Kwantificering van de modulatie van de activiteit van het elastase-enzym door middel van colorimetrische analyse

Summary

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een colorimetrische testmethode voor het bepalen van het vermogen van verbindingen om de elastase-activiteit te remmen of te activeren.

Abstract

Elastase, een serineprotease, speelt een essentiële rol bij de afbraak van elastine. Elastine is een extracellulair eiwit dat helpt de weefselelasticiteit in de longen, huid en bloedvaten te behouden. Strikte regulering van de elastase-activiteit is cruciaal voor weefselhomeostase, omdat ontregeling kan bijdragen aan pathologieën zoals emfyseem, rimpels en atherosclerose. Sommige verbindingen, zoals van nature voorkomende fytochemicaliën, hebben potentieel getoond voor therapeutische interventie en hebben veel belangstelling getrokken. Het ophelderen van de modulerende effecten van verschillende verbindingen op elastase, zowel remmend als stimulerend, is cruciaal voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische en cosmetische strategieën gericht op elastase-geassocieerde aandoeningen. Een algemeen aanvaarde methode voor het meten van de elastase-activiteit is de colorimetrische elastasetest. In deze test wordt een specifiek substraat gebruikt om elastase af te breken, waarbij een detecteerbare gele verbinding, p-nitroaniline (pNA), vrijkomt. De geproduceerde hoeveelheid pNA weerspiegelt de elastase-activiteit in het monster en kan worden gemeten door middel van colorimetrie. Deze test biedt verschillende voordelen, waaronder eenvoud, hoge gevoeligheid, snelle resultaten en aanpasbaarheid aan verschillende onderzoeksbehoeften. De colorimetrische elastasetest blijft een waardevol hulpmiddel om te bestuderen hoe verbindingen de elastase-activiteit beïnvloeden. Vanwege het gebruiksgemak en de effectiviteit is deze test een hoeksteen van onderzoek op dit gebied.

Introduction

Elastase is een serineprotease-enzym dat een cruciale rol speelt bij de afbraak van elastine, een eiwit dat elasticiteit biedt aan verschillende weefsels in het lichaam, waaronder de longen, huid en bloedvaten. De elastase-activiteit wordt streng gereguleerd om de weefselhomeostase te behouden, en ontregeling kan leiden tot pathologische en dermale aandoeningen zoals emfyseem, atherosclerose en^huidrimpels.

Er zijn verschillende soorten elastasen, elk met specifieke kenmerken en functies. Neutrofiele elastasen, geproduceerd door neutrofielen, zijn belangrijk bij de immuunrespons en ontsteking. Deze enzymen kunnen een breed scala aan extracellulaire eiwitten afbreken en zijn betrokken bij chronische ontstekingsziekten^. Pancreaselastasen daarentegen spelen een rol bij de vertering van eiwitten in de dunne darm³. Het onderscheid tussen deze elastasen is cruciaal voor het ontwikkelen van specifieke therapieën voor verschillende ziekten.

Gezonde niveaus van elastine en routes die de elastase-activiteit reguleren, helpen de elasticiteit van de huid te behouden en vroegtijdige veroudering te voorkomen. Factoren zoals veroudering, UV-straling, ontstekingen, genetische aanleg, milieuverontreinigende stoffen en voeding hebben een aanzienlijke invloed op de activiteit en afbraak van elastase⁴. Een opkomend interessegebied is de studie van elastokines, bioactieve fragmenten die worden gegenereerd door de afbraak van elastine door elastase. Deze moleculen kunnen aanzienlijke biologische effecten veroorzaken, waaronder verhoogde ontsteking, verkalking van elastische vezels en afzetting van lipiden. Elastokines kunnen de progressie van ziekten die verband houden met de afbraak van elastine beïnvloeden en een potentieel doelwit bieden voor nieuwe therapeutische interventies (Figuur 1).

Sommige verbindingen, zoals van nature voorkomende fytochemicaliën, hebben veel aandacht gekregen vanwege hun mogelijke therapeutische en cosmetische effecten, waaronder hun vermogen om de elastase-activiteit te moduleren^. Van quercetine, een flavonoïde die voorkomt in appels en uien, is bijvoorbeeld aangetoond dat het de elastase-activiteit effectief remt, wat bijdraagt aan de ontstekingsremmende en anti-verouderingseffecten⁷. Curcumine, de bioactieve stof in kurkuma, is een andere goed bestudeerde fytochemische stof die elastaseremming vertoont en beschermende effecten biedt tegen huidveroudering en ontstekingen⁸. Bovendien heeft epigallocatechinegallaat (EGCG), de primaire catechine in groene thee, een krachtige elastaseremmende werking aangetoond, waardoor het een waardevolle verbinding is voor huidverzorgingsformules die gericht zijn op het behoud van de elasticiteit van de huid^. Deze voorbeelden onderstrepen het potentieel van fytochemicaliën als natuurlijke elastaseremmers en vormen een basis voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische en cosmetische producten.

Momenteel is de colorimetrische elastasetest een veelgebruikte methode voor het meten van elastase-activiteit 7,10,11,12,13. Deze test is gebaseerd op het vermogen van het enzym om een specifiek substraat, N-succinyl-(Ala)3-nitroanilide (SANA), te hydrolyseren tot succinylaminozuren en p-nitroaniline (pNA). pNA is een geelgekleurde chromofoor die gemakkelijk kan worden gedetecteerd bij 410 nm met behulp van een spectrofotometer (Figuur 2). De snelheid van pNA-productie is recht evenredig met de elastase-activiteit in monster¹⁴.

Deze methode heeft een breed scala aan toepassingen in verschillende onderzoeksgebieden. Door middel van deze methode kunnen onderzoekers snel het vermogen van verbindingen identificeren om de elastase-activiteit te moduleren, de werkingsmechanismen van elastaseremmers onderzoeken en de werkzaamheid van deze remmers evalueren in cellulaire en diermodellen van elastase-gerelateerde ziekten. Bovendien kan de test worden gebruikt om verschillende mechanismen van remming te bestuderen, zoals competitieve of niet-competitieve remming, wat waardevolle informatie oplevert over hoe natuurlijke of synthetische verbindingen de elastase-activiteit moduleren.

De elasticase-activiteitsmodulatietest biedt verschillende voordelen ten opzichte van andere methoden voor het meten van elastase-activiteit. Het is eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren, vereist minimale technische expertise en kan worden uitgevoerd in een standaard laboratoriumomgeving¹⁵. Bovendien is de test zeer gevoelig en kan hij kleine veranderingen in de elastase-activiteit detecteren. De test levert snelle en kwantitatieve resultaten op, waardoor efficiënte gegevensanalyse mogelijk is. Bovendien kan het worden aangepast aan verschillende formaten, waaronder high-throughput screening en kinetische studies¹⁶.

De test heeft echter ook verschillende beperkingen, zoals een lage substraatspecificiteit (aangezien deze specifiek is voor elastase) en gevoeligheid voor interferentie van andere componenten in het monster, zoals gekleurde verbindingen of remmers van pNA-hydrolyse. Daarom moeten onderzoekers rekening houden met deze beperkingen en aanvullende methoden gebruiken om de mechanismen die ten grondslag liggen aan de werking van elastaseremmers uitgebreid te onderzoeken¹⁷.

Er zijn alternatieve methoden voor het monitoren van de elastaseactiviteit, zoals zymografie, die een uitstekend hulpmiddel bieden voor het identificeren en differentiëren van verschillende elastase-isovormen, wat cruciaal is bij het bestuderen van de specifieke bijdragen van verschillende elastase-subtypes aan een bepaald ziekteproces. zymografie is echter een semi-kwantitatieve techniek en vereist extra stappen voor visualisatie; In vergelijking met de spectrofotometrische methode is zymografie dus minder efficiënt voor high-throughput analyse¹⁸. Fluorometrische assays bieden een verhoogde gevoeligheid voor de spectrofotometrische methode, waardoor lagere detectielimieten worden geboden. Dit maakt een gevoeligere analyse van de elastase-activiteit en modulatorinteracties mogelijk, waardoor een completer beeld van enzymatische processen wordt verkregen¹⁹. Fluorometrische tests vereisen echter gespecialiseerde instrumenten en kunnen gevoelig zijn voor interferentie van bepaalde verbindingen in biologische monsters. Radiometrische tests bereiken een uitzonderlijke gevoeligheid, waardoor ze ideaal zijn voor de detectie van zeer lage niveaus van elastase-activiteit. Het gebruik van radioactief materiaal vereist echter gespecialiseerde apparatuur, strenge veiligheidsprotocollen en passende procedures voor de verwijdering van afval, die logistieke uitdagingen en veiligheidsproblemen met zich meebrengen²⁰. Immunoassays onderscheiden zich door hun veelzijdigheid en kunnen worden gebruikt om de elastase-activiteit direct te meten of elastase-remmercomplexen te kwantificeren, waardoor inzicht wordt verkregen in de werkzaamheid van remmers. Bovendien kunnen immunoassays worden aangepast om te werken met complexe biologische monsters, zoals weefselhomogenaten, in tegenstelling tot de SANA-methode. Het ontwikkelen en valideren van immunoassays kan echter tijdrovend zijn en specifieke antilichamen vereisen, wat mogelijk leidt tot hogere kosten dan die van eenvoudigere spectrofotometrische benaderingen²¹.

De colorimetrische elasticiteitsmodulatietest voor elastase is een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van het vermogen van een verbinding om de elastase-activiteit te wijzigen. Vanwege zijn eenvoud, gevoeligheid en aanpassingsvermogen wordt de methode veel gebruikt in verschillende onderzoeksomgevingen. Onderzoekers moeten echter rekening houden met de beperkingen van de test en aanvullende methoden gebruiken om de mechanismen die ten grondslag liggen aan de activiteit van elastaseremmers uitgebreid te bepalen.

Protocol

De bijzonderheden van de reagentia en de apparatuur die voor dit onderzoek zijn gebruikt, zijn vermeld in de materiaaltabel.

1. Bereiding van 0,2 M Tris base reaction buffer (RB)

1. Weeg de bijbehorende Tris-basis met behulp van een analytische balans.
2. Doe de Tris-basis in een bekerglas en voeg gedeïoniseerd water toe met behulp van een maatcilinder.
3. Roer de oplossing met een magnetische roerder totdat de Tris-basis volledig is opgelost.
4. Pas de pH aan naar 8,0 door druppelsgewijs 4 N HCl toe te voegen. Gebruik een pH-meter om de pH te controleren.
5. Zodra de gewenste pH is bereikt, brengt u de oplossing over in een maatkolf en vult u deze tot de gewenste volumemarkering met gedeïoniseerd water.
6. Breng de buffer over in een geëtiketteerde bewaarfles en bewaar deze tot gebruik op kamertemperatuur.

2. Voorbereiding van het monster

1. Weeg de benodigde hoeveelheid monsters nauwkeurig af met behulp van een analytische balans. Voor dit onderzoek is 1 mg van elk monster voldoende.
2. Los de monsters op in RB tot de gewenste concentratie. Er kunnen verschillende monsterconcentraties worden getest, waarbij 1 mg/ml een goede referentie is.
3. Gebruik een vortexmixer om ervoor te zorgen dat de monsters volledig zijn opgelost.
4. Bewaar de voorbereide monsters op ijs tot ze klaar zijn voor gebruik.
   OPMERKING: Als het monster een sterke kleuring heeft die de absorptiemetingen zou kunnen verstoren, bereid dan kleurcontroles voor door dezelfde procedure te volgen, maar zonder in latere stappen het elastase-enzym toe te voegen.

3. Bereiding van het elastase-enzym

1. Bereid een werkende oplossing van elastase in RB in een eindconcentratie van 10 μg/ml. Gebruik de volgende vergelijking om het benodigde volume van de voorraadoplossing te berekenen:
   Volume van de voorraad (μL) = Gewenst eindvolume (μL) x Gewenste eindconcentratie (μg/ml)/Voorraadconcentratie (μg/ml)
2. Bewaar de bereide elastase-oplossing op ijs tot gebruik gebruik.
   OPMERKING: Houd rekening met de specifieke activiteit van het enzym zoals verstrekt door de leverancier, die kan variëren tussen batches. Ook kan de enzymactiviteit afnemen na bevriezing; Bereid indien mogelijk verse oplossingen voor.

4. Voorbereiding van het SANA-substraat

1. Bereid 0,8 mM SANA-oplossing voor door de juiste hoeveelheid SANA-poeder op te lossen in RB. Gebruik de volgende vergelijking:
   Massa van SANA (mg) = Gewenst eindvolume (μL) × Gewenste eindconcentratie (mM) × Molecuulgewicht (mg/mmol)/1000
2. Bescherm de oplossing tegen licht en bewaar deze tot gebruik bij 4 °C.

5. Bereiding van de fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) stockoplossing

1. Bereid een 100 mM PMSF-bouillonoplossing in isopropanol.
2. Bewaar de bereide PMSF-oplossing op ijs tot gebruik gebruik.
   OPMERKING: Aliquoteer de PMSF-oplossing in kleinere volumes (bijv. 100 μL) en bewaar bij -20 °C om vries-dooicycli te voorkomen.

6. Instellen van de test

1. Bereid de volgende oplossingen in drievoud in microcentrifugebuisjes:
   1. Negatieve controle: Pipet: 800 μL RB.
   2. Voertuigcontrole: Voeg 600 μL RB en 200 μL van het oplosmiddel toe dat is gebruikt om het monster op te lossen.
   3. Positieve remmingscontrole: Voeg 24 μL PMSF-stockoplossing en 776 μL RB toe.
   4. Isopropanolcontrole: Voeg 24 μL isopropanol en 776 μL RB toe.
   5. Monsters: Pipetteer 200 μL van de bereide monsteroplossing en voeg 600 μL RB toe.
   6. Kleurcontroles (indien nodig): Pipetteer 200 μl van de monsteroplossing en voeg 800 μl RB toe.
2. Voeg 100 μL van de elastaseoplossing (10 μg/ml) toe aan elk buisje, behalve voor de kleurregelaars.
3. Incubeer alle buisjes 20 minuten bij kamertemperatuur.
4. Voeg 100 μL SANA-substraatoplossing (0,8 mM) toe aan elke buis, behalve voor de kleurregelaars.
5. Meng de oplossingen grondig door de buisjes meerdere keren voorzichtig om te keren. Breng 300 μl over van elke buis naar een plaat met 96 putjes, zodat de metingen voor elk monster in drievoud worden geregeld.
6. Plaats de plaat met 96 putjes in een microplaatlezer die is ingesteld op 410 nm. Meet de absorptie periodiek, elke minuut, gedurende 20 minuten of totdat het signaal stabiliseert. Stel de lezer in om bij kamertemperatuur te meten.
   OPMERKING: Als de plaatlezer kinetische metingen ondersteunt, programmeer deze dan om automatisch metingen uit te voeren met ingestelde tussenpozen. Registreer anders handmatig de absorptie op de gewenste tijdstippen.

7. Analyse van de gegevens

1. Normaliseer de resultaten door de positieve remmingscontrole (PMSF) in te stellen op 100% remming en de negatieve controle (alleen RB) op 0% remming.
2. Bereken het remmingspercentage voor elke steekproef met behulp van de volgende formule:
   % Remming = 100 - [(Monsterabsorptie - Absorptie voertuigregeling - Kleurcontrole-absorptie)/(Negatieve controle-absorptie - Positieve controle-absorptie - Isopropanol-controle-absorptie)] × 100
3. Gebruik grafische software om de remmingspercentages voor elke monsterconcentratie uit te zetten tegen de monsterconcentratie om het remmende effect te visualiseren.

Results

Zodra het protocol is voltooid, kunnen de absorptiegegevens worden verkregen die nodig zijn om de relevante berekeningen uit te voeren en het vermogen van monsters om de elastaseactiviteit te moduleren. Figuur 3 geeft de locatie van de putjes met de verschillende controles en monsters weer. In het geval van gekleurde monsters, zoals degene die in dit voorbeeld wordt gebruikt, is het noodzakelijk om kleurcontroles toe te voegen om spectrofotometrische interfe...

Discussion

In de huidige methode worden de modulerende effecten van fytochemicaliën op elastase-enzymen onderzocht met behulp van een colorimetrische test. Elastase, een serineprotease dat cruciaal is voor de afbraak van elastine, speelt een belangrijke rol bij het behoud van de weefselelasticiteit in verschillende organen. De colorimetrische elastase-assay die in dit werk wordt beschreven, biedt een eenvoudige, gevoelige en snelle methode voor het meten van elastase-activiteit.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate	Corning Incorporated	3599	Flat bottom with lid, polystyrene
Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	BioTek Cytation 1	Gebruikt met Gen5 software
Elastase From Porcine Pancreas	Sigma-Aldrich	E7885	CAS 39445-21-1; 25,9 kDa
Isopropanol 99.5%	Fisher Scientific	AC184130010	CAS 67-63-0; C3H8O; 60.10 g/mol
N-Succinil-(Ala)3-nitroanilide	Sigma-Aldrich	S4760	CAS 52299-14-6; C19H25N5O8 ; 451.43 g/mol
pH Meter	Hach Lange	sensION+ PH31	Met magnetische roerder en sensorhouder
Phenylmethanesulfonyl Fluoride	Sigma-Aldrich	P7626	CAS 329-98-6; C7H7FO2S; 174,19 g/mol
Tris For Molecular Biology	PanReac AppliChem	A2264	CAS 77-86-1; C4H11NO3; 121,14 g/mol