Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Identificatie en kwantificering van gestoorde metabolieten bij ernstig zieke patiënten met behulp van op NMR gebaseerde metabolomics

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67319

⸱

29 november 2024

 ,  ,  , 
1Centre of Biomedical Research, SGPGIMS Campus, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), 3Department of Critical Care Medicine, Sanjay Gandhi Postgraduate Institute of Medical Sciences

In dit artikel

Samenvatting

Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie wordt gebruikt om ontregeling in de metabolieten te identificeren bij patiënten met verschillende ziekten. Deze techniek maakt het mogelijk om de gestoorde metabolieten te kwantificeren, waardoor de pathofysiologische inzichten worden ontrafeld. Hier beschrijven we de stap-voor-stap procedure van de NMR-gebaseerde benadering voor de metabole karakterisering van de patiënten.

Samenvatting

Metabolomics is in opkomst als een belangrijke benadering om de reactie van het individu op pathofysiologische aandoeningen weer te geven. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie is geëvolueerd als een hulpmiddel om metabole ontregeling te identificeren bij ernstig zieke patiënten die lijden aan aandoeningen zoals acute respiratory distress syndrome (ARDS), ernstige acute pancreatitis (SAP), acuut nierletsel (AKI) en sepsis. De spectrale gegevens van het serummonster van de onderzoeks- en controlegroep worden geregistreerd met behulp van een 800 MHz NMR-spectrometer en verwerkt met behulp van NMR-verwerkings- en analysetools. Bovendien wordt een rigoureuze statistische analyse, zoals univariate en multivariate tests, uitgevoerd om significante metabolieten te lokaliseren, die vervolgens nauwkeurig worden geïdentificeerd en gekwantificeerd met behulp van NMR-metabolietkwantificeringssoftware. Bovendien benadrukt pathway-analyse de gestoorde biochemische cycli die resulteren in de ernst van de ziekte. Door middel van deze alomvattende aanpak willen onderzoekers een dieper inzicht krijgen in de metabole veranderingen die verband houden met deze kritieke ziekten, wat mogelijk de weg vrijmaakt voor een beter begrip van de ziekte en verbeterde diagnostiek en behandelingsstrategieën.

Inleiding

Ondanks voortdurende inspanningen om wereldwijd een efficiënte diagnose van ziekten te bieden, heeft doelgerichte therapie nog steeds niet zijn ware potentieel bereikt. Verschillende benaderingen, zoals transcriptomics, proteomics, enz., hebben geresulteerd in de identificatie van verschillende biomarkers, maar deze hadden niet voldoende klinisch nut vanwege het gebrek aan gevoeligheid en specificiteit 1,2. Doelgerichte therapie is een grote uitdaging bij sommige multifactoriële ziekten, wat uiteindelijk leidt tot een hogere mortaliteit. Er is behoefte aan een beter begrip van het onderliggende mechanisme en de pathofysiologie van complexe ziekten die met een grote heterogeniteit bestaan. In dit opzicht heeft de ontwikkeling van metabolomics dus een revolutie teweeggebracht in de therapeutische ontwikkeling, wat uiteindelijk kan helpen bij het afstemmen van de behandelingsregimes op verschillende kritieke ziekten zoals acute respiratory distress syndrome (ARDS), sepsis en ernstige acute pancreatitis (SAP).

Metabolomics is een alomvattende benadering gericht op het identificeren en kwantificeren van moleculen met een klein molecuulgewicht (metabolieten zoals aminozuren, lipiden, peptiden, organische zuren en vitamines) in verschillende biovloeistoffen, cellen of weefselextracten. Deze metabolieten, die doorgaans minder dan 1500 Da wegen, spelen een actieve rol in biochemische processen en weerspiegelen een progressief overzicht van de biologische toestand van het organisme. Ze omvatten substraten voor belangrijke enzymatische processen, tussenproducten in biologische routes en bijproducten van het cellulaire metabolisme. Bijgevolg legt metabolomics een gedetailleerde vingerafdruk vast van voedingsinvloeden, geneesmiddelinteracties en ziektetoestanden. Metabolietveranderingen zijn zeer gevoelige indicatoren van metabolisme en biologische routes, waardoor correlaties met fenotypische expressies en resulterende pathofysiologische afwijkingen mogelijk zijn 3,4. Initiële variaties in metabolieten kunnen dienen als vroege indicatoren van de ernst van de ziekte, terwijl tijdelijke veranderingen kunnen helpen bij het monitoren van de werkzaamheid van de behandeling, ziekteprogressie en klinische resultaten 5,6,7. Metabolomics verbetert dus klinische assays en verschillende andere omics-benaderingen door ziekten te herdefiniëren door middel van klinische, fysiologische en biochemische eindpunten 8,9,10,11,12,13. De analytische mogelijkheden van metabolomics worden gebruikt om de vatbaarheid voor ziekten te monitoren en te bepalen door middel van gewijzigde metabolietconcentraties14,15.

In deze context zijn zowel massaspectrometrie (MS) als nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie naar voren gekomen als de primaire analytische platforms voor metabolietprofilering in biologische monsters. Deze methoden worden gebruikt voor zowel gerichte als ongerichte identificatie en kwantificering van metabolieten 16,17,18. Elk platform heeft zijn voordelen en beperkingen, maar de niet-destructieve aard van NMR maakt het geschikt voor de voorkeur in verschillende in vivo onderzoeken en voor de karakterisering van de structuur van onbekende verbindingen, met name in de beginfase van metabolomics-onderzoek. De monsterfractionering, derivatisering en ionisatie die nodig zijn voordat MS kan vertekeningen veroorzaken en vaak resulteren in monsterverlies, wat van invloed is op de dynamische kenmerken die NMR-spectroscopie kan vastleggen met minimale of geen monstervoorbereiding. De belangrijkste beperking van NMR is de lagere gevoeligheid in vergelijking met MS, die een lagere detectielimiet biedt, waardoor het een uitdaging is om minder overvloedige metabolieten te detecteren19. Ontwikkelingen zoals supergeleidende magneten met hoge resolutie, cryogeen gekoelde NMR-sondes en technieken die de gevoeligheid verbeteren, hebben deze beperking echter verzacht 20,21,22. Als complementaire benadering van genomica en proteomics wint metabole profilering met behulp van NMR-spectroscopie aan populariteit als voorkeurstechniek 23,24,25. De minimale monstervoorbereiding, reproduceerbaarheid en herhaalbaarheid van NMR maken het een waardevol hulpmiddel voor het vastleggen van de inherente dynamische kenmerken van metabolieten, ondanks de gevoeligheidsuitdagingen26.

Verschillende onderzoeksgroepen hebben metabolomics met succes uitgevoerd, waarbij het ontregelde metabole profiel van patiënten voor verschillende ziekten27 werd vastgesteld, zoals ARDS 28,29,30,31,32,33, longontsteking 34, sepsis7, galstenen35 en pancreatitis36. Op NMR gebaseerde metabolomics-onderzoeken van ernstig zieke patiënten hebben een belangrijke rol gespeeld bij het volgen van de progressie van systemisch inflammatoir responssyndroom (SIRS) naar meervoudig orgaandisfunctiesyndroom (MODS), een belangrijke oorzaak van mortaliteit en morbiditeit op de intensive care (ICU)37. In een studie van Stringer et al. werden plasmamonsters gebruikt om metabole veranderingen te onderzoeken bij patiënten met door sepsis geïnduceerde acute longbeschadiging (ALI) in vergelijking met controlepatiënten38. De belangrijkste metabolieten die in deze pilotstudie verhoogd werden gevonden, weerspiegelden de betrokken metabole routes en hun associatie met klinische scores. Dit onderzoek werd uitgebreid naar serummetabolomics om sepsis te onderscheiden van de vroege stadia van longbeschadigingsmechanismen bij ARDS32. Bovendien identificeerde een andere studie in ARDS krachtige serumbiomarkers die duidelijk onderscheid maken tussen acuut longletsel/ARDS en gezonde controles, en biedt het inzicht in systemische metabole veranderingen die overeenkomen met het acute begin van longbeschadiging39,40.

NMR-spectroscopie is een geautomatiseerde analytische techniek met hoge doorvoer die robuuste en onbevooroordeelde informatie levert over de metabole vingerafdruk die de onderliggende pathofysiologie onthult38. De klinische toepassing en biologische interpretatie van NMR-gegevens hangen af van het verkrijgen van spectra van hoge kwaliteit die rijke informatie bevatten. Daarom is het van cruciaal belang om te zorgen voor nauwkeurige, uniforme en goed geformuleerde gegevensverzameling, -verwerking en -analyse. Daarom is het doel van deze studie om de essentiële stappen van NMR-gebaseerde metabolomics te benutten voor de identificatie en kwantificering van metabolieten. Deze studie belicht de belangrijkste stappen van het protocol dat nodig is voor klinisch metabolomics-onderzoek (Figuur 1), zoals de selectie van geschikte monsters, verzameling en opslag, monsterverwerking en -voorbereiding, gegevensverzameling en -analyse, het identificeren en kwantificeren van de metaboliet van belang, en uiteindelijk, interpretatie van de resultaten in een klinische context om relevante inzichten af te leiden. Elk van deze stappen is essentieel voor het gebruik van NMR-spectroscopie in metabolomics om significante biologische en klinische inzichten te ontdekken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Ethische goedkeuring (IEC-code: 2022-71-PhD-126) werd verkregen van de IEC van Sanjay Gandhi Postgraduate Institute of Medical Sciences (SGPGIMS), Lucknow. Er werden schriftelijke en geïnformeerde toestemmingen verkregen van de patiënten of hun familieleden om het onderzoek uit te voeren en de gegevens voor onderzoeksdoeleinden te publiceren. Bovendien is het onderzoek uitgevoerd volgens de richtlijnen van de instelling.

1. Onderzoeksopzet en ethische klaring

  1. Bepaal de steekproefomvang voor elke groep. Bekijk en stel de selectiecriteria voor deelnemers zorgvuldig vast. Bovendien, als de onderzoeksopzet de opname van monsters van mensen of dieren vereist, verkrijg dan ethische goedkeuring van de juiste institutionele ethische commissie (IEC) voordat u begint met het verzamelen van monsters.
  2. Selecteer ARDS-patiënten gecategoriseerd als mild, matig en ernstig, op basis van de diagnostische criteria van de definitie van Berlijn 2012 op basis van de partiële zuurstofdruk in arterieel bloed (PaO2) tot de fractie ingeademde zuurstof (FiO2) (P/F) verhouding. De ARDS-patiënten met een P/F-bereik van 300-200 worden beschouwd als mild, 200-100 als matig en onder de 100 als ernstig38. Hier hebben we ons gericht op twee groepen: milde en matige ARDS-patiënten (zie tabel 1).
    OPMERKING: De studie omvat het gebruik van serum verkregen uit bloedmonsters om op NMR gebaseerde metabolomics uit te voeren. In deze studie hadden de ter referentie opgenomen deelnemers een gemiddelde leeftijd van 42 jaar (± 10,9 jaar), met een geslachtsverdeling van 2 mannen en 6 vrouwen.

CategorieP/F-verhouding
Redelijk300-200
Gematigd200-100
Ernstig100-0

Tabel 1: Categorisering van ARDS-patiënten.

2. Selectie, verzameling en verwerking van monsters

  1. Voer serumisolatie uit door de onderstaande stappen te volgen.
    1. Om te experimenteren, verzamel 2 ml bloedmonsters uit de slagaders met behulp van een steriele naald in een gewone (zonder toevoegingen) en steriele injectieflacon. Laat het monster 30 minuten stollen bij kamertemperatuur. Voor deze studie werden 4 patiënten met de diagnose milde ARDS en 4 patiënten met matige ARDS geselecteerd.
    2. Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 3100 x g om het serum25 te scheiden. Breng het serum over in steriele microcentrifugebuisjes, maak aliquots met een kleiner volume (d.w.z. 400-500 μL), label ze op de juiste manier (naam van de patiënt, CR-nummer, dagpunt, enz.) en bewaar ze bij -80 °C voor toekomstige analyse.
      OPMERKING: Op dit punt kan het experiment worden gepauzeerd en hervat op een geschikt moment.
  2. Verwerk het serummonster vóór NMR-experimenten met behulp van de volgende stappen.
    1. Ontdooi het monster voordat u de NMR-experimenten uitvoert. Meng 250 μL aliquoot van het serum met 250 μL zoute fosfaatbufferoplossing (bevattende 100% D2O, 0,9% NaCl, 50 mM natriumfosfaatbuffer, pH 7,4) om pH-variatie te minimaliseren.
    2. Draai het mengsel een paar seconden (~15 s) om ervoor te zorgen dat het homogeen gemengd is. Breng ten slotte het voorbereide monster over naar een schone NMR-buis met een coaxiaal inzetstuk dat trimethylsilylpropionaat (TSP) bevat in een concentratie van 0,05 mM, dat dient als externe standaard voor kalibratie en kwantificering41.
      OPMERKING: Ter referentie wordt een inerte en niet-reactieve verbinding gebruikt die geen interactie heeft met de analyten. Andere veelgebruikte referentieverbindingen zijn tetramethylsilaan (TMS) en natriumtrimethylsilylpropaansulfonaat (DSS).

3. NMR-experimenten

OPMERKING: De focus ligt op het identificeren van kleine moleculen in de serummonsters, daarom hebben we de Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) pulssequentie gebruikt, die macromolecuulsignalen onderdrukt. Alle serummonsters in deze studie werden geregistreerd met behulp van een 800 MHz NMR-spectrometer uitgerust met een cryogeen gekoelde drievoudige resonantie TCI 5 mm breedband inverse sondekop en afgeschermde z-gradiënt.

  1. Plaats het monster in de magneet. Schrijf het commando wrpa (vermeld experimentnummer) en druk op enter om een protonexperiment op te zetten met het cpmg-pulsprogramma. Vermeld de naam van de patiënt en andere noodzakelijke gegevens door op de optie Titel te klikken.
  2. Vergrendel het magnetische veld door de opdracht Lock te schrijven , op enter te drukken en de optie 90% H2O en 10% D2O verder te selecteren. Stem de sonde handmatig af en pas deze aan met ATMM om de efficiëntie van radiofrequentiepulsen te optimaliseren en de gevoeligheid te maximaliseren. Voer 1D gradiënt shimming uit door op topshim te klikken.
  3. Stel de volgende acquisitieparameters in, waaronder een relaxatievertraging van 5 s, een spectrale sweep-breedte van 12 parts per million (ppm) en een echotijd van 300 μs. Al deze parameters kunnen eenvoudig worden gewijzigd door de optie Acquisitieparameters in het bovenste paneel te selecteren.
  4. Pas een lijnverbreding van 0,3 Hz toe met behulp van een exponentiële vensterfunctie, waarbij gegevens worden verzameld in 64.000 punten over 128 scans. Deze parameters kunnen op dezelfde manier worden gewijzigd door de optie Acquisitieparameters in het bovenste paneel te selecteren. Door op Acquisitieparameters te klikken, verschijnt een lijst met specificaties en kunnen de genoemde attributen, samen met andere parameters, tijdens de optimalisatie worden gewijzigd.
  5. Verkrijg de NMR-spectra met behulp van NMR-verwerkings- en analysetools. Zodra de definitieve spectra zijn verkregen, schrijft u de opdracht apk en absn en drukt u op enter om respectievelijk fasecorrectie en basislijncorrectie uit te voeren. Klik op de optie As kalibreren op het bovenste paneel en kalibreer vervolgens de TSP-piek automatisch of handmatig op 0 ppm.
  6. Breng de verkregen gegevens over van het systeem naar het werkstation, waar verdere verwerking en analyse worden uitgevoerd.
    OPMERKING: De experimentele fase is nu voltooid en kan worden gepauzeerd. Het voorverwerken, analyseren en interpreteren van gegevens kan gemakkelijk worden uitgevoerd.

4. Voorverwerking van gegevens

  1. Voer de voorverwerking van de gegevens uit met behulp van NMR-verwerkings- en analysetools en NMR-metabolietkwantificeringssoftware.
    1. Soms is alleen automatische correctie niet voldoende, en in dat geval is ook handmatige correctie noodzakelijk. Om fasecorrectie handmatig uit te voeren, klikt u op de optie Proces in de bovenste menubalk van NMR-verwerkings- en analysetools. Klik vervolgens op Fase aanpassen, sleep de muis en observeer totdat de spectra fasegecorrigeerd zijn. Als u klaar bent, klikt u op de optie Opslaan en retourneren (aanwezig in de vorm van een pictogram) die beschikbaar is in dezelfde menubalk.
    2. Om handmatige basislijncorrectie (Whittaker-methode) uit te voeren, opent u het spectrale bestand in de processormodule van de NMR-metabolietkwantificeringssoftware. Selecteer de optie Basislijncorrectie. Selecteer vervolgens de optie Whittaker Methode. Plaats nu de stippen aan de basis van de pieken in de hele spectra (0,0 tot 10 ppm, meestal in het geval van serum of afhankelijk van de beschikbaarheid van de metaboliet in de spectra) om de basis aan te passen. Nadat alle spectrale bestanden zijn gecorrigeerd in de basislijn, slaat u ze op in een enkele map. Verdere verwerking, met behulp van de processor of de profilermodule van de NMR-metabolietkwantificeringssoftware, kan worden uitgevoerd met behulp van hetzelfde bestand dat in het specifieke formaat is opgeslagen.
    3. Voer binning uit met behulp van de profilermodule van dezelfde software. Selecteer de optie Extra, vervolgens Batchproces en vervolgens Spectrale binning.
  2. Als u het definitieve binningsblad wilt genereren dat moet worden gebruikt voor statistische analyse, selecteert u de map met alle voor de basislijn gecorrigeerde spectrale bestanden nadat u op Spectrale binning hebt geklikt.
  3. Verdeel de spectra in een bepaald aantal bakken van gelijke grootte met een gedefinieerde spectrale breedte, variërend van 0,01 tot 0,04 ppm (kan worden geoptimaliseerd volgens het onderzoek). Dit proces vereenvoudigt en organiseert de spectrale gegevens, waardoor een consistentere analyse mogelijk wordt. Geef de bucketgrootte op, samen met de ppm-waarden voor het begin en het einde en geef de map aan waarin de uitvoerbinningvellen worden opgeslagen.
  4. Sluit de chemische verschuivingsgebieden uit die overeenkomen met water en het oplosmiddel TSP (4,8-5,2 en 0,0-0,7 ppm) om spectrale interferentie te voorkomen 42,43,44.
  5. Dit werkblad bevat de voorbeeldnamen in de ene rij en de verschillende bin-waarden samen met ppm in de andere rijen. Voordat u dit blad voor statistische analyse gebruikt, moet u het wijzigen door de steekproeven in groepen voor analyse te ordenen en het alleen in door komma's gescheiden (CSV) op te slaan.
    OPMERKING: Bij het vergelijken van de milde groep met de matige groep ARDS-patiënten hebben we bijvoorbeeld de gegevens gerangschikt met milde en matige labels, een serienummer toegevoegd en het bestand opgeslagen in CSV-indeling.

5. Statistische analyse

OPMERKING: Het binningblad dat uit de vorige stap is verkregen, dient als invoerbestand voor statistische analyse. In deze studie werd de module statistische analyse (één factor) van de statistische analysesoftware voor metabolomics gebruikt.

  1. Voer vóór statistische analyse de normalisatiestap uit met behulp van som, log en Pareto, maar deze kan variëren in verschillende onderzoeken45.
  2. Voer univariate en multivariate analyses uit om de verschillende groepen te onderscheiden en de nauwkeurigheid van de geïdentificeerde metabolieten te bepalen.
    1. Voer hoofdcomponentenanalyse (PCA), gedeeltelijke kleinste-kwadratenanalyse (PLS-DA) en orthogonale gedeeltelijke kleinste-kwadratenanalyse (OPLS-DA) uit om discriminatie tussen de groepen te observeren, wat resulteert in VIP-scores met variabel belang van projectie voor elke metaboliet die verantwoordelijk is voor het verschil in het metabole profiel.
    2. Voer univariate methoden uit, zoals de student t-test en ANOVA, om de significante metabolieten te identificeren op basis van de criteria van een p-waarde van minder dan 0,05. Beide tests leveren box whisker-plots op die het verschil in de relatieve concentratie van de metabolieten laten zien.
    3. Voer een biomarkeranalyse uit, die een gebied oplevert onder de AUROC-grafiek (Operating Operating Characteristics Curve) van de ontvanger. De AUC-waarde (gebied onder de curve) > 0,8 wordt als significant beschouwd46.
    4. Selecteer de definitieve lijst van significante metabolieten met behulp van de criteria VIP-score>1, Bonferroni-gecorrigeerde p-waarde<0,0544 en AUC > 0,846.
  3. Identificeer metabolieten zoals hieronder beschreven.
    1. Binning levert significante metabolieten in de vorm van ppm-waarden in plaats van namen. Identificeer de metabolieten die overeenkomen met specifieke ppm-waarden met behulp van databases zoals de Biological Magnetic Resonance Bank (BMRB)47en de Human Metabolome Database (HMDB).
    2. Gebruik daarnaast eerder gepubliceerde literatuur42,44 voor identificatie en validatie.
    3. Gebruik de profilermodule van de NMR-metabolietkwantificeringssoftware om de geïdentificeerde metabolieten te bevestigen met hun ppm-waarden.

6. Kwantificering van metabolieten met behulp van NMR-software voor het kwantificeren van metabolieten

OPMERKING: De profilermodule van de software wordt veel gebruikt om de geïdentificeerde metabolieten te kwantificeren.

  1. Voordat u met de kwantificering begint, kalibreert u de referentieverbinding die voor het onderzoek is geselecteerd (tsp gebruikt in dit onderzoek) met behulp van de processormodule. Klik op de optie CSI kalibreren (chemische vormindicator). Vermeld de concentratie van de referentieverbinding (0,05 mM voor deze studie). Sleep vervolgens de softwarepiek naar de spectrale referentiepiek en pas de hoogte en breedte correct aan. Zodra de spectrale referentiepieken overeenkomen met de piek van de software, klikt u op Accepteren.
  2. Open de gewenste spectra in de profilermodule en selecteer de juiste samengestelde bibliotheek voor onderzoek.
  3. Onderaan het scherm wordt een lijst met metabolieten weergegeven. Selecteer de metaboliet die van belang is uit deze lijst. Eenmaal geselecteerd, verschijnt de mogelijke ppm van de gekozen metaboliet in de bovenhoek van de spectra.
  4. Selecteer de ppm-waarde in de bovenhoek en zoom in op de spectra tot de specifieke ppm-schaal van de metaboliet.
  5. Op dit punt verschijnen er twee pieken op het scherm: een die de geregistreerde gegevens vertegenwoordigt en de andere, weergegeven als een stippellijn, die de softwarepiek vertegenwoordigt. Lijn beide pieken uit. Sleep de softwarepiek en pas de hoogte en positie aan zodat deze overeenkomen met de piek in het voorbeeld.
  6. Zodra de concentratie van de metaboliet correct is uitgelijnd, kan deze worden verkregen uit de waarde die voor die metaboliet wordt weergegeven onder de kop concentratie in mM (figuur 1).
  7. Volg dezelfde procedure voor alle metabolieten en monsters en exporteer de gekwantificeerde waarden in een spreadsheet. Om het uitvoerbestand te genereren, klikt u op de optie Batchbewerkingen onder het menu Extra . Geef de gewenste map op voor het opslaan van het uitvoerbestand.

7. Analyse van de route

OPMERKING: De significante metabolieten die na analyse zijn geïdentificeerd, worden gebruikt om de belangrijkste routes te bepalen die de uitkomst in ziektegroepen rechtstreeks beïnvloeden. De routeanalysemodule van metabolomics statistische analysesoftware en de KEGG-database worden over het algemeen voor dit doel gebruikt.

  1. Voer de verkregen lijst met significante metabolieten in de module in. Er wordt een lijst gegenereerd met de namen van de routes.
  2. Selecteer de uiteindelijke routes op basis van een criterium van een impactfactor van meer dan 0,1. Significante impactwaarden geven ziektegerelateerde routes aan30.
  3. Analyseer de resulterende routes grondig om de ontregeling op te helderen die verband houdt met de ernst van de ziekte. Een van de tekortkomingen van deze methode is de inefficiëntie bij het identificeren van de ontregelde routes wanneer de significante metabolieten minder dan 3 zijn.
  4. Om hiermee om te gaan, kan de geïdentificeerde metaboliet en de correlatie met de ernst van de ziekte ook worden bepaald aan de hand van de eerder gepubliceerde literatuur. Voer een grondig literatuuronderzoek uit en observeer of de geïdentificeerde metaboliet ook dezelfde trend volgt als uw interesse.

figure-protocol-1
Figuur 1: Fundamentele stappen in NMR-gebaseerde metabolomics. De figuur toont de belangrijkste stappen in op NMR gebaseerde metabolomics: het verzamelen en voorbereiden van monsters, het uitvoeren van NMR-spectroscopie, het voorbewerken van gegevens, het uitvoeren van statistische analyse, het identificeren en kwantificeren van metabolieten en het interpreteren van biologische significantie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om een metabolomics-onderzoek uit te voeren, is het essentieel om de steekproefomvang en de specifieke groepen die zullen worden geanalyseerd te bepalen. Het selecteren van een geschikte steekproefomvang is essentieel voor het verkrijgen van significante resultaten die nauwkeurig correleren met de ernst van de ziekte48. In dit specifieke werk hebben we echter een kleine steekproefomvang gebruikt om de stappen te demonstreren die betrokken zijn bij de identificatie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Metabolomics identificeert en kwantificeert efficiënt metabolieten, gericht op de metabole cycli die tijdens de ziekte verstoord raken. De kwaliteit van de resultaten hangt af van de nauwgezette uitvoering van elke stap in de metabolomics-aanpak. Elke fase, van monsterselectie en -verzameling tot route-identificatie, is van cruciaal belang bij het nauwkeurig identificeren van de primaire factoren die bijdragen aan de ziekte. Alvorens metabolomics uit te voeren, is een grondig onderzoek v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

AS erkent de Academie voor Wetenschappelijk en Innovatief Onderzoek (AcSIR) voor de registratie (registratienummer 10BB22A71002). AS erkent ook de Defence Research and Development Organization (DRDO) voor de fellowship. We erkennen het Centre of Biomedical Research (CBMR) voor het ter beschikking stellen van de 800 MHz NMR-spectrometerfaciliteit en financiering via het intramurale project (CBMR/IMR/0008/2021). We erkennen ook de afdeling Critical Care Medicine (CCM), SGPGIMS, voor constante ondersteuning. We erkennen de hulp van veel verpleegkundigen en, belangrijker nog, de patiënten die aan deze studie hebben deelgenomen. Deze studie werd gefinancierd door het intramurale project (CBMR/IMR/0008/2021) van het Centrum voor Biomedisch Onderzoek (CBMR) en door het extramurale project (nr. LSRB/01/15001/LSRB-404/PEE&BS/2023) van de Defence Research and Development Organization (DRDO).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CentirfugeSigma aldrich3-18KS
Chenomx NMR suite NMR Suite, v9, Chenomx Inc., Edmonton, CanadaNMR metaboliet kwantificatiesoftware
Co-axial insertSigma aldrichZ278513
Deuterim oxideSigma aldrich151882
Eppendorf tubesTarsons500020
MetaboanalystWishart Research GroupMetabolomics statistische analysesoftware
NMR tubeWilmadZ4120075mm diameter
PipetteEppendorf research plus31230000390-100 μl
Sample collection vialsTarsons cryo chill vials523194
Sodium azideSigma aldrichS2002
Sodium chloride crystalSigma aldrichS9625
Sodium phosphate dibasicSigma aldrich567550
Sodium phosphate monobasicSigma aldrichS0751
Topspin 3.6.4BrukerNMR verwerkings- en analysetool
Tsp saltSigma aldrich269913

Referenties

  1. Rubenfeld, G. D. Confronting the frustrations of negative clinical trials in acute respiratory distress syndrome. Ann. Am. Thorac. Soc. 12 (Supplement 1), S58-S63 (2015).
  2. Ware, L. B., et al. Prognostic and pathogenetic value of combining clinical and biochemical indices in patients with acute lung injury. Chest. 137 (2), 288-296 (2010).
  3. Johnson, C. H., Julijana, I., Gary, S. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (7), 451-459 (2016).
  4. Patti, G. J., Oscar, Y., Gary, S. Metabolomics: the apogee of the omics trilogy. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (4), 263-269 (2012).
  5. Nicholson, J. K., John, C. L. Metabonomics. Nature. 455 (7216), 1054-1056 (2008).
  6. Schnackenberg, L. K., Beger, R. D. Monitoring the health to disease continuum with global metabolic profiling and systems biology. Pharmacogenomics. 7 (7), 1077-1086 (2006).
  7. Pandey, S., Siddiqui, M. A., Azim, A., Sinha, N. Metabolic fingerprint of patients showing responsiveness to treatment of septic shock in intensive care unit. Magn Reson Mater Phys Biol Med. 36 (4), 659-669 (2023).
  8. Mamas, M., Dunn, W. B., Neyses, L., Goodacre, R. The role of metabolites and metabolomics in clinically applicable biomarkers of disease. Arch. Toxicol. 85, 5-17 (2011).
  9. Dunn, W. B., Broadhurst, D. I., Atherton, H. J., Goodacre, R., Griffin, J. L. Systems level studies of mammalian metabolomes: the roles of mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Chem Soc Rev. 40 (1), 387-426 (2011).
  10. Dettmer, K., Bruce, D. H. Metabolomics--a new exciting field within the" omics" sciences. Environ Health Perspect. 112 (7), A396-A397 (2004).
  11. Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data. Trends Biotechnol. 22 (5), 245-252 (2004).
  12. Lindon, J. C., Nicholson, J. K., Holmes, E., Everett, J. R. Metabonomics: metabolic processes studied by NMR spectroscopy of biofluids. Concepts Magn Reson Educ J. 12 (5), 289-320 (2000).
  13. Bernini, P., et al. Individual human phenotypes in metabolic space and time. J Proteome Res. 8 (9), 4264-4271 (2009).
  14. Nicholson, J. K., et al. Metabolic phenotyping in clinical and surgical environments. Nature. 491 (7424), 384-392 (2012).
  15. Vinayavekhin, N., Homan, E. A., Saghatelian, A. Exploring disease through metabolomics. ACS Chem Biol. 5 (1), 91-103 (2010).
  16. Dunn, W. B., Ellis, D. I. Metabolomics: current analytical platforms and methodologies. TrAC Trends Anal Chem. 24 (4), 285-294 (2005).
  17. Dunn, W. B., Bailey, N. J. C., Johnson, H. E. Measuring the metabolome: current analytical technologies. Analyst. 130 (5), 606-625 (2005).
  18. Bingol, K. Recent advances in targeted and untargeted metabolomics by NMR and MS/NMR methods. High-throughput. 7 (2), 9(2018).
  19. Emwas, A. H. M. The strengths and weaknesses of NMR spectroscopy and mass spectrometry with particular focus on metabolomics research. Methods Mol Biol. 1277, 161-193 (2015).
  20. Markley, J. L., et al. The future of NMR-based metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 43, 34-40 (2017).
  21. Marchand, J., Martineau, E., Guitton, Y., Dervilly-Pinel, G., Giraudeau, P. Multidimensional NMR approaches towards highly resolved, sensitive and high-throughput quantitative metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 43, 49-55 (2017).
  22. Eghbalnia, H. R., et al. Increasing rigor in NMR-based metabolomics through validated and open source tools. Curr Opin Biotechnol. 43, 56-61 (2017).
  23. Vignoli, A., et al. High-throughput metabolomics by 1D NMR. Angew Chem Int Ed. 58 (4), 968-994 (2019).
  24. Sundekilde, U. K., Eggers, N., Bertram, H. C. NMR-based metabolomics of food. Methods Mol Biol. 2037, 335-344 (2019).
  25. Garcia-Perez, I., et al. Identifying unknown metabolites using NMR-based metabolic profiling techniques. Nat Protoc. , 1-30 (2020).
  26. Dona, A. C., et al. A guide to the identification of metabolites in NMR-based metabonomics/metabolomics experiments. Comput Struct Biotechnol J. 14, 135-153 (2016).
  27. Siddiqui, M. A., Pandey, S., Azim, A., Sinha, N., Siddiqui, M. H. Metabolomics: an emerging potential approach to decipher critical illnesses. Biophys Chem. 267, 106462(2020).
  28. McNicholas, B. A., et al. Impact of early acute kidney injury on management and outcome in patients with acute respiratory distress syndrome: a secondary analysis of a multicenter observational study. Crit. Care Med. 47 (9), 1216-1225 (2019).
  29. Ambruso, S. L., et al. Inter-organ communication in homeostasis and disease: Lung metabolomics after ischemic acute kidney injury reveals increased oxidative stress, altered energy production, and ATP depletion. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 321 (1), L50(2021).
  30. Viswan, A., et al. Metabolomics based predictive biomarker model of ARDS: A systemic measure of clinical hypoxemia. PloS One. 12 (11), e0187545(2017).
  31. Metwaly, S. M., Brent, W. W. Systems biology ARDS research with a focus on metabolomics. Metabolites. 10 (5), 207(2020).
  32. Stringer, K. A., et al. Metabolic consequences of sepsis-induced acute lung injury revealed by plasma 1H-nuclear magnetic resonance quantitative metabolomics and computational analysis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 300 (1), L4-L11 (2011).
  33. Singh, A., Siddiqui, M. A., Pandey, S., Azim, A., Sinha, N. Unveiling Pathophysiological Insights: Serum Metabolic Dysregulation in Acute Respiratory Distress Syndrome Patients with Acute Kidney Injury. J Proteome Res. 23 (10), 4216-4228 (2024).
  34. Slupsky, C. M. NMR-based analysis of metabolites in urine provides rapid diagnosis and etiology of pneumonia. Biomark Med. 4 (2), 195-197 (2010).
  35. Siddiqui, M. A., et al. NMR spectroscopy-based analysis of gallstones of cancerous and benign gallbladders from different geographical regions of the Indian subcontinent. Plos One. 18 (6), e0286979(2023).
  36. Li, J., et al. 1HNMR-based metabolomic profile of rats with experimental acute pancreatitis. BMC Gastroenterol. 14, 1-7 (2014).
  37. Mao, H., et al. Systemic metabolic changes of traumatic critically ill patients revealed by an NMR-based metabonomic approach. J Proteome Res. 8 (12), 5423-5430 (2009).
  38. Stringer, K. A., Jones, A. E., Puskatich, M. A., Karnovsky, A., Serkova, N. J. 1H-nuclear magnetic resonance (NMR)-detected lipids associated with apoptosis differentiate early acute respiratory distress syndrome (ARDS) from sepsis. C63. LUNG INJURY AND REPAIR: TWO TO TANGO. Am J Resp Crit Care Med. 189, A5000(2014).
  39. Viswan, A., Singh, C., Kayastha, A. M., Azim, A., Sinha, N. An NMR based panorama of the heterogeneous biology of acute respiratory distress syndrome (ARDS) from the standpoint of metabolic biomarkers. NMR Biomed. 33 (2), e4192(2020).
  40. Singh, C., et al. Metabolic profiling of human lung injury by 1 H high-resolution nuclear magnetic resonance spectroscopy of blood serum. Metabolomics. 11, 166-174 (2015).
  41. Pandey, S., Siddiqui, M. A., Trigun, S. K., Azim, A., Sinha, N. Gender-specific association of oxidative stress and immune response in septic shock mortality using NMR-based metabolomics. Mol Omics. 18 (2), 143-153 (2022).
  42. Nagana, G. A., Gowda, Y. N., Raftery, D. Expanding the limits of human blood metabolite quantitation using NMR spectroscopy. Anal Chem. 87 (1), 706-715 (2015).
  43. Gowda, G. A. N., Raftery, D. Quantitating metabolites in protein precipitated serum using NMR spectroscopy. Anal Chem. 86 (11), 5433-5440 (2014).
  44. Gowda, G. A. N., Raftery, D. NMR-based metabolomics. Adv Exp Med Biol. 1280, 19-37 (2021).
  45. Xia, J., Psychogios, N., Young, N., Wishart, D. S. MetaboAnalyst: a web server for metabolomic data analysis and interpretation. Nucleic Acids Res. 37 (suppl_2), W652-W660 (2009).
  46. orbacıoğlu, ŞK., Aksel, G. Receiver operating characteristic curve analysis in diagnostic accuracy studies: A guide to interpreting the area under the curve value. Turk J Emerg Med. 23 (4), 195(2023).
  47. Ulrich, E. L., et al. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36 (suppl_1), D402-D408 (2007).
  48. Nyamundanda, G., Gormley, I. C., Fan, Y., Gallagher, W. M., Brennan, L. MetSizeR: selecting the optimal sample size for metabolomic studies using an analysis based approach. BMC bioinformatics. 14, 1-8 (2013).
  49. Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat Protoc. 2 (11), 2692(2007).
  50. Dona, A. C., et al. Precision high-throughput proton NMR spectroscopy of human urine, serum, and plasma for large-scale metabolic phenotyping. Anal Chem. 86 (19), 9887-9894 (2014).
  51. Ala-Korpela, M. Potential role of body fluid 1H NMR metabonomics as a prognostic and diagnostic tool. Expert Rev Mol Diagn. 7 (6), 761-773 (2007).
  52. Takeda, I., et al. Understanding the human salivary metabolome. NMR Biomed. 22 (6), 577-584 (2009).
  53. Callejon-Leblic, B. em, García-Barrera, T., Pereira-Vega, A., Gómez-Ariza, J. L. Metabolomic study of serum, urine and bronchoalveolar lavage fluid based on gas chromatography mass spectrometry to delve into the pathology of lung cancer. J Pharm Biomed Anal. 163, 122-129 (2019).
  54. Van Oort, P. M. P., et al. Exhaled breath metabolomics for the diagnosis of pneumonia in intubated and mechanically-ventilated intensive care unit (ICU)-patients. Int J Mol Sci. 18 (2), 449(2017).
  55. Serkova, N. J., Niemann, C. U. Pattern recognition and biomarker validation using quantitative 1H-NMR-based metabolomics. Expert Rev Mol Diagn. 6 (5), 717-731 (2006).
  56. Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times. Rev Sci Instrum. 29 (8), 688-691 (1958).
  57. Xi, Y., Rocke, D. M. Baseline correction for NMR spectroscopic metabolomics data analysis. BMC bioinformatics. 9, 1-10 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

NMR-metabolomicsmetabolietkwantificeringARDS-metabolomicsserum-NMR-spectroscopiemetabole profileringprincipale componentenanalysebiomarkeranalysemetabole padanalyselactaatdysregulatie
Identificatie en kwantificering van gestoorde metabolieten bij ernstig zieke patiënten met behulp van op NMR gebaseerde metabolomics
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.