Identificatie en kwantificering van gestoorde metabolieten bij ernstig zieke patiënten met behulp van op NMR gebaseerde metabolomics

Summary

Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie wordt gebruikt om ontregeling in de metabolieten te identificeren bij patiënten met verschillende ziekten. Deze techniek maakt het mogelijk om de gestoorde metabolieten te kwantificeren, waardoor de pathofysiologische inzichten worden ontrafeld. Hier beschrijven we de stap-voor-stap procedure van de NMR-gebaseerde benadering voor de metabole karakterisering van de patiënten.

Abstract

Metabolomics is in opkomst als een belangrijke benadering om de reactie van het individu op pathofysiologische aandoeningen weer te geven. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie is geëvolueerd als een hulpmiddel om metabole ontregeling te identificeren bij ernstig zieke patiënten die lijden aan aandoeningen zoals acute respiratory distress syndrome (ARDS), ernstige acute pancreatitis (SAP), acuut nierletsel (AKI) en sepsis. De spectrale gegevens van het serummonster van de onderzoeks- en controlegroep worden geregistreerd met behulp van een 800 MHz NMR-spectrometer en verwerkt met behulp van NMR-verwerkings- en analysetools. Bovendien wordt een rigoureuze statistische analyse, zoals univariate en multivariate tests, uitgevoerd om significante metabolieten te lokaliseren, die vervolgens nauwkeurig worden geïdentificeerd en gekwantificeerd met behulp van NMR-metabolietkwantificeringssoftware. Bovendien benadrukt pathway-analyse de gestoorde biochemische cycli die resulteren in de ernst van de ziekte. Door middel van deze alomvattende aanpak willen onderzoekers een dieper inzicht krijgen in de metabole veranderingen die verband houden met deze kritieke ziekten, wat mogelijk de weg vrijmaakt voor een beter begrip van de ziekte en verbeterde diagnostiek en behandelingsstrategieën.

Introduction

Ondanks voortdurende inspanningen om wereldwijd een efficiënte diagnose van ziekten te bieden, heeft doelgerichte therapie nog steeds niet zijn ware potentieel bereikt. Verschillende benaderingen, zoals transcriptomics, proteomics, enz., hebben geresulteerd in de identificatie van verschillende biomarkers, maar deze hadden niet voldoende klinisch nut vanwege het gebrek aan gevoeligheid en specificiteit ^1,2. Doelgerichte therapie is een grote uitdaging bij sommige multifactoriële ziekten, wat uiteindelijk leidt tot een hogere mortaliteit. Er is behoefte aan een beter begrip van het onderliggende mechanisme en de pathofysiologie van complexe ziekten die met een grote heterogeniteit bestaan. In dit opzicht heeft de ontwikkeling van metabolomics dus een revolutie teweeggebracht in de therapeutische ontwikkeling, wat uiteindelijk kan helpen bij het afstemmen van de behandelingsregimes op verschillende kritieke ziekten zoals acute respiratory distress syndrome (ARDS), sepsis en ernstige acute pancreatitis (SAP).

Metabolomics is een alomvattende benadering gericht op het identificeren en kwantificeren van moleculen met een klein molecuulgewicht (metabolieten zoals aminozuren, lipiden, peptiden, organische zuren en vitamines) in verschillende biovloeistoffen, cellen of weefselextracten. Deze metabolieten, die doorgaans minder dan 1500 Da wegen, spelen een actieve rol in biochemische processen en weerspiegelen een progressief overzicht van de biologische toestand van het organisme. Ze omvatten substraten voor belangrijke enzymatische processen, tussenproducten in biologische routes en bijproducten van het cellulaire metabolisme. Bijgevolg legt metabolomics een gedetailleerde vingerafdruk vast van voedingsinvloeden, geneesmiddelinteracties en ziektetoestanden. Metabolietveranderingen zijn zeer gevoelige indicatoren van metabolisme en biologische routes, waardoor correlaties met fenotypische expressies en resulterende pathofysiologische afwijkingen mogelijk zijn ^3,4. Initiële variaties in metabolieten kunnen dienen als vroege indicatoren van de ernst van de ziekte, terwijl tijdelijke veranderingen kunnen helpen bij het monitoren van de werkzaamheid van de behandeling, ziekteprogressie en klinische resultaten ^5,6,7. Metabolomics verbetert dus klinische assays en verschillende andere omics-benaderingen door ziekten te herdefiniëren door middel van klinische, fysiologische en biochemische eindpunten 8,9,10,11,12,13. De analytische mogelijkheden van metabolomics worden gebruikt om de vatbaarheid voor ziekten te monitoren en te bepalen door middel van gewijzigde metabolietconcentraties^14,15.

In deze context zijn zowel massaspectrometrie (MS) als nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie naar voren gekomen als de primaire analytische platforms voor metabolietprofilering in biologische monsters. Deze methoden worden gebruikt voor zowel gerichte als ongerichte identificatie en kwantificering van metabolieten 16,17,18. Elk platform heeft zijn voordelen en beperkingen, maar de niet-destructieve aard van NMR maakt het geschikt voor de voorkeur in verschillende in vivo onderzoeken en voor de karakterisering van de structuur van onbekende verbindingen, met name in de beginfase van metabolomics-onderzoek. De monsterfractionering, derivatisering en ionisatie die nodig zijn voordat MS kan vertekeningen veroorzaken en vaak resulteren in monsterverlies, wat van invloed is op de dynamische kenmerken die NMR-spectroscopie kan vastleggen met minimale of geen monstervoorbereiding. De belangrijkste beperking van NMR is de lagere gevoeligheid in vergelijking met MS, die een lagere detectielimiet biedt, waardoor het een uitdaging is om minder overvloedige metabolieten te detecteren¹⁹. Ontwikkelingen zoals supergeleidende magneten met hoge resolutie, cryogeen gekoelde NMR-sondes en technieken die de gevoeligheid verbeteren, hebben deze beperking echter verzacht 20,21,22. Als complementaire benadering van genomica en proteomics wint metabole profilering met behulp van NMR-spectroscopie aan populariteit als voorkeurstechniek 23,24,25. De minimale monstervoorbereiding, reproduceerbaarheid en herhaalbaarheid van NMR maken het een waardevol hulpmiddel voor het vastleggen van de inherente dynamische kenmerken van metabolieten, ondanks de gevoeligheidsuitdagingen²⁶.

Verschillende onderzoeksgroepen hebben metabolomics met succes uitgevoerd, waarbij het ontregelde metabole profiel van patiënten voor verschillende ziekten²⁷ werd vastgesteld, zoals ARDS 28,29,30,31,32,33, longontsteking ³⁴, sepsis⁷, galstenen³⁵ en pancreatitis³⁶. Op NMR gebaseerde metabolomics-onderzoeken van ernstig zieke patiënten hebben een belangrijke rol gespeeld bij het volgen van de progressie van systemisch inflammatoir responssyndroom (SIRS) naar meervoudig orgaandisfunctiesyndroom (MODS), een belangrijke oorzaak van mortaliteit en morbiditeit op de intensive care (ICU)³⁷. In een studie van Stringer et al. werden plasmamonsters gebruikt om metabole veranderingen te onderzoeken bij patiënten met door sepsis geïnduceerde acute longbeschadiging (ALI) in vergelijking met controlepatiënten³⁸. De belangrijkste metabolieten die in deze pilotstudie verhoogd werden gevonden, weerspiegelden de betrokken metabole routes en hun associatie met klinische scores. Dit onderzoek werd uitgebreid naar serummetabolomics om sepsis te onderscheiden van de vroege stadia van longbeschadigingsmechanismen bij ARDS³². Bovendien identificeerde een andere studie in ARDS krachtige serumbiomarkers die duidelijk onderscheid maken tussen acuut longletsel/ARDS en gezonde controles, en biedt het inzicht in systemische metabole veranderingen die overeenkomen met het acute begin van longbeschadiging^39,40.

NMR-spectroscopie is een geautomatiseerde analytische techniek met hoge doorvoer die robuuste en onbevooroordeelde informatie levert over de metabole vingerafdruk die de onderliggende pathofysiologie onthult³⁸. De klinische toepassing en biologische interpretatie van NMR-gegevens hangen af van het verkrijgen van spectra van hoge kwaliteit die rijke informatie bevatten. Daarom is het van cruciaal belang om te zorgen voor nauwkeurige, uniforme en goed geformuleerde gegevensverzameling, -verwerking en -analyse. Daarom is het doel van deze studie om de essentiële stappen van NMR-gebaseerde metabolomics te benutten voor de identificatie en kwantificering van metabolieten. Deze studie belicht de belangrijkste stappen van het protocol dat nodig is voor klinisch metabolomics-onderzoek (Figuur 1), zoals de selectie van geschikte monsters, verzameling en opslag, monsterverwerking en -voorbereiding, gegevensverzameling en -analyse, het identificeren en kwantificeren van de metaboliet van belang, en uiteindelijk, interpretatie van de resultaten in een klinische context om relevante inzichten af te leiden. Elk van deze stappen is essentieel voor het gebruik van NMR-spectroscopie in metabolomics om significante biologische en klinische inzichten te ontdekken.

Protocol

Ethische goedkeuring (IEC-code: 2022-71-PhD-126) werd verkregen van de IEC van Sanjay Gandhi Postgraduate Institute of Medical Sciences (SGPGIMS), Lucknow. Er werden schriftelijke en geïnformeerde toestemmingen verkregen van de patiënten of hun familieleden om het onderzoek uit te voeren en de gegevens voor onderzoeksdoeleinden te publiceren. Bovendien is het onderzoek uitgevoerd volgens de richtlijnen van de instelling.

1. Onderzoeksopzet en ethische klaring

1. Bepaal de steekproefomvang voor elke groep. Bekijk en stel de selectiecriteria voor deelnemers zorgvuldig vast. Bovendien, als de onderzoeksopzet de opname van monsters van mensen of dieren vereist, verkrijg dan ethische goedkeuring van de juiste institutionele ethische commissie (IEC) voordat u begint met het verzamelen van monsters.
2. Selecteer ARDS-patiënten gecategoriseerd als mild, matig en ernstig, op basis van de diagnostische criteria van de definitie van Berlijn 2012 op basis van de partiële zuurstofdruk in arterieel bloed (PaO2) tot de fractie ingeademde zuurstof (FiO2) (P/F) verhouding. De ARDS-patiënten met een P/F-bereik van 300-200 worden beschouwd als mild, 200-100 als matig en onder de 100 als ernstig³⁸. Hier hebben we ons gericht op twee groepen: milde en matige ARDS-patiënten (zie tabel 1).
   OPMERKING: De studie omvat het gebruik van serum verkregen uit bloedmonsters om op NMR gebaseerde metabolomics uit te voeren. In deze studie hadden de ter referentie opgenomen deelnemers een gemiddelde leeftijd van 42 jaar (± 10,9 jaar), met een geslachtsverdeling van 2 mannen en 6 vrouwen.

Categorie	P/F-verhouding
Redelijk	300-200
Gematigd	200-100
Ernstig	100-0

Tabel 1: Categorisering van ARDS-patiënten.

2. Selectie, verzameling en verwerking van monsters

1. Voer serumisolatie uit door de onderstaande stappen te volgen.
   1. Om te experimenteren, verzamel 2 ml bloedmonsters uit de slagaders met behulp van een steriele naald in een gewone (zonder toevoegingen) en steriele injectieflacon. Laat het monster 30 minuten stollen bij kamertemperatuur. Voor deze studie werden 4 patiënten met de diagnose milde ARDS en 4 patiënten met matige ARDS geselecteerd.
   2. Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 3100 x g om het serum²⁵ te scheiden. Breng het serum over in steriele microcentrifugebuisjes, maak aliquots met een kleiner volume (d.w.z. 400-500 μL), label ze op de juiste manier (naam van de patiënt, CR-nummer, dagpunt, enz.) en bewaar ze bij -80 °C voor toekomstige analyse.
      OPMERKING: Op dit punt kan het experiment worden gepauzeerd en hervat op een geschikt moment.
2. Verwerk het serummonster vóór NMR-experimenten met behulp van de volgende stappen.
   1. Ontdooi het monster voordat u de NMR-experimenten uitvoert. Meng 250 μL aliquoot van het serum met 250 μL zoute fosfaatbufferoplossing (bevattende 100% D₂O, 0,9% NaCl, 50 mM natriumfosfaatbuffer, pH 7,4) om pH-variatie te minimaliseren.
   2. Draai het mengsel een paar seconden (~15 s) om ervoor te zorgen dat het homogeen gemengd is. Breng ten slotte het voorbereide monster over naar een schone NMR-buis met een coaxiaal inzetstuk dat trimethylsilylpropionaat (TSP) bevat in een concentratie van 0,05 mM, dat dient als externe standaard voor kalibratie en kwantificering⁴¹.
      OPMERKING: Ter referentie wordt een inerte en niet-reactieve verbinding gebruikt die geen interactie heeft met de analyten. Andere veelgebruikte referentieverbindingen zijn tetramethylsilaan (TMS) en natriumtrimethylsilylpropaansulfonaat (DSS).

3. NMR-experimenten

OPMERKING: De focus ligt op het identificeren van kleine moleculen in de serummonsters, daarom hebben we de Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) pulssequentie gebruikt, die macromolecuulsignalen onderdrukt. Alle serummonsters in deze studie werden geregistreerd met behulp van een 800 MHz NMR-spectrometer uitgerust met een cryogeen gekoelde drievoudige resonantie TCI 5 mm breedband inverse sondekop en afgeschermde z-gradiënt.

1. Plaats het monster in de magneet. Schrijf het commando wrpa (vermeld experimentnummer) en druk op enter om een protonexperiment op te zetten met het cpmg-pulsprogramma. Vermeld de naam van de patiënt en andere noodzakelijke gegevens door op de optie Titel te klikken.
2. Vergrendel het magnetische veld door de opdracht Lock te schrijven , op enter te drukken en de optie 90% H₂O en 10% D₂O verder te selecteren. Stem de sonde handmatig af en pas deze aan met ATMM om de efficiëntie van radiofrequentiepulsen te optimaliseren en de gevoeligheid te maximaliseren. Voer 1D gradiënt shimming uit door op topshim te klikken.
3. Stel de volgende acquisitieparameters in, waaronder een relaxatievertraging van 5 s, een spectrale sweep-breedte van 12 parts per million (ppm) en een echotijd van 300 μs. Al deze parameters kunnen eenvoudig worden gewijzigd door de optie Acquisitieparameters in het bovenste paneel te selecteren.
4. Pas een lijnverbreding van 0,3 Hz toe met behulp van een exponentiële vensterfunctie, waarbij gegevens worden verzameld in 64.000 punten over 128 scans. Deze parameters kunnen op dezelfde manier worden gewijzigd door de optie Acquisitieparameters in het bovenste paneel te selecteren. Door op Acquisitieparameters te klikken, verschijnt een lijst met specificaties en kunnen de genoemde attributen, samen met andere parameters, tijdens de optimalisatie worden gewijzigd.
5. Verkrijg de NMR-spectra met behulp van NMR-verwerkings- en analysetools. Zodra de definitieve spectra zijn verkregen, schrijft u de opdracht apk en absn en drukt u op enter om respectievelijk fasecorrectie en basislijncorrectie uit te voeren. Klik op de optie As kalibreren op het bovenste paneel en kalibreer vervolgens de TSP-piek automatisch of handmatig op 0 ppm.
6. Breng de verkregen gegevens over van het systeem naar het werkstation, waar verdere verwerking en analyse worden uitgevoerd.
   OPMERKING: De experimentele fase is nu voltooid en kan worden gepauzeerd. Het voorverwerken, analyseren en interpreteren van gegevens kan gemakkelijk worden uitgevoerd.

4. Voorverwerking van gegevens

1. Voer de voorverwerking van de gegevens uit met behulp van NMR-verwerkings- en analysetools en NMR-metabolietkwantificeringssoftware.
   1. Soms is alleen automatische correctie niet voldoende, en in dat geval is ook handmatige correctie noodzakelijk. Om fasecorrectie handmatig uit te voeren, klikt u op de optie Proces in de bovenste menubalk van NMR-verwerkings- en analysetools. Klik vervolgens op Fase aanpassen, sleep de muis en observeer totdat de spectra fasegecorrigeerd zijn. Als u klaar bent, klikt u op de optie Opslaan en retourneren (aanwezig in de vorm van een pictogram) die beschikbaar is in dezelfde menubalk.
   2. Om handmatige basislijncorrectie (Whittaker-methode) uit te voeren, opent u het spectrale bestand in de processormodule van de NMR-metabolietkwantificeringssoftware. Selecteer de optie Basislijncorrectie. Selecteer vervolgens de optie Whittaker Methode. Plaats nu de stippen aan de basis van de pieken in de hele spectra (0,0 tot 10 ppm, meestal in het geval van serum of afhankelijk van de beschikbaarheid van de metaboliet in de spectra) om de basis aan te passen. Nadat alle spectrale bestanden zijn gecorrigeerd in de basislijn, slaat u ze op in een enkele map. Verdere verwerking, met behulp van de processor of de profilermodule van de NMR-metabolietkwantificeringssoftware, kan worden uitgevoerd met behulp van hetzelfde bestand dat in het specifieke formaat is opgeslagen.
   3. Voer binning uit met behulp van de profilermodule van dezelfde software. Selecteer de optie Extra, vervolgens Batchproces en vervolgens Spectrale binning.
2. Als u het definitieve binningsblad wilt genereren dat moet worden gebruikt voor statistische analyse, selecteert u de map met alle voor de basislijn gecorrigeerde spectrale bestanden nadat u op Spectrale binning hebt geklikt.
3. Verdeel de spectra in een bepaald aantal bakken van gelijke grootte met een gedefinieerde spectrale breedte, variërend van 0,01 tot 0,04 ppm (kan worden geoptimaliseerd volgens het onderzoek). Dit proces vereenvoudigt en organiseert de spectrale gegevens, waardoor een consistentere analyse mogelijk wordt. Geef de bucketgrootte op, samen met de ppm-waarden voor het begin en het einde en geef de map aan waarin de uitvoerbinningvellen worden opgeslagen.
4. Sluit de chemische verschuivingsgebieden uit die overeenkomen met water en het oplosmiddel TSP (4,8-5,2 en 0,0-0,7 ppm) om spectrale interferentie te voorkomen 42,43,44.
5. Dit werkblad bevat de voorbeeldnamen in de ene rij en de verschillende bin-waarden samen met ppm in de andere rijen. Voordat u dit blad voor statistische analyse gebruikt, moet u het wijzigen door de steekproeven in groepen voor analyse te ordenen en het alleen in door komma's gescheiden (CSV) op te slaan.
   OPMERKING: Bij het vergelijken van de milde groep met de matige groep ARDS-patiënten hebben we bijvoorbeeld de gegevens gerangschikt met milde en matige labels, een serienummer toegevoegd en het bestand opgeslagen in CSV-indeling.

5. Statistische analyse

OPMERKING: Het binningblad dat uit de vorige stap is verkregen, dient als invoerbestand voor statistische analyse. In deze studie werd de module statistische analyse (één factor) van de statistische analysesoftware voor metabolomics gebruikt.

1. Voer vóór statistische analyse de normalisatiestap uit met behulp van som, log en Pareto, maar deze kan variëren in verschillende onderzoeken⁴⁵.
2. Voer univariate en multivariate analyses uit om de verschillende groepen te onderscheiden en de nauwkeurigheid van de geïdentificeerde metabolieten te bepalen.
   1. Voer hoofdcomponentenanalyse (PCA), gedeeltelijke kleinste-kwadratenanalyse (PLS-DA) en orthogonale gedeeltelijke kleinste-kwadratenanalyse (OPLS-DA) uit om discriminatie tussen de groepen te observeren, wat resulteert in VIP-scores met variabel belang van projectie voor elke metaboliet die verantwoordelijk is voor het verschil in het metabole profiel.
   2. Voer univariate methoden uit, zoals de student t-test en ANOVA, om de significante metabolieten te identificeren op basis van de criteria van een p-waarde van minder dan 0,05. Beide tests leveren box whisker-plots op die het verschil in de relatieve concentratie van de metabolieten laten zien.
   3. Voer een biomarkeranalyse uit, die een gebied oplevert onder de AUROC-grafiek (Operating Operating Characteristics Curve) van de ontvanger. De AUC-waarde (gebied onder de curve) > 0,8 wordt als significant beschouwd⁴⁶.
   4. Selecteer de definitieve lijst van significante metabolieten met behulp van de criteria VIP-score>1, Bonferroni-gecorrigeerde p-waarde<0,05⁴⁴ en AUC > 0,8⁴⁶.
3. Identificeer metabolieten zoals hieronder beschreven.
   1. Binning levert significante metabolieten in de vorm van ppm-waarden in plaats van namen. Identificeer de metabolieten die overeenkomen met specifieke ppm-waarden met behulp van databases zoals de Biological Magnetic Resonance Bank (BMRB)⁴⁷en de Human Metabolome Database (HMDB).
   2. Gebruik daarnaast eerder gepubliceerde literatuur^42,44 voor identificatie en validatie.
   3. Gebruik de profilermodule van de NMR-metabolietkwantificeringssoftware om de geïdentificeerde metabolieten te bevestigen met hun ppm-waarden.

6. Kwantificering van metabolieten met behulp van NMR-software voor het kwantificeren van metabolieten

OPMERKING: De profilermodule van de software wordt veel gebruikt om de geïdentificeerde metabolieten te kwantificeren.

1. Voordat u met de kwantificering begint, kalibreert u de referentieverbinding die voor het onderzoek is geselecteerd (tsp gebruikt in dit onderzoek) met behulp van de processormodule. Klik op de optie CSI kalibreren (chemische vormindicator). Vermeld de concentratie van de referentieverbinding (0,05 mM voor deze studie). Sleep vervolgens de softwarepiek naar de spectrale referentiepiek en pas de hoogte en breedte correct aan. Zodra de spectrale referentiepieken overeenkomen met de piek van de software, klikt u op Accepteren.
2. Open de gewenste spectra in de profilermodule en selecteer de juiste samengestelde bibliotheek voor onderzoek.
3. Onderaan het scherm wordt een lijst met metabolieten weergegeven. Selecteer de metaboliet die van belang is uit deze lijst. Eenmaal geselecteerd, verschijnt de mogelijke ppm van de gekozen metaboliet in de bovenhoek van de spectra.
4. Selecteer de ppm-waarde in de bovenhoek en zoom in op de spectra tot de specifieke ppm-schaal van de metaboliet.
5. Op dit punt verschijnen er twee pieken op het scherm: een die de geregistreerde gegevens vertegenwoordigt en de andere, weergegeven als een stippellijn, die de softwarepiek vertegenwoordigt. Lijn beide pieken uit. Sleep de softwarepiek en pas de hoogte en positie aan zodat deze overeenkomen met de piek in het voorbeeld.
6. Zodra de concentratie van de metaboliet correct is uitgelijnd, kan deze worden verkregen uit de waarde die voor die metaboliet wordt weergegeven onder de kop concentratie in mM (figuur 1).
7. Volg dezelfde procedure voor alle metabolieten en monsters en exporteer de gekwantificeerde waarden in een spreadsheet. Om het uitvoerbestand te genereren, klikt u op de optie Batchbewerkingen onder het menu Extra . Geef de gewenste map op voor het opslaan van het uitvoerbestand.

7. Analyse van de route

OPMERKING: De significante metabolieten die na analyse zijn geïdentificeerd, worden gebruikt om de belangrijkste routes te bepalen die de uitkomst in ziektegroepen rechtstreeks beïnvloeden. De routeanalysemodule van metabolomics statistische analysesoftware en de KEGG-database worden over het algemeen voor dit doel gebruikt.

1. Voer de verkregen lijst met significante metabolieten in de module in. Er wordt een lijst gegenereerd met de namen van de routes.
2. Selecteer de uiteindelijke routes op basis van een criterium van een impactfactor van meer dan 0,1. Significante impactwaarden geven ziektegerelateerde routes aan³⁰.
3. Analyseer de resulterende routes grondig om de ontregeling op te helderen die verband houdt met de ernst van de ziekte. Een van de tekortkomingen van deze methode is de inefficiëntie bij het identificeren van de ontregelde routes wanneer de significante metabolieten minder dan 3 zijn.
4. Om hiermee om te gaan, kan de geïdentificeerde metaboliet en de correlatie met de ernst van de ziekte ook worden bepaald aan de hand van de eerder gepubliceerde literatuur. Voer een grondig literatuuronderzoek uit en observeer of de geïdentificeerde metaboliet ook dezelfde trend volgt als uw interesse.

Figuur 1: Fundamentele stappen in NMR-gebaseerde metabolomics. De figuur toont de belangrijkste stappen in op NMR gebaseerde metabolomics: het verzamelen en voorbereiden van monsters, het uitvoeren van NMR-spectroscopie, het voorbewerken van gegevens, het uitvoeren van statistische analyse, het identificeren en kwantificeren van metabolieten en het interpreteren van biologische significantie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Results

Om een metabolomics-onderzoek uit te voeren, is het essentieel om de steekproefomvang en de specifieke groepen die zullen worden geanalyseerd te bepalen. Het selecteren van een geschikte steekproefomvang is essentieel voor het verkrijgen van significante resultaten die nauwkeurig correleren met de ernst van de ziekte⁴⁸. In dit specifieke werk hebben we echter een kleine steekproefomvang gebruikt om de stappen te demonstreren die betrokken zijn bij de identificatie en kwantificering van metabolieten met behulp van op NMR gebaseerde metabolomics, die in de eerste plaats bedoeld was als referentie. In deze studie onderzochten we de metabole verschillen tussen patiënten in de milde en matige stadia van ARDS op dag 1 van hun IC-opname, waaronder in totaal 8 proefpersonen. Volgens het protocol werden NMR-spectra van alle monsters verkregen en verwerkt, en uiteindelijk werd een spreadsheet gemaakt met de binningresultaten.

Vervolgens voerden we een rigoureuze statistische analyse uit, waarbij de binningvellen werden gebruikt als invoerbestanden, waarbij de gegevens werden genormaliseerd met behulp van som, log en Pareto. We voerden PCA (Figuur 2A) en OPLS-DA (Figuur 2B) uit, waarbij de eerste clustering vertoonde, maar de laatste duidelijke discriminatie tussen de groepen aan het licht bracht en metabole verschillen benadrukte. Statistische analyse van de permutatietest (20x) leverde waarden op van R2Y=0,99 en Q2=0,47. Vervolgens voerden we een t-test (Figuur 2C) en biomarkeranalyse (Figuur 2D) uit om ontregelde metabolieten te identificeren. Volgens de criteria die in het protocolgedeelte worden beschreven, hebben we de resultaten gefilterd op de significante metabolieten (Tabel 2).

Figuur 2: Multivariate en univariate analyse. (A) Hoofdcomponentenanalyse (PCA) en (B) Orthogonale partiële kleinste-kwadratische discriminantanalyse (OPLS-DA) van milde ARDS-patiënten (weergegeven door rode kleur) en matige ARDS-patiënten (weergegeven door groene kleur). (C) De box-cum-whisker-grafieken benadrukken de verschillen in de relatieve concentratie van metabolieten tussen milde en matige ARDS-patiënten gedetecteerd door protonnucleaire magnetische resonantiespectroscopie in serummonsters. De x-as vertegenwoordigt de onderzoeksgroepen en de y-as toont de relatieve concentratie wanneer milde ARDS-patiënten (weergegeven door rode kleur) en matige ARDS-patiënten (weergegeven door groene kleur) werden vergeleken op dag 1 van IC-opname. (D) Het gebied onder de curve (AUC) plot van significante metabolieten die de ernst voorspellen, verkregen na het uitvoeren van biomarkeranalyse waarbij milde en matige ARDS-patiënten worden vergeleken op dag 1 van opname op de IC. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

S.No.	Naam	Spectrale locatie (ppm)	p-waarde	VIP	AUC-waarde
1	Lactaat	1.34	0.04	1.99	1
2	Isoleucine	1.42	0.03	2.01	0.875

Tabel 2: Lijst van significante metabolieten verkregen na vergelijking van milde en matige ARDS-patiënten op dag 1 van IC-opname.

Aangezien de resultaten werden verkregen in ppm-waarden, hebben we metabolieten toegewezen op basis van eerdere literatuur en deze gevalideerd via de profiler. Na de toewijzing werden lactaat en isoleucine verkregen als significante metabolieten, die ook zijn gerapporteerd in sommige eerdere ARDS-onderzoeken^30,40. We zorgden voor de selectie van goed opgeloste, niet-overlappende pieken. Na identificatie hebben we de lijst van de significante metabolieten gefilterd aan de hand van de criteria die in het protocol worden vermeld. Vervolgens kwantificeerden we de metabolieten van belang met behulp van de profilermodule door de spectra te openen, te zoeken naar de metaboliet van belang en de softwarepiek aan te passen aan de piek die in de spectra werd verkregen. Dit leverde de gekwantificeerde waarden van de metabolieten in mM op. Ter referentie werd een spreadsheet gegenereerd met monsternamen, namen van metabolieten en concentraties. Na kwantificering met de software kan validatie via andere benaderingen, zoals proteomics, worden uitgevoerd.

Bovendien worden de geïdentificeerde metabolieten grondig geanalyseerd om hun correlatie met de ernst van de ziekte te bepalen en om de biochemische routes te identificeren waarin deze metabolieten actief betrokken zijn. Aangezien slechts twee significante metabolieten werden geïdentificeerd na gebruik van de criteria vermeld in de sectie over materiaal en methode, was routeanalyse met behulp van de software niet mogelijk. Daarom werd een grondig literatuuronderzoek gedaan om de gestoorde metabole cycli in kaart te brengen. De twee metabolieten die in deze studie werden geïdentificeerd, correleerden met succes met de ernst van ARDS. Verhoogd lactaat duidde op longontsteking en anaërobe ademhaling, terwijl verhoogd isoleucine duidde op eiwitkatabolisme geassocieerd met longbeschadiging, infectie en energiemetabolisme⁴⁰. Het begrijpen van deze metabole routes heeft een tweeledig doel. Ten eerste onthult het de complexiteit van de ziekte en geeft het inzicht in de biologische mechanismen ervan. Ten tweede helpt het de therapeutische vooruitgang door clinici te begeleiden bij het op maat maken van behandelingen voor patiënten, wat uiteindelijk de klinische resultaten verbetert.

Discussion

Metabolomics identificeert en kwantificeert efficiënt metabolieten, gericht op de metabole cycli die tijdens de ziekte verstoord raken. De kwaliteit van de resultaten hangt af van de nauwgezette uitvoering van elke stap in de metabolomics-aanpak. Elke fase, van monsterselectie en -verzameling tot route-identificatie, is van cruciaal belang bij het nauwkeurig identificeren van de primaire factoren die bijdragen aan de ziekte. Alvorens metabolomics uit te voeren, is een grondig onderzoek van de literatuur essentieel en moet in elke fase zorgvuldig worden opgelet

Bij het ontwerpen van een metabolomics-onderzoek is de selectie van een monster cruciaal voor het extraheren van significante informatie en het garanderen van een ideale monstervoorbereiding, of het nu gaat om gerichte of ongerichte metabole vingerafdrukken van de klinische aandoening in kwestie. Een goede verwerking van de eerste monsters is van cruciaal belang en protocollen moeten consequent worden gevolgd voor alle monsters tijdens het onderzoek⁴⁹. Extra voorzichtigheid is geboden bij het werken met klinische monsters. Veelgebruikte monsters voor op NMR gebaseerde metabolomics zijn biovloeistoffen, celextracten en weefselextracten^50,51. Cerebrospinale vloeistof (CSF) en urine vereisen vaak een minimale voorbehandeling en worden vaak bestudeerd in contexten zoals niergerelateerde aandoeningen, neurodegeneratieve ziekten en toxiciteit van geneesmiddelen. Volbloed, plasma en serum bieden uitgebreide informatie voor een breed spectrum van kritieke ziekten en hebben de voorkeur vanwege het gemak van verzameling. Een breed scala aan andere biovloeistoffen, zoals zaadvloeistof, speeksel, gal, dialysevloeistof, vruchtwater, uitgeademd ademcondensaat, longaspiraten, gewrichtsvloeistof en mini bronchoalveolaire lavagevloeistof (mBALF), zijn op grote schaal gebruikt vanwege hun specificiteit en nauwkeurigheid met behulp van NMR 52,53,54. Elke biovloeistof heeft zijn voordelen en uitdagingen op het gebied van verzameling, beschikbaarheid en informatieve inhoud, afhankelijk van de studie of de experimentele opzet⁵⁵. We hebben ons voor deze studie gericht op serummonsters van ARDS-patiënten, omdat bloedmonsters doorgaans informatie bieden op het niveau van het hele lichaam en niet significant worden beïnvloed door extreme dagelijkse variaties. Aan de andere kant zijn urinemonsters onderhevig aan verschillende fluctuaties en kunnen ze worden beïnvloed door voeding, levensstijl, medicijnen en omgevingsfactoren²⁷. Een goede opslag van monsters is ook belangrijk om enzymatische activiteit of microbiële afbraak te voorkomen. Monsters worden doorgaans gecryopreserveerd bij -80 °C met minimale vries-dooicycli om metabolische afbraak te voorkomen en de stabiliteit van het monster te behouden. Het monster kan gedurende langere tijd bij -80 °C worden bewaard, waardoor NMR-experimenten gemakkelijk kunnen worden uitgevoerd. Het is echter raadzaam om het experiment zo snel mogelijk te plannen en uit te voeren voor een optimaal resultaat.

In deze studie hebben we een 800 MHz NMR-spectrometer gebruikt voor data-acquisitie, die spectrale gegevens met een hoge resolutie levert. Voor dit experiment hebben we ons gehouden aan dezelfde acquisitieparameters als hierboven vermeld. Het is echter belangrijk op te merken dat dezelfde acquisitieparameters die in dit protocol worden beschreven, kunnen worden toegepast met behulp van NMR-spectrometers die werken met andere magnetische veldsterktes. Het aantal scans kan worden verhoogd wanneer met een lager magnetisch veld wordt gewerkt om de resolutie te verbeteren. Hoewel hogere veldsterktes een betere resolutie kunnen bieden, blijven de kernaspecten van het acquisitieproces, zoals pulssequenties, relaxatievertragingen en temperatuurregeling, consistent in verschillende instrumenten, waardoor de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van de resultaten worden gegarandeerd.

Het volgen van een gestandaardiseerde procedure is essentieel om de reproduceerbaarheid en onpartijdigheid te behouden, aangezien afwijkingen de daaropvolgende gegevensanalyse en -evaluatie kunnen belemmeren. Elke stap van het NMR-experiment moet minutieus worden uitgevoerd, aangezien de kwaliteit van de spectra ervan afhangt. Speciale aandacht moet worden besteed aan shimming, omdat het de piekvorm definieert, en acquisitieparameters moeten worden geoptimaliseerd op basis van het monster en het onderzoeksontwerp. Voor monsters met een lage metabolische concentratie in het monster kan het aantal scans worden verhoogd. Data-acquisitie in NMR omvat standaardoptimalisatie van zowel 1D- als 2D-experimenten die zijn afgestemd op de keuze van het monster en de specifieke vereiste informatie. Verschillende NMR-experimenten zijn geoptimaliseerd om spectra van hoge kwaliteit uit biovloeistoffen te verkrijgen, waardoor de impact van ongewenste macromoleculen wordt geminimaliseerd. De CPMG-pulssequentie⁵⁶ heeft de voorkeur voor monsters zoals serum, plasma of hersenvocht. Deze techniek onderdrukt de brede signalen van macromoleculen zoals lipiden en eiwitten, die lange transversale relaxatietijden hebben en de resonanties van metabolieten met een laag molecuulgewicht kunnen verdoezelen.

De voorverwerking van de gegevens omvat de tussenliggende methoden die worden gebruikt om een uniforme en homogene gegevensanalyse en de interpretatie ervan te garanderen. Dit proces omvat het vermijden van ongewenste signalen of spectrale gebieden die vatbaar zijn voor inconsistenties en het corrigeren van piekverschuivingen. In biovloeistoffen betekent het uitsluiten van ongewenste gebieden vaak het verwijderen van signalen, zoals die uit water, die het bereik van 4,6 ppm tot 5 ppm domineren. Piekverschuivingen, veroorzaakt door variaties in pH, temperatuur, zoutconcentratie, verdunningsfactoren en ionische samenstelling, kunnen worden geminimaliseerd door buffers te gebruiken bij een homeostatische pH. Bovendien kan het gebruik van standaard referentieverbindingen, piekuitlijning en binning helpen om piekverschuivingen te verminderen. Piekuitlijning is cruciaal om patronen te correleren tussen verschillende spectra die onder identieke omstandigheden zijn verkregen.

De verwerking van spectra moet op de juiste manier worden uitgevoerd om later in de analyse een nauwkeurige binning te garanderen. Alle spectra moeten uniform worden gekalibreerd en uitgelijnd, en basis- en fasecorrecties kunnen handmatig of automatisch worden uitgevoerd. Een goede fase- en basiscorrectie, evenals kalibratie, zijn van cruciaal belang. Het uitvoeren van een basislijncorrectie is essentieel om verstoringen te voorkomen die de identificatie en kwantificering van metabolieten kunnen beïnvloeden⁵⁷. Fasecorrectie is nodig om ervoor te zorgen dat er geen vervormde of omgekeerde pieken de interpretatie van de resultaten kunnen beïnvloeden. Beslis zorgvuldig over de criteria voor het selecteren van significante metabolieten en filter de resultaten dienovereenkomstig. Aangezien binning resultaten oplevert in de vorm van ppm-waarden, moet u de naam van de metaboliet nauwkeurig identificeren met behulp van verschillende bronnen die in het protocol worden genoemd. Als er meerdere metabolieten aanwezig zijn met dezelfde ppm-waarden, identificeer ze dan aan de hand van de piekvorm.

Alvorens de statistische analyse uit te voeren, wordt normalisatie uitgevoerd om variaties in de dataset te verminderen, al dan niet geïnduceerd, als gevolg van verschillen in omvang en fluctuaties in metabolietconcentraties. Dit proces omvat verschillende methoden voor centreren, schalen en transformeren, gekozen op basis van de verdeling en variabiliteit van de gegevens. Het doel is om ongewenste systematische vooringenomenheid te minimaliseren met behoud van de biologische factoren die van belang zijn. Multivariate methoden, waaronder PCA, PLS-DA en OPLS-DA, worden gebruikt om differentiële metabolieten met VIP-waarden groter dan 1 vast te stellen. De voorspelbaarheid en kruisvalidatie van het model worden bepaald aan de hand van R2 (goodness of fit) en Q2 (goodness of prediction) waarden, terwijl permutatieteststatistieken het model valideren. Een op Pearson-correlatie gebaseerde heatmap beoordeelt de robuustheid van het model door op- en neergetelde metabolieten in subfenotypes en de resulterende endotypes op te sommen.

Univariate methoden, zoals de student t-test en ANOVA, zoals Bonferroni-correctie of minimalisering van FDR (false discovery rate) en Benjamini-Hochberg, worden gebruikt om de kans op valse positieven te verkleinen. Deze methoden bieden een ruwe maat voor potentieel belangrijke kenmerken, onafhankelijk van hun correlatie binnen of tussen moleculen en andere verstorende factoren. Significante metabolieten worden geïdentificeerd op basis van een p-waarde van minder dan 0,05, die vervolgens worden gebruikt om metabole endotypes in uitkomstsubgroepen⁴⁵ te onderbouwen.

Individuele box whisker-plots en AUROC worden gebruikt om de specificiteit en gevoeligheid van de endotypes in uitkomstsubgroepen te evalueren. De klinische score wordt gecombineerd met het model in AUROC om de nauwkeurigheid van het model te valideren. De AUC-waarde > 0,8 wordt als significant beschouwd⁴⁶. Verschillende andere tests zijn online beschikbaar om de nauwkeurigheid van de discriminatie en werkzaamheid van geïdentificeerde metabolieten te testen. Sommigen van hen zijn willekeurige bosclassificatie, heatmap, correlatie, ^enz.45.

Er worden verschillende benaderingen gebruikt om significante metabolieten te kwantificeren, waaronder piekintegratie, wat een uitdaging kan zijn voor beginners vanwege hun geavanceerde aard. Identificeer karakteristieke pieken voor metabolieten door te verwijzen naar individuele chemische verschuivingen voor nauwkeurige identificatie. Bepaal de oppervlakte van deze karakteristieke pieken ten opzichte van de oppervlakte van de referentiepiek, TSP. Om de absolute concentratie van een metaboliet (Cm) te berekenen, gebruikt u de volgende vergelijking:

Cm = Im.nr.Cr/Ir.nm

Waarbij Cr de concentratie van de referentieverbinding (TSP) in de oplossing is, zijn Im en Ir de geïntegreerde piekgebieden (kunnen worden verkregen met behulp van NMR-verwerkings- en analysetool) van respectievelijk de metaboliet en de referentie (TSP), en nm en nr zijn het aantal protonen dat respectievelijk de metaboliet- en referentiepieken vertegenwoordigt²⁴.

Als alternatief wordt geautomatiseerde kwantificeringssoftware voor NMR-metabolieten gebruikt om metabolietconcentraties voor enkele of meerdere spectra te verkrijgen op basis van de concentratie van de referentiestandaard, TSP. Kwantificering met behulp van software vereenvoudigt het proces en verkleint de kans op fouten in vergelijking met andere methoden. Hoewel dit onderzoeksartikel het gebruik van software voor het kwantificeren van metabolieten belicht, kunnen er problemen optreden als de metaboliet van belang niet aanwezig is in de softwarebibliotheek. Bovendien wordt de software betaald, dus alleen onderzoekers met een geautoriseerde licentie kunnen er gebruik van maken.

Metabolomics heeft bewezen een belangrijke rol te spelen bij het ontrafelen van de complexiteit van verschillende ziekten door ontregelde metabole cycli te identificeren die bijdragen aan de ernst van de ziekte. Het vertalen van deze bevindingen naar de klinische praktijk was echter een uitdaging. De medische gemeenschap legt nu de nadruk op een gepersonaliseerde geneeskundebenadering om de ziekteresultaten te verbeteren. Hoewel het identificeren van ontregelde metabolieten voorheen voldoende was, richten de huidige inspanningen zich op nauwkeurige kwantificering om ziektespecifieke bereiken te definiëren. Deze informatie is van onschatbare waarde voor clinici bij het aanpassen van behandelstrategieën. De vooruitgang in kwantificeringstechnieken heeft de onderzoeksinspanningen vergemakkelijkt, waarbij tal van onderzoeksgroepen over de hele wereld deze benaderingen met succes hebben toegepast met behulp van gespecialiseerde software.

Deze vooruitgang onderstreept het potentieel van metabolomics om een aanzienlijke impact te hebben op gepersonaliseerde geneeskunde en de klinische resultaten te verbeteren. Bovendien belooft de integratie van metabolomics-gegevens met andere omics-gegevens, zoals genomics en proteomics, een beter begrip van ziektemechanismen te verschaffen en therapeutische interventies verder te verfijnen. Naarmate de technologie zich blijft ontwikkelen, wordt verwacht dat de precisie en bruikbaarheid van metabolomics in klinische omgevingen zullen toenemen, wat de weg vrijmaakt voor effectievere en gepersonaliseerde oplossingen voor de gezondheidszorg.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centirfuge	Sigma aldrich	3-18KS
Chenomx NMR suite	NMR Suite, v9, Chenomx Inc., Edmonton, Canada		NMR metaboliet kwantificatiesoftware
Co-axial insert	Sigma aldrich	Z278513
Deuterim oxide	Sigma aldrich	151882
Eppendorf tubes	Tarsons	500020
Metaboanalyst	Wishart Research Group		Metabolomics statistische analysesoftware
NMR tube	Wilmad	Z412007	5mm diameter
Pipette	Eppendorf research plus	3123000039	0-100 μl
Sample collection vials	Tarsons cryo chill vials	523194
Sodium azide	Sigma aldrich	S2002
Sodium chloride crystal	Sigma aldrich	S9625
Sodium phosphate dibasic	Sigma aldrich	567550
Sodium phosphate monobasic	Sigma aldrich	S0751
Topspin 3.6.4	Bruker		NMR verwerkings- en analysetool
Tsp salt	Sigma aldrich	269913