Onthulling van histon-proteovormen met behulp van 2D-TAU gelelektroforese

Samenvatting

Deze methode beschrijft een eenvoudige en snelle strategie voor de karakterisering en het onderzoek van histonproteoformen.

Samenvatting

Histonen ondergaan verschillende posttranslationele modificaties (PTM's) zoals methylering, acetylering, fosforylering, acylering en ubiquitinatie, die de nucleosoomdynamiek regelen en het lot van de cel bepalen. Het nucleosoom, de functionele eenheid van chromatine, bestaat uit DNA, vier paren histonen (H3, H4, H2A en H2B) die de bolvormige kern vormen, en de linkerhiston H1, die de chromatinestructuur stabiliseert. De amino (N)-terminale staarten van de histonen steken uit de bolvormige kerndomeinen en ondergaan verschillende PTM's die het chromatinelandschap beïnvloeden. Er zijn aanwijzingen dat histon PTM-homeostase cruciaal is voor het behoud van alle fysiologische activiteiten. De deregulatie van histon-PTM's is de primaire oorzaak van abnormale cellulaire proliferatie, invasie en metastase. Daarom is het ontwikkelen van methoden voor het karakteriseren van histon-PTM's cruciaal. Hier beschrijven we een effectieve techniek voor het isoleren en analyseren van histonisovormen. De methode, gebaseerd op de combinatie van twee orthogonale scheidingen, maakt de verrijking van histonisovormen en de volgende massaspectrometrie-identificatie mogelijk. De techniek, oorspronkelijk beschreven door Shechter et al., combineert zuur-ureumpolyacrylamidegels (TAU-GEL), die basische histon-eiwitten kunnen scheiden op basis van grootte en lading, en natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegels (SDS-PAGE), die eiwitten kunnen scheiden op molecuulgewicht. Het resultaat is een tweedimensionale kaart van histon-isovormen, geschikt voor in-gel digestie, gevolgd door massaspectrometrie-identificatie en western blot-analyse. Het resultaat is een tweedimensionale kaart van histon-isovormen, geschikt voor zowel in-gel-digestie gevolgd door massaspectrometrie-identificatie als western blot-analyse. Deze proteomische benadering is een robuuste methode die de verrijking van een enkele histonisovorm en de karakterisering van nieuwe histon-PTM's mogelijk maakt.

Inleiding

Het begin, de progressie en de chemoresistentie van kanker zijn gerelateerd aan genetische en epigenetische gebeurtenissen, waaronder histon-PTM's. Histonen ondergaan een verscheidenheid aan PTM's die de chromatinedynamiek reguleren en het lot van de cel dicteren¹.

Het nucleosoom is de functionele eenheid van chromatine en is een moleculair complex van DNA en eiwitten waarmee DNA in de kern kan worden verpakt. Het bestaat uit vier paren histonen (H3, H4, H2A en H2B) die de nucleosoomkern vormen, evenals de linkerhiston H1, die helpt de chromatinestructuur te stabiliseren. De histonen amino (N)-terminale staarten steken uit hun bolvormige kerndomeinen en ondergaan specifieke posttranslationele modificaties die het chromatinelandschap beïnvloeden².

Tot nu toe zijn er minstens 23 klassen van histon-PTM's bekend. Deze PTM's zijn covalente modificaties die voornamelijk bestaan uit methylering, acetylering, fosforylering, glycosylering, ubiquitylering, SUMOylering en ADP-ribosylering³. Bovendien is onlangs een nauwe correlatie tussen epigenoomhomeostase en metabole herbedrading voorgesteld, wat de exponentiële groei van het mogelijke aantal histonen PTM's 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 verklaart . Histon-PTM's, afgezet, gewist en getransduceerd door modificerende enzymen, worden respectievelijk schrijvers, gummen en lezers genoemd. Ze beïnvloeden de fysische en chemische eigenschappen van de chromatinestructuur en beïnvloeden het genexpressieprofiel, inclusief de expressie van tumorsuppressorgenen en oncogenen 14,15,16.

Het aantal histonenproteovormen neemt toe wanneer het als histonvarianten in het nucleosoom wordt opgenomen. Deze varianten zijn niet-allelische isovormen van canonieke histonen en ze voegen complexiteit toe door de chemische en fysische eigenschappen van chromatine te veranderen. In vergelijking met canonieke histonen hebben histonvarianten functionele domeinen die unieke posttranslationele modificaties ondergaan of interageren met specifieke chromatinecomponenten, wat de dynamiek en stabiliteit van het nucleosoom¹⁷ beïnvloedt.

In kankercellen beïnvloedt de deregulatie van histon-PTM's en -varianten het genexpressieprofiel, wat leidt tot abnormale cellulaire proliferatie, invasie, metastase en de activering van resistentieroutes tegen geneesmiddelen 3,18,19,20. Mutaties in histonen of chromatine-remodelleringscomplexen kunnen het celfenotype veranderen, wat bijdraagt aan neoplastische transformatie. De accumulatie van epigenetische veranderingen, zoals histonmethylering, is een sleutelfactor bij het activeren van resistentieroutes tegen geneesmiddelen 21,22,23. Mutaties binnen het SWI/SNF-complex, dat bestaat uit 15 subeenheden gecodeerd door 29 genen, beïnvloeden meer dan 20% van de menselijke kankers in vele tumortypes. In het afgelopen decennium zijn op epigenetica gebaseerde medicijnstrategieën (epi-drugs) ontwikkeld en veel medicijnen gericht op kanker met abnormale histonmodificatiepatronen zijn goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA)²³.

De analyse van histon-eiwitten is behoorlijk uitdagend, waardoor het een veeleisend studiegebied is. Onlangs zijn massaspectrometriemethoden de voorkeursmanier geworden voor het karakteriseren en bestuderen van histon-proteovormen. De drastische extractieomstandigheden, in combinatie met de slechte oplosbaarheid van sommige varianten en de hoge sequentiehomologie, maken hun analyse echter uitdagend.

In het afgelopen decennium zijn er verschillende op massaspectrometrie gebaseerde methoden ontwikkeld voor histonprofilering en -onderzoek 24,25,26,27. In deze studie presenteren we een kosteneffectieve en betrouwbare methode om een tweedimensionale kaart van histonproteovormen te maken, wat de kans op het ontdekken van nieuwe posttranslationele modificaties kan vergroten.

2D TAU-elektroforese combineert scheiding in zure omstandigheden met SDS PAGE. In de eerste dimensie geeft de zure toestand van het medium een netto positieve lading aan basische eiwitten. Omdat histonen zeer basische eiwitten zijn en een hoger iso-elektrisch punt (pH) hebben in vergelijking met het medium, worden ze positief geladen en migreren ze onder een elektrisch veld. In de tweede dimensie worden histonen gedenatureerd door SDS en gescheiden op basis van hun molecuulgewicht. De resulterende 2D-kaart kan worden gebruikt als een hulpmiddel om specifieke proteovormen te verrijken met een single-spot resolutie voor massaspectrometrie-analyse en immunologische studies^28,29. Na elektroforese kunnen 2D TAU-vlekken worden vastgehouden, trypsine worden verteerd en geanalyseerd door middel van massaspectrometrie. Als alternatief kan de 2D TAU-kaart op een nitrocellulose/PVDF-filter worden gedept en worden onderzocht door middel van immunokleuring²⁷.

In deze context kunnen de methoden van strategisch belang zijn om de identificatie en analyse van nieuwe posttranslationele modificaties die gecorreleerd zijn met metabole herbedrading^{te verbeteren 30,31}.

We hebben de oorspronkelijke methode verder verbeterd door een sonicatiestap op te nemen, die nuttig is voor DNA-afbraak en het verbeteren van de oplosbaarheid van eiwitten. Bovendien hebben we de incubatiestap voor histonextractie verlengd om een eiwitmonster met een hoge zuiverheid te verkrijgen. Bovendien hebben we in ons protocol de eerste dimensie voor een langere duur op laagspanning laten draaien om een betere resolutie te bereiken. De resulterende gel werd gebruikt voor het onderzoeken van canonieke histonen PTM's en het karakteriseren van nieuwe modificaties zoals glycatie^10,32.

Over het algemeen hebben we een methode ontwikkeld voor het extraheren en zuiveren van histonen, gevolgd door de resolutie van histon-proteovormen met behulp van een tweedimensionale kaart. Het werk omvat ook een procedure voor in-gel digestie voor massaspectrometrie-analyse en de stappen voor tweedimensionale western blot-analyse.

Protocol

1. Histon extractie

1. Voer histonextractie uit uit ten minste 1 x 10⁶ cellen, die voor 80% samenvloeien. Voor dit experiment hebben we MCF-10A-cellijnen van ATCC gebruikt. Was de cellen na het plateren driemaal met 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 1x. Voer alle stappen op het ijs uit.
2. Bereid een cellysisbuffer voor met 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM KCl en 1,5 mM MgCl₂. Voeg vlak voor gebruik 1 mM dithioerythritol en protease- en fosfataseremmers toe.
3. Voeg 800 μL cellysebuffer toe aan de celbevattende petrischaal, schraap en verzamel de cellen in een buis van 1,5 ml en incubeer vervolgens op een rotator bij 300 tpm, 4 °C gedurende 1 uur.
4. Centrifugeer bij 10.000 x g, 4 °C, gedurende 10 minuten in een voorgekoelde microcentrifuge met een rotator voor buisjes van 1,5 ml.
5. Was de pellet met 400 μL cellysebuffer en centrifugeer op 10.000 x g, 4 °C, gedurende 10 min. Gooi het bovenstaande weg. Herhaal de wasstap 3x.
   OPMERKING: Gebruik een voorgekoelde microcentrifuge (4 °C) met een rotator voor buisjes van 1,5 ml voor alle stappen. Behandel de pellet voorzichtig om materiaalverlies te voorkomen.
6. Resuspendeer de pellet in 640 μL 0,2 M H₂SO₄ en incubeer op een rotator bij 300 tpm bij 4 °C gedurende 16 uur.
   LET OP: Zwavelzuur is een gevaarlijke chemische stof; Gebruik het onder een chemische zuurkast.
7. Centrifugeren bij 16.000 x g, 4 °C, gedurende 10 min. Breng het bovenstaande over in een nieuwe tube en bewaar het tot de volgende stappen. Gooi het nucleaire puin weg.
8. Sla histonen neer door druppel voor druppel 212 μL trichloorazijnzuur toe te voegen (de uiteindelijke concentratie TCA is 33%). Meng de oplossing door de buis 10x om te keren. Incubeer op ijs, in het donker, gedurende 16 uur.
   LET OP: TCA is een gevaarlijke chemische stof; Gebruik onder een chemische zuurkast.
9. Pellethistonen door in een voorgekoelde centrifuge bij 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C te centrifugeren. Verwijder voorzichtig het bovenstaande en was de pellet 3x met 200 μL koude aceton.
10. Resuspendeer de pellet met koude aceton en sonificeer vervolgens 2x met hoog vermogen met 3 cycli van 30 s aan/uit, afgewisseld met een pauze van 10 minuten op ijs.
    OPMERKING: De procedure werd uitgevoerd met behulp van een ultrasoonapparaat. Deze stap is essentieel om in histon gewikkeld DNA te elimineren.
11. Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 10 min, gooi aceton weg en suspendeer het monster opnieuw in 100 μL dubbel gedestilleerd water. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-testmethode, volgens de instructies van de fabrikant³³.
    OPMERKING: Na centrifugeren lijkt de pellet soms wit of doorschijnend. Een wit en ondoorzichtig neerslag kan duiden op de aanwezigheid van zoutverontreinigingen die de 2D-scheiding kunnen belemmeren. Als dit het geval is, herhaalt u de stappen voor het wassen van aceton totdat de pellet doorschijnend wordt.
12. Vries 70 μg histonen volgens de instructies van de fabrikant. Stel de vriesdofiliser in op 30 °C gedurende 60 min. Controleer het buisvolume en herhaal de stap bij 30 °C totdat het monster volledig is gelyofiliseerd (over het algemeen is 90 minuten nodig om het monster volledig te lyofiliseren). Controleer na 60 minuten het volume elke 10 minuten, aangezien het proces monsterafhankelijk is.
    OPMERKING: Als de hoeveelheid histon-eiwitten laag is, begin dan met 2 x 10⁶ cellen. Gebruik in dit geval hetzelfde volume reagentia dat wordt gebruikt voor 1 x 10⁶ cellen. Controleer de zuiverheid van alle chemicaliën die tijdens de procedure worden gebruikt; alle reagentia moeten van HPLC-kwaliteit zijn.

2. Mini 2D gel tritonzuur-ureum (TAU) elektroforese

1. Bereid een mini-TAU-gel voor op een mini verticaal polyacrylamidegelelektroforesesysteem zoals hieronder beschreven.
   1. Bereid de scheidingsgel voor: 6 M Ureum, 15% acrylamide/bisacrylamide (29:1), 5% ijsazijnzuur, 0,25% Triton X-100 (v/v), 0,4% TEMED (v/v), 0,1% APS (p/v). Los voor de bereiding van de oplossing ureum op in acrylamide/bis en 1 ml ultrapuur water met zacht roeren bij kamertemperatuur; Voeg de andere componenten toe en pas het volume aan. Bereid voor een mini-TAU-gel 10 ml oplossing. Vul de vooraf ingestelde gelplaten met de oplossing en vermijd de vorming van luchtbellen op slechts 1,5 cm van de bovenkant. Bedek de oplossing met 1 ml isopropanol om de gel te egaliseren.
   2. Bereid stapelgel voor: 6 M Ureum, 6% acrylamide/bisacrylamide (29:1), 5% ijszuurazijnzuur, 0,25% Triton X-100 (v/v), 0,4% TEMED (v/v), 0,1% APS (p/v). Los voor de bereiding van de oplossing ureum op in acrylamide/bis en 1 ml ultrapuur water; Voeg de andere componenten toe en pas het volume aan. Vul de gelplaten met stapeloplossing, plaats een gelkam met 10 putjes tussen de platen en plaats deze totdat de geloplossing halverwege de tanden van de kam komt. Laat de gel 16 uur polymeriseren bij 4 °C.
      OPMERKING: Plaats de kam voorzichtig om een regelmatige vorming van putjes te garanderen.
2. Bereid 100 μL TAU-monsterbuffer voor door 6 M ureum, 5% ijsazijn en dubbel gedestilleerd water op te lossen. Los het gevriesdroogde monster op in 30 μl TAU-monsterbuffer.
3. Vul de minicassette met TAU loopbuffer, 5% azijnzuur eindconcentratie. Spoel de putjes van de TAU-gel met een spuit gevuld met loopbuffer en vul het monster met een micropipet in het putje.
4. Sluit de elektroforetische kamer aan op de voeding, met de positieve (rode) elektrode aan de onderkant. Let op, bij IP > pH zijn eiwitten positief geladen, dus de migratie is van positieve naar negatieve elektrode. Laat de gel eerst 70 minuten op 30 V draaien en vervolgens gedurende 17 uur op de constante spanning van 25 V.
   OPMERKING: Schakel gedurende deze tijd af en toe de stroomtoevoer uit en spoel de gelwellen af met een wegwerpspuit. Let erop dat u eventuele luchtbellen van de onderkant van de gel verwijdert met behulp van een spuit om verlies van het monster en de aanwezigheid van een versmering in de opgeloste eiwitten te voorkomen.
5. Verwijder de gel van de gelplaten en snijd de lijn van interesse af met een schoon scalpel. Ga voorzichtig om met de gel om gelbreuk te voorkomen. Aangezien de interesselijn kleurloos is, laadt u het monster in put nummer 1 om de interessebaan precies te identificeren en af te snijden.
   OPMERKING: Om de scheiding op de mini-TAU-gel te controleren, bereidt u het monster voor en voert u het in tweevoud uit. Een van deze gels kan worden gekleurd met Coomassie Brilliant Blue. Het scheidingspatroon wordt weergegeven in figuur 1A.
6. Was de baan met 15 ml 0,5 M Tris-HCl pH 8,8 gedurende 15 min.
7. Bereid 15 ml evenwichtsbuffer 1 voor met 6 M ureum, 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 30% glycerol, 20% SDS en 2% dithioerythritol. Bereid 15 ml evenwichtsbuffer 2 voor met 6 M ureum, 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 30% glycerol, 20% SDS en 2% jodoacetamide. Bereid de evenwichtsbuffer 1 en 2 vlak voor gebruik voor; Bewaar de evenwichtsbuffer 2 in het donker.
8. Incubeer de gelbaan, onder zacht roeren, in 10 ml evenwichtsbuffer 1 gedurende 15 minuten en decanteer vervolgens. Incubeer de gelbaan, onder zacht roeren, met 10 ml evenwichtsbuffer 2 gedurende 15 minuten in het donker en decanteer vervolgens.
9. Bereid een oplossende SDS 15% acrylamidegel voor door tabel 1 te volgen. Zet de gelplaat op en vul deze met de oplossende geloplossing. Vul de oplossing tot deze 1,5 cm van het einde van de lange gelplaat is. Doe 1 ml isopropanol op het oppervlak om de gel waterpas te maken en laat deze polymeriseren.
10. Na gelpolymerisatie decanteert u de isopropanol en droogt u de put af met 3 mm Chr cellulosechromatografiepapier. Steek de resulterende baan uit stap 8 in de gellade.
11. Sluit de baan naar de oplossende gel af met een afdichtingsoplossing van 0,5% agarose met een laag smeltpunt in 1x Tris/glycine/SDS-buffer en 5 μL 0,003% broomfenolblauw. Laat agarosegelpolymerisatie 30 minuten toe.
    OPMERKING: Vermijd de vorming van luchtbellen tijdens het sealen van agarose om uitsmeren van de gel te voorkomen.
12. Plaats de gelplaten in de cassette en vul met 1x Tris/glycine/SDS buffer. Laat de gel op 120 V draaien totdat de broomfenolblauwe kleurstof de bodem bereikt. Verwijder de gel voorzichtig van de platen, gooi het teveel aan agarose weg en kleur de gel zilverkleurig met behulp van een procedure die compatibel is met massaspectrometrie of dep voor immunologische test.

3. Zilverkleuring ³²

1. Bereid de volgende reagentia voor - Fixeermiddel: 50% methanol, 5% azijnzuur, 45% gedeïoniseerd water; Wasoplossing: 50% methanol, 50% gedeïoniseerd water; Sensibilisator: 0,02% Na₂S₂O₃ 5H₂O in gedeïoniseerd water; Zilverreagens: 0,1% zilvernitraat in koud (4°C) gedeïoniseerd water; Ontwikkelaar: 0,04% Formaline en 2% Na₂CO₃, Formaldehyde (37%) (voeg net voor gebruik toe) 0,4 ml gedeïoniseerd water en vul tot 1000 ml; Stop-reagens: 5% azijnzuur; Gel opslagoplossing: 1% azijnzuur.
   OPMERKING: Aangezien chemicaliën die worden gebruikt voor het kleuren gevaarlijk zijn, moet u alle stappen uitvoeren onder een chemische zuurkast.
2. Volg de procedure in tabel 2 met de volgende overweging. Voer alle incubaties uit met zacht roeren. Bereid het stopreagens voor voordat u met de ontwikkelingsstap begint; Dit zorgt voor de ontwikkeling van de gel met de juiste intensiteit. Tijdens de ontwikkelingsstap verschijnen vlekken als gele signalen die aan het einde van de incubatie lichtbruin worden. De intensiteit van de verschillende vlekken is afhankelijk van de hoeveelheid histon-proteoforms. De gel is klaar voor spotexcisie en in-gel digestie (Figuur 1B)

4. In-gel spijsvertering

1. Bereid de volgende oplossingen: 50 mM ammoniumbicarbonaat (NH₄HCO3)/50% (v/v) acetonitril; 10 mM dithiothreitol (DTT) in 50 mM NH₄HCO₃; 55 mM jodoacetamide (IAZ) in 50 mM NH₄HCO₃; 0,1% TFA; 50 mM NH₄HCO₃, pH 8; Acetonitril van HPLC-kwaliteit; 1 ml siliconen buisjes.
   OPMERKING: Om menselijke keratinebesmetting van haar of huid te omzeilen, gebruikt u schone handschoenen en werkt u in een schone ruimte.
2. Snijd histonvlekken van de bevlekte gel met behulp van een schoon scalpel en plaats ze in een nieuwe siliconen tube (1,5 ml). Zorg ervoor dat u een enkele plek wegsnijdt en in een enkele buis plaatst om kruisbesmetting in isovorm te voorkomen.
3. Voeg aan elke gelspot 250 μL 50 mM NH₄HCO₃/50% acetonitril toe en incubeer onder zacht roeren in een thermomixer bij kamertemperatuur. Decanteer de oplossing en herhaal deze stap 3x. Gelstukjes zien er transparant uit.
4. Dehydrateer gelvlekken door acetonitril (200 μL) toe te voegen. In dit stadium zullen de gelstukjes een ondoorzichtige witte kleur aannemen.
5. Decanteer acetonitril en laat 10 minuten aan de lucht drogen. Het gelstuk lijkt gedroogd in de tube. Reductie en alkylering zijn niet essentieel, aangezien histoneiwitten tijdens de evenwichtsstap zijn gereduceerd en gealkyleerd.
6. Rehydrateer gelvlekken in 20 μL trypsineoplossing (0,1 mM HCl) of een volume dat voldoende is om de gelstukjes te bedekken. Plaats de buizen in de thermomixer en incubeer, onder zacht roeren, bij 37 °C gedurende minimaal 4 uur tot 16 uur.
7. Breng het bovenstaande dat de tryptische peptiden bevat over in een vers buisje. Voeg 50 μL extractieoplossing (60% acetonitril, 1% TFA) toe aan de gelstukjes en sonificeer 2x in een ultrasoon waterbad gedurende 10 minuten bij 4 °C.
8. Breng het supernatant, dat extra tryptische peptiden bevat, over naar de verse buis. Gebruik een vriesdroogapparaat om de gepoolde geëxtraheerde peptiden te drogen. Stel de vriesdroger in op 30 °C en droog de oplossing; Er verschijnt een gevriesdroogde pellet in de buis.
   OPMERKING: Deze stap is volumeafhankelijk; Over het algemeen is 1 uur voldoende, maar controleer het volume elke 10 minuten totdat het monster volledig is opgedroogd.
9. Voeg 15 μl 0,1 % TFA toe aan elke buis en incubeer voorzichtig in een thermomixer bij 25 °C. Breng het bovenstaande over naar de injectieflacon voor LC-MS/MS-analyse.

5. 2DTAU westelijke vlek

1. Bereid de overdrachtsbuffer, 250 mM Tris-basis, 92 mM glycine en 10% methanol voor met dubbel gedestilleerd water.
2. Snijd het nitrocellulosemembraan en het filtreerpapier op de afmetingen van de gel.
3. Breng de gel in evenwicht en week het membraan, het filtreerpapier en het filterpapier 15 minuten in de transferbuffer. Gebruik nitrocellulose- of PVDF-membranen. Als u PVDF-membranen (polyvinylideendifluoride) gebruikt, activeer deze dan door ze te weken in 100% MetOH.
4. Bereid de gelsandwich in de cassette als volgt voor op een halfdroge transfer: Negatieve elektrode/Filterpapier/Gel/Nitrocellulose-membraan/Filterpapier/Positieve elektrode. Verwijder eventuele luchtbellen tussen de gel en het membraan voor goede resultaten.
5. Plaats de cassette in de Semi-droge unit en laat de blot 30 minuten op 25 V draaien. Haal aan het einde de blotting sandwich uit elkaar en bewaar het membraan voor de immunologische test. Controleer de overdrachtsefficiëntie met Ponceau-kleuring. Markeer het membraan met een teken rechtsboven om de juiste filterrichting te behouden.
6. Incubeer met primaire en secundaire antilichamen, afhankelijk van het experiment (Figuur 2).

Resultaten

In Figuur 1A is het mogelijk om te zien hoe histon-eiwitten migreren in een 1D-gel. Dit is een belangrijke voorbereidende stap om de looptijd van de eerste dimensie te begrijpen. Zodra het juiste moment van scheiding is bepaald, voer je de tweede dimensie uit. De 2D-kaart van histon-proteovormen vertoont een onderscheidend topografisch patroon (Figuur 1B). Elke plek in figuur 1B vertegenwoordigt een specifiek histontype. Observeer het exacte gebied van de gel waar elke histon-proteoform te vinden is. De identificatie van de massaspectrometrie voor elke histonproteoform wordt gerapporteerd in Perri et ^al.32. Daarom wordt elke plek in deze toestand geassocieerd met een specifiek histontype. De aanwezigheid van extra vlekken, naast de canonieke, kan wijzen op het bestaan van nieuwe wijzigingen. Gelbeelden kunnen worden verkregen met behulp van densitometrie en het resulterende beeld kan worden geanalyseerd met behulp van beeldanalysesoftware.

De betrouwbaarheid van de 2D TAU-kaart is afhankelijk van de rondheid van de plek. Als de run correct is uitgevoerd, verschijnen de vlekken als duidelijke signalen en zijn er geen horizontale en verticale strepen zichtbaar. Omgekeerd kunnen onzuiverheden in het monster, de oplossingen en de agarose-overlay strepen en/of strepen in de gel veroorzaken. De kwaliteit van de gel zal van invloed zijn op de digitalisering van het beeld en de daaropvolgende kwantitatieve en kwalitatieve analyse. Bovendien kan het van invloed zijn op het succes van Western Blot-analyse en MS-onderzoeken. Om de betrouwbaarheid van de methode te verifiëren, hebben we het nitrocellulosemembraan van opgeloste histonproteovormen onderzocht met het primaire antilichaam geacetyleerd lysine (Ac-K2-100) Rabbit mAb³² (Figuur 2). Een anti-konijn HRP secundair antilichaam werd gebruikt om histonsignalen te detecteren. Zoals verwacht is het met behulp van een densitometer mogelijk om de eigenaardige posttranslationele modificatie op elke histonvariant die in de vlek aanwezig is, te kwantificeren.

Figuur 1: 1D en 2D TAUgel. (A) Representatief beeld van histonen topografisch patroon verkregen met behulp van 1D TAUgel. (B) Representatief beeld van histonen topografisch patroon verkregen met behulp van 2D TAUgel. Gegevensidentificaties worden gerapporteerd door Perri et al. ³². Zoals verwacht vertegenwoordigt elke vlek een specifieke histon-proteoform. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve 2DTAU Western blot. In de afbeelding is het mogelijk om het niveau van lysineacetylering in elke histon-proteoform te observeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Reagentia	Concentratie: 15%
40% Acrylamide/Bis	3.75
1,5 m tris pH 8,8	2,5 ml
MilliQ water	3,6 ml
10% SDS	100 μL
10% APS	50 μL
GEAARD	5 μL

Tabel 1: Samenstelling van de geloplossing oplossen.

Stap	Tijd
Fixeren 50% methanol / 5% azijnzuur	1 uur
Wassen 30% ethanol	2 x 20 min
Was gedeïoniseerd water	1 x 20 min
Sensibilisator Thiosulfaat reagens	1 minuut
Was gedeïoniseerd water	3 x 20 seconden
Zilver Zilvernitraat	30 minuten
Was gedeïoniseerd water	3 x 1 min
Ontwikkeling Ontwikkelaar	25-30 min Opmerking: Ontwikkel de gel totdat de vlekken zichtbaar zijn (lichtbruin)
Oplossing stoppen	1 x 10 minuten
Was gedeïoniseerd water	2 x 5 min
Was gedeïoniseerd water	1 uur

Tabel 2: Methode voor het kleuren van zilver.

Discussie

In het afgelopen decennium heeft de therapie van kankerpatiënten een revolutie teweeggebracht door verschillende moleculaire veranderingen te identificeren die de ontwikkeling en progressie van kanker stimuleren. De belangrijkste vooruitgang in de moderne oncologie is de ontwikkeling van therapie op basis van uitgebreide moleculaire analyse. Technologische vooruitgang op het gebied van genomica en proteomica heeft een cruciale rol gespeeld bij het profileren van specifieke biomarkers voor vroege detectie, surveillance, prognose en monitoring van geneesmiddelen. Proteomics wordt gedefinieerd als de analyse van het volledige eiwitcomplement van een cel, weefsel of organisme onder een bepaalde toestand, en het omvat ook de studie van eiwitinteracties, posttranslationele modificaties en lokalisatie³⁴. Een specifiek gebied van proteomics is epi-proteomics, waarbij de systematische studie van histon posttranslationele modificaties betrokken is. Deze zijn in verband gebracht met de ontwikkeling en progressie van kanker³⁵. Het artikel schetst een methode voor het identificeren van specifieke histonisovormen die bijdragen aan het cellulaire fenotype.

De cruciale stap van de methode is het extraheren van histonen vanwege hun slechte oplosbaarheid en hoge basiciteit. De belangrijkste beperkingen zijn de complexiteit van de 2D-kaart en het lage aantal varianten, wat de MS/MS-analyse kan bemoeilijken.

Over het algemeen is het grote voordeel van deze aanpak dat deze in elk laboratorium kan worden uitgevoerd en dat een mini-gelapparaat met de juiste voorzorgsmaatregelen kan worden gebruikt. In deze context zijn we ervan overtuigd dat deze methode een groot aantal wetenschappers, zoals degenen die niet kunnen profiteren van een grote faciliteit in hun instelling, kan helpen om nieuwe epi-markers te identificeren, met als doel de kennis over het epi-proteoom te verbeteren. Bovendien kan deze methode worden gecombineerd met massaspectrometrie, die als een service kan worden uitbesteed, om nieuwe proteovormen te ontdekken. Het kan ook worden gebruikt met immunologische testen om de veranderingen te bevestigen in een specifieke posttranslationele modificatie waarvoor een commercieel antilichaam beschikbaar is.

De methode is gebruikt om de typische veranderingen in histonmodificaties gerelateerd aan de ontwikkeling van borstkanker te bestuderen²⁸en om de modificaties van H1 in embryonale stamcellen van muizen te onderzoeken³⁶. Bovendien is de methode met succes gebruikt om het niveau van histoncarbonylering³⁷ in snelgroeiende fibroblasten te meten en om nieuwe histonmodificaties te onderzoeken, zoals histonglycatie en histon-MARylatie³⁸.

Vanuit ons perspectief zijn we ervan overtuigd dat deze methode met succes kan worden toegepast voor het profileren van nieuwe histon-PTM's, met name die welke verband houden met de abnormale activering van specifieke metabole routes, zoals acetylering, malonylering, methylering, lipidatie, lactylering, butylering en andere. Uiteindelijk zou de methode ook kunnen dienen als een micropreparatief instrument voor het isoleren van individuele proteovormen en kan het de analyse van metabolisme-gekoppelde PTM's vergemakkelijken, waardoor ons begrip van dit cruciale onderzoeksgebied wordt vergroot.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1,4-Dithioerythritol	SIGMA- ALDRICH	D8255	Reagens voor het handhaven van −SH groepen in de gereduceerde staat; reduceert kwantitatief disulfiden.
1,5 M Tris-HCL buffer, pH 8.8	BIO-RAD	161-0798	Resolving Gel Buffer
10x Tris/Glycine/SDS	BIO-RAD	1610772	Gebruik deze voorgemengde 10x Tris/glycine/SDS draaibuis om eiwitmonsters te scheiden door SDS-PAGE.
2-Propanol	SIGMA-ALDRICH	33539	2-Propanol (Isopropanol) is een secundair alcohol. Het is getest als vervanger voor brandstof voor gebruik in verschillende brandstofcellen. CuO-poeder opgelost in 2-propanol is gebruikt voor de door laserablatie ondersteunde synthese van Cu-colloïden. Suspensie van 2-propanol met Zn(NO3)2 is gebruikt voor de fabricage van titaniumdioxide-gecoat roestvrij staal (P25-TiO2/SS) fotoanode gecoat met een uniform dikke laag P25-TiO2.Deze fotoanode werd gebruikt voor het elektrochemische fotokatalytische (ECPC) degradatieproces.
30% Acrylamide/Bis Solution	BIO-RAD	1610158	2,6% Crosslinker. Elektroforese zuiverheidsreagens
Acetic Acid Glacial	Carlo Erba Reagennts	401392	Azijnzuur is een belangrijk chemisch reagens met vele industriële toepassingen.
Acetone	Panreac Applichem	211007.1214	Aceton is een oplosmiddel, bekend om zijn veelzijdigheid in verschillende laboratorium-, productie- en reinigingstoepassingen.
Acetonitile	VWR	83640320	voor HPLC   LC-MS kwaliteit
Agarose	Invitrogen	15510-027	Agarose is een heteropolysaccharide  vaak gebruikt in moleculaire biologie.
Ammonium bicarbonate	SIGMA-ALDRICH	A6141	minimum 99,0%
Ammonium persulfate	SIGMA-ALDRICH	A3678	Voor moleculaire biologie, voor elektroforese, ≥98%
Bioruptor plus	Diagenode	B01020001 - B01020002- B01020003	sonicator
Dithiothreitol	SIGMA- ALDRICH	D9163-5G	Reducerend middel dat wordt gebruikt om disulfidebindingen in eiwitten te reduceren.
Dodeca Silver Stain Kit	BIO-RAD	161-0480	De Dodeca zilverkleuringskit is eenvoudig te gebruiken voor de detectie van nonagrammige niveaus van eiwitten in polyacrylamide gels.
Glycerol	GE - Healthcare Life Sciences	171325010L	Glycerol is een eenvoudige triol verbinding, het is betrokken om te helpen bij het casten van gradiënt gels, eiwitstabilisator en opslagoplossingscomponent.
Halt Phosphatase Inhibitor	Thermo SCIENTIFIC	78428	Thermo Scientific Halt Fosfatase Inhibitor Cocktail bewaart de fosforylatietoestand van eiwitten tijdens en na cellyse of weefsel-eiwitextractie  Single- Use Cocktail (100X).
Halt Protease Inhibitor	Thermo SCIENTIFIC	78430	Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X) zijn gebruiksklare geconcentreerde stockoplossingen van proteaseremmers voor toevoeging aan monsters om proteolytische afbraak tijdens cellyse en eiwitextractie te voorkomen. Single- Use Cocktail (100X).
Hydrochloric acid	SIGMA-ALDRICH	H1758	BioReagens, voor moleculaire biologie
Iodoacetamide	SIGMA-ALDRICH	I6125	≥99% (NMR), kristallijn
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541	Kaliumchloride, KCl, wordt algemeen gebruikt in laboratoriumroutines. Het gebruik ervan als opslagoplossing voor pH-elektroden en als referentieoplossing voor geleidbaarheidsmetingen is goed gevestigd.
MCF10 cell line	atcc	CRL-10317	epitheliale cellijn die in 1984 werd geïsoleerd uit de borstklier van een blanke, 36-jarige vrouw met fibrocystische borsten. Deze cellijn werd gedeponeerd door de Michigan Cancer Foundation.
MgCl2	SIGMA-ALDRICH	208337	Magnesiumchloride is een kleurloze kristallijne vaste stof.
N,N,N',N'-Tetramethylethylene-diamine	SIGMA-ALDRICH	T9281	Voor elektroforese, ongeveer 99%
Phosphate saline buffer 1X	Corning	15373631	1 X PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing) is een gebufferde gebalanceerde zout oplossing die wordt gebruikt voor een verscheidenheid aan biologische en celkweektoepassingen, zoals het wassen van cellen vóór dissociatie, het transporteren van cellen of weefsel, het verdunnen van cellen voor het tellen en het bereiden van reagentia.
Potassium hexacyanoferrate	SIGMA-ALDRICH	60299	Elektron acceptor, gebruikt in systemen die elektrontransport omvatten,
SDS Solution 20% (w/v)	BIO-RAD	161-0418	Natriumdodecylsulfaat. Elektroforese zuiverheidsreagens
Sodium thiosulfate, ReagentPlus 99%	SIGMA- ALDRICH	21,726-3	Natriumthiosulfaat, ReagentPlus 99%
Sulfuric acid	SIGMA-ALDRICH	339741	Zwavelzuur, Reagens, is een extreem corrosief zuur dat komt als geel, licht viskeuze vloeistof. Het is oplosbaar in water en is een diprotisch zuur. Het heeft zeer sterke corrosieve, dehydraterende en oxiderende eigenschappen en is hygroscopisch.
Trichloroacetic acid	SIGMA-ALDRICH	T6399-5G	Trichloroazijnzuur (TCA) wordt gebruikt als reagens voor de precipitatie van eiwitten1,2 en nucleïnezuren