Een high-throughput screeningbenadering voor het evalueren van de bindingsaffiniteit van milieuverontreinigende stoffen voor nucleaire receptoren

Summary

Dit protocol beschrijft een high-throughput screeningsysteem dat fluorescentiepolarisatie van een specifieke fluorescerende sonde die bindt aan een nucleaire receptor gebruikt als uitlezing voor het screenen van milieuverontreinigende stoffen.

Abstract

Er zijn toenemende niveaus van verbindingen in het milieu gedetecteerd, die wijdverbreide vervuiling veroorzaken en risico's voor de menselijke gezondheid met zich meebrengen. Ondanks het feit dat ze vaak voorkomen in het milieu, is er echter zeer beperkte informatie over hun toxicologische effecten. Het is dringend nodig om high-throughput screening (HTS) -methoden te ontwikkelen om toxicologische studies te begeleiden. In deze studie werd een receptor-ligandbindingstest met behulp van een HTS-systeem ontwikkeld om de bindingspotentie van milieuverontreinigende stoffen op nucleaire receptoren te bepalen. De test wordt uitgevoerd met behulp van een microplaatlezer (d.w.z. een plaat met 96 putjes die verschillende chemicaliën bevat) door de fluorescentiepolarisatie (FP) van een specifieke fluorescerende sonde te meten. Deze test bestaat uit vier delen: de constructie en transformatie van recombinante vectoren, de expressie en zuivering van het receptoreiwit (ligandbindend domein), receptor-sondebinding en competitieve binding van chemicaliën met de receptor. De bindende potentie van twee milieuverontreinigende stoffen, perfluoroctaansulfonzuur (PFOS) en trifenylfosfaat (TPHP), met peroxisoomproliferator-geactiveerd receptorgamma (PPARγ) werd bepaald om de testprocedure te illustreren. Tot slot kwamen ook de voor- en nadelen van deze methode en de mogelijke toepassingen ervan aan bod.

Introduction

Een groot aantal chemicaliën is op grote schaal aangetroffen in het milieu en het menselijk lichaam, wat aanleiding geeft tot grote bezorgdheid over hun impact op het ecologische milieu en de menselijke gezondheid ^1,2,3. Ondanks het feit dat ze veel voorkomen in het milieu, is informatie over hun toxicologische effecten schaars. Daarom is het dringend nodig om high-throughput screening (HTS) -methoden te ontwikkelen om de beoordeling van chemische toxiciteit te vergemakkelijken.

Er zijn verschillende high-throughput screening (HTS)-methoden gerapporteerd voor de beoordeling van chemische toxiciteit, zoals de HTS-bioassays die worden gebruikt in de Tox21- en ToxCast-programma's ^4,5. Deze methoden kunnen snel potentiële toxische stoffen identificeren en waardevolle informatie opleveren over de mechanismen van chemische toxiciteit. Deze HTS-bioassays zijn echter voornamelijk gebaseerd op celgebaseerde systemen, die complex en duur kunnen zijn. Daarnaast zijn high-throughput sequencing-methoden ook gebruikt voor de beoordeling van de chemische toxiciteit, maar het bereiken van een high-throughput evaluatie van chemicaliën blijft een uitdaging⁶. Eerdere studies hebben op fluorescentiepolarisatie (FP) gebaseerde receptor-ligand competitieve bindingstesten ontwikkeld om de bindingspotentie te bepalen van verschillende milieuverontreinigende stoffen, waaronder per- en polyfluoralkylstoffen (PFAS)^7,8,9, bisfenol A (BPA)^10,11 en fijnstof (PM)¹², met nucleaire receptoren zoals peroxisoomproliferator-geactiveerde receptor (PPAR)^7, 8,9,10,13, farnesoïde X-receptor (FXR)^11,12 en schildklierreceptor (TR)^14,15. Deze aanpak is efficiënt, kosteneffectief en levert mechanistische inzichten op.

In deze studie wordt het protocol voor de receptor-ligandbindingstest beschreven op basis van het detecteren van de fluorescentiepolarisatie (FP) van een kleine fluorescerende sonde. Het principe van de FP-gebaseerde receptor-ligandbindingstest wordt geïllustreerd in figuur 1. Wanneer een klein fluorescerend molecuul wordt geëxciteerd door vlakgepolariseerd licht, wordt het uitgezonden licht sterk gedepolariseerd als gevolg van snelle moleculaire rotatie. Wanneer de tracer echter bindt aan een grotere receptor, wordt de rotatie vertraagd. Een hoge FP-waarde wordt gedetecteerd wanneer de tracer aan de grote receptor is gebonden, terwijl een lage FP-waarde wordt waargenomen wanneer de tracer vrij is. Peroxisoomproliferator-geactiveerd receptorgamma (PPARγ) werd gezuiverd voor de binding van de sonde aan de receptor. Rosiglitazon (Rosi), perfluoroctaansulfonzuur (PFOS) en trifenylfosfaat (TPHP) werden gebruikt om te concurreren om de binding van de sonde aan de receptor. Rosi, een specifieke agonist van PPARγ, werd gebruikt als positieve controle in de receptor competitieve bindingstesten. Bovendien zijn PFOS en TPHP eerder geïdentificeerd als zwakke agonisten van PPARγ in eerdere studies 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Bovendien behoren ze tot verschillende structurele categorieën van verbindingen die bekend staan om hun blootstelling aan het milieu en zijn ze opmerkelijk vanwege hun relatief hoge detectiepercentages in menselijke populaties. Deze verbindingen werden gebruikt om de brede toepasbaarheid van de competitiebindingstest verder te valideren. De procedure bestaat uit vier stappen: constructie en transformatie van recombinante vectoren, expressie en zuivering van het receptoreiwit (ligandbindend domein), receptor-sondebinding en competitieve binding van chemicaliën met de receptor.

Protocol

De details van de reagentia en de apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Constructie en transformatie van recombinante vectoren

OPMERKING: PPARγ is een ligand-afhankelijke transcriptiefactor met een klassieke nucleaire receptorstructuur, bestaande uit een DNA-bindend domein dat doelgenen reguleert en een ligandbindend domein dat wordt geactiveerd door liganden. Bij ligandactivering vormt PPARγ een heterodimeer met een andere nucleaire receptor, retinoïde X-receptor (RXR), en bindt zich aan responselementen van PPARγ, waardoor de transcriptie van stroomafwaartse doelgenen wordt gereguleerd ^9,16.

1. Ontwerp primers voor de PPARγ-LBD (zie Tabel 1) en amplificeer het PPARγ-LBD DNA-segment (zie Tabel 2 en Tabel 3).
2. Lineariseer de His×6-gelabelde pET28a-vector door deze te verteren met restrictie-endonucleasen XhoI en BamHI¹⁸.
3. Kloon het PPARγ-LBD DNA-segment in de His×6-gelabelde pET28a-vector met behulp van de in de handel verkrijgbare kloonkit, wat resulteert in het recombinante plasmide pET28a-PPARγ-LBD-6×His¹⁸.
4. Transfecteer het recombinante expressieplasmide pET28a-PPARγ-LBD-6×His in BL21 (DE3) Escherichia coli-cellen voor eiwitexpressie¹⁸.
5. Voeg 5 μL van de recombinante vector toe aan competente BL21(DE3)-cellen, incubeer 30 minuten op ijs, voer een hitteschok uit bij 42 °C gedurende 45 s en keer dan onmiddellijk terug naar het ijs.
6. Voeg 900 μL LB-medium toe, schud 1 uur bij 37 °C (160-200 tpm) en centrifugeer vervolgens 5 minuten bij ~3000 x g bij kamertemperatuur.
7. Gooi het bovenstaande weg, suspendeer de bacteriële pellet in 100 μL LB-medium en verdeel op een vast medium. Keer de platen en de cultuur 12-16 uur om bij 37 °C.
8. Selecteer individuele kolonies voor sequencing-identificatie en daaropvolgende eiwitexpressie en -zuivering.

2. Expressie en zuivering van het receptoreiwit

1. Incubeer de getransformeerde BL21 (DE3)-cellen in 200 ml LB-medium aangevuld met 100 μg/ml ampicilline op een orbitale schudder (230 tpm) gedurende 1-2 uur bij 37 °C.
2. Induceer de cellen wanneer de OD₆₀₀ 0,4-0,6 absorptie-eenheden bereikt door 10 μM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe te voegen en gedurende 16 uur bij 16 °C te incuberen.
3. Vang de bacteriële suspensie op en centrifugeer bij 8000 × g, 4 °C, gedurende 10 min.
4. Lyseer de cellen in 20 ml oplosbare lysisbuffer (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool, pH 8,0), voeg 200 μL fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) en 200 μL lysozym toe. Resuspendeer de bacteriële pellet met behulp van een pipet van 5 ml en ga vervolgens 20 minuten verder met sonicatie op 30% vermogen.
5. Voeg een lysisbuffer toe die gelijk is aan 5 keer het kolomvolume om de nikkelkolom in evenwicht te brengen. Herhaal dit proces twee keer en zet apart.
6. Centrifugeer de gesonificeerde bacteriële suspensie bij 8000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C om het bacteriële supernatans lysaat (CL) te verkrijgen.
7. Laad de CL op de nikkelkolom (voor eiwitadsorptie) om de doorstroom (FT) te verkrijgen.
8. Was de kolom met 5 keer het kolomvolume wasbuffer (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 20 mM imidazool, pH 8,0) om het waseluaat te verkrijgen (W1-W6).
9. Was de kolom met 1 ml elutiebuffer (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 250 mM imidazool, pH 8,0) om het doeleiwit te elueren en de eiwitfracties (E1-E5) te verkrijgen.
10. Neem een aliquot van 20 μL van elke fractie (CL, FT, W1-W6 en E1-E5) en analyseer met behulp van SDS-PAGE¹⁸ met Coomassie Brilliant Blue-kleuring. PPARγ-LBD werkt als een eiwit van 34,9 kDa op een denatureringsgel.

3. Receptor bindende test

OPMERKING: In deze test werd C1-BODIPY-C12 gebruikt als een plaatsspecifieke fluorescerende sonde om het receptor-ligandbindingssysteem tot stand te brengen. C1-BODIPY-C12, een specifiek ligand voor PPARγ, is een fluorescerend analoog van vetzuur met de BODIPY fluorescerende groep opgenomen in het vetzuur op de C1-positie.

1. Verdun de gezuiverde menselijke PPARγ-LBD in Tris-HCl-buffer (20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0) tot een concentratiebereik van 1 nM tot 6400 nM. Verdun ook de C1-BODIPY-C12-sonde in de Tris-HCl-buffer tot een concentratie van 50 nM.
2. Meng de verdunde PPARγ-LBD-oplossing (55 μL per putje) en de C1-BODIPY-C12 sonde-oplossing (55 μL per putje) in een zwarte plaat met 96 putjes. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
3. Meet fluorescentiepolarisatie (FP) met de microplaatlezer.
4. Zet de FP-waarden af tegen de receptorconcentratie, pas de curve aan met behulp van de specifieke binding met de heuvelhellingvergelijking met behulp van statistische en grafische software en bereken de K_d-waarde .

4. Concurrerende bindingstest

OPMERKING: In deze test werden 800 nM menselijke PPARγ-LBD en 50 nM C1-BODIPY-C12-sonde gebruikt voor receptorbinding. Rosiglitazon (Rosi), trifenylfosfaat (TPHP) en perfluoroctaansulfonzuur (PFOS) werden gebruikt om te concurreren met de binding van de sonde aan PPARγ.

1. Verdun de drie verbindingen in de Tris-HCl-buffer binnen een concentratiebereik van 0-200 μM.
2. Bereid de receptor-sondebindingsoplossing voor met een eindconcentratie van 800 nM humaan PPARγ-LBD en 50 nM C1-BODIPY-C12-sonde.
3. Meng de receptor-sondebindingsoplossing (55 μl per putje) en de samengestelde oplossing (55 μl per putje) in een zwarte plaat met 96 putjes. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
4. Meet fluorescentiepolarisatie (FP) met de microplaatlezer.
5. Zet de FP-waarden uit als functie van de ligandconcentratie. Verkrijg de halfmaximale remmende concentratie (IC₅₀) van elk ligand uit de wedstrijdcurve met behulp van het sigmoïdale model dat wordt verwerkt door een grafiek- en analysesoftware.

Results

Eiwitexpressie en zuivering van PPARγ-LBD
PPARγ-LBD werd heteroloog tot expressie gebracht in BL21 (DE3) als een histidine-gelabeld eiwit. Het eiwit werd gedetecteerd in de oplosbare fracties en de gezuiverde PPARγ-LBD vertoonde een enkele band op SDS-PAGE met een schijnbaar molecuulgewicht van ongeveer 34,9 kDa (Figuur 2), consistent met het voorspelde molecuulgewicht van het eiwit.

De binding van de C 1-BODIPY-C_12-sonde aan PPARγ-LBD
In de receptorbindingstest werd C1-BODIPY-C12, een BODIPY-gelabeld vetzuur dat kan binden aan PPARγ-LBD, gebruikt als fluorescentiesonde om het bindingsvermogen van milieuverontreinigende stoffen met hPPARγ-LBD te bestuderen. Zoals te zien is in figuur 3A, namen de fluorescentiepolarisatiewaarden (FP) toe van 20 naar 250 na toevoeging van PPARγ-LBD, wat wijst op de binding van C1-BODIPY-C12 aan de receptor. De bindingscurve bereikte verzadiging bij 800 nM PPARγ-LBD, met een dissociatieconstante (K_d) van 253,5 nM ± 10,05 nM. Daarom werd gekozen voor 800 nM PPARγ-LBD voor de daaropvolgende competitieve bindingstesten.

De concurrerende binding van milieuverontreinigende stoffen aan PPARγ-LBD
Rosiglitazon (Rosi), een specifieke agonist van PPARγ, werd gebruikt als positieve controle om de fluorescerende sonde te vervangen in de competitieve ligandbindingstesten. Zoals te zien is in figuur 3B, remde Rosi de binding van de C1-BODIPY-C12-sonde aan PPARγ-LBD op een dosisafhankelijke manier, met een IC₅₀ van 6,89 μM, wat de haalbaarheid van de test aantoont. Vervolgens werden de bindingsaffiniteiten van TPHP en PFOS naar PPARγ-LBD bepaald. Zoals te zien is in figuur 3C,D, remden TPHP en PFOS ook de binding van de C1-BODIPY-C12-sonde aan PPARγ-LBD op een dosisafhankelijke manier, met IC_50-waarden van respectievelijk 60,45 μM en 37,27 μM.

Figuur 1: Schematische weergave van op fluorescentiepolarisatie (FP) gebaseerde receptor competitieve bindingstesten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: SDS-PAGE analyse van de gezuiverde PPARγ-LBD. M is de eiwitmarker voor molecuulgewicht. Cl is het cellysaat, FT is de doorstroomfractie, W1-W6 zijn de wasoplossingen, E1 is het eluaat en E2-E4 zijn de gezuiverde PPARγ-LBD-eiwitten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Fluorescentiepolarisatie (FP)-gebaseerde receptorbindingscurve en concurrerende bindingscurves. (A) FP-gebaseerde bindingscurve van C 1-BODIPY-C₁₂ naar humaan PPARγ-LBD. (B-D) FP-gebaseerde competitieve bindingscurves van Rosi, TPHP en PFOS naar humaan PPARγ-LBD. Foutbalken geven de standaarddeviatie (SD) aan voor drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

LEGITIMATIEBEWIJS	Seq
pET28a-Menselijke PPARG-P1	CAAATGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCC
pET28a-Menselijke PPARG-P2	GTGGTGGTGCTCGAGTCAGTACAAGTCCTTGTAGATCTC
PPARγ-LBD nucleotidesequentie	AGACGACATTCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGAT ATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTG GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAA TGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCCGCTGAC CTCCGGGCCCTGGCAAAACATTTGTATGACTCATACATAAAGTCCTTCC CGCTGACCAAAGCAAAGGCGAGGGCGATCTTGACAGGAAAGACAACA GACAAATCACCATTCGTTATCTATGACATGAATTCCTTAATGATGGGAGA AGATAAAATCAAGTTCAAACACATCACCCCTGCAGGAGCAGAGCAA AGAGGTGGCCATCCGCATCTTTCAGGGCTGCCAGTTTCGCTCCGTGG AGGCTGTGCAGGAGATCACAGAGTATGCCAAAAGCATTCCTGGTTTTG TAAATCTTGACTTGAACGACCAAGTAACTCTCCTCAAATATGGAGTCCA CGAGATCATTTACACAATGCTGGCCTCCTTGATGAATAAAGATGGGGT TCTCATATCCGAGGGCCAAGGCTTCATGACAAGGGAGTTTCTAAAG AGCCTGCGAAAGCCTTTTGGTGACTTTATGGAGCCCAAGTTTGAGT TTGCTGTGAAGTTCAATGCACTGGAATTAGATGACAGCGACTTGGCAA TATTTATTGCTGTCATTATTCTCAGTGGAGACCGCCCAGGTTTGCTGAA TGTGAAGCCCATTGAAGACATTCAAGAACCTGCTACAAGCCCTGG AGCTCCAGCTGAAGCTGAACCCTGAGTCCTCACAGCTGTTTG CCAAGCTGCTCCAGAAAATGACAGACCTCAGAGAGATTGTCACGGA ACACGTGCAGCTACTGCAGGTGATCAAGAAGACGGAAACCGACATG AGTCTTCACCCGCTCCTGCAGGAGATCTACAAGGACTTGGACTGG CTCGAGGCCACCCACCC

Tabel 1: De primer en nucleotidesequentie van het PPARγ-ligandbindende domein.

Namen van experimentele reagentia	Volume/Dosis
pET28a-Menselijke PPARG-P1	1 μL
pET28a-Menselijke PPARG-P2	1 μL
2×phanta Max Master Mix	12,5 μL
cDNA	2 μL
ddH2O	8,5 μL

Tabel 2: PCR experimenteel reagenssysteem.

Namen van experimenten	Temperatuur	Tijd
Pre-denaturatie	95 °C	3 minuten
Denaturatie	95 °C	15 s
Annealing	65 °C	15 s
Extensie	72 °C	6 minuten
Winkel	12 °C	--

Tabel 3: PCR experimenteel reactieprogramma.

Discussion

Fluorescentiepolarisatie (FP), oppervlakteplasmonresonantie (SPR) en nucleaire magnetische resonantie (NMR) zijn veelgebruikte technieken die worden gebruikt voor het beoordelen van directe bindingsinteracties tussen eiwitten en verbindingen^19,20. FP is op grote schaal gebruikt bij het onderzoek naar moleculaire interacties voor het ontdekken van geneesmiddelen en chemische screening 21,22,23. Ter vergelijking: SPR- en NMR-assays zijn duur en tijdrovend, waardoor ze minder geschikt zijn voor high-throughput screening (HTS)-toepassingen. Dit protocol beschrijft een receptor-ligandanalysemethode op basis van FP met een plaatdetectiesysteem met meerdere putjes, waardoor de HTS van chemicaliën mogelijk wordt.

Het kiezen van de juiste sonde voor een receptorbindingstest is cruciaal. De sonde moet uit twee componenten bestaan: een specifieke ligand voor de nucleaire receptor en een fluorescerende groep. Doorgaans kunnen dergelijke sondes commercieel worden verkregen, zoals geïllustreerd door de C1-BODIPY-C12-sonde die in dit onderzoek is gebruikt. C1-BODIPY-C12 is een fluorescerend analoog van vetzuur, met de BODIPY fluorescerende groep opgenomen op de C1-positie, en is een specifiek ligand voor PPARγ. Als een in de handel verkrijgbare fluorescerende sonde geen optie is, moet deze chemisch worden gesynthetiseerd door een fluorescerende groep aan een bekende specifieke ligand te bevestigen.

De klassieke structuur van een nucleaire receptor omvat een DNA-bindend domein dat verantwoordelijk is voor het reguleren van de expressie van het doelgen en een ligandbindend domein (LBD), dat zich meestal op de C-terminus²⁴ van de receptor bevindt. De coregulatorische bindingsplaats wordt over het algemeen gevonden in het transcriptionele activeringsfunctiedomein van de nucleaire receptor, waar het interageert met nucleaire coregulerende factoren²⁵. Deze coregulatoren kunnen de transcriptieactiviteit van de receptor versterken of onderdrukken, waardoor de genexpressie wordt gemoduleerd. De LBD, die zich in een specifiek gebied van het receptoreiwit bevindt, reguleert de conformationele veranderingen van de receptor bij ligandbinding, die op zijn beurt de transcriptieactiviteit activeert of remt. Aangezien de LBD een goed gedefinieerd domein is dat cruciaal is voor het herkennen en binden van specifieke liganden van kleine moleculen²⁴, werd in deze studie alleen de receptor-LBD gebruikt in de receptorcompetitieve bindingstest. Deze aanpak, waarbij het ligandbindende domein van PPARγ tot expressie werd gebracht en gezuiverd, verlaagde de analysekosten.

De reagentia die bij deze methode worden gebruikt, waaronder buffers voor eiwitzuivering, C1-BODIPY-C12-sonde en Tris-HCl, zijn in de handel verkrijgbaar en goedkoop, wat een belangrijk voordeel is voor de test. Fluorescentiepolarisatie (FP) detectie wordt uitgevoerd in een plaat met meerdere putjes (96 putjes of 384 putjes), met een snelle leestijd van 3-5 minuten per plaat, waardoor de testdoorvoer en efficiëntie worden verbeterd. De receptor-ligandbindingsbenadering is zeer flexibel en kan gemakkelijk worden aangepast aan verschillende receptoren, op voorwaarde dat de receptoreiwitten beschikbaar zijn. Dit aanpassingsvermogen verbreedt de reikwijdte van het onderzoek dat met deze methode kan worden uitgevoerd. Over het algemeen maakt de combinatie van deze voordelen - gebruiksgemak, kostenefficiëntie, hoge doorvoercapaciteit, snelle verwerking en flexibiliteit bij receptoraanpassing - deze methode tot een veelbelovende optie voor het screenen van giftige milieuverontreinigende stoffen.

De huidige resultaten tonen aan dat PFOS en TPHP kunnen binden aan PPARγ, wat consistent is met eerdere bevindingen van moleculaire docking- en reportergentesten ^9,26. Bovendien is de in dit manuscript beschreven methode gebruikt om de bindende potentie van verschillende milieuverontreinigende stoffen met nucleaire receptoren te beoordelen. Bijvoorbeeld, met behulp van de FP-gebaseerde receptor-ligand competitieve bindingstest, de bindingspotentie van 19 per- en polyfluoralkylstoffen (PFAS's) en 7 bisfenol A (BPA)-verbindingen aan peroxisoomproliferator-geactiveerde receptor β/δ (PPARβ/δ)^7,10, 12 PFAS's aan PPARγ ^9,13, 7 BPA-verbindingen en 3 fijnstof (PM_2.5) componenten aan farnesoïde X-receptor (FXR)^{11, Er zijn 12} en 8 polybroomdifenylethers (PBDE's) en 6 polychloorbifenylen (PCB's) naar de schildklierreceptor (TR)^14,15 bepaald. Deze bevindingen benadrukken het potentieel van deze methode voor het screenen van de bindende interacties tussen milieuverontreinigende stoffen en nucleaire receptoren.

Eerdere studies hebben fluorescentiepolarisatie (FP)-testmethoden voor PPARγ gerapporteerd waarbij gelfiltratie wordt gebruikt om de binding te meten, wat ten minste 1,5 uur vereist om de binding van een enkele verbinding te detecteren²³. Daarentegen maakt deze methode het mogelijk om bindingsaffiniteiten te detecteren voor ten minste 12 verbindingen met PPARγ binnen 10 minuten. Bovendien kosten sommige in de handel verkrijgbare testkits (zie Materiaaltabel) meer dan $ 3000 voor een formaat van 800 × 20 μL. Deze methoden zijn met name duur en tijdrovend. Deze studie presenteert verbeteringen ten opzichte van deze bestaande methoden.

Een mogelijke beperking van deze methode is dat de fluorescentiesonde een ligand voor de receptor moet zijn en dat fluorescentiesondes niet rechtstreeks interageren met milieuverontreinigende stoffen. Daarom is het van cruciaal belang ervoor te zorgen dat de sonde en milieuverontreinigende stoffen gescheiden worden gehouden in de oplossing. Bovendien weerspiegelt deze test een in vitro situatie en kan het in vivo interacties niet volledig vastleggen, aangezien receptoren in vivo heterodimeer zijn ²⁷. Hoewel deze methode dient als een snel screeningsinstrument, is verder onderzoek naar receptoractivering en gerelateerde toxicologische mechanismen in vivo noodzakelijk.

Een ander nadeel is het "rechtse verschuiving"-fenomeen dat wordt waargenomen in fluorescentiepolarisatie (FP)-tests bij het evalueren van bindingsaffiniteit, wat kan leiden tot een systematische onderschatting van de gemeten affiniteiten. In eerdere studies werd de bindingsaffiniteit van rosiglitazon met PPARγ beoordeeld met behulp van de time-resolved fluorescence resonance energy transfer (TR-FRET) assay²⁸, een zeer gevoelige methode voor het meten van ligand-receptorbindingsaffiniteit. De TR-FRET-test is echter relatief tijdrovend en omslachtig, en vereist een incubatie van 4 uur van de reactieoplossing bij kamertemperatuur voordat deze wordt gedetecteerd. Hoewel de FP-test een lagere gevoeligheid vertoont in vergelijking met de TR-FRET-test, is deze meer geschikt voor high-throughput screening van omgevingsliganden die binden aan nucleaire receptoren. Desalniettemin kan de FP-test enkele zwakke omgevingsliganden missen. Bovendien werd in eerdere studies de bindingsaffiniteit van PFOS met PPARγ bepaald met behulp van evenwichtsdialyse (EqD)²⁹, een andere zeer gevoelige methode voor het meten van ligandreceptorbindingsaffiniteit. EqD vertrouwt echter op dure analytische apparatuur (LC-MS/MS), wat de toepassing ervan beperkt en screeningmogelijkheden met hoge doorvoer uitsluit.

Hoewel deze fluorescentiepolarisatie (FP)-test een "right-shift"-fenomeen vertoont, wat kan resulteren in over het algemeen hogere berekende IC_50-waarden , heeft dit geen invloed op de relatieve affiniteitsrangschikking of daaropvolgende risicobeoordelingsvoorspellingen. Bovendien is de FP-test kosteneffectief, tijdbesparend en in staat om een breed scala aan verbindingen te screenen op hun affiniteit met meerdere nucleaire receptoren. Over het algemeen vergemakkelijkt FP-gebaseerde high-throughput screening van milieuliganden de snelle identificatie van giftige milieuverontreinigende stoffen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C1-BODIPY-C12 Probe	Thermo Fisher Scientific, China	102209-82-3	Bindt aan PPARγ-LBD en zendt fluorescentie uit.
Coomassie Brilliant Blue R-250	Solarbio, China	6104-59-2	Kleur de eiwitbanden.
GraphPad prism	Dotmatics		https://www.graphpad.com/features
imidazol	Solarbio, China	I8090	Bereid buffers voor het eiwitzuiveringsproces.
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid	Solarbio, China	367-93-1	Induceert de expressie van PPARγ-LBD
Microplate reader	Biotek, USA	Synergy H1	Detectie van FP-waarde
NaCl	Shanghai Reagent	7647-15-5	Bereid buffers voor het eiwitzuiveringsproces.
NaH2PO4 · 2H2O	Shanghai Reagent	13472-35-0	Bereid buffers voor het eiwitzuiveringsproces.
Ni NTA Beads 6FF	Smart-Lifesciences, China	SA005005	Eiwitzuivering.
Origin 8.5	OriginLab, Northampton, MA, U.S.A.
Perfluoroctaansulfonzuur (PFOS)	J&K Scientific Ltd, China	1763-23-1	De gedetecteerde milieuverontreinigingen
Fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Solarbio, China	P0100	Remt eiwitafbraak.
PPARγ-Competitor Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	PV6136	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
PPARγ-LBD Ligand Screening Assay Kit	Cayman	600616	https://www.caymanchem.com/product/600616
Rosiglitazone (Rosi)	aladdin, China	122320-73-4	De agonisten van PPARγ
Shaker	ZHICHENG, China	ZWY-211C	Bacteriekweekexpansie en inductie van eiwitexpressie
Trifenylfosfaat (TPHP)	Macklin, China	T819317	De gedetecteerde milieuverontreinigingen
Tris	Solarbio, China	T8230	Bereid buffers voor het eiwitzuiveringsproces.
Tryptone	OXOID Limited, China	LP0042B	Bereid Lysogeny Broth (LB) medium.
Ultrasoon schoonmaakmiddel	Kimberly, China	LHO-1	Verstoort de bacteriën om volledige lysering te bereiken
Urea	Solarbio, China	U8020	Bereid buffers voor het eiwitzuiveringsproces.
Gistextract	OXOID Limited, China	LP0021B	Bereid Lysogeny Broth (LB) medium.