Methodenartikel

Een medisch beslissingsondersteunend platform voor het identificeren van trombospondine 1 bij niet-alcoholische leververvetting via immuno-infiltratieanalyse

704 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67328

⸱

30 augustus 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Geriatric Cardiology, General Hospital of Southern Theater Command, 2Guangzhou Key Laboratory of Cardiac Rehabilitation, 3Branch of National Clinical Research Center for Geriatric Diseases, Chinese PLA General Hospital, 4The First School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 5Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Cardiovascular Department/The Second School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 6Department of Electronics & Communication Engineering, Mepco Schlenk Engineering College, 7Department of Teleinformatics Engineering, Federal University of Ceará

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie onderzocht de relaties tussen niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) en myocardinfarct (MI) door middel van co-tot expressie gebrachte genen, waarbij trombospondine 1 (THBS1) als biomarker werd geïdentificeerd. Immuno-infiltratieanalyse onthulde CD8+ T-cellen en neutrofielen als sleutelfactoren, waarbij THBS1 potentieel toonde als diagnostisch hulpmiddel voor NAFLD en MI.

Samenvatting

Niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) en myocardinfarct (MI) zijn twee belangrijke gezondheidsproblemen met een aanzienlijke prevalentie en mortaliteit. Deze studie had tot doel de genen met co-expressie te onderzoeken om de relatie tussen NAFLD en MI te begrijpen en potentiële cruciale biomarkers van NAFLD-gerelateerd MI te identificeren met behulp van bio-informatica en machine learning. Er werd een functionele verrijkingsanalyse uitgevoerd, een co-eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerkdiagram werd geconstrueerd en ondersteunende vector machine-recursieve functie-eliminatie (SVM-RFE) en minst absolute krimp- en selectieoperatortechnieken (LASSO) werden gebruikt om één differentieel tot expressie gebracht gen (DEG), trombospondine 1 (THBS1), te identificeren. THBS1 vertoonde sterke prestaties bij het onderscheiden van NAFLD-patiënten (AUC = 0,981) en MI-patiënten (AUC = 0,900). Immuno-infiltratieanalyse toonde significant lagere CD8+ T-cellen en hogere neutrofielenniveaus bij patiënten met NAFLD en MI. CD8+ T-cellen en neutrofielen waren effectief in het onderscheiden van NAFLD/MI van gezonde controles. Correlatieanalyse toonde aan dat THBS1 positief gecorreleerd was met CCR (chemokinereceptor), MHC-klasse (major histocompatibility complex-klasse), neutrofielen, para-inflammatie en Tfh (folliculaire helper-T-cellen), en negatief gecorreleerd met CD8+ T-cellen, cytolytische activiteit en TIL (tumor-infiltrerende lymfocyten) bij NAFLD- en MI-patiënten. THBS1 kwam naar voren als een nieuwe biomarker voor het diagnosticeren van NAFLD/MI in vergelijking met gezonde controles. De resultaten geven aan dat CD8+ T-cellen en neutrofielen kunnen dienen als inflammatoire immuunkenmerken om patiënten met NAFLD/MI te onderscheiden van gezonde individuen.

Inleiding

Niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) is een belangrijk probleem voor de volksgezondheid met een prevalentie van 25%-30%1. Er is gemeld dat de prevalentie van NAFLD hoog is bij patiënten met diabetes2. De betekenis van NAFLD bij niet-diabetische patiënten is echter nog niet duidelijk. Studies hebben gesuggereerd dat NAFLD een onafhankelijke rol speelt in de pathogenese van atherosclerose 3,4. Bovendien heeft een meta-analyse aangetoond dat NAFLD nauw verbonden is met verkalking van de kransslagader, endotheeldisfunctie en atherosclerose, en naar voren is gekomen als een onafhankelijke cardiovasculaire risicofactor5. Het verband tussen NAFLD en hart- en vaatziekten moet nog verder worden onderzocht.

Myocardinfarct (MI) is een catastrofale ziekte die de gezondheid bedreigt en een aanzienlijke economische last vormt voor patiënten en hun families wereldwijd6. MI is ook een belangrijke doodsoorzaak bij patiënten met NAFLD. Een klinische studie gepubliceerd in het British Medical Journal heeft aangetoond dat het risico op een hartinfarct bij NAFLD-patiënten 1,17 keer groter is dan bij niet-NAFLD-patiënten 7,8. Sommige studies hebben moleculaire routes geïdentificeerd, waaronder ontsteking, oxidatieve stress en lipidenmetabolisme, die bijdragen aan NAFLD-gerelateerde MI 9,10,11. De onderliggende mechanismen die NAFLD en MI met elkaar verbinden, blijven echter onduidelijk. Het is van cruciaal belang om nieuwe biomarkers te identificeren die verband houden met de prognose van NAFLD en MI.

De toenemende prevalentie van NAFLD, die een breed deel van de bevolking treft, onderstreept een belangrijk probleem voor de volksgezondheid, vooral gezien het verband met diabetes. De impact van NAFLD op niet-diabetische patiënten blijft echter slecht begrepen. NAFLD is betrokken bij de pathogenese van atherosclerose en wordt erkend als een onafhankelijke cardiovasculaire risicofactor, die nauw verband houdt met verkalking van de kransslagader, endotheeldisfunctie en atherosclerose. Ondanks deze associaties moeten de precieze mechanismen die NAFLD en hart- en vaatziekten zoals een myocardinfarct (MI) overbruggen, verder worden opgehelderd. MI is wereldwijd een van de belangrijkste doodsoorzaken en legt een aanzienlijke economische last met zich mee. Het risico op MI bij NAFLD-patiënten is aanzienlijk hoger dan bij patiënten zonder NAFLD, wat de noodzaak benadrukt van een beter begrip van de moleculaire routes die deze aandoeningen met elkaar verbinden. Hoewel ontsteking, oxidatieve stress en lipidenmetabolisme zijn gesuggereerd als bijdragende factoren, blijven de exacte mechanismen onduidelijk. Er is een dringende behoefte aan het identificeren van nieuwe biomarkers die inzicht kunnen geven in de prognose en behandeling van NAFLD-gerelateerd MI.

Bijgevolg werden in deze studie RNA-microarray-datasets voor NAFLD en MI gedownload van het National Center for Biotechnology Information-Gene Expression Omnibus (NCBI-GEO, zie Materiaaltabel) om de interactie van differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) tussen NAFLD en MI te identificeren en te analyseren. Verrijkingsanalyse, constructie van netwerkdiagrammen voor eiwit-eiwitinteractie (PPI), ondersteuning voor vectormachine-recursieve functie-eliminatie (SVM-RFE), en de algoritmen van de minst absolute krimp- en selectieoperator (LASSO) werden gebruikt om hub-genen 12,13,14,15,16,17,18,19 te identificeren. Immuno-infiltratieanalyse werd uitgevoerd om immuuncellen bij NAFLD- en MI-patiënten te onderzoeken. Uiteindelijk werden deze methoden geïntegreerd om de relatie tussen NAFLD en MI op te helderen. Figuur 1 illustreert de ontwerpvolgorde die in dit onderzoek is gevolgd. Door bio-informatica, machine learning en immuno-infiltratieanalyse te combineren, wil deze studie bijdragen aan de ontwikkeling van een nieuw medisch beslissingsondersteunend platform.

De belangrijkste bijdragen van dit artikel zijn: (1) Identificatie van genen die samen tot expressie worden gebracht: De studie benadrukt de relatie tussen NAFLD en MI door genen met co-expressie te identificeren, wat een beter begrip biedt van de moleculaire verbanden tussen deze twee aandoeningen. (2) Toepassing van bio-informatica en machine learning: Met behulp van bio-informatica en machine learning-technieken, waaronder support vector machine-recursive feature elimination (SVM-RFE)17 en least absolute shrinkage and selection operator (LASSO)19, identificeert de studie THBS1 als een differentieel tot expressie gebracht gen. THBS1 vertoont hoge prestaties bij het onderscheiden van NAFLD- en MI-patiënten van gezonde controles. (3) Immuno-infiltratieanalyse: De studie voert een immuno-infiltratieanalyse uit, waarbij significant lagere niveaus van CD8+ T-cellen en hogere niveaus van neutrofielen worden onthuld bij patiënten met NAFLD en MI. (4) Correlatieanalyse: Het onderzoek toont aan dat THBS1 positief gecorreleerd is met verschillende immuunfactoren, waaronder CCR (chemokinereceptor), MHC klasse I (belangrijk histocompatibiliteitscomplex klasse I), neutrofielen, para-inflammatie en Tfh-cellen (folliculaire helper T). Het is negatief gecorreleerd met CD8+ T-cellen, cytolytische activiteit en tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL).

Protocol

De details van de gebruikte databases, weblinks en software/pakketten staan vermeld in de Materiaaltabel. De gebruikte simulatieparameters worden weergegeven in tabel 1.

1. Het verkrijgen van RNA microarray datasets

  1. Download de dataset voor een myocardinfarct (MI), GSE66360, uit de NCBI-GEO-database .
  2. Download de dataset voor niet-alcoholische leververvetting (NAFLD), GSE89632, uit de NCBI-GEO-database .
  3. Zorg ervoor dat de gedownloade gegevenssets 49 MI-monsters, 50 gezonde controles voor GSE66360, 39 NAFLD-monsters en 24 gezonde controles voor GSE89632 bevatten.

2. Identificatie van DEG's

  1. Voorverwerking van gegevens en DEG-identificatie
    1. Laad de datasets in RStudio met behulp van de juiste R-functies.
    2. Gebruik de limma van het R-pakket om DEG's12 te identificeren met de volgende drempelwaarden: P < 0,05P en | log FC | > 1,5.
    3. Gebruik de R-pakketten pheatmap, ggplot2 en Venn om heatmaps en Venn-diagrammen te genereren voor het visualiseren van DEG's.
  2. Visualisaties maken
    1. Gebruik pheatmap om heatmaps van DEG's te genereren.
    2. Gebruik ggplot2 om Venn-diagrammen te maken die de overlap van DEG's tussen NAFLD en MI laten zien.

3. Verrijking analyse

  1. Voer GO-, KEGG- en DO-verrijkingsanalyses uit
    1. Laad DEG's in de R-pakketclusterProfiler13.
    2. Voer genontologie (GO)-verrijkingsanalyse uit om DEG's te categoriseren in moleculaire functies, biologische processen en cellulaire componenten.
    3. Voer Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway-analyse uit om DEG's in kaart te brengen op biochemische routes.
    4. Gebruik Disease Ontology (DO) verrijkingsanalyse om DEG's te koppelen aan specifieke klinische toestanden.

4. PPI-analyse door het bouwen van PPI-netwerken

  1. Gebruik het STRING online platform14 om eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerkdiagrammen van co-DEG's te bouwen met een betrouwbaarheidsscore van 0,4.
  2. Visualiseer de PPI-netwerken met behulp van Cytoscape15.

5. Candidate hub DEG's screenen door machine learning-algoritmen toe te passen

  1. Gebruik SVM-RFE (Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination) en LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) regressiealgoritmen in RStudio om de meest relevante DEG's 16,17,18 te selecteren.
  2. Zorg ervoor dat SVM-RFE functies iteratief rangschikt en verwijdert, terwijl LASSO-regressie19 regularisatie toepast om een schaarse set DEG's te identificeren.

6. ROC-curveconstructie voor het beoordelen van diagnostische prestaties

  1. Gebruik RStudio om ROC-curveanalyse (Receiver Operating Characteristic) uit te voeren20.
  2. Bereken de oppervlakte onder de curve (AUC) voor cruciale co-DEG's.

7. Immuno-infiltratieanalyse om immuuninfiltratie te onderzoeken

  1. Voer een enkelvoudige Gene Set Enrichment Analysis (ssGSEA) uit met behulp van de R-pakketten GSVA en GSEABase om immuuninfiltratie in NAFLD en MI21 te analyseren.
  2. Vergelijk de relatieve overvloed aan immuunceltypen tussen NAFLD- en MI-monsters en gezonde controles.

8. Statistische analyse

  1. Voer alle statistische analyses uit in RStudio.
  2. Pas Pearson-correlatieanalyse toe om patronen van co-expressie van genen te onderzoeken.
  3. Zorg voor statistische significantie met P < 0,05.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat alle software en R-pakketten correct zijn geïnstalleerd en bijgewerkt naar de nieuwste versies voordat u het protocol start.

Resultaten

De belangrijkste bevindingen van de voorgestelde studie worden hier gepresenteerd, waaronder verschillende analyses die zijn uitgevoerd om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan NAFLD en MI op te helderen.

Identificatie van DEG's
In de GSE89632-dataset werden 76 opgereguleerde en 20 neerwaarts gereguleerde genen geïdentificeerd als NAFLD-DEG's (Figuur 2B,D), terwijl de GSE66360-dataset 118 opgereguleerde en 8 neerwaarts gereguleerde genen onthulde als MI-DEG's (Figuur 2C,E). Vervolgens werden co-DEG's afgeleid uit de overlap tussen NAFLD-DEG's en MI-DEG's, waarbij 13 opwaarts gereguleerde DEG's en 1 neerwaarts gereguleerde DEG onder de co-DEG's werden geïdentificeerd (Figuur 2A).

Het identificeren van DEG's die uniek zijn voor NAFLD en MI, evenals die welke beide aandoeningen gemeen hebben, biedt waardevolle inzichten in de moleculaire processen die ten grondslag liggen aan deze ziekten. Inzicht in de verschillende en gedeelde genexpressiepatronen die verband houden met beide aandoeningen helpt de pathofysiologie van NAFLD en MI te verduidelijken en kan potentiële moleculaire doelen voor therapeutische interventie identificeren. Verder onderzoek naar de co-DEG's zou kritische regulatoren of routes kunnen onthullen die essentieel zijn voor de interactie tussen deze twee aandoeningen, waardoor de ontwikkeling van gerichte therapieën wordt vergemakkelijkt die gericht zijn op het verminderen van de negatieve gezondheidsresultaten die verband houden met NAFLD en MI.

Verrijking analyse
GO-analyse toonde aan dat NAFLD DEG's voornamelijk werden verrijkt in de volgende biologische processen (BP): vetceldifferentiatie, respons op lipopolysaccharide en meercellige organismeprocessen (p < 0,05, figuur 3A). Voor cellulaire componenten (CC) waren NAFLD DEG's voornamelijk geassocieerd met het fosfatidylinositol 3-kinasecomplex, secretoir granulelumen en cytoplasmatisch blaasjeslumen (p < 0,05, figuur 3A). In termen van moleculaire functie (MF) omvatten de belangrijkste activiteiten fosfatidylinositol-3-kinaseregulatoractiviteit, DNA-bindende transcriptieactivatoractiviteit (RNA-polymerasespecifiek) en algemene DNA-bindende transcriptieactivatoractiviteit (p < 0,05, Figuur 3A).

Voor MI-DEG's toonde de BP-analyse verrijking in leukocytenchemotaxis, activering van myeloïde leukocyten en celchemotaxis (p < 0,05, figuur 3B). De CC-analyse benadrukte verrijking in tertiaire korrels, ficoline-1-rijke korrels en secretoir korrellumen (p < 0,05, Figuur 3B). MF-analyse onthulde verrijking in patroonherkenningsreceptoractiviteit, RAGE-receptorbinding en immuunreceptoractiviteit (p < 0,05, Figuur 3B).

KEGG-verrijkingsanalyse gaf aan dat NAFLD-DEG's significant verrijkt waren in de volgende routes: IL-17, AGE-RAGE, TNF, osteoclastdifferentiatie, malaria, reumatoïde artritis, ziekte van Chagas en JAK-STAT-signaleringsroutes (p < 0,05, figuur 3C). MI-DEG's waren verrijkt in IL-17, TNF, lipidenmetabolisme en atherosclerose, toll-like receptorsignalering, C-type lectinereceptorsignalering, legionellose, reumatoïde artritis en NF-KB-signaleringsroutes (p < 0,05, Figuur 3D). Disease Ontology (DO) verrijkingsanalyse toonde aan dat de top drie DEG's voor zowel NAFLD als MI significant geassocieerd waren met atherosclerose, arteriosclerotische hart- en vaatziekten en arteriosclerose (p < 0,05, figuur 3E-F).

Analyse van PPI-netwerkdiagrammen
In het PPI-netwerkdiagram voor NAFLD werden 92 knooppunten en 250 randen geïdentificeerd, wat een weerspiegeling is van een complex netwerk van interacties tussen eiwitten die verband houden met deze aandoening. Evenzo onthulde het PPI-netwerkdiagram voor MI 117 knooppunten en 587 randen, wat wijst op een ingewikkelder netwerk dat kenmerkend is voor het moleculaire landschap van een hartinfarct. Bovendien identificeerden de PPI-netwerkdiagrammen voor co-DEG's 14 knooppunten en 21 randen, wat de nadruk legde op mogelijke sleutelinteracties tussen eiwitten die worden gedeeld tussen NAFLD en MI (Figuur 4A-F).

PPI-netwerken zijn waardevol voor het construeren en analyseren van therapeutische doelen en bieden belangrijke inzichten in de moleculaire verbindingen die ten grondslag liggen aan NAFLD en MI. De unieke netwerktopologieën die in NAFLD en MI worden waargenomen, benadrukken de verschillende pathofysiologische mechanismen die bij deze ziekten betrokken zijn. Bovendien suggereert de ontdekking van gedeelde verbindingen tussen co-DEG's potentiële gedeelde routes of regulerende netwerken die de interactie tussen MI en NAFLD bemiddelen. Verder onderzoek naar deze verbanden zou nieuwe moleculaire doelen voor interventie en therapieontwikkeling aan het licht kunnen brengen, die mogelijk nieuwe behandelingsopties voor deze complexe ziekten kunnen bieden.

Screening van kandidaat-hub DEG's
Het SVM-RFE-algoritme17 werd gebruikt om te screenen op potentiële cruciale DEG's, wat resulteerde in de identificatie van 6 genen in GSE89632 en 4 genen in GSE66360 (Figuur 5A,B). Evenzo werd het LASSO-algoritme19 gebruikt om kandidaat-cruciale DEG's te identificeren, wat 4 genen opleverde in GSE89632 en 5 genen in GSE66360 (Figuur 5C,D). Een Venn-diagram toonde met name de kruising van de hub-DEG (THBS1) geïdentificeerd door SVM-RFE-, LASSO- en co-PPI-netwerkanalyses, wat het belang ervan in zowel NAFLD- als MI-pathogenese onderstreepte (Figuur 5F).

Deze geavanceerde machine learning-algoritmen boden een robuust raamwerk voor het identificeren van belangrijke DEG's die verband houden met MI en NAFLD en boden waardevolle inzichten in hun potentieel als therapeutische of diagnostische doelen. De identificatie van THBS1 als een hub-gen door middel van meerdere analytische technieken benadrukt het belang ervan in de moleculaire routes die aan beide ziekten ten grondslag liggen. Verder onderzoek naar de functionele betekenis van THBS1 en de interacties ervan binnen het co-PPI-netwerk zou nieuwe mechanismen kunnen ophelderen die NAFLD en MI met elkaar verbinden, wat mogelijk de weg vrijmaakt voor gerichte therapieën en strategieën voor precisiegeneeskunde.

Diagnostische waarde van één hub DEG's
ROC-analyse werd uitgevoerd om de diagnostische efficiëntie van de geïdentificeerde hub-DEG's in zowel NAFLD- als MI-datasets te beoordelen. Zoals weergegeven in figuur 6A,B, vertoonde THBS1 een hoog onderscheidend vermogen, met een AUC van 0,981 (95% BI: 0,949-1,000) bij NAFLD-patiënten en 0,900 (95% BI: 0,834-0,956) bij MI-patiënten. De sterke prestaties van THBS1 als diagnostische biomarker benadrukken het potentiële nut ervan bij het differentiëren tussen NAFLD, MI en gezonde controles.

Deze resultaten suggereren dat THBS1 zou kunnen dienen als een waardevolle marker voor de ziektetoestand, en clinici een nuttig hulpmiddel biedt voor risicobeoordeling en vroege identificatie. Om de integratie van THBS1 in de klinische praktijk te vergemakkelijken en de patiëntenzorg en -behandeling te verbeteren, zijn verdere validatiestudies nodig om de diagnostische nauwkeurigheid ervan te bevestigen in diverse patiëntenpopulaties en klinische omgevingen.

Analyse van immuuninfiltratie
ssGSEA werd uitgevoerd om 29 immuungerelateerde genen tussen NAFLD/MI en de controlegroep (CON) te analyseren. Vergeleken met de CON-groep was de infiltratie van immuuncellen significant verhoogd in de NAFLD- en MI-groepen, met name voor CCR-, MHC-klasse I, neutrofielen, para-inflammatie en Tfh-cellen (p < 0,05, figuur 7A,B). Omgekeerd nam de infiltratie van immuuncellen aanzienlijk af in de NAFLD- en MI-groepen ten opzichte van de CON-groep, vooral voor CD8+ T-cellen, cytolytische activiteit en tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL) (p < 0,05, Figuur 7C,D).

Deze resultaten suggereren ontregeling van de infiltratie van immuuncellen in zowel NAFLD als MI, wat het complexe immunologische landschap benadrukt dat met deze aandoeningen gepaard gaat. De waargenomen veranderingen in de samenstelling van immuuncellen bieden waardevolle inzichten in de immunologische processen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en pathofysiologie van deze ziekten. Een beter begrip van deze immuunkenmerken zou nieuwe therapeutische doelen voor interventie kunnen onthullen en de ontwikkeling van geïndividualiseerde behandelplannen kunnen ondersteunen op basis van de immunologische profielen van patiënten met NAFLD en MI.

figure-results-1
Figuur 1: De ontwerpvolgorde van het medische beslissingsondersteunende systeem voor het identificeren van THBS1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Venn-diagrammen, vulkaandiagrammen en heatmaps. (A) Venn-diagram voor GSE89632 en GSE66360. (B) Een vulkaandiagram van differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) in GSE89632. (C) Een vulkaandiagram van DEG's in GSE66360. (D) Een heatmap-diagram van DEG's in GSE89632. (E) Een heatmap-diagram van DEG's in GSE66360. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Verrijkingsanalyse van differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's). (A) De top vijf NALFD-DEG's verrijkte genontologie (GO) in biologisch proces (BP), cellulaire component (CC) en moleculaire functie (MF). (B) De top vijf MI-DEG's verrijkte GO in BP, CC en MF. (C) De top acht NALFD-DEG's verrijkte Kyoto-encyclopedie van genen en genomen (KEGG) signaalroutes. (D) De top acht MI-DEG's verrijkten KEGG-signaleringsroutes. (E) De top vijf NALFD-DEG's verrijkte ziekteontologie (DO). (F) De top vijf MI-DEG's verrijkte DO. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Eiwit-eiwit interactie (PPI) netwerkdiagrammen. (A) Een PPI-netwerkdiagram van niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) verkregen van het online platform String. (B) Een PPI-netwerkdiagram van NAFLD verkregen van Cytoscape. (C) Een PPI-netwerkdiagram van een myocardinfarct (MI) verkregen van het online platform String. (D) Een PPI-netwerkdiagram van MI verkregen Cytoscape. (E) Een PPI-netwerkdiagram van eiwitinteracties. (F) Een PPI-netwerkdiagram van IL1B en FOS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Screening van DEG's in de kandidatenhub. (A) Zes cruciale DEG's verkregen door SVM-RFE in NAFLD. (B) Vier cruciale DEG's verkregen door SVM-RFE bij een myocardinfarct (MI). (C) Vier cruciale DEG's verkregen door LASSO in NAFLD. (D) Vijf cruciale DEG's verkregen door LASSO in MI. (E) Slechts één DEG verkregen uit het bovenstaande resulteert in het Venn-diagram. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Diagnostische waarde van één hub differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's). (A) ROC-curven in NAFLD. (B) ROC-curven in MI. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Verdeling van infiltrerende immuuncellen en correlatie tussen THBS1 en infiltrerende immuuncellen bij niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) en myocardinfarct (MI). (A) Verdeling van infiltrerende immuuncellen bij NAFLD. (B) Distributie van infiltrerende immuuncellen in MI. (C) Correlatie tussen THBS1 en infiltrerende immuuncellen in NAFLD. (D) Correlatie tussen THBS1 en infiltrerende immuuncellen in MI. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

AfkortingNomenclatuur
AUCGebied onder kromme
BPBiologisch proces
CCCellulaire component
BEDRIEGENBesturingselementen
DEGDifferentieel tot expressie gebrachte genen
DOENOntologie van de ziekte
GAANGen ontologie
KEGGKyoto Encyclopedie van Genen en Genomen
LASSOOperator Minste absolute krimp en selectie
MFMoleculaire functie
MIMyocardinfarct
NAFLDNiet-alcoholische leververvetting
PPIEiwit-eiwit interactie
ROCOntvanger Operator Karakteristieken
ssGSEAverrijkingsanalyse van genenset met één steekproef
SVM-RFEOndersteuning voor eliminatie van vectormachine-recursieve functies
THBS1Trombospondine 1

Tabel 1: Simulatieparameters die bij de experimenten zijn gebruikt.

Discussie

De methode die in deze studie wordt beschreven, heeft belangrijke implicaties voor het onderzoek naar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan NAFLD en MI. Door belangrijke biomarkers zoals THBS1 te identificeren, biedt het voorgestelde protocol potentiële doelen voor zowel diagnostische als therapeutische interventies. Deze benadering kan worden uitgebreid naar andere complexe ziekten waarbij meerdere routes en immuunresponsen betrokken zijn, waardoor de ontdekking van nieuwe biomarkers en therapeutische doelen wordt vergemakkelijkt. Bovendien biedt de integratie van bio-informatica en machine learning-technieken een veelzijdig kader voor gepersonaliseerde geneeskunde, waardoor op maat gemaakte behandelingsstrategieën mogelijk zijn op basis van individuele moleculaire profielen. Deze methode kan ook worden aangepast voor gebruik in klinische omgevingen om de diagnostische nauwkeurigheid te verbeteren en de patiëntresultaten te verbeteren door middel van gerichte interventies.

NAFLD en myocardinfarct (MI) zijn twee belangrijke gezondheidsproblemen met een aanzienlijke prevalentie en mortaliteit. NAFLD wordt gekenmerkt door de ophoping van lipiden in de lever1. Toenemend bewijs suggereert dat NAFLD niet alleen de structurele integriteit van het hart nadelig beïnvloedt, maar ook de functie ervan, met name in de context van MI 22,23,24. Bovendien is er overtuigend bewijs dat wijst op een sterke correlatie tussen NAFLD en atherosclerose. Studies hebben aangetoond dat de prevalentie en ernst van NAFLD bij patiënten met niet-diabetisch MI verband houden met coronaire hartziekte25. Matige tot ernstige NAFLD is een onafhankelijke risicofactor gebleken, waardoor het risico op meerdere laesies van de kransslagader drievoudig toeneemt4. Deze studies richten zich echter voornamelijk op NAFLD en MI, waardoor de onderliggende mechanismen van de associatie tussen NAFLD en atherosclerose nog onduidelijk zijn. Het is dus van cruciaal belang om deze mechanismen te onderzoeken om NAFLD-gerelateerd MI te voorkomen.

In deze studie zijn twee datasets verkregen van de NCBI-GEO. De analyse onthulde 13 opwaarts gereguleerde DEG's en 1 neerwaarts gereguleerde DEG tussen NAFLD en MI. Er werd een functionele verrijkingsanalyse uitgevoerd, er werd een co-PPI-netwerkdiagram geconstrueerd en er werden twee machine-learning-algoritmen gebruikt om hub-DEG's te identificeren. Als gevolg hiervan werd THBS1 geïdentificeerd als een nieuwe biomarker met een uitstekende diagnostische efficiëntie voor zowel NAFLD als MI. Support Vector Machine (SVM) is een gesuperviseerde machine learning-techniek die veel wordt gebruikt voor classificatie en regressie17. Recursieve functie-eliminatie (RFE) helpt bij het selecteren van de meest significante genen uit het monster. Het LASSO-regressie-algoritme19 past regularisatie toe om de nauwkeurigheid van de voorspelling te verbeteren. Door deze algoritmen te combineren met co-DEG's, konden we screenen op de optimale DEG's.

Op basis van de analyse met behulp van twee machine learning-algoritmen en co-DEG's werd trombospondine 1 (THBS1 of TSP1) geïdentificeerd als een belangrijke diagnostische hub DEG. THBS1 is een lid van de extracellulaire matrixeiwitten en werd voor het eerst gedetecteerd in bloedplaatjes als reactie op trombinestimulatie26. Verschillende cellen, waaronder endotheelcellen, leverstellaatcellen en gladde spiercellen, kunnen THBS1 produceren en afscheiden in de extracellulaire ruimte 27,28,29. THBS1 interageert met CD36, een bekend ligand30, en oefent een anti-angiogeen effect uit door CD36 29,31 te reguleren, wat de belangrijke rol ervan bij hart- en vaatziekten onderstreept. Bovendien kan THBS1 angiogenese en bloedplaatjesaggregatie reguleren door zijn interacties met receptoren en eiwitten zoals CD47, transformerende groeifactor-β en integrinen32. Dit suggereert dat THBS1 een cruciale rol kan spelen bij trombusvorming, kwetsbare plaqueruptuur en daaropvolgende ventriculaire remodellering tijdens MI 33,34,35.

Bovendien is de ontwikkeling van NAFLD nauw verbonden met de synthese van uitgescheiden eiwitten in omloop. Een cruciale studie gepubliceerd in EBioMedicine toonde aan dat THBS1, als een uitgescheiden eiwit, zou kunnen dienen als een nieuwe biomarker voor NAFLD. Uit deze studie bleek ook dat exogene toediening van THBS1 de lipidenafzetting in de lever verbetert door de lipidesyntheseroutes te remmen36. Met name CD36 werd geïdentificeerd als een belangrijke receptor voor de effecten van THBS1 tegen NAFLD. Bovendien is aangetoond dat ABT-526, een peptide-analoog van THBS1, de lipidensynthese in hepatocyten remt. Deze bevindingen bieden nieuwe inzichten in de diagnose en behandeling van NAFLD en suggereren dat THBS1 een nieuwe biomarker zou kunnen zijn voor zowel NAFLD als MI, en een snel, eenvoudig en toegankelijk diagnostisch hulpmiddel biedt.

Recent bewijs benadrukt de cruciale rol van immuun-inflammatoire reacties in de progressie van NAFLD en MI. Belangrijke kenmerken zijn onder meer cytokine-expressie, immuunregulatie en activering van het neuro-endocriene systeem. Wabitsch et al. toonden aan dat metformine hepatoprotectie verleent door de expressie van CD8+ T-cellen in NAFLD-muizen te remmen37. Dolejsi et al. rapporteerden een afname van CD8+ T-cellen en een significante vermindering van de myocardiale herstelcapaciteit38. Qin et al. ontdekte dat neutrofielen, als onderdeel van de systemische immuunontstekingsindex, geassocieerd zijn met de albumine-uitscheiding in de urine bij NAFLD-patiënten39. Zhang et al. gaven aan dat neutrofieleninfiltratie en degranulatie betrokken zijn bij zowel verwondings- als herstelprocessen tijdens MI27.

In lijn met deze bevindingen toonden de huidige resultaten een verhoogde infiltratie van CCR-, MHC-klasse I-, neutrofielen-, para-inflammatie- en Tfh-cellen, terwijl CD8+ T-cellen, cytolytische activiteit en TIL waren afgenomen bij NAFLD- en MI-patiënten in vergelijking met gezonde controles. Bovendien toonde correlatieanalyse aan dat THBS1 positief gecorreleerd was met CCR, MHC klasse I, neutrofielen, para-inflammatie en Tfh-cellen, en negatief gecorreleerd met CD8+ T-cellen, cytolytische activiteit en TIL bij NAFLD- en MI-patiënten. Deze waarnemingen suggereren dat THBS1 kan bijdragen aan de modulatie van immuunresponsen door CCR-, MHC-klasse I-, neutrofielen-, para-inflammatie- en Tfh-cellen te verhogen, terwijl CD8+ T-cellen, cytolytische activiteit en TIL worden verlaagd tijdens de ontwikkeling en progressie van NAFLD en MI. Deze speculaties rechtvaardigen echter verder onderzoek om de precieze rol van THBS1 in deze processen te bevestigen.

Deze studie had tot doel de moleculaire verbanden tussen NAFLD en MI op te helderen met behulp van uitgebreide bio-informatica- en machine learning-benaderingen. De bevindingen identificeerden 96 differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) in NAFLD en 126 in MI, met 14 DEG's die de twee aandoeningen overlappen. Functionele verrijkingsanalyse toonde aan dat deze DEG's betrokken zijn bij kritieke biologische processen en routes, zoals vetceldifferentiatie, leukocytenchemotaxis en verschillende signaalroutes, waaronder IL-17, TNF en NF-KB. Deze resultaten benadrukken het ingewikkelde samenspel van ontstekings- en metabole routes bij NAFLD en MI. De constructie van eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerkdiagrammen, gecombineerd met machine learning-analyses (SVM-RFE en LASSO), identificeerde THBS1 als een belangrijk hub-gen. THBS1 vertoonde uitstekende diagnostische prestaties, met een gebied onder de curve (AUC) van 0,981 voor NAFLD en 0,900 voor MI, wat wijst op het potentieel ervan als een robuuste biomarker voor beide aandoeningen.

Bovendien onthulde immuno-infiltratieanalyse verschillende immuuncelprofielen bij NAFLD- en MI-patiënten in vergelijking met gezonde controles. In het bijzonder vertoonden NAFLD- en MI-patiënten een verhoogde infiltratie van CCR-, MHC-klasse I, neutrofielen, para-inflammatie en Tfh-cellen, terwijl ze verlaagde niveaus van CD8+ T-cellen, cytolytische activiteit en TIL vertoonden. Deze immuunkenmerken onderstrepen de inflammatoire aard van beide aandoeningen en benadrukken de rol van THBS1 bij het moduleren van immuunresponsen.

Deze studie biedt nieuwe inzichten in de gedeelde moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan NAFLD en MI, waarbij THBS1 naar voren komt als een nieuwe biomarker voor diagnose en een potentieel therapeutisch doelwit. De bevindingen maken de weg vrij voor toekomstig onderzoek naar gerichte interventies en gepersonaliseerde behandelingsstrategieën voor patiënten met deze onderling verbonden aandoeningen. Door bio-informatica, machine learning en immuno-infiltratieanalyse te integreren, draagt het onderzoek bij aan de ontwikkeling van een medisch beslissingsondersteunend platform gericht op het verbeteren van de klinische behandeling van NAFLD en MI.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 62271511, U21A200949), Yucai Foundation of General Hospital of the Southern Theatre Command (2022NZC011), het Guangzhou Science and Technology Program Project (2023A03J0170), het National Clinical Research Center for Geriatrics (NCRCG-PLAGH-2023006) en Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (nr. 2020A1515010288, nr. 2021A1515220101).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CytoscapeCytoscape ConsortiumVersie 3.6.1Gebruikt voor het visualiseren van eiwit-eiwit interactie (PPI) netwerken
MI dataset GSE66360 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).NCBI-GEO database -Om RNA microarray datasets voor analyse te verzamelen
R pakket clusterProfilerBioconductor -Gebruikt voor GO, KEGG en DO verrijkingsanalyses
R pakket ggplot2CRAN -Gebruikt voor het maken van Venn diagrammen en andere visualisaties
R pakket GSEABaseBioconductor -Gebruikt in combinatie met GSVA voor genset verrijkingsanalyse
R pakket GSVABioconductor -Gebruikt voor single-sample genset verrijkingsanalyse (ssGSEA)
R pakket limmaBioconductor -Gebruikt voor het identificeren van differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs)
R pakket pheatmapCRAN -Gebruikt voor het genereren van heatmaps
R pakket vennCRAN -Gebruikt voor het maken van Venn diagrammen
RNA microarray datasets (GSE66360, GSE89632)NCBI-GEO -Openbaar beschikbare RNA microarray datasets gebruikt voor analyse
RStudioRStudio, PBCVersie 1.4.1717Geïntegreerde ontwikkelingsomgeving voor R
String databaseSTRING (www.string-db.org/) -Online tool voor het construeren van PPI netwerken

Referenties

  1. de Alwis, N. M. W., Day, C. P. Non-alcoholic fatty liver disease: The mist gradually clears. J Hepatol. 48 (Suppl), S104-S112 (2008).
  2. Adams, L. A., Anstee, Q. M., Tilg, H., Targher, G. Non-alcoholic fatty liver disease and its relationship with cardiovascular disease and other extrahepatic diseases. Gut. 66 (6), 1138-1153 (2017).
  3. Bhatia, L. S., Curzen, N. P., Calder, P. C., Byrne, C. D. Non-alcoholic fatty liver disease: A new and important cardiovascular risk factor. Eur Heart J. 33 (9), 1190-1200 (2012).
  4. Boddi, M., et al. Non-alcoholic fatty liver in non-diabetic patients with acute coronary syndromes. Eur J Clin Invest. 43 (4), 429-438 (2013).
  5. Oni, E. T., et al. A systematic review: Burden and severity of subclinical cardiovascular disease among those with non-alcoholic fatty liver; should we care. Atherosclerosis. 230 (2), 258-267 (2013).
  6. Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. Acute myocardial infarction. Lancet. 389 (10070), 197-210 (2017).
  7. Stahl, E. P., et al. Non-alcoholic fatty liver disease and the heart: JACC state-of-the-art review. J Am Coll Cardiol. 73 (8), 948-963 (2019).
  8. Alexander, M., et al. Non-alcoholic fatty liver disease and risk of incident acute myocardial infarction and stroke: findings from matched cohort study of 18 million European adults. BMJ. 367, 1934578X221093907(2019).
  9. Cobbina, E., Akhlaghi, F. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)-pathogenesis, classification, and effect on drug metabolizing enzymes and transporters. Drug Metab Rev. 49 (2), 197-211 (2017).
  10. Pawlak, M., Lefebvre, P., Staels, B. Molecular mechanism of PPARα action and its impact on lipid metabolism, inflammation and fibrosis in non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatol. 62 (3), 720-733 (2015).
  11. Katsiki, N., Mikhailidis, D. P., Mantzoros, C. S. Non-alcoholic fatty liver disease and dyslipidemia: An update. Metabolism. 65 (8), 1109-1123 (2016).
  12. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 43 (7), e47(2015).
  13. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: An R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
  14. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2021: Customizable protein-protein networks, and functional characterization of user-uploaded gene/measurement sets. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D605-D612 (2021).
  15. Sriroopreddy, R., Sajeed, R., Raghuraman, P., Sudandiradoss, C. Differentially expressed gene (DEG) based protein-protein interaction (PPI) network identifies a spectrum of gene interactome, transcriptome and correlated miRNA in nondisjunction Down syndrome. Int J Biol Macromol. 122, 1080-1089 (2019).
  16. Engebretsen, S., Bohlin, J. Statistical predictions with glmnet. Clin Epigenetics. 11, 123(2019).
  17. Ma, H., Ding, F., Wang, Y. A novel multi-innovation gradient support vector machine regression method. ISA Trans. 130, 343-359 (2022).
  18. Han, Y., Huang, L., Zhou, F. A dynamic recursive feature elimination framework (dRFE) to further refine a set of OMIC biomarkers. Bioinformatics. 37 (12), 2183-2189 (2021).
  19. Colombani, C., et al. Application of Bayesian least absolute shrinkage and selection operator (LASSO) and BayesCπ methods for genomic selection in French Holstein and Montbéliarde breeds. J Dairy Sci. 96 (2), 575-591 (2013).
  20. Gamper, M., et al. Gene expression profile of bladder tissue of patients with ulcerative interstitial cystitis. BMC Genomics. 10 (1), 1-17 (2009).
  21. Hänzelmann, S., Castelo, R., Guinney, J. GSVA: Gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 14, 1-15 (2013).
  22. Valbusa, F., et al. Non-alcoholic fatty liver disease and increased risk of all-cause mortality in elderly patients admitted for acute heart failure. Int J Cardiol. 265, 162-168 (2018).
  23. Zhang, Q., et al. Identification of hub biomarkers of myocardial infarction by single-cell sequencing, bioinformatics, and machine learning. Front Cardiovasc Med. 9, 939972(2022).
  24. Zhang, Q., et al. 7-Hydroxyflavone alleviates myocardial ischemia/reperfusion injury in rats by regulating inflammation. Molecules. 27 (17), 5371(2022).
  25. Zhang, Q., Guo, Y., Zhang, D. Network pharmacology integrated with molecular docking elucidates the mechanism of wuwei yuganzi san for the treatment of coronary heart disease. Nat Prod Commun. 17 (1), 1934578X221093907(2022).
  26. Baenziger, N. L., Brodie, G., Majerus, P. W. A thrombin-sensitive protein of human platelet membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 68 (2), 240-243 (1971).
  27. Zhang, N., Aiyasiding, X., Li, W. J., Liao, H. H., Tang, Q. Z. Neutrophil degranulation and myocardial infarction. Cell Commun Signal. 20 (1), 50(2022).
  28. Lawler, J. Thrombospondin-1 as an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. J Cell Mol Med. 6 (1), 1-12 (2002).
  29. Kaur, S., et al. Functions of thrombospondin-1 in the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 22 (9), 4570(2021).
  30. Asch, A. S., et al. Isolation of the thrombospondin membrane receptor. J Clin Invest. 79 (4), 1054-1061 (1987).
  31. Armstrong, L. C., Bornstein, P. Thrombospondins 1 and 2 function as inhibitors of angiogenesis. Matrix Biol. 22 (1), 63-71 (2003).
  32. Roberts, D. D., Isenberg, J. S. CD47 and thrombospondin-1 regulation of mitochondria, metabolism, and diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 321 (1), C201-C213 (2021).
  33. Emre, A., et al. Impact of non-alcoholic fatty liver disease on myocardial perfusion in non-diabetic patients undergoing primary percutaneous coronary intervention for ST-segment elevation myocardial infarction. Am J Cardiol. 116 (11), 1810-1814 (2015).
  34. Mouton, A. J., et al. Fibroblast polarization over the myocardial infarction time continuum shifts roles from inflammation to angiogenesis. Basic Res Cardiol. 114 (1), 1-16 (2019).
  35. Liu, Y., et al. Atherosclerotic conditions promote the packaging of functional microRNA-92a-3p into endothelial microvesicles. Circ Res. 124 (4), 575-587 (2019).
  36. Bai, J., et al. Thrombospondin 1 improves hepatic steatosis in diet-induced insulin-resistant mice and is associated with hepatic fat content in humans. EBioMedicine. 57 (1), 102-111 (2020).
  37. Wabitsch, S., et al. Metformin treatment rescues CD8+ T-cell response to immune checkpoint inhibitor therapy in mice with NAFLD. J Hepatol. 77 (4), 748-760 (2022).
  38. Dolejsi, T., et al. Adult T-cells impair neonatal cardiac regeneration. Eur Heart J. 43 (27), 2698-2709 (2022).
  39. Qin, Z., et al. Systemic immune-inflammation index is associated with increased urinary albumin excretion: a population-based study. Front Immunol. 13, 863640(2022).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Bio informatica analysemachine learningsupport vector machineeiwit eiwitinteractiedifferentieel tot expressie gebracht genCD8 T cellenneutrofielenspiegels
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.