Methodenartikel

Isolatie en opname van patch-clamp met hele cellen van hippocampale microglia van volwassen muizen

DOI:

10.3791/67315

⸱

27 september 2024

 ,  , 
1School of Life Sciences, South China Normal University, 2School of Life Sciences, Guangzhou University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft hoe primaire hippocampale microglia van volwassen muizen kunnen worden geïsoleerd en gezuiverd, gevolgd door instructies voor het uitvoeren van patch-clamp-opnames van hele cellen op deze acuut geïsoleerde cellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia zijn residente immuuncellen in de hersenen die interageren met neuronen om de homeostase van het centrale zenuwstelsel (CZS) te behouden. Studies tonen aan dat het microgliale oppervlak kaliumkanalen tot expressie brengt die de activering van microglia reguleren, terwijl afwijkingen in deze kaliumkanalen kunnen leiden tot neurale ziekten. Momenteel worden patch-clamp-opnames van microglia met hele cellen meestal uitgevoerd op gekweekte primaire microglia van foetale of pasgeboren muizen vanwege moeilijkheden bij het uitvoeren van elektrofysiologische evaluaties op acuut geïsoleerde microglia. Deze studie introduceert een eenvoudig te volgen protocol voor het isoleren van hippocampale microglia van volwassen muizen en het uitvoeren van patch-clamp-opnames van hele cellen op de geïsoleerde cellen. In het kort werden de hersenen van een muis verwijderd na onthoofding, de hippocampus werd bilateraal ontleed en microglia werden geïsoleerd met behulp van een hersendissociatiekit voor volwassen muizen. De microglia werden vervolgens gezuiverd met behulp van een magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) -methode en op dekglaasjes gezaaid. Succesvolle microgliale isolatie werd bevestigd door immunofluorescerende kleuring met anti-CD11- en anti-Iba1-antilichamen. Een dekglaasje werd in een opnamekamer geplaatst en de kaliumstromen van de acuut geïsoleerde microglia werden geregistreerd onder spanningsklemomstandigheden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia, die afkomstig zijn van myeloïde voorlopers in de primitieve dooierzak, bevinden zich in het CZS en omvatten ongeveer 10% tot 15% van de totale zenuwcellen 1,2. Functioneel gezien kunnen microglia, naast het bewaken van de lokale omgeving, het uitvoeren van immuunafweerfuncties en het bieden van voeding en ondersteuning aan neuronen 3,4, ook direct contact opnemen met neuronen om neuronale oppervlaktereceptoren en bijbehorende ligandbinding te reguleren, en indirect interageren met neuronen via de secretie van cytokines5. Studies in vitro en in vivo hebben aangetoond dat microglia verschillende soorten kaliumkanalen tot expressie brengen, die bijdragen tot het behoud van het negatieve membraanpotentiaal6 en de activering van microglia reguleren. Aangezien abnormale microgliale kaliumkanalen zijn waargenomen bij verschillende hersenziekten7, is het van cruciaal belang voor onderzoekers om potentiële geneesmiddelen te identificeren die zich op deze kaliumkanalen richten en strategieën te ontwikkelen om de microgliale functie te reguleren.

Traditionele spijsverterings- en zuiveringsmethoden voor microglia maken vaak gebruik van de hele hersenen, wat de heterogeniteit van microglia in verschillende hersengebieden over het hoofd ziet. In vitro dissociatie en langdurige kweek in serumbevattende media plaatsen microglia in een actieve toestand9, die mogelijk niet nauwkeurig hun fysiologische kenmerken en ware toestand weerspiegelt.

Bovendien, terwijl uitgaande gelijkrichter kaliumstromen zijn geregistreerd in primaire gekweekte pasgeboren microglia en cellijnen10, kunnen gegevens van langdurige culturen van foetaal of pasgeboren hersenweefsel van muizen verschillen van die van rijpe microglia. Het huidige protocol heeft tot doel microglia acuut te isoleren en onmiddellijk volledige celopnames van microgliale kaliumstromen uit te voeren met behulp van volwassen hersenweefsel van muizen.

De eigenschappen van biochemicaliën en kaliumkanalen werden onderzocht met behulp van een methode die geschikt is voor de isolatie en zuivering van microglia uit kleine weefsels 11,12,13,14,15. Daarom biedt dit protocol een leidraad voor onderzoekers om de biochemische en functionele eigenschappen van microglia onder fysiologische en ziekteomstandigheden op te helderen. Hoewel dit protocol de hippocampus en kaliumkanalen als voorbeeld gebruikt, kan het ook worden toegepast op de studie van andere hersengebieden en elektrofysiologische eigenschappen van kanalen/cellen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten werden goedgekeurd door het Life Science Animal Care and Use Committee van de South China Normal University en de juiste normen voor dierenwelzijn werden gehandhaafd (ethische goedkeuring: SCNU-SLS-2023-048). Voor dit onderzoek werden mannelijke of vrouwelijke C57BL/6J-muizen van 3-5 maanden oud gebruikt. De details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Bereiding van oplossingen

  1. Bereid 50 ml intracellulaire oplossing met 160 mM KF, 10 mM HEPES, 10 mM EGTA en 2 mM MgCl2. Stel de pH in op 7,2 met 1 M KOH-oplossing en stel de osmotische druk in op 300 mOsm met D-sucrose13,16. Bewaren bij -20 °C.
  2. Bereid 50 ml magnetisch-geactiveerde celsortering (MACS) buffer voor met 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) in PBS.
  3. Bereid poly-L-lysine (PLL) in een verdunning van 1:1000 in water.
    OPMERKING: Dekglaasjes moeten de dag voor het experiment worden gecoat met PLL. Incubeer de gecoate slips een nacht bij 37 °C. Recycle PLL op de tweede dag en droog de gecoate slips bij 37 °C.

2. Bereiding van eencellige suspensie uit hersenweefsel

  1. Verdoof de muizen met 2,5% chloraalhydraat (0,15 ml/10 g, i.p.) (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Het verdwijnen van hoornvliesreflex en pijnreflex door in de tenen te knijpen of in de huid te knijpen bij muizen bevestigt diepe anesthesie. Leg de dieren in rugligging op een snijtafel en speld hun ledematen vast.
    1. Ontbloot de borstkas en doordrenk het hart17 met ijskoude, steriele PBS om intravasculaire circulerende bloedcellen te verwijderen. Houd het hoofd vast en knip de huid langs de middellijn van de hersenen met een schaar om de schedel bloot te leggen.
    2. Knip de achterkant van de schedel bilateraal en tussen de oogkassen af met een kleine schaar. Snijd de schedel langs de sagittale hechting en verwijder de schedel met een pincet. Extraheer het hersenweefsel snel met een pincet17.
  2. Plaats het hersenweefsel in kweekschaaltjes van 10 cm met daarin ijskoude PBS. Ontleed de hersenschors bilateraal met een pincet, isoleer het hippocampusweefsel en snijd het in kleinere stukjes. Breng de stukjes over in een centrifugebuis van 15 ml.
    OPMERKING: Bilaterale dissectie van de hersenschors onthult de halve maan van hippocampusweefsel in beide hersenhelften.
  3. Resuspendeer de kleine stukjes hippocampusweefsel in 2 ml ijskoude Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) en centrifugeer bij 300 × g gedurende 3 minuten (bij kamertemperatuur) en gooi de HBSS vervolgens weg.
  4. Voeg 1950 μL enzymmengsel 1 toe aan de centrifugebuis van 15 ml die de stukjes hippocampusweefsel bevat. Schud de centrifugebuis continu in een waterbad van 37 °C gedurende 5 minuten.
    OPMERKING: Enzymmengsel 1 is een combinatie van 50 μL enzym P en 1900 μL buffer Y, voorverwarmd tot 37 °C (aanwezig als onderdeel van de in de handel verkrijgbare kit, zie Materiaaltabel).
  5. Verwijder de centrifugebuis uit het waterbad. Voeg 30 μL vers bereid enzymmengsel 2 toe aan de centrifugebuis van 15 ml. Pipetteer de weefselfragmenten 20 keer op en neer met een pipetpunt van 1 ml en incubeer gedurende 5 minuten in een waterbad onder continu schudden bij 37°C.
    OPMERKING: Enzymmengsel 2 is een combinatie van 20 μL buffer Y en 10 μL enzym A. De bovenstaande twee verteringsstappen zetten het hersenweefsel om in een cellulaire suspensie. De totale verteringstijd mag niet langer zijn dan 15 minuten.
  6. Verwijder de centrifugebuis en pipetteer de suspensie meerdere keren op en neer met een pipet van 1 ml totdat er geen grote stukjes weefsel meer over zijn.
  7. Filtreer de celsuspensie door een 70 μm celzeeffilter en vang het filtraat op in een schone centrifugebuis van 50 ml.
    OPMERKING: Bij deze stap worden grote stukken onverteerd weefsel verwijderd.
  8. Breng het filtraat over in een nieuwe centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C 300 × g . Gooi het bovenstaande weg met een pipet van 1 ml.
  9. Spoel de celsuspensie door 20 maal op en neer te pipetteren met 15 ml HBSS en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 ×g bij 4 °C, 300 g . Gooi het bovenstaande weg en
    suspendeer de celpellet in 1 ml MACS-buffer.
    OPMERKING: Deze stap levert de eencellige suspensie op die in latere experimenten wordt gebruikt.

3. Acute scheiding van microglia

  1. Breng 1 ml van de eencellige suspensie over in een microcentrifugebuis van 2 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 300 g bij 4 ° C ×. Gooi het bovenstaande weg.
  2. Resuspendeer de eencellige pellet in 90 μl MACS-buffer. Voeg 10 μl CD11b/c-microbeads toe en incubeer de suspensie gedurende 15 minuten bij 4 °C op een horizontale schudder.
  3. Plaats de sorteerkolom in het magnetische veld van een geschikte MACS-scheider en bevochtig de kolom tweemaal met 500 μL MACS-buffer.
  4. Was de eencellige suspensie door 1 ml MACS-buffer rechtstreeks aan de buis toe te voegen en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 4 °C 300 × g . Zuig het bovenstaande volledig op.
  5. Resuspendeer de celpellet in 500 μL MACS-buffer.
  6. Breng de geresuspendeerde celsuspensie over naar de sorteerkolom in het magnetische veld met behulp van een pipet van 1 ml. Gooi de doorstroom weg. Was de kolom driemaal met 500 μL MACS-buffer terwijl deze in het magnetische veld blijft.
    OPMERKING: De doorstroom bevat niet-gelabelde cellen. De kolom moet worden gewassen zonder deze uit het magnetische veld te halen.
  7. Verwijder de sorteerkolom uit het magnetisch veld. Voeg 1 ml MACS-buffer toe aan de kolom en duw deze langzaam door met de zuiger. Verzamel de doorstroom.
    OPMERKING: De doorstroom bevat de gelabelde cellen (d.w.z. de microglia). Om de zuiverheid van de microglia te verbeteren, kan het proces worden herhaald met een nieuwe sorteerkolom (optioneel).
  8. Zaai de geselecteerde cellen in een plaat met 24 putjes met een dekglaasje bedekt met PLL. Voeg 200 μL kweekmedium toe en incubeer gedurende 20 minuten in een incubator van 37 °C met 95% O2, 5% CO2 en 60%-80% luchtvochtigheid. Met deze stap kunnen de microglia zich aan het dekglaasje hechten voor daaropvolgende patch-clamp- en immunofluorescentie-experimenten met hele cellen.

4. Immunofluorescentie

  1. Zuig het kweekmedium uit de platenputjes en spoel de cellen driemaal met 0,1 M PBS op de schudder.
  2. Gooi de PBS weg en bevestig de microglia op het dekglaasje met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  3. Verwijder het fixeermiddel en spoel het dekglaasje driemaal af met 0,1 M PBS.
  4. Gooi de PBS weg en permeabiliseer de cellen met 200 μL blokkeerbuffer met 0,2% Triton X-100 en 5% BSA in PBS gedurende 1 uur bij RT op de schudder.
  5. Incubeer de microglia met blokkeerbuffer plus anti-Iba1 en anti-CD11b primaire antilichamen18 een nacht bij 4 °C.
  6. Verwijder de volgende dag de primaire antilichamen en spoel het dekglaasje driemaal af met PBS bij RT op de schudder.
  7. Incubeer de microglia met de blokkeerbuffer die fluorofoorgekoppelde secundaire antilichamen bevat gedurende 2 uur bij RT. Voeg DAPI-kleurstof toe gedurende de laatste 15 minuten van de incubatie.
  8. Verwijder de secundaire antilichamen en spoel het dekglaasje driemaal af met PBS. Monteer de dekglaasjes op microscoopglaasjes voor beeldvorming.

5. Registratie van kaliumstromen in microglia

  1. Ontdooi de intracellulaire oplossing en bewaar deze op ijs.
  2. Trek patchpipetten (elektroden) uit dunwandige capillairen van borosilicaatglas met behulp van een verticale trekker17.
    OPMERKING: De elektrodeweerstand moet minder dan 10 MΩ zijn.
  3. Breng een dekglaasje over in de opnamekamer en voeg de extracellulaire oplossing toe die 160 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 en 10 mM HEPES bevat. Stel de pH in op 7,2 met 1 M NaOH-oplossing vóór gebruik13,16 en stel de osmotische druk in op 300 mOsm met D-sucrose.
  4. Lokaliseer de sferische microglia onder een watermicroscoop met behulp van het 40x-objectief.
  5. Vul de elektrode met een intracellulaire oplossing, bevestig deze aan de versterkerkop van de elektrofysiologische opstelling en oefen positieve druk uit. Schakel over naar het 4x objectief en zoek de elektrode.
    1. Laat de elektrode in de badoplossing zakken en zet de amplifier in de voltage-clampmodus om de membraantest in de badmodus uit te voeren. Schakel terug naar het 40x-objectief en plaats de elektrodepunt dichter bij de microglia.
      OPMERKING: Wanneer de elektrodepunt zich heel dicht bij een microgliacel bevindt, zou de weerstand iets moeten toenemen.
    2. Oefen een kleine negatieve druk uit om de cel vast te houden. Wanneer de weerstand 100 MΩ bereikt, schakelt u in de membraantest over van de bad - naar de patchmodus . Wanneer de weerstand 300 MΩ bereikt, laat u de onderdruk los.
    3. Wanneer de weerstand de vorming van een gigaohm-afdichting (d.w.z. >1 GΩ) tussen de elektrode en het microgliale membraan aangeeft, schakelt u in de membraantest over van patch - naar celmodus .
  6. Oefen een kleine hoeveelheid zuigkracht uit en initieer een elektrische schok om het membraan te scheuren. Het verschijnen van grote capacitieve transiënten duidt op een succesvolle membraanruptuur.
  7. Schakel over naar de voltage-clamp-modus en open het opnameprogramma. Registreer kaliumstromen gedurende 200 ms. Om potentialen te testen, past u spanningsstappen toe in stappen van 20 mV van -120 mV tot +40 mV bij 1 Hz.
  8. Analyseer de verkregen gegevens offline met behulp van de juiste software.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kort gezegd omvat het proces de isolatie van hippocampale microglia uit de hersenen van volwassen muizen, gevolgd door patch-clamp-registratie van deze cellen (Figuur 1). De procedure begint met het ontleden van de hippocampus van volwassen muizen van 3 tot 5 maanden oud C57BL/6J. Concreet worden de hele hersenen na perfusie verwijderd en in een kweekschaal met ijskoude PBS geplaatst (Figuur 2A). Om een acute isolatie van cellen van de hippocampus te garanderen, wordt de hersenschors verwijderd en wordt het halvemaanvormige hippocampusweefsel intact geïsoleerd (Figuur 2B).

Voor een optimale celkwaliteit en daaropvolgende hoogwaardige patch-clamp-opnames van de hele cel, is het van cruciaal belang om de verteringstijd tijdens de bereiding van de eencellige suspensie te beheersen. De studie agiteerde consequent handmatig het hippocampusweefsel in het enzymmengsel en beperkte de spijsverteringsperiode strikt tot niet meer dan 15 minuten (Figuur 3). De cellen werden vervolgens geïsoleerd met behulp van de MACS-methode, waardoor een zuiverheid van 86,20% ± 0,68%19,20 werd bereikt. Om te bevestigen dat deze gesorteerde cellen microglia waren, werden microgliale oppervlaktemarkers getest door middel van immunofluorescentie met behulp van anti-Iba1- en anti-CD11b-antilichamen, die veel worden gebruikt om microglia18 te detecteren. De resultaten gaven aan dat de geïsoleerde cellen CD11b- en Iba1-positief waren, wat de succesvolle isolatie van microglia bevestigt (Figuur 4).

Om ten slotte te beoordelen of de acuut geïsoleerde microglia van hoge kwaliteit zijn voor vervolgexperimenten, beschrijven we hoe patch-clamp-opnames van hele cellen kunnen worden uitgevoerd om microgliale kaliumstromen te evalueren. De geregistreerde microglia hadden een gemiddelde membraancapaciteit van 10,42 ± 2,05 (Figuur 5). De resultaten toonden aan dat microgliale kaliumstromen konden worden geregistreerd, wat aangeeft dat de acuut geïsoleerde microglia geschikt zijn voor neurobiologisch onderzoek.

figure-results-1
Figuur 1: Overzicht van de experimentele procedure. Er zijn vier hoofdstappen: het hersenweefsel wordt zorgvuldig geëxtraheerd en de hippocampus wordt bilateraal ontleed; Hippocampusweefsels worden verteerd om een eencellige suspensie te bereiden met behulp van een enzymmengsel zoals beschreven in het protocolgedeelte; de doelcellen worden geïsoleerd door middel van een magnetisch geactiveerde celsorteermethode; en kaliumstromen in acuut geïsoleerde cellen worden getest door middel van patch-clamp-registratie van hele cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Dissectie van de hippocampus. (A) Het hele brein van een muis van 3 tot 5 maanden oud. (B) Geïsoleerde bilaterale hippocampus. Schaal balk: 0,5 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Schematisch diagram van de vertering van hippocampusweefsels. Illustratie van kritische experimentele stappen, waarbij ervoor wordt gezorgd dat het weefsel van de hippocampus wordt verteerd tot een eencellige suspensie door enzymmengsels toe te voegen bij 37 °C met continu schudden gedurende maximaal 15 minuten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Identificatie van acuut geïsoleerde hippocampale microglia. Representatieve confocale beelden van CD11b (groen) en Iba1 (rood) positieve cellen gezuiverd uit de hippocampus, wat bevestigt dat de geïsoleerde cellen microglia zijn. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Registratie van microgliale kaliumstromen van de hele cel. (A) Een registratie-elektrode wordt op het oppervlak van geïsoleerde hippocampale microglia geplaatst. Schaalbalk: 20 μm. (B) Representatieve kaliumstromen van acuut geïsoleerde hippocampale microglia onder spanningsklemomstandigheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gekweekte microglia van foetale of pasgeboren muizen zijn duidelijk ongeschikt voor het bestuderen van volwassen microglia. Bovendien, gezien de heterogeniteit van microglia in verschillende hersengebieden21, is het mogelijk dat microglia geïsoleerd uit de hele hersenen de kenmerken van microglia in een specifieke hersenstructuur niet nauwkeurig weergeven. Dit protocol biedt een methode voor het isoleren van hippocampale microglia, specifiek om de elektrische eigenschappen van deze cellen te evalueren. Het bevat methoden voor het registreren van de stromen die worden beheerst door microgliale kaliumkanalen.

Het is algemeen bekend dat de weefselvertering strikt moet worden gecontroleerd bij het bereiden van eencellige suspensies om te voorkomen dat de eigenschappen van deze cellen tijdens de primaire celkweek en de daaropvolgende experimenten in gevaar komen. Doorgaans wordt een eencellige suspensie uit de hele hersenen verkregen door middel van de vertering van pancreasenzymen en fysieke homogenisatie. Bij het isoleren van microglia uit een specifiek hersengebied, zoals de hippocampus, levert fysieke homogenisatie alleen echter niet voldoende cellen op voor zinvolle experimenten. Bovendien hebben pancreasenzymen een krachtige spijsverteringsactiviteit, wat de levensvatbaarheid van de cellen kan beïnvloeden.

Om deze problemen aan te pakken, nam de studie een relatief milde dissociatieprocedure aan en controleerde handmatig de verteringstijd tot niet meer dan 15 minuten met behulp van de hersendissociatiekit voor volwassen muizen. Deze benadering houdt de microglia in een actieve toestand, wat van cruciaal belang is voor latere patch-clamp-opnames van de hele cel. De milde dissociatieprocedure biedt ook voordelen op het gebied van snelheid en kosteneffectiviteit.

Methoden voor de zuivering van primaire microglia zijn onder meer de gestratificeerde schudmethode (SSM)22, de dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethode (DGCM)23 en de fluorescentie-geactiveerde celsorteermethode (FACS)11,24. Onder deze wordt de SSM veel gebruikt voor de zuivering van neuronen of gliacellen. Een belangrijke beperking van het GTM is echter het onvermogen om hoge zuiverheidsniveaus te bereiken25. Evenzo leidt de DGCM ook tot lage zuiverheidsniveaus. De FACS-methode vereist het kleuren van cellen gedurende 15 minuten tot 1 uur, gevolgd door sorteren met een snelle celsorteerder, wat de levensvatbaarheid van de cellen kan aantasten. Dit protocol maakt daarentegen gebruik van de MACS-methode, die een kortere isolatietijd biedt en het repetitieve en tijdrovende gebruik van instrumenten en kleuringsprocedures vermijdt. Als gevolg hiervan worden microglia met een hoge zuiverheid verkregen, hoewel in mogelijk kleinere hoeveelheden in vergelijking met sommige alternatieve methoden.

Er zijn beperkingen aan deze techniek. De magnetisch-geactiveerde celsortering (MACS)-methode levert bijvoorbeeld relatief weinig microglia op en acuut geïsoleerde microglia kunnen niet gedurende langere perioden worden gekweekt. Deze benadering is echter waardevol omdat het het mogelijk maakt om de elektrofysiologische eigenschappen van microglia te onderzoeken die vers zijn bereid uit de hippocampus van volwassen muizen, in plaats van te vertrouwen op cellen die lange tijd zijn gekweekt.

De patch-clamp-techniek van de hele cel is een cruciaal en veelgebruikt hulpmiddel voor het bestuderen van cellulaire, met name neuronale, elektrofysiologische eigenschappen op gebieden zoals neurowetenschappen, farmacologie en cytobiologie26. Patch-clamp-opname van hele cellen is in tal van onderzoeken gebruikt om de eigenschappen van acuut ontlede hersenplakjes, primaire culturen en cellijnen te onderzoeken. Patch-clamp-opnames van acuut geïsoleerde microglia uit de hersenen van volwassen muizen ontbraken echter tot ons onderzoek.

Deze studie biedt niet alleen een protocol voor het isoleren van volwassen hippocampale microglia, maar toont ook de succesvolle registratie van kaliumstromen in deze geïsoleerde microglia aan. Dit protocol is met name waarschijnlijk van toepassing op de studie van microglia in andere hersenstructuren dan de hippocampus.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (32170950, 32371065), de Natural Science Foundation of Guangdong Province, nrs. 2023A1515010899 en 2021A1515010804.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 mm Petri dishCorning353003
15 mL Falcon tubesBD352096
24-well platesBD353047
35 mm Petri dishCorning353001-
50 mL Falcon tubesBD352070
70 μm cell screeningMiltenyi130-095-823Om celklompjes te verwijderen voordat cellen worden gesorteerd
Adult Mouse Brain Dissociation KitMiltenyi130- 107-677
Anti-CD11b AntibodyBio-RadMCA74Geiten-Anti-muis IgG ook beschikbaar. Voor het blokkeren van endogene immunoglobulinen.
Anti-Iba 1 AntibodySYSY234308Geiten-Anti-guinea pig IgG) ook beschikbaar. Voor het blokkeren van endogene immunoglobulinen.
Axon Digidata 1440AUSA
Axon MultiClamp 700B AmplifierUSA
BSA Albumin Fraction VBioFrox4240GR500Serum
C57BL/6 mice Guangdong Medical Laboratory Animal Center
CD11 b/c MicroBeadsMiltenyi130-105-634
Chloral hydrateAbsinabs47051394Widspread gebruikt als anesthesie bij muizen
Clampfit 10.6USA
Confocal MicroscopeZeiss LSM 800
Culture mediumFisher ScientificC11995500BT-
DAPI dyeBeyotimeC1002
Electrode pullerNarishigePC-10
HBSSServicebioG4203
Horizontal shakerSCILOGEXSLK-O3000-S
Image analysis softwareFiji
MACS ColumnsMiltenyi130-042-201
MACS SeparatorsMiltenyi130-042-102
ParaformaldehydeFisher ScientificT353-500Gebruik verse 4% oplossing in 1X PBS, pH 7.2-7.4. 
Poly-L-lysineBeyotime C0313Coverslip coating
Triton X-100SigmaX100

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8 (11), e1000527(2010).
  3. Voet, S., Prinz, M., Van Loo, G. Microglia in central nervous system inflammation and multiple sclerosis pathology. Trends Mol Med. 25 (2), 112-123 (2019).
  4. Salter, M. W., Beggs, S. Sublime microglia: Expanding roles for the guardians of the CNS. Cell. 158 (1), 15-24 (2014).
  5. Wohleb, E. S. Neuron-microglia interactions in mental health disorders: For better, and for worse. Front Immunol. 7, 544(2016).
  6. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratskya, A. Physiology of microglia. Physiol Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
  7. Sarkar, S. Microglial ion channels: Key players in non-cell autonomous neurodegeneration. Neurobiol Dis. 174, 105861(2022).
  8. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: Active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
  9. Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium. J Vis Exp. 133, e57122(2018).
  10. Lyons, S. A., et al. Distinct physiologic properties of microglia and blood-borne cells in rat brain slices after permanent middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 20 (11), 1537-1549 (2000).
  11. Li, Q., Lan, X., Han, X., Wang, J. Expression of tmem119/SALL1 and CCR2/CD69 in FACS-sorted microglia- and monocyte/macrophage-enriched cell populations after intracerebral hemorrhage. Front Cell Neurosci. 12, 520(2018).
  12. Sarkar, S., et al. Kv1.3 modulates neuroinflammation and neurodegeneration in Parkinson's disease. J Clin Invest. 130 (8), 4195-4212 (2020).
  13. Maezawa, I., et al. Kv1.3 inhibition as a potential microglia-targeted therapy for Alzheimer's disease: Preclinical proof of concept. Brain. 141 (2), 596-612 (2018).
  14. Delbridge, A. R. D., et al. Organotypic brain slice culture microglia exhibit molecular similarity to acutely isolated adult microglia and provide a platform to study neuroinflammation. Front Cell Neurosci. 14, 592005(2020).
  15. Volden, T. A., Reyelts, C. D., Hoke, T. A., Arikkath, J., Bonasera, S. J. Validation of flow cytometry and magnetic bead-based methods to enrich cns single cell suspensions for quiescent microglia. J Neuroimmune Pharmacol. 10 (4), 65-665 (2015).
  16. Wulff, H., et al. The voltage-gated kv1.3 k(+) channel in effector memory t cells as new target for ms. J Clin Invest. 111 (11), 1703-1713 (2003).
  17. Tan, S., et al. Biocytin-labeling in whole-cell recording: Electrophysiological and morphological properties of pyramidal neurons in CYLD-deficient mice. Molecules. 28 (10), 4092(2023).
  18. Manitz, M. P., et al. Flow cytometric characterization of microglia in the offspring of polyi:C treated mice. Brain Res. 1636, 172-182 (2016).
  19. Xu, Y. N., et al. A modified protocol of mouse hippocampal primary microglia culture by using manual dissociation, magnetic activated cell sorting and tic medium. Sheng Li Xue Bao. 71 (6), 883-893 (2019).
  20. Zelenka, L., et al. Novel protocol for the isolation of highly purified neonatal murine microglia and astrocytes. J Neurosci Methods. 366, 109420(2022).
  21. Keren-Shaul, H., et al. A unique microglia type associated with restricting development of alzheimer's disease. Cell. 169 (7), 1276-1290.e17 (2017).
  22. Yang, B., et al. Various cell populations within the mononuclear fraction of bone marrow contribute to the beneficial effects of autologous bone marrow cell therapy in a rodent stroke model. Transl Stroke Res. 7 (4), 322-330 (2016).
  23. Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
  24. Ramesha, S., Rayaprolu, S., Rangaraju, S. Flow cytometry approach to characterize phagocytic properties of acutely-isolated adult microglia and brain macrophages in vitro. J Vis Exp. 160, e61467(2020).
  25. Mccarthy, K. D., De Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  26. Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van microgliavolwassen muizenbreinkaliumstromenmagnetisch geactiveerde celselectieimmunofluorescentievleuringvoltage clamp registratiepoly L lysine coatingCD11b microbeads

Gerelateerde artikelen