Dit protocol beschrijft een high-throughput screeningsysteem dat fluorescentiepolarisatie van een specifieke fluorescerende sonde die bindt aan een nucleaire receptor gebruikt als uitlezing voor het screenen van milieuverontreinigende stoffen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Dit protocol beschrijft een high-throughput screeningsysteem dat fluorescentiepolarisatie van een specifieke fluorescerende sonde die bindt aan een nucleaire receptor gebruikt als uitlezing voor het screenen van milieuverontreinigende stoffen.
Er zijn toenemende niveaus van verbindingen in het milieu gedetecteerd, die wijdverbreide vervuiling veroorzaken en risico's voor de menselijke gezondheid met zich meebrengen. Ondanks het feit dat ze vaak voorkomen in het milieu, is er echter zeer beperkte informatie over hun toxicologische effecten. Het is dringend nodig om high-throughput screening (HTS) -methoden te ontwikkelen om toxicologische studies te begeleiden. In deze studie werd een receptor-ligandbindingstest met behulp van een HTS-systeem ontwikkeld om de bindingspotentie van milieuverontreinigende stoffen op nucleaire receptoren te bepalen. De test wordt uitgevoerd met behulp van een microplaatlezer (d.w.z. een plaat met 96 putjes die verschillende chemicaliën bevat) door de fluorescentiepolarisatie (FP) van een specifieke fluorescerende sonde te meten. Deze test bestaat uit vier delen: de constructie en transformatie van recombinante vectoren, de expressie en zuivering van het receptoreiwit (ligandbindend domein), receptor-sondebinding en competitieve binding van chemicaliën met de receptor. De bindende potentie van twee milieuverontreinigende stoffen, perfluoroctaansulfonzuur (PFOS) en trifenylfosfaat (TPHP), met peroxisoomproliferator-geactiveerd receptorgamma (PPARγ) werd bepaald om de testprocedure te illustreren. Tot slot kwamen ook de voor- en nadelen van deze methode en de mogelijke toepassingen ervan aan bod.
Een groot aantal chemicaliën is op grote schaal aangetroffen in het milieu en het menselijk lichaam, wat aanleiding geeft tot grote bezorgdheid over hun impact op het ecologische milieu en de menselijke gezondheid 1,2,3. Ondanks het feit dat ze veel voorkomen in het milieu, is informatie over hun toxicologische effecten schaars. Daarom is het dringend nodig om high-throughput screening (HTS) -methoden te ontwikkelen om de beoordeling van chemische toxiciteit te vergemakkelijken.
Er zijn verschillende high-throughpu....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De details van de reagentia en de apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Constructie en transformatie van recombinante vectoren
OPMERKING: PPARγ is een ligand-afhankelijke transcriptiefactor met een klassieke nucleaire receptorstructuur, bestaande uit een DNA-bindend domein dat doelgenen reguleert en een ligandbindend domein dat wordt geactiveerd door liganden. Bij ligandactivering vormt PPARγ een heterodimeer met een andere nucleaire receptor, retinoïde X-receptor (RXR), en bindt zich aan responselementen van PPARγ, waardoor de transcri....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Eiwitexpressie en zuivering van PPARγ-LBD
PPARγ-LBD werd heteroloog tot expressie gebracht in BL21 (DE3) als een histidine-gelabeld eiwit. Het eiwit werd gedetecteerd in de oplosbare fracties en de gezuiverde PPARγ-LBD vertoonde een enkele band op SDS-PAGE met een schijnbaar molecuulgewicht van ongeveer 34,9 kDa (Figuur 2), consistent met het voorspelde molecuulgewicht van het eiwit.
De binding van de
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Fluorescentiepolarisatie (FP), oppervlakteplasmonresonantie (SPR) en nucleaire magnetische resonantie (NMR) zijn veelgebruikte technieken die worden gebruikt voor het beoordelen van directe bindingsinteracties tussen eiwitten en verbindingen19,20. FP is op grote schaal gebruikt bij het onderzoek naar moleculaire interacties voor het ontdekken van geneesmiddelen en chemische screening 21,22,23.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn.
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 82103875).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| C1-BODIPY-C12 Probe | Thermo Fisher Scientific, China | 102209-82-3 | Bindt aan PPARγ-LBD en zendt fluorescentie uit. |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Solarbio, China | 6104-59-2 | Kleur de eiwitbanden. |
| GraphPad prism | Dotmatics | https://www.graphpad.com/features | |
| imidazol | Solarbio, China | I8090 | Bereid buffers voor het eiwitzuiveringsproces. |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid | Solarbio, China | 367-93-1 | Induceert de expressie van PPARγ-LBD |
| Microplate reader | Biotek, USA | Synergy H1 | Detectie van FP-waarde |
| NaCl | Shanghai Reagent | 7647-15-5 | Bereid buffers voor het eiwitzuiveringsproces. |
| NaH2PO4 · 2H2O | Shanghai Reagent | 13472-35-0 | Bereid buffers voor het eiwitzuiveringsproces. |
| Ni NTA Beads 6FF | Smart-Lifesciences, China | SA005005 | Eiwitzuivering. |
| Origin 8.5 | OriginLab, Northampton, MA, U.S.A. | ||
| Perfluoroctaansulfonzuur (PFOS) | J&K Scientific Ltd, China | 1763-23-1 | De gedetecteerde milieuverontreinigingen |
| Fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Solarbio, China | P0100 | Remt eiwitafbraak. |
| PPARγ-Competitor Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | PV6136 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136 |
| PPARγ-LBD Ligand Screening Assay Kit | Cayman | 600616 | https://www.caymanchem.com/product/600616 |
| Rosiglitazone (Rosi) | aladdin, China | 122320-73-4 | De agonisten van PPARγ |
| Shaker | ZHICHENG, China | ZWY-211C | Bacteriekweekexpansie en inductie van eiwitexpressie |
| Trifenylfosfaat (TPHP) | Macklin, China | T819317 | De gedetecteerde milieuverontreinigingen |
| Tris | Solarbio, China | T8230 | Bereid buffers voor het eiwitzuiveringsproces. |
| Tryptone | OXOID Limited, China | LP0042B | Bereid Lysogeny Broth (LB) medium. |
| Ultrasoon schoonmaakmiddel | Kimberly, China | LHO-1 | Verstoort de bacteriën om volledige lysering te bereiken |
| Urea | Solarbio, China | U8020 | Bereid buffers voor het eiwitzuiveringsproces. |
| Gistextract | OXOID Limited, China | LP0021B | Bereid Lysogeny Broth (LB) medium. |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit artikel is gepubliceerd
Video binnenkort beschikbaar