Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een medisch beslissingsondersteunend platform voor het identificeren van trombospondine 1 bij niet-alcoholische leververvetting via immuno-infiltratieanalyse

740 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67328

⸱

30 augustus 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Geriatric Cardiology, General Hospital of Southern Theater Command, 2Guangzhou Key Laboratory of Cardiac Rehabilitation, 3Branch of National Clinical Research Center for Geriatric Diseases, Chinese PLA General Hospital, 4The First School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 5Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Cardiovascular Department/The Second School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 6Department of Electronics & Communication Engineering, Mepco Schlenk Engineering College, 7Department of Teleinformatics Engineering, Federal University of Ceará

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie onderzocht de relaties tussen niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) en myocardinfarct (MI) door middel van co-tot expressie gebrachte genen, waarbij trombospondine 1 (THBS1) als biomarker werd geïdentificeerd. Immuno-infiltratieanalyse onthulde CD8+ T-cellen en neutrofielen als sleutelfactoren, waarbij THBS1 potentieel toonde als diagnostisch hulpmiddel voor NAFLD en MI.

Samenvatting

Niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) en myocardinfarct (MI) zijn twee belangrijke gezondheidsproblemen met een aanzienlijke prevalentie en mortaliteit. Deze studie had tot doel de genen met co-expressie te onderzoeken om de relatie tussen NAFLD en MI te begrijpen en potentiële cruciale biomarkers van NAFLD-gerelateerd MI te identificeren met behulp van bio-informatica en machine learning. Er werd een functionele verrijkingsanalyse uitgevoerd, een co-eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerkdiagram werd geconstrueerd en ondersteunende vector machine-recursieve functie-eliminatie (SVM-RFE) en minst absolute krimp- en selectieoperatortechnieken (LASSO) werden gebruikt om één differentieel tot expressie gebracht gen (DEG), trombospondine 1 (THBS1), te identificeren. THBS1 vertoonde sterke prestaties bij het onderscheiden van NAFLD-patiënten (AUC = 0,981) en MI-patiënten (AUC = 0,900). Immuno-infiltratieanalyse toonde significant lagere CD8+ T-cellen en hogere neutrofielenniveaus bij patiënten met NAFLD en MI. CD8+ T-cellen en neutrofielen waren effectief in het onderscheiden van NAFLD/MI van gezonde controles. Correlatieanalyse toonde aan dat THBS1 positief gecorreleerd was met CCR (chemokinereceptor), MHC-klasse (major histocompatibility complex-klasse), neutrofielen, para-inflammatie en Tfh (folliculaire helper-T-cellen), en negatief gecorreleerd met CD8+ T-cellen, cytolytische activiteit en TIL (tumor-infiltrerende lymfocyten) bij NAFLD- en MI-patiënten. THBS1 kwam naar voren als een nieuwe biomarker voor het diagnosticeren van NAFLD/MI in vergelijking met gezonde controles. De resultaten geven aan dat CD8+ T-cellen en neutrofielen kunnen dienen als inflammatoire immuunkenmerken om patiënten met NAFLD/MI te onderscheiden van gezonde individuen.

Inleiding

Niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) is een belangrijk probleem voor de volksgezondheid met een prevalentie van 25%-30%1. Er is gemeld dat de prevalentie van NAFLD hoog is bij patiënten met diabetes2. De betekenis van NAFLD bij niet-diabetische patiënten is echter nog niet duidelijk. Studies hebben gesuggereerd dat NAFLD een onafhankelijke rol speelt in de pathogenese van atherosclerose 3,4. Bovendien heeft een meta-analyse aangetoond dat NAFLD nauw verbonden is met verkalking van de kransslagader, endotheeldisfunctie en atherosclerose, en naar voren is gekomen als een onafhankelijke cardiovasculaire risicofactor5. Het verband tussen NAFLD en hart- en vaatziekten moet nog verder worden onderzocht.

Myocardinfarct (MI) is een catastrofale ziekte die de gezondheid bedreigt en een aanzienlijke economische last vormt voor patiënten en hun families wereldwijd6. MI is ook een belangrijke doodsoorzaak bij patiënten met NAFLD. Een klinische studie gepubliceerd in het British Medical Journal heeft aangetoond dat het risico op een hartinfarct bij NAFLD-patiënten 1,17 keer groter is dan bij niet-NAFLD-patiënten 7,8. Sommige studies hebben moleculaire routes geïdentificeerd, waaronder ontsteking, oxidatieve stress en lipidenmetabolisme, die bijdragen aan NAFLD-gerelateerde MI 9,10,11. De onderliggende mechanismen die NAFLD en MI met elkaar verbinden, blijven echter onduidelijk. Het is van cruciaal belang om nieuwe biomarkers te identificeren die verband houden met de prognose van NAFLD en MI.

De toenemende prevalentie van NAFLD, die een breed deel van de bevolking treft, onderstreept een belangrijk probleem voor de volksgezondheid, vooral gezien het verband met diabetes. De impact van NAFLD op niet-diabetische patiënten blijft echter slecht begrepen. NAFLD is betrokken bij de pathogenese van atherosclerose en wordt erkend als een onafhankelijke cardiovasculaire risicofactor, die nauw verband houdt met verkalking van de kransslagader, endotheeldisfunctie en atherosclerose. Ondanks deze associaties moeten de precieze mechanismen die NAFLD en hart- en vaatziekten zoals een myocardinfarct (MI) overbruggen, verder worden opgehelderd. MI is wereldwijd een van de belangrijkste doodsoorzaken en legt een aanzienlijke economische last met zich mee. Het risico op MI bij NAFLD-patiënten is aanzienlijk hoger dan bij patiënten zonder NAFLD, wat de noodzaak benadrukt van een beter begrip van de moleculaire routes die deze aandoeningen met elkaar verbinden. Hoewel ontsteking, oxidatieve stress en lipidenmetabolisme zijn gesuggereerd als bijdragende factoren, blijven de exacte mechanismen onduidelijk. Er is een dringende behoefte aan het identificeren van nieuwe biomarkers die inzicht kunnen geven in de prognose en behandeling van NAFLD-gerelateerd MI.

Bijgevolg werden in deze studie RNA-microarray-datasets voor NAFLD en MI gedownload van het National Center for Biotechnology Information-Gene Expression Omnibus (NCBI-GEO, zie Materiaaltabel) om de interactie van differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) tussen NAFLD en MI te identificeren en te analyseren. Verrijkingsanalyse, constructie van netwerkdiagrammen voor eiwit-eiwitinteractie (PPI), ondersteuning voor vectormachine-recursieve functie-eliminatie (SVM-RFE), en de algoritmen van de minst absolute krimp- en selectieoperator (LASSO) werden gebruikt om hub-genen 12,13,14,15,16,17,18,19 te identificeren. Immuno-infiltratieanalyse werd uitgevoerd om immuuncellen bij NAFLD- en MI-patiënten te onderzoeken. Uiteindelijk werden deze methoden geïntegreerd om de relatie tussen NAFLD en MI op te helderen. Figuur 1 illustreert de ontwerpvolgorde die in dit onderzoek is gevolgd. Door bio-informatica, machine learning en immuno-infiltratieanalyse te combineren, wil deze studie bijdragen aan de ontwikkeling van een nieuw medisch beslissingsondersteunend platform.

De belangrijkste bijdragen van dit artikel zijn: (1) Identificatie van genen die samen tot expressie worden gebracht: De studie benadrukt de relatie tussen NAFLD en MI door genen met co-expressie te identificeren, wat een beter begrip biedt van de moleculaire verbanden tussen deze twee aandoeningen. (2) Toepassing van bio-informatica en machine learning: Met behulp van bio-informatica en machine learning-technieken, waaronder support vector machine-recursive feature elimination (SVM-RFE)17 en least absolute shrinkage and selection operator (LASSO)19, identificeert de studie THBS1 als een differentieel tot expressie gebracht gen. THBS1 vertoont hoge prestaties bij het onderscheiden van NAFLD- en MI-patiënten van gezonde controles. (3) Immuno-infiltratieanalyse: De studie voert een immuno-infiltratieanalyse uit, waarbij significant lagere niveaus van CD8+ T-cellen en hogere niveaus van neutrofielen worden onthuld bij patiënten met NAFLD en MI. (4) Correlatieanalyse: Het onderzoek toont aan dat THBS1 positief gecorreleerd is met verschillende immuunfactoren, waaronder CCR (chemokinereceptor), MHC klasse I (belangrijk histocompatibiliteitscomplex klasse I), neutrofielen, para-inflammatie en Tfh-cellen (folliculaire helper T). Het is negatief gecorreleerd met CD8+ T-cellen, cytolytische activiteit en tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De details van de gebruikte databases, weblinks en software/pakketten staan vermeld in de Materiaaltabel. De gebruikte simulatieparameters worden weergegeven in tabel 1.

1. Het verkrijgen van RNA microarray datasets

  1. Download de dataset voor een myocardinfarct (MI), GSE66360, uit de NCBI-GEO-database .
  2. Download de dataset voor niet-alcoholische leververvetting (NAFLD), GSE89632, uit de NCBI-GEO-database .
  3. Zorg ervoor dat de gedownloade gegevenssets 49 MI-monsters, 50 gezonde controles voor GSE66360, 39 NAFLD-monsters en 24 gezonde controles voor GSE89632 bevatten.

2. Identificatie van DEG's

  1. Voorverwerking van gegevens en DEG-identificatie
    1. Laad de datasets in RStudio met behulp van de juiste R-functies.
    2. Gebruik de limma van het R-pakket om DEG's12 te identificeren met de volgende drempelwaarden: P < 0,05P en | log FC | > 1,5.
    3. Gebruik de R-pakketten pheatmap, ggplot2 en Venn om heatmaps en Venn-diagrammen te genereren voor het visualiseren van DEG's.
  2. Visualisaties maken
    1. Gebruik pheatmap om heatmaps van DEG's te genereren.
    2. Gebruik ggplot2 om Venn-diagrammen te maken die de overlap van DEG's tussen NAFLD en MI laten zien.

3. Verrijking analyse

  1. Voer GO-, KEGG- en DO-verrijkingsanalyses uit
    1. Laad DEG's in de R-pakketclusterProfiler13.
    2. Voer genontologie (GO)-verrijkingsanalyse uit om DEG's te categoriseren in moleculaire functies, biologische processen en cellulaire componenten.
    3. Voer Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway-analyse uit om DEG's in kaart te brengen op biochemische routes.
    4. Gebruik Disease Ontology (DO) verrijkingsanalyse om DEG's te koppelen aan specifieke klinische toestanden.

4. PPI-analyse door het bouwen van PPI-netwerken

  1. Gebruik het STRING online platform14 om eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerkdiagrammen van co-DEG's te bouwen met een betrouwbaarheidsscore van 0,4.
  2. Visualiseer de PPI-netwerken met behulp van Cytoscape15.

5. Candidate hub DEG's screenen door machine learning-algoritmen toe te passen

  1. Gebruik SVM-RFE (Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination) en LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) regressiealgoritmen in RStudio om de meest relevante DEG's 16,17,18 te selecteren.
  2. Zorg ervoor dat SVM-RFE functies iteratief rangschikt en verwijdert, terwijl LASSO-regressie19 regularisatie toepast om een schaarse set DEG's te identificeren.

6. ROC-curveconstructie voor het beoordelen van diagnostische prestaties

  1. Gebruik RStudio om ROC-curveanalyse (Receiver Operating Characteristic) uit te voeren20.
  2. Bereken de oppervlakte onder de curve (AUC) voor cruciale co-DEG's.

7. Immuno-infiltratieanalyse om immuuninfiltratie te onderzoeken

  1. Voer een enkelvoudige Gene Set Enrichment Analysis (ssGSEA) uit met behulp van de R-pakketten GSVA en GSEABase om immuuninfiltratie in NAFLD en MI21 te analyseren.
  2. Vergelijk de relatieve overvloed aan immuunceltypen tussen NAFLD- en MI-monsters en gezonde controles.

8. Statistische analyse

  1. Voer alle statistische analyses uit in RStudio.
  2. Pas Pearson-correlatieanalyse toe om patronen van co-expressie van genen te onderzoeken.
  3. Zorg voor statistische significantie met P < 0,05.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat alle software en R-pakketten correct zijn geïnstalleerd en bijgewerkt naar de nieuwste versies voordat u het protocol start.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De belangrijkste bevindingen van de voorgestelde studie worden hier gepresenteerd, waaronder verschillende analyses die zijn uitgevoerd om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan NAFLD en MI op te helderen.

Identificatie van DEG's
In de GSE89632-dataset werden 76 opgereguleerde en 20 neerwaarts gereguleerde genen geïdentificeerd als NAFLD-DEG's (Figuur 2B,D), terwijl de GSE66360-dataset 118 opgereguleerde en...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De methode die in deze studie wordt beschreven, heeft belangrijke implicaties voor het onderzoek naar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan NAFLD en MI. Door belangrijke biomarkers zoals THBS1 te identificeren, biedt het voorgestelde protocol potentiële doelen voor zowel diagnostische als therapeutische interventies. Deze benadering kan worden uitgebreid naar andere complexe ziekten waarbij meerdere routes en immuunresponsen betrokken zijn, waardoor de ontdekking van ni...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 62271511, U21A200949), Yucai Foundation of General Hospital of the Southern Theatre Command (2022NZC011), het Guangzhou Science and Technology Program Project (2023A03J0170), het National Clinical Research Center for Geriatrics (NCRCG-PLAGH-2023006) en Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (nr. 2020A1515010288, nr. 2021A1515220101).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CytoscapeCytoscape ConsortiumVersie 3.6.1Gebruikt voor het visualiseren van eiwit-eiwit interactie (PPI) netwerken
MI dataset GSE66360 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).NCBI-GEO database -Om RNA microarray datasets voor analyse te verzamelen
R pakket clusterProfilerBioconductor -Gebruikt voor GO, KEGG en DO verrijkingsanalyses
R pakket ggplot2CRAN -Gebruikt voor het maken van Venn diagrammen en andere visualisaties
R pakket GSEABaseBioconductor -Gebruikt in combinatie met GSVA voor genset verrijkingsanalyse
R pakket GSVABioconductor -Gebruikt voor single-sample genset verrijkingsanalyse (ssGSEA)
R pakket limmaBioconductor -Gebruikt voor het identificeren van differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs)
R pakket pheatmapCRAN -Gebruikt voor het genereren van heatmaps
R pakket vennCRAN -Gebruikt voor het maken van Venn diagrammen
RNA microarray datasets (GSE66360, GSE89632)NCBI-GEO -Openbaar beschikbare RNA microarray datasets gebruikt voor analyse
RStudioRStudio, PBCVersie 1.4.1717Geïntegreerde ontwikkelingsomgeving voor R
String databaseSTRING (www.string-db.org/) -Online tool voor het construeren van PPI netwerken

Referenties

  1. de Alwis, N. M. W., Day, C. P. Non-alcoholic fatty liver disease: The mist gradually clears. J Hepatol. 48 (Suppl), S104-S112 (2008).
  2. Adams, L. A., Anstee, Q. M., Tilg, H., Targher, G. Non-alcoholic fatty liver disease and its relationship with cardiovascular disease and other extrahepatic diseases. Gut. 66 (6), 1138-1153 (2017).
  3. Bhatia, L. S., Curzen, N. P., Calder, P. C., Byrne, C. D. Non-alcoholic fatty liver disease: A new and important cardiovascular risk factor. Eur Heart J. 33 (9), 1190-1200 (2012).
  4. Boddi, M., et al. Non-alcoholic fatty liver in non-diabetic patients with acute coronary syndromes. Eur J Clin Invest. 43 (4), 429-438 (2013).
  5. Oni, E. T., et al. A systematic review: Burden and severity of subclinical cardiovascular disease among those with non-alcoholic fatty liver; should we care. Atherosclerosis. 230 (2), 258-267 (2013).
  6. Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. Acute myocardial infarction. Lancet. 389 (10070), 197-210 (2017).
  7. Stahl, E. P., et al. Non-alcoholic fatty liver disease and the heart: JACC state-of-the-art review. J Am Coll Cardiol. 73 (8), 948-963 (2019).
  8. Alexander, M., et al. Non-alcoholic fatty liver disease and risk of incident acute myocardial infarction and stroke: findings from matched cohort study of 18 million European adults. BMJ. 367, 1934578X221093907(2019).
  9. Cobbina, E., Akhlaghi, F. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)-pathogenesis, classification, and effect on drug metabolizing enzymes and transporters. Drug Metab Rev. 49 (2), 197-211 (2017).
  10. Pawlak, M., Lefebvre, P., Staels, B. Molecular mechanism of PPARα action and its impact on lipid metabolism, inflammation and fibrosis in non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatol. 62 (3), 720-733 (2015).
  11. Katsiki, N., Mikhailidis, D. P., Mantzoros, C. S. Non-alcoholic fatty liver disease and dyslipidemia: An update. Metabolism. 65 (8), 1109-1123 (2016).
  12. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 43 (7), e47(2015).
  13. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: An R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
  14. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2021: Customizable protein-protein networks, and functional characterization of user-uploaded gene/measurement sets. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D605-D612 (2021).
  15. Sriroopreddy, R., Sajeed, R., Raghuraman, P., Sudandiradoss, C. Differentially expressed gene (DEG) based protein-protein interaction (PPI) network identifies a spectrum of gene interactome, transcriptome and correlated miRNA in nondisjunction Down syndrome. Int J Biol Macromol. 122, 1080-1089 (2019).
  16. Engebretsen, S., Bohlin, J. Statistical predictions with glmnet. Clin Epigenetics. 11, 123(2019).
  17. Ma, H., Ding, F., Wang, Y. A novel multi-innovation gradient support vector machine regression method. ISA Trans. 130, 343-359 (2022).
  18. Han, Y., Huang, L., Zhou, F. A dynamic recursive feature elimination framework (dRFE) to further refine a set of OMIC biomarkers. Bioinformatics. 37 (12), 2183-2189 (2021).
  19. Colombani, C., et al. Application of Bayesian least absolute shrinkage and selection operator (LASSO) and BayesCπ methods for genomic selection in French Holstein and Montbéliarde breeds. J Dairy Sci. 96 (2), 575-591 (2013).
  20. Gamper, M., et al. Gene expression profile of bladder tissue of patients with ulcerative interstitial cystitis. BMC Genomics. 10 (1), 1-17 (2009).
  21. Hänzelmann, S., Castelo, R., Guinney, J. GSVA: Gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 14, 1-15 (2013).
  22. Valbusa, F., et al. Non-alcoholic fatty liver disease and increased risk of all-cause mortality in elderly patients admitted for acute heart failure. Int J Cardiol. 265, 162-168 (2018).
  23. Zhang, Q., et al. Identification of hub biomarkers of myocardial infarction by single-cell sequencing, bioinformatics, and machine learning. Front Cardiovasc Med. 9, 939972(2022).
  24. Zhang, Q., et al. 7-Hydroxyflavone alleviates myocardial ischemia/reperfusion injury in rats by regulating inflammation. Molecules. 27 (17), 5371(2022).
  25. Zhang, Q., Guo, Y., Zhang, D. Network pharmacology integrated with molecular docking elucidates the mechanism of wuwei yuganzi san for the treatment of coronary heart disease. Nat Prod Commun. 17 (1), 1934578X221093907(2022).
  26. Baenziger, N. L., Brodie, G., Majerus, P. W. A thrombin-sensitive protein of human platelet membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 68 (2), 240-243 (1971).
  27. Zhang, N., Aiyasiding, X., Li, W. J., Liao, H. H., Tang, Q. Z. Neutrophil degranulation and myocardial infarction. Cell Commun Signal. 20 (1), 50(2022).
  28. Lawler, J. Thrombospondin-1 as an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. J Cell Mol Med. 6 (1), 1-12 (2002).
  29. Kaur, S., et al. Functions of thrombospondin-1 in the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 22 (9), 4570(2021).
  30. Asch, A. S., et al. Isolation of the thrombospondin membrane receptor. J Clin Invest. 79 (4), 1054-1061 (1987).
  31. Armstrong, L. C., Bornstein, P. Thrombospondins 1 and 2 function as inhibitors of angiogenesis. Matrix Biol. 22 (1), 63-71 (2003).
  32. Roberts, D. D., Isenberg, J. S. CD47 and thrombospondin-1 regulation of mitochondria, metabolism, and diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 321 (1), C201-C213 (2021).
  33. Emre, A., et al. Impact of non-alcoholic fatty liver disease on myocardial perfusion in non-diabetic patients undergoing primary percutaneous coronary intervention for ST-segment elevation myocardial infarction. Am J Cardiol. 116 (11), 1810-1814 (2015).
  34. Mouton, A. J., et al. Fibroblast polarization over the myocardial infarction time continuum shifts roles from inflammation to angiogenesis. Basic Res Cardiol. 114 (1), 1-16 (2019).
  35. Liu, Y., et al. Atherosclerotic conditions promote the packaging of functional microRNA-92a-3p into endothelial microvesicles. Circ Res. 124 (4), 575-587 (2019).
  36. Bai, J., et al. Thrombospondin 1 improves hepatic steatosis in diet-induced insulin-resistant mice and is associated with hepatic fat content in humans. EBioMedicine. 57 (1), 102-111 (2020).
  37. Wabitsch, S., et al. Metformin treatment rescues CD8+ T-cell response to immune checkpoint inhibitor therapy in mice with NAFLD. J Hepatol. 77 (4), 748-760 (2022).
  38. Dolejsi, T., et al. Adult T-cells impair neonatal cardiac regeneration. Eur Heart J. 43 (27), 2698-2709 (2022).
  39. Qin, Z., et al. Systemic immune-inflammation index is associated with increased urinary albumin excretion: a population-based study. Front Immunol. 13, 863640(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Bio-informatica-analysemachine learningsupport vector machineeiwit-eiwitinteractiedifferentieel tot expressie gebracht genCD8+ T-cellenneutrofielenspiegels

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.