekmedium en spoel de cellen voorzichtig af met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Verwijder dekglaasjes met aangehechte cellen van kweekschalen met behulp van een fijne tang of pincet. Plaats eventueel dekglaasjes in een nieuwe schaal met PBS om uitdrogen tijdens het overbrengen te voorkomen.
- Neem een schoon microscoopglaasje en plaats een druppel PBS. Breng het dekglaasje met cellen voorzichtig over op de druppel montagemedium en zorg ervoor dat de cellen met de voorkant naar beneden op de slede staan.
- Plaats het voorbereide objectglaasje op de tafel van de omgekeerde microscoop. Selecteer de juiste objectieflens (bijv. 10x, 20x) en pas de scherpstelling aan met behulp van grove en fijne scherpstelknoppen.
- Stel microscoopparameters in, zoals de intensiteit van de verlichting en de camera-instellingen. Maak met behulp van de microscoopsoftware beelden van de cellen met de gewenste vergrotingen en gezichtsvelden. Pas de belichtingstijd en andere beeldinstellingen aan om de beeldkwaliteit te optimaliseren.
5. Beeldverwerking
- Klik op Openen om de afbeelding te openen, klik op > Filters > Verbetering > verwerken om Lokale egalisatie te kiezen en klik op Toepassen.
- Klik op Bewerken > Converteren naar > grijsschaal 8. Klik op Verbeteren en kies Contrast toepassen.
- Klik op Onderwerpen tellen en meten. Klik op Handmatig, selecteer een bereik en pas het histogram aan om ervoor te zorgen dat alle cellen worden bedekt.
- Klik op Masker toepassen, sluit het huidige venster, klik op Automatisch heldere objecten > Meten, selecteer Meting en kies Aera, Dendric, Dichtheid en Grootte.
- Klik op Automatisch heldere objecten en klik vervolgens op Tellen. Klik op Gegevens exporteren om de meetgegevens naar een werkblad te exporteren.
6. Cellen oogsten
- Verwijder de dekglaasjes van het microscoopglaasje en leg ze op een schone en droge put.
- Oogst de Ishikawa-cel met RNA-isolatiereagens voor transcriptomisch of Ripa-lysisreagens voor proteomisch onderzoek.
OPMERKING: Voor hESC was de dekglaasjescultuurmethode effectiever voor het vastleggen van beelden na immuunkleuring. Als alternatief kan de hESC worden geoogst met RNA-isolatiereagens of Ripa-lysisreagens. Cellijnen die op het dekglaasje of het oppervlak van de plaat zijn gekweekt, kunnen worden uitgewisseld; We raden echter aan om de cellen die zijn voorbereid voor beeldvormingsanalyse op het dekglaasje te zaaien.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 toont de zelfgemaakte steiger voor celdia's die in dit proces worden gebruikt, die bestaat uit een bovenste steunring die is afgestemd op bevestiging aan standaard celkweekplaten met 12 putjes, aangevuld met een basale celdiahouder met vier L-vormige staafachtige structuren.
Volgens Figuur 2 bleef de dichtheid van beide celtypen in de co-cultuur conditie (Figuur 2A,B
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er wordt een vereenvoudigd en kosteneffectief protocol beschreven voor de indirecte co-cultuur van endometrium-, stromale en epitheelcellen. Deze methode maakt gebruik van een zelfgemaakte steiger voor celdia's, die bestaat uit een bovenste steunring die is gemaakt voor bevestiging aan standaard celkweekplaten met 12 putjes, aangevuld met een basale celdiahouder met vier L-vormige staafachtige structuren. Deze opstelling vergemakkelijkt de scheiding van endometrium-, stromale en epitheel...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.
Dankbetuigingen
We willen alle proefpersonen bedanken die bij dit onderzoek betrokken waren. We waarderen ook de beeldvormingshulp van Light Innovation Technology Ltd, Shenzhen. Deze studie werd ondersteund door Natural Science Funding of China (Grant No. 82201851), Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. JCYJ20210324141403009, RCYX20210609104608036), Shenzhen Key Medical Discipline Construction Fund (subsidienr. SZXK028) en het Shenzhen Baoan Women's and Children's Hospital (subsidienr. BAFY 2023003).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10x Hanks′ Balanced Salt solution | Solarbio | H1046 | 1/10 |
| 12-well Clear TC-treated Plates | Corning | 3513 | - |
| 25 cm² Cell Culture Flask | Corning | 430639 | - |
| Aluminum | Markforged | 6061-T6 | - |
| DMEM/F12 | Sigma-aldrich | D2906 | - |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| FBS | Gibco | 10099141C | 1/10 |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099141C | |
| ITS Premix | Biocoat | 354350 | 1/100 |
| Matrigel Matrix | Corning | 354248 | ECM |
| Metal X | Markforged | M F-PR-5000 | - |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 1/100 |
| Round Coverslip | Biosharp | BS-18-RC | - |
| TrypLE Select (10X) | Gibco | A1217701 | dissociation enzyme |
Referenties
- Iske, J., Elkhal, A., Tullius, S. G. The fetal-maternal immune interface in uterus transplantation. Trend Immunol. 41 (3), 213-224 (2020).
- Dey, S. K., et al. Molecular cues to implantation. Endocrine Rev. 25 (3), 341-373 (2004).
- Li, X., et al. Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation. Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120(2022).
- Goss, S., et al. Mod3d: A low-cost, flexible modular system of live-cell microscopy chambers and holders. PLoS One. 17 (6), e0269345(2021).
- Zheng, J., Liu, L., Wang, S., Huang, X. Sumo-1 promotes Ishikawa cell proliferation and apoptosis in endometrial cancer by increasing sumoylation of histone h4. Int J Gynecol Cancer. 25 (8), 1364-1368 (2015).
- Damdimopoulou, P., et al. Human embryonic stem cells. Best Pract Res Clin Obst Gynaecol. 31, 2-12 (2016).
- Gargett, C. E., Schwab, K. E., Deane, J. A. Endometrial stem/progenitor cells: The first 10 years. Hum Reprod Update. 22 (2), 137-163 (2015).
- Lerman, M. J., Lembong, J., Gillen, G., Fisher, J. P. 3d printing in cell culture systems and medical applications. Appl Phys Rev. 5 (4), 041109(2018).
- Palmara, G., Frascella, F., Roppolo, I., Chiappone, A., Chiadò, A. Functional 3d printing: Approaches and bioapplications. Biosens Bioelectron. 175, 112849(2021).
- Li, S., et al. Multiscale architecture design of 3d printed biodegradable zn-based porous scaffolds for immunomodulatory osteogenesis. Nat Comm. 15 (1), 3131(2024).
- Arnold, J. T., Lessey, B. A., Seppälä, M., Kaufman, D. G. Effect of normal endometrial stroma on growth and differentiation in Ishikawa endometrial adenocarcinoma cells1. Cancer Res. 62 (1), 79-88 (2002).
- Casper, R. F., Yanushpolsky, E. H. Optimal endometrial preparation for frozen embryo transfer cycles: Window of implantation and progesterone support. Fertil Steril. 105 (4), 867-872 (2016).
- Cooke, P. S., et al. Stromal estrogen receptors mediate mitogenic effects of estradiol on uterine epithelium. Proc Natl Acad Sci U S Am. 94 (12), 6535-6540 (1997).
- Owusu-Akyaw, A., Krishnamoorthy, K., Goldsmith, L. T., Morelli, S. S. The role of mesenchymal-epithelial transition in endometrial function. Hum Reprod Update. 25 (1), 114-133 (2019).
- Evans, J., Hutchison, J., Salamonsen, L. A., Azlan, A. Endometrial inflammasome activation accompanies menstruation and may have implications for systemic inflammatory events of the menstrual cycle. Hum Reprod. 35 (6), 1363-1376 (2020).
- Gołąbek-Grenda, A., Olejnik, A. In vitro modeling of endometriosis and endometriotic microenvironment - challenges and recent advances. Cellular Signal. 97, 110375(2022).
- Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G. L., Gemzell-Danielsson, K. Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system. Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
