Intravitale longitudinale beeldvorming van vasculaire dynamiek in het calvariale beenmerg

Samenvatting

Intravitale microscopie maakt het mogelijk om dynamische biologische processen zoals weefselregeneratie en tumorontwikkeling te bestuderen. Het calvariale beenmerg, een zeer dynamisch weefsel, biedt inzicht in hematopoëse en vasculaire functie. Het gebruik van een biocompatibel 3D-geprint hoofdfixatie-implantaat maakt repetitieve longitudinale beeldvorming mogelijk, waardoor ons begrip van weefseldynamiek en de micro-omgeving van de tumor wordt verbeterd.

Samenvatting

Intravitale longitudinale fluorescentiemicroscopie beeldvorming is naar voren gekomen als een cruciale techniek voor het bestuderen van dynamische biologische processen, met name in de context van weefselregeneratie, tumorontwikkeling en therapeutische responsen. Met name het calvariale beenmerg is een zeer dynamisch weefsel, waar het hematopoëtische lot verbonden is met de omringende micro-omgeving, met gespecialiseerde bloedvaten die reageren op normale en pathologische hematopoëse. Traditionele beeldvorming van gefixeerde weefsels biedt statische informatie, waardoor een uitgebreid begrip van deze processen vaak wordt beperkt.

De integratie van transgene dieren die celspecifieke markers tot expressie brengen, levende celtracers, vooruitgang in beeldvormingsapparatuur en het gebruik van gespecialiseerde kamers heeft intravitale microscopie verheven tot een cruciaal hulpmiddel voor het verkrijgen van inzicht in dynamische biologische verschijnselen. Een toepassing van intravitale beeldvorming is het onderzoek naar het gedrag van tumorvaten en therapeutische effecten. Een nieuw ontworpen 3D-geprint titanium hoofdfixatie-implantaat kan stabiel worden aangesloten op de schedel van de muis en is geschikt voor longitudinale beeldvorming tijdens meerdere sessies.

Het voorgestelde protocol maakt het mogelijk om ruimtelijk en temporeel onderzoek te doen van de vasculaire dynamiek in het calvariale beenmerg, inclusief visualisatie en kwantificering van vasculaire heterogeniteit, interactie met stromale en hematopoëtische cellen en meting van vasculaire functionele parameters. Bovendien maakt de techniek de visualisatie van gevestigde vaatbedden mogelijk en het monitoren van therapeutische effecten, stamcelmobilisatie en de lokalisatie van chemotherapeutische verbindingen in de loop van de tijd met behulp van twee-fotonmicroscopie. Over het algemeen biedt dit intravitale longitudinale beeldvormingsprotocol een uitgebreid platform voor het onderzoeken van zowel het gedrag van tumorvaten als de hematopoëtische celdynamiek, en biedt het waardevolle inzichten in de ingewikkelde processen die deze biologische verschijnselen beheersen.

Inleiding

Intravitale microscopische beeldvorming van het calvariale beenmerg (BM) dient als een krachtige en onmisbare techniek voor het onderzoeken van de dynamische processen van hematopoëse, regulatie van de weefselmicro-omgeving en vasculaire dynamiek binnen de BM-niche. Het primaire doel van deze methodologische benadering is het mogelijk maken van real-time visualisatie en analyse van cellulair gedrag, interacties en ruimtelijke organisatie binnen de BM-micro-omgeving in vivo. Door de BM calvaria direct te observeren met behulp van geavanceerde beeldvormingstechnieken in combinatie met fluorescerende labeling, kunnen onderzoekers het complexe samenspel tussen hematopoëtische stamcellen (HSC's), stromale cellen en het omringende vaatstelsel ophelderen, waardoor cruciale inzichten worden verkregen in de regulatie van hematopoëse en immuunresponsen.

De ontwikkeling en het gebruik van intravitale microscopie beeldvorming stamcellen van de beperkingen van traditionele histologische en ex vivo beeldvormingsmethoden, die er vaak niet in slagen de dynamische aard van cellulair gedrag en interacties van een weefsel vast te leggen. In tegenstelling tot statische beeldvormingstechnieken, stelt intravitale microscopie onderzoekers in staat om cellulaire dynamiek in realtime te observeren, waardoor longitudinale processen zoals celmigratie, proliferatie en differentiatie binnen hun oorspronkelijke niche kunnen worden bestudeerd, zonder proefdieren op te offeren. Bovendien biedt intravitale microscopie het unieke voordeel van het bestuderen van functioneel gedrag in vivo, zoals vasculaire functionaliteit (bijv. perfusie, permeabiliteit, hypoxie), waardoor de fysiologische relevantie behouden blijft en artefacten die verband houden met weefselfixatie en -verwerking worden vermeden. Baanbrekende studies in het veld hebben de enorme voordelen van deze aanpak aangetoond ^1,2, en hun bevindingen zijn bevestigd en uitgebreid door meer recent verfijnde benaderingen ^3,4,5 die intravitale microscopie gebruikten om endogene HSC-lokalisatie, migratie en interacties met het vaatstelsel binnen de BM-niche te volgen. Bovendien heeft intravitale microscopie een belangrijke rol gespeeld bij het ophelderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan hematopoëtische aandoeningen, zoals leukemie en BM-faalsyndromen, en heeft het nieuwe inzichten opgeleverd in de motiliteit van leukemische cellen ^6,7, ziektegeassocieerde vasculaire implicaties 8 en geneesmiddelrespons⁹.

Er zijn verschillende voordelen van intravitale microscopische beeldvorming van de calvariale BM die alternatieve botplaatsen bestrijkt. Ten eerste biedt de BM in het schedelbot gemakkelijke toegankelijkheid voor intravitale beeldvorming in vergelijking met diepere botten zoals het dijbeen of scheenbeen. Deze toegankelijkheid vergemakkelijkt de directe observatie van de micro-omgeving van het weefsel, inclusief het bot zelf, via visualisatie van de tweede harmonische generatie (SHG)¹⁰, zonder dat invasieve chirurgische ingrepen nodig zijn. Ten tweede is de schedel relatief dun en doorschijnend, waardoor een betere visualisatie van de cellulaire dynamiek binnen de BM-niche mogelijk is. Deze transparantie vergemakkelijkt beeldvorming met hoge resolutie met twee-fotonmicroscopie, confocale microscopie en light-sheet microscopie, zonder dat er technieken nodig zijn om het bot dunner te maken of op te ruimen. Het calvariale bot biedt een stabiel, plat en stijf platform voor intravitale beeldvormingsexperimenten, waardoor weefselbewegingsartefacten worden geminimaliseerd en consistente beeldvormingsomstandigheden worden gegarandeerd gedurende langere observatieperioden. Deze stabiliteit is vooral voordelig voor longitudinale studies die cellulair gedrag en reacties in de loop van de tijd volgen. Reproduceerbaarheid is een ander groot voordeel, gezien de relatief kleine en ruimtelijk gedefinieerde structuur van het calvariale bot bij proefdieren. Deze uniformiteit vergemakkelijkt de vergelijking tussen verschillende experimentele groepen en maakt een robuuste statistische analyse van beeldvormingsgegevens mogelijk.

Hier beschrijven we een methode om de calvariale BM van de muis in beeld te brengen via intravitale twee-fotonmicroscopie door de introductie van een nieuw ontwikkeld hoofdfixatie-implantaat¹¹, 3D-geprint met behulp van biocompatibele Grade 23 titaniumlegering (Ti6Al4V), met een speciale en gemakkelijk te plaatsen harde hoes gemaakt van dezelfde titaniumlegering, waardoor de wond veilig kan worden gesloten om infecties of schade aan de operatieplaats te voorkomen. Het implantaat fixeert het hoofd van de muis stevig en stabiel op de microscooptafel via een implantaathouder, waardoor ademhalingsartefacten worden geminimaliseerd en longitudinale beeldvorming van dezelfde gebieden in de loop van de tijd mogelijk is. Er worden enkele voorbeelden gegeven van meerkleurige afbeeldingen van cellen en structuren uit de BM-micro-omgeving (SHG⁺ botoppervlak; nestine-GFP⁺ mesenchymale cellen; cdh5-DSRED⁺, cdh5-GFP⁺ of pdgfb-GFP⁺ endotheelcellen) en het kwaadaardige hematopoëtische compartiment (tdTOMATO⁺ AML-cellen), evenals fluorescerende contrastmiddelen die het lumen van de bloedvaten weergeven (dextran-TRITC). Vasculaire parameters gemeten over uren of dagen, waaronder vaatlengte, rechtheid en diameter, evenals permeabiliteit in verschillende vasculaire regio's, kunnen belangrijke informatie verschaffen over weefselgedrag en gezondheid.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd onder de ethische overeenkomst APAFIS#27215-2020041513522374 v6, goedgekeurd door het Franse "Ministère de l'enseignement supérieur, de la recherche et de l'innovation."

1. Ontwerp van een biocompatibel titanium kopfixatie-implantaat voor 3D-printen

OPMERKING: We hebben een biocompatibel hoofdfixatie-implantaat ontworpen met behulp van een parametrische modellering computer-aided design (CAD)-software met ingebouwde Finite Element Analysis (FEA)-mogelijkheden (zie de materiaaltabel). De primaire input voor het ontwerpproces omvat een anatomisch model met hoge resolutie van de schedel van de muis, een model van het microscoopobjectief en een model van het fixatiesysteem, die samen de afmetingen en configuratie van het implantaat bepalen. De uiteindelijke uitvoer is een platformonafhankelijk mesh-bestand, meestal in STL- of STEP-formaat, compatibel met de meeste 3D-printsoftware. Dit bestandsformaat zorgt voor een naadloze overdracht naar de 3D-printer voor een nauwkeurige fabricage van implantaten.

1. Voorbereiding van het 3D-model van de muis
   1. Plaats de schedel van de muis, voorbereid of in vivo, in de micro-CT-scanner.
   2. Stel de scanparameters in voor een optimale resolutie van fijne anatomische details: open het Configuratiescherm en kies in het gedeelte Scancondities een Field of View (FOV). Gebruik LiveView om het scanvolume te definiëren.
      OPMERKING: Door de detectorresolutie bepaalt het gezichtsveld de voxelgrootte op basis van de detectorresolutie. In nieuwere micro-CT-machines komt een FOV van 5 mm doorgaans overeen met een voxelgrootte van 5 μm, een FOV van 10 mm met een voxelgrootte van 10 μm, een FOV van 25 mm met een voxelgrootte van 21 μm. Het beperkte gezichtsveld bij deze resolutie kan meerdere scans vereisen om de hele schedel te bedekken. Meerdere scans vereisen overlap tussen scans.
   3. Plak meerdere scans met hoge resolutie aan elkaar in beeldvormingssoftware om een enkel, uitgebreid model van de schedel te maken.
   4. Importeer micro-CT DICOM-bestanden in segmentatiesoftware (bijv. 3D Slicer, Amira, Avizo of Mimics) om de schedel te isoleren.
   5. Voer segmentatie op basis van drempels uit om botweefsel te scheiden van omliggende structuren en maak handmatige aanpassingen om complexe of luidruchtige gebieden te verfijnen.
      1. Importeer in 3D Slicer eerst DICOM-bestanden en laad de dataset en observeer de CT-segmenten in de axiale, sagittale en coronale segmentweergaven.
      2. Open de Segmentbewerkingen klik op Toevoegen om een nieuwe segmentatie te maken | Toevoegen om een nieuw segment te maken, dat moet worden gedrempelt.
      3. Klik in het deelvenster Segmenteditor op het effect Drempel. Pas de schuifregelaars Onderste en Bovenste drempel aan (of typ numerieke waarden) zodat het te segmenteren gebied rood wordt gemarkeerd in de segmentweergaven. Een 3D-segment met drempels is klaar.
   6. Als u de gesegmenteerde schedel als STL-bestand wilt exporteren, schakelt u over naar de segmentatiemodule. Zorg ervoor dat het segment met drempelwaarde is geselecteerd. Stel in de sectie Modellen exporteren/importeren en Labeltoewijzingen de optie Type exporteren in op Modellen. en bestandsformaat: STL. Klik op de knop Exporteren.
      OPMERKING: STL-bestanden gebruiken een driehoekig mesh-formaat, dat het oppervlak van de schedel weergeeft met duizenden driehoeken, waarbij de anatomische vorm tot in de kleinste details wordt vastgelegd.
      1. Doe indien nodig het naaien in MeshLab als volgt:
         1. Importeer meshes door te klikken op Bestand | Importeer Mesh en selecteer er een als referentiescan.
         2. Lijn andere scans uit met de tool Uitlijnen (Filters | Registratie | Uitlijnen) door de overeenkomstige punten te markeren en Proces te gebruiken.
         3. Voeg de uitgelijnde scans samen door op Filters | Mesh laag | Maak zichtbare lagen plat met de optie Alleen zichtbare lagen samenvoegen .
   7. Reinig en repareer het gaas, waarbij dubbele hoekpunten en driehoeken als volgt worden geëlimineerd, om ervoor te zorgen dat door lawaai veroorzaakte driehoeken worden verwijderd en onbedoelde gaten worden opgevuld, om een glad en doorlopend oppervlak te verkrijgen:
      1. Klik op Filters | Schoonmaken en repareren | Verwijder dubbele hoekpunten.
      2. Klik op Filters | Schoonmaken en repareren | Verwijder dubbele vlakken.
      3. Klik op Filters | Schoonmaken en repareren | Verwijder geïsoleerde stukken (op gezichtsnummer). Geef een drempel op voor het minimale aantal vlakken dat moet worden behouden (stel deze drempel bijvoorbeeld laag in om kleine clusters of ruis te verwijderen).
      4. Klik op Filters | Remeshing, vereenvoudiging en reconstructie | Sluit gaten.
   8. Voer mesh-vereenvoudiging uit tot ~10.000-30.000 driehoeken, aangezien de eerste STL-bestanden van micro-CT zeer hoge driehoeken bevatten die niet compatibel zijn met de CAD-software. Houd in gebieden met veel detail kleinere driehoeken aan de bovenkant van de schedel om een nauwkeurige pasvorm van het implantaat te garanderen. Vereenvoudig in grovere regio's minder kritieke regio's met grotere driehoeken om de bestandsgrootte te verkleinen en de verwerkingsefficiëntie te optimaliseren.
      OPMERKING: De vereenvoudiging van het net wordt gemaakt door gebieden en beschreven in 1.1.8.1-1.1.8.3.
      1. Gebruik Verbonden componenten selecteren in een regioselectietool om gebieden te selecteren die u wilt vereenvoudigen.
      2. Gebruik decimering van de kwadratische rand samenvouwen op de geselecteerde gebieden met parameters. Klik op Filters | Remeshing, vereenvoudiging en reconstructie | Vereenvoudiging: Decimering van de kwadrale rand instorting. Stel de kwaliteitsdrempel in op 0,8, de grens van het net behouden op JA, de topologie behouden op JA, het doelaantal vlakken: stel een doelnummer in dat overeenkomt met de benodigde resolutie .
      3. Herhaal indien nodig totdat het totale aantal driehoeken is teruggebracht tot het gewenste niveau. Sla vervolgens het vereenvoudigde model op in een STL-bestand.
2. Voorbereiding van het schedelmodel in het CAD-model
   1. Importeer het vereenvoudigde schedelmodel in STL-formaat in de CAD-software als een nieuw onderdeel of model. Zorg ervoor dat het geïmporteerde bestand indien nodig correct wordt geconverteerd naar een vaste of oppervlaktebehuizing, afhankelijk van de mogelijkheden van de software. Sla het model op in het oorspronkelijke CAD-bestandsformaat om verdere wijzigingen mogelijk te maken en compatibiliteit met volgende ontwerpstappen te garanderen.
   2. Plaats referentiepunten op Bregma en Lambda en creëer de as Bregma-Lambda in dit model.
   3. Maak het middenvlak inclusief de as Bregma-Lambda.
   4. maak in het middenvlak een as die tangentieel is aan de calvaria en sla vervolgens de voorbereide schedel op (aanvullende figuur S1).
   5. Maak een nieuw geheel en plaats de voorbereide schedel op een manier dat Bregma samenvalt met de oorsprong, het middelste vlak met het rechtervlak en de calvariale as horizontaal is.
   6. Het hoofdfixatie-implantaat wordt direct in het geheel ontworpen om een perfecte pasvorm met het voorbereide schedelmodel te garanderen. Om dit te bereiken, maakt u het implantaat als een nieuw onderdeel binnen de assemblage. Begin met navigeren naar Invoegen | Onderdeel | Nieuw onderdeel in de CAD-software. Selecteer desgevraagd het calvaria-oppervlak of het bovenste vlak van het merk als referentie om het nieuwe onderdeel te positioneren en te verankeren.
      1. Maak een reeks vlakken op gelijke afstand (2 mm afstand) over de schedel. Maak op elk vlak een schets en teken op elke schets een geprojecteerde curve met een offset van 0,2 mm in de vorm van een symmetrische spline met negen punten, waarbij u het gedeelte van het bovenoppervlak van de schedel 0,2 mm boven de schedel volgt (aanvullende figuur S2).
      2. Creëer een geveegd oppervlak met behulp van deze splines - het Skull Limit Surface - en zorg ervoor dat dit oppervlak glad is zonder enig defect, te gebruiken voor de constructie van de implantaatkenmerken.
3. Definitie van het waarneembare oppervlak op de schedel
   OPMERKING: Op basis van het 3D-model wordt het platste gebied van het calvariabot geïdentificeerd dat ideaal is voor 3D-observatie. Dit gebied is zorgvuldig gekozen om optimale toegang voor het objectief van de twee-fotonenmicroscoop te garanderen, rekening houdend met de biologische en structurele integriteit van de schedel. De definitie kan stereotactische coördinaten gebruiken waarbij het Bregma-punt dient als de oorsprong van het coördinatensysteem.
   1. Maak een schets in het calvariale vlak en maak een peervormige spline van AP +6,5 tot -2, 6 mm breedte bij AP 0,0. Dit wordt de waarneembare oppervlaktecontour (aanvullende figuur S3).
      OPMERKING: Het microscoopobjectief bevindt zich virtueel ten opzichte van het eerder gedefinieerde waarneembare oppervlak op de schedel. Deze stap omvat het bepalen van de ruimtelijke beperkingen die worden opgelegd door de grootte en vorm van het objectief, zodat het implantaatontwerp voldoet aan de vereisten van de microscoop.
   2. Plaats het objectiefmodel van de microscoop verticaal in het geheel. Beperk het focuspunt op een vlak evenwijdig aan het calvariale vlak van het calvariale bot en definieer het begrenzende volume van het microscoopobjectief.
   3. Creëer een volume door het objectief te vegen volgens de waarneembare oppervlaktecontour.
   4. Creëer een observatievenster rond het gedefinieerde waarneembare oppervlak, zodat het microscoopobjectief onbelemmerd toegankelijk is.
      OPMERKING: Het observatievenster is een ringvormige structuur met secundaire functies zoals het vasthouden van onderdompelingsvloeistof en een vaste structuur voor het correct sluiten van het beschermdeksel.
   5. Maak een schets in het calvariale vlak en kopieer de waarneembare oppervlaktecontour.
   6. Creëer een parallelle contour van 0,5 mm dikte. Extrudeer deze dubbele contour 0,9 mm naar boven en naar beneden naar het oppervlak Skull Limit Surface met een trekhoek van 4°.
4. Het definiëren van de cement-, staart- en zwaluwstaartstructuren.
   1. Maak een schets in het calvariale vlak en teken een 0,5 mm dikke C-vorm die aansluit op het observatievenster en extrudeer 2 mm hoog en naar beneden naar het oppervlak van het schedellimietoppervlak met een trekhoek van 4° (aanvullende afbeelding S4).
   2. Maak een schets in het calvariale vlak en vul deze ruimte met rechthoeken van 0,4 mm dik, radiaal geplaatst met 1 mm ruimte ertussen.
   3. Extrudeer op dezelfde manier als het observatievenster.
   4. Maak de staart van het implantaat en vertrouw op de schedel tot de fixatie door het beschikbare volume te respecteren.
      1. Maak een transversaal vlak tangentieel aan de cementstructuur en nog eens 12,5 mm naar achteren.
      2. Schets rechthoeken op deze vlakken. Veeg er een piramidaal lichaam tussen en stel de hoeken ongeveer 20° en 37° in ten opzichte van horizontaal.
      3. Voeg een M1.6-gat met schroefdraad toe aan de staart bij de cementstructuur.
      4. Maak een schets op het einde van de staart en teken het zwaluwstaartprofiel.
      5. Extrudeer dit profiel met 8 mm.
5. Verificatie van het niet interfereren met het doel.
   1. Onderzoek het volledige implantaatontwerp, inclusief het waarnemingsvenster en de zwaluwstaart, om er zeker van te zijn dat er geen mechanische interferentie is met het microscoopobjectief. Controleer op interferenties met het volume dat in stap 1.3.3 is gemaakt.
      OPMERKING: Deze verificatiestap is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat het doel naar wens zonder belemmering kan worden gepositioneerd en verplaatst.
6. Verwijder onnodig materiaal van de staart van het implantaat om het gewicht te minimaliseren en mogelijk ongemak voor het dier te verminderen.
   1. Maak een schets in het middenvlak en teken er driehoekige uitsparingen op om een truss-structuur te vormen wanneer deze wordt geëxtraheerd door extrusie uit het staartlichaam.
   2. Herhaal in het loodrechte vlak.
7. Controleer de maximale verplaatsing door middel van de Finite Element Method (FEM)-simulatie om de mechanische eigenschappen van het implantaat onder verschillende omstandigheden te analyseren.
   OPMERKING: Deze simulatie helpt bij het voorspellen van de maximale verplaatsing en spanningen in het implantaat tijdens gebruik, waardoor de betrouwbaarheid wordt gegarandeerd.
   1. Schakel de invoegtoepassing voor CAD-softwaresimulatie in.
   2. Maak op de werkbalk Simulatie een nieuw statisch onderzoek. Navigeer naar het tabblad Simulatie (indien zichtbaar) of ga naar Simulatie | Studie. Kies in het dialoogvenster Studie de optie Statisch als studietype. Klik op OK om het nieuwe onderzoek te maken (aanvullende afbeelding S5).
      OPMERKING: Dit studietype is geschikt voor het analyseren van vervorming en spanning onder statische belastingen, zoals verwacht bij het gebruik van het implantaat.
   3. Kies een materiaal voor het implantaat dat overeenkomt met de werkelijke samenstelling van het implantaat (Ti6Al4V).
   4. Definieer vaste beperkingen om de bevestigingspunten van het implantaat te simuleren waar het in contact zou komen met de zwaluwstaartfixatie. Definieer het bovenoppervlak van de zwaluwstaart als vast.
   5. Definieer de verticale belasting op het onderoppervlak van het implantaat. Stel 1 N verticale kracht in.
   6. Genereer een net. Verfijn het net in gebieden waar hoge spanning of vervorming wordt verwacht (aanvullende afbeelding S6). Klik hiervoor met de rechtermuisknop op het mesh-element van de studieboom en selecteer Mesh maken... Pas in het dialoogvenster Mesh de dichtheid van het net aan met de schuifregelaar of door het vak Besturingselement van het net te activeren om de maximale en minimale elementgrootten onafhankelijk van elkaar in te stellen. Klik op OK om het net te genereren.
      OPMERKING: De software genereert automatisch een eerste mesh voor het onderzoek, maar voor nauwkeurigere resultaten kan de mesh worden verfijnd om een fijnere mesh te selecteren, met name in regio's die cruciaal zijn voor de stabiliteit van het implantaat (zoals het observatievenster). Fijnere mazen in deze regio's verbeteren de nauwkeurigheid van de simulatie door lokale stressconcentraties vast te leggen.
   7. Start de statische analyse om de verplaatsing, spanning en rekverdelingen over het implantaat te berekenen.
   8. Analyseer de resultaten. Onderzoek de verplaatsingsgrafiek om gebieden met maximale vervorming te identificeren. Deze grafiek laat zien hoeveel het implantaat zou vervormen onder de uitgeoefende belastingen, waarbij eventuele gebieden met een risico op overmatige beweging worden gemarkeerd. Zorg ervoor dat de vervorming in het observatievenster niet groter is dan 3 micron.
8. Ontwerp ten slotte een beschermkap om het observatievenster te beschermen wanneer het niet in gebruik is. Dit deksel beschermt het blootgestelde bot tegen milieuverontreinigende stoffen en fysieke schade.

2. Muisbehandelingen, anesthesie en chirurgische implantatie van het hoofdimplantaat

OPMERKING: Hier kunnen mannelijke of vrouwelijke, 7 tot 12 weken oude C57BL/6 of transgene muizen worden gebruikt, zoals afgebeeld. Om leukemiekolonisatie van de BM te induceren, worden gegenereerde leukemische cellen, zoals beschreven door Horton et ^al.12, 2-3 weken vóór beeldvorming intraveneus toegediend. Om de gezondheid van de wond te garanderen, moeten steriele technieken worden gebruikt.

1. Monteer onder de motorkap steriel chirurgisch gereedschap (botte schaar en pincet), trimmer en de verbruiksartikelen, waaronder ooggel, zoutoplossing, ontsmettingsmiddel, tandheelkundig cement, absorberende wattenstaafjes en reinigingsweefsel. Zet de kralensterilisator aan.
2. Vul de anesthesie-inductiekamer met 4% isofluraan en zuurstof uit de lucht en plaats de muis in de kamer. Wanneer het dier volledig verdoofd is (controleer op verlies van de oprichtreflex en een dieper en langzamer ademhalingspatroon), schakelt u de isofluraanstroom naar de neuskegel van het verdovingsmasker over en verlaagt u de isofluraanconcentratie tot 2%.
3. Plaats de muis op een verwarmingskussen van 37 °C en houd de ademhalingsfrequentie visueel in de gaten. Optioneel: Voor muizen met een pathologisch fenotype, voeg een overlevingsdeken toe om de juiste temperatuur tijdens de anesthesie te behouden.
4. Pijnmedicatie subcutaan toedienen (Buprecare, 0,01 mg/kg) 30 minuten voor de operatie.
5. Scheer het hoofd van de muis met een elektrisch scheerapparaat.
6. Voeg een druppel oogheelkundige gel toe op de ogen van de muis om uitdroging onder narcose te voorkomen en zorg ervoor dat de gel niet op de hoofdhuid druppelt.
7. Reinig de muis om eventuele achtergebleven haren uit het operatiegebied te verwijderen. Veeg de bovenkant van de hoofdhuid af met ontsmettingsmiddel op een katoenen tissue. Zorg ervoor dat u al het haar verwijdert om beeldvormingsartefacten en het risico op wondinfectie te voorkomen.
8. Maak met een steriele tang en een schaar (na 30 s in de sterilisator) een kleine incisie in het centrale deel van de hoofdhuid om het centrale botlitteken bloot te leggen. Volg het om het beeldvormingsgebied met de juiste lengte en breedte te definiëren. Verwijder voorzichtig het stuk van de hoofdhuid, til de huid tussen de oren op met een tang en maak een kleine incisie aan de achterkant van het hoofd. Houd de huid omhoog, haal de schaar onder de huid en knip voorzichtig buiten het beeldvormingsgebied.
9. Verwijder het bindweefsel tussen de schedel en de hoofdhuid. Veeg het blootgestelde bot af met steriel PBS op een wattenstaafje. Ga snel verder met het bevestigen van het hoofdimplantaat aan de schedel van de muis om langdurige blootstelling van het schedelbot te voorkomen (<10 min).
10. Maak een pasta met voldoende tandcement in een petrischaaltje volgens de instructies van de fabrikant en breng het snel aan op de onderkant van het hoofdfixatie-implantaat.
11. Zonder tandcement in het beeldvormingsgebied te krijgen, plaatst u de hoofdhouder op de blootgestelde schedel van de muis en wacht u tot deze is uitgehard.
12. Eenmaal uitgehard (normaal gesproken binnen 3-5 minuten), voeg je een paar druppels 37 °C PBS toe aan de beeldkamer om de schedel gehydrateerd te houden.

3. Beeldvorming met behulp van een twee-fotonenmicroscoop

1. Voordat u met de operatie begint, schakelt u de laser in en laat u deze opwarmen om te stabiliseren. Zet de microscoop aan en start de acquisitiesoftware. Selecteer het juiste doel (25x/0,95 WATER onderdompeling voor dit experiment).
2. Gebruik een rechtopstaande microscoopstandaard met vaste trap die voldoende ruimte heeft om een veterinair breadboard met een heatpad te plaatsen, allemaal integraal te verplaatsen met de xy-fase. Gebruik een stevig aluminium optisch breadboard als platform om het hoofdimplantaat en het stereotactische masker te bevestigen. Koppel flexibele slangen en hun connectoren in verband met isofluraaninjectie en -extractie aan het masker in de microscoopkooi.
3. Configureer de acquisitie-instellingen om snel te scannen: formaat 512 x 512 pixels; snelheid 600 Hz; en zoomfactor 1.
4. Stem de laserlijn af op 880 nm om de SHG, GFP en tdTOMATO met dezelfde excitatiegolflengte te kunnen detecteren.
5. Schakel het licht in de kamer uit en sluit de doos rond de microscoopstandaard goed voordat u de NDD-detectoren activeert en definieer de spectrale detectiepoorten: PMT1, om SHG [388 - 431 nm] te detecteren; HyD2, voor GFP [485 - 548 nm] en HyD3 voor tdTOMATO [551 - 645 nm]. Laat de offset op 0 staan.
6. Maak een nieuwe projectgegevensset en wijzig de naam ervan op basis van het specifieke experiment.
7. Zodra het hoofdfixatie-implantaat aan de muizenschedel is bevestigd (bevestigd via de cementharding), schakelt u het isofluraan in de richting van het stereotactische masker van de microscoop.
8. Breng de muis snel naar de microscoop. Steek de muizentanden voorzichtig in het masker om isofluraan door de neus van de muis te laten dringen door de neus met één hand op te tillen.
9. Terwijl u de muis met één hand vasthoudt, schuift u met de andere hand voorzichtig de zwaluwstaart van het hoofdfixatie-implantaat in de fixatiehouder en zet u deze vast met een halve draai aan de schroefknop.
10. Introduceer een rectale sonde die vooraf is ingebed met een gel op waterbasis voor temperatuurbewaking en voeg oogdruppels toe aan de ogen van de muis.
11. Vul de beeldvormingskamer van het hoofd met een grote hoeveelheid gel op waterbasis of PBS en laat het doel van de onderdompeling in water zakken om het volledig onder te dompelen om optimale excitatie en detectie van de signalen te verkrijgen die worden gegenereerd door excitatie met twee fotonen.
12. Verplaats de x-y-trap en de z-aandrijving om scherp te stellen op het centrale bot in het steigerlitteken.
    OPMERKING: Het is handig om de oculairs van de microscoop en een metaalhalogenide-type lamp als lichtbron te gebruiken, gefilterd door een driebands excitatie-emissiefilter. Het ontbreken van optische doorsnede maakt het onmogelijk om een helder beeld te verkrijgen; Maar met wat oefening is het centrale gebied van de schedel gemakkelijk te herkennen.
13. Nadat u het weefsel hebt geïdentificeerd, gemarkeerd door een botoppervlak en een centrale ader, schakelt u de metaalhalogenidelamp uit en sluit u de vensters van de microscoopkooi om de HyD-detectoren te beschermen en de infrarood (IR) laser te laten passeren.
14. Stel de PMT/SHG-versterking in op 850 V (het lineaire werkbereik) en stel de HyD-versterking in op 100%. Verhoog het IR-laservermogen totdat een beeld met een dynamisch bereik van 200 grijsniveaus (met 8-bits dynamische detectoren) wordt verkregen op het laagste van de drie kanalen. Verminder de winst van de andere detectoren als de emissieverschillen te groot zijn of als er verzadiging is door de modus "onder lagere" opzoektabel (LUT) te gebruiken.
    OPMERKING: In ons geval was een laservermogen van 30% voldoende om contrast in alle kanalen te verkrijgen.
15. Zoek in de acquisitiesoftware naar een gebied dat bestaat uit BM-pockets (GFP⁺, tdTOMATO⁺) ingekapseld in de botoppervlakken (SHG).
16. Om verschillende ROI's te vinden, activeert u LAS NAVIGATOR en creëert u een overzicht van de hele regio met behulp van de spiraalmodus. Stop de acquisitie wanneer het verkregen oppervlak groot genoeg is. Sla het overzicht op, voeg het samen en hernoem het: dit wordt het referentiebeeld in het geval van longitudinale beeldvorming.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat er geen te grote spiraal ontstaat, omdat de apparaathouder hierdoor in contact kan komen met het objectief.
17. Noteer enkele ROI-posities door op het pictogram met één afbeelding te klikken en hernoem elke positie in de takenlijst. Maak een schermafbeelding om de relatieve positie van de verschillende ROI's over het eerder opgeslagen overzicht te leggen.
    OPMERKING: Deze schermopname is essentieel voor het vervangen van de ROI's in longitudinale beeldvorming, aangezien de acquisitiesoftware niet toestaat dat deze groep posities wordt opgeroepen in de versie die voor dit experiment is gebruikt.
18. Als u een z-stack-volume wilt verkrijgen, selecteert u de z-stack-modus, definieert u de stapgrootte op 3 μm en deselecteert u de optie dezelfde stapelgrootte voor alle regio's . Selecteer de eerste positie, definieer de bovenste en onderste posities, controleer de grootte van de z-stap en klik op stapel opnieuw definiëren. Er verschijnt een kubuspictogram naast de naam van de positie in de positielijst. Herhaal deze stap voor alle posities van de verschillende ROI's.
19. Druk op , verkrijg en sla de afbeeldingen op (drie kanalen, z-stacks met ~ 50 plannen) in de juiste map. Deze stap markeert T_ctrl van het experiment; Controleer of de acquisitieparameters correct zijn (verkrijg het juiste dynamische bereik in de drie kanalen, vermijd signaalverzadiging zoveel mogelijk en controleer de acquisitietijd voor een volledige cyclus).
20. Om een dynamisch kenmerk te meten (vasculaire permeabiliteit in dit geval), maakt u een timelapse.
    1. In deze opstelling maken de drie detectoren gelijktijdige beeldvorming van drie kanalen mogelijk; als er een vierde kanaal nodig is voor het experiment (Dextran monitoring in dit geval), activeer dan de sequentiële modus en voeg een tweede acquisitiesequentie toe. Stem de IR-laserlijn af op 820 nm om de Dextran Cy5-fluorofoor te kunnen exciteren. Wijzig het Hyd2-detectiebereik in [650 - 744 nm] en deactiveer de andere detectoren. Kies tussen de acquisitiemodus voor stapels .
       OPMERKING: Standaard heeft de tweede acquisitiesequentie dezelfde parameters als sequentie 1.
    2. Voordat u met de timelapse begint, start u de acquisitie van alle posities om ervoor te zorgen dat de opnametijd niet langer is dan 3 minuten (rekening houdend met de toevoeging van de sequentiële modus), de minimale tijd die nodig is om de dextern-lekkage te detecteren.
    3. Vóór de Dextrans-injectie wijzigt u de acquisitiemodus in xyzt. Stel in de t-module het tijdsinterval in op 3 minuten en de duur op 1 uur.
21. Injecteer 100 μL Dextran 70 KDa-TRITC (of 500 KDa-Cy5) 3 mg/muis intraveneus en begin met acquisitie.
22. Sla de dataset na acquisitie op in de daarvoor bestemde map.
    OPMERKING: Controleer tijdens deze talrijke stappen regelmatig de ademhalingsfrequentie en temperatuur van de muis en pas indien nodig de isofluraanstroom aan. Idealiter zouden temperatuur, ECG en ademhalingsfrequentie kunnen worden geregistreerd en opgenomen als metadata van het experiment.

4. Muis herstel

1. Zodra de beeldvormingssessie is voltooid, deactiveert u de HyDs-detector in de acquisitiesoftware en schakelt u de muisverwarmingsbox in (37 °C). Open de microscoopkooi, til het objectief op en verwijder de rectale sonde van de muis. Schuif vervolgens voorzichtig de zwaluwstaart van het hoofdfixatie-implantaat uit de fixatiehouder en verplaats de muis van het stereotactische masker van de microscoop naar het operatiemasker op het warmtekussen.
2. Schakel de isofluraaninjectie onder de microscoop uit en schakel het warmtekussen uit.
3. Verwijder voorzichtig de gel op waterbasis of PBS van de schedel van de muis met een steriel wattenstaafje.
4. Voeg intrasite-gel toe om het schedelvocht tussen beeldvormingssessies te behouden, zoals eerder beschreven¹³.
5. Sluit het beeldvormingsgebied van het hoofdimplantaat af met de specifieke afdekking en zet deze voorzichtig vast met de schroef.
6. Plaats de muis in de verwarmingsbox op 37 °C en wacht tot hij wakker wordt. Breng de muis naar de dierenopvang en huisvest hem in een schone kooi met hydrogel en verrijking. Controleer de dieren elke dag om tekenen van pijn of infectie te herkennen, in welk geval Buprecare dagelijks wordt toegediend. Om de calvariale vochtigheid te behouden, vervangt u de intrasite-gel 2x per week.
   OPMERKING: Kies een hoge kooi met kartonnen schuilplaatsen en nestmateriaal en zorg ervoor dat u muizen in individuele kooien plaatst.

5. Longitudinale verwervingen

OPMERKING: De muis kan de komende dagen opnieuw worden afgebeeld. Zorg er echter voor dat u niet meer dan drie beeldvormingssessies per week herhaalt om ongewenste effecten van herhaalde anesthesie te voorkomen, zoals droge ogen of overmatige vermoeidheid, evenals ademnood en onderkoeling.

1. Om een muis opnieuw in beeld te brengen waarvan de hoofdhouder al is geïnstalleerd, volgt u stap 2.2 en plaatst u een kleine druppel oogheelkundige gel op de ogen van de muis om uitdroging tijdens de procedure te voorkomen.
2. Volg sectie 3 tot en met stap 3.16 om de overzichtsafbeelding te verkrijgen.
   OPMERKING: Het gebruik van het titanium hoofdimplantaat zonder de hoogte of hoek van de houderpositie te hoeven veranderen, maakt het heel gemakkelijk om het totale interessegebied te vinden.
3. Lijn indien nodig de vorige en nieuwe afbeeldingen opnieuw uit met behulp van de module voor het openen en uitlijnen van afbeeldingen.
4. Open de schermopnameafbeelding uit stap 3.17 om posities op hun oorspronkelijke plaats te markeren.
   OPMERKING: Het gebruik van SHG-contrast is erg handig, vooral wanneer u een remodellering van de bloedvaten en bijbehorende cellen die GFP tot expressie brengen, verwacht.
5. Verkrijg z-stacks en timelapses op dezelfde manier als beschreven in stap 3.18-3.22.

6. Kwantificering van vasculaire parameters

1. Vasculaire parameters
   1. Om de afbeeldingen die met de software zijn gegenereerd (.lif-bestanden) in IMARIS te openen, converteert u ze eerst naar ".ims"-formaat met de File Converter. Open het ".ims"-bestand met IMARIS, controleer de metadata (X-, Y-, Z-schalen) en selecteer de filamentmodule . Selecteer Automatisch maken overslaan, handmatig bewerken.
   2. Voor een betere visualisatie tijdens het genereren van filament, navigeert u naar Instellingen (bladsymbool), selecteert u Lijn in stijl en laat u het aantal pixels op de standaardwaarde (1) staan. Vink de vakjes aan Toon dendrieten, inclusief Beginpunt, Vertakkingspunten en Eindpunten. Verwijder het vinkje bij Rug weergeven.
   3. Selecteer onder tekenen (penseelsymbool) de optie Methode AutoPath; 5 μm als diameter en de kanaalbron die bij het vat hoort (in dit geval TRITC-Dextran). Vink ten slotte automatisch midden en automatische diameterr aan.
   4. Begin met het tekenen van de filamenten door shift + rechtermuisknop te gebruiken om een beginpunt van de tak te kiezen en shift + klik met de linkermuisknop om een eindpunt van een tak te kiezen.
      OPMERKING: Het startpunt is lichtblauw, vertakkingspunten zijn rood of donkerblauw en de eindpunten zijn groen.
   5. Om tijdens het tekenen de juiste diameter van het filament in te stellen, gebruik je de scrollknop van de muis.
   6. Om twee filamenten met verschillende eindpunten samen te voegen, maakt u een nieuw startpunt ertussen en sluit u dit op elk eindpunt aan.
      OPMERKING: Groene eindpunten verschijnen dus in vertakkende punten.
   7. Zodra de vasculaire boom is gemaakt, gaat u terug naar de instellingen en zorgt u ervoor dat het aantal begin-, vertakkings- en eindpunten correct is. Selecteer de kegel om de diameters te visualiseren en hun uiterlijk te verifiëren.
   8. Als de diameter (of verbinding) van een filament onjuist lijkt, navigeert u naar Bewerken (potloodsymbool), selecteert u het filament dat u wilt verwijderen met een klik met de rechtermuisknop en klikt u op Verwijderen. Teken het filament opnieuw door de diameter op het filament aan te passen met de muisknop.
   9. Om alle gegenereerde statistische gegevens te extraheren en op te slaan, klikt u op het pictogram Statistiek | alle statistieken exporteren naar bestand-(pictogram met meerdere diskettes onderaan het scherm).
      OPMERKING: Om mogelijk afwijkende filamenten te voorkomen die niet overeenkomen met vaten, werden alleen filamenten langer dan 20 μm in de statistische analyse opgenomen.
2. Kwantificering van lekken
   OPMERKING: Om de afbeeldingen die met de software zijn gegenereerd (.lif-bestand) in IMARIS te openen, converteert u ze eerst naar ".ims"-indeling met de File Converter.
   1. Om foto's die voor en na dextran-injectie in dezelfde tijdreeks zijn gemaakt, samen te voegen, gaat u naar de Surpass-modus, klikt u op zowel de eerste afbeelding (T_ctrl , vóór dextran-injectie) als de timelapse-afbeelding (tijd 1, 60 min) om ze te openen en ze te combineren door op Bewerken te klikken en tijdpunten toe te voegen.
      OPMERKING: Om eventuele 3D-drift te corrigeren, doorloopt u de stappen 6.2.2-6.2.7 met behulp van de brugfunctie tussen Fiji en IMARIS. Installeer de volgende plug-ins in Fiji: "IMARIS_Bridge96.jar" en "IMARISBridgeUtils.jar". De 3D drift Registratie wordt uitgevoerd met behulp van "StackReg Pluging" (al beschikbaar in Fiji). Als het niet nodig is, ga dan naar stap 6.2.8
   2. Om 3D-driftcorrectie uit te voeren, opent u Fiji om afbeeldingen van IMARIS te overbruggen door op Plug-ins | IMARIS | Afbeelding van IMARIS.
   3. Selecteer in Fiji de optie Plug-ins | Registratie | Correcte 3D-drift.
   4. Kies in de nieuwe vensters die verschijnen het juiste kanaal voor registratie.
      OPMERKING: In dit geval was het Nestin-GFP, maar het kon elk kanaal zijn dat onbeweeglijke objecten en een hoge signaal-achtergrondverhouding benadrukte.
   5. Als u de detectie van kleine afwijkingen wilt verbeteren, selecteert u Multi-tijdschaalberekening, Subpixeldriftcorrectie en Randverbeter afbeeldingen en laat u de andere instellingen als standaard staan.
   6. Om de gecorrigeerde afbeelding naar IMARIS te overbruggen, selecteert u deze en klikt u op Plug-ins | IMARIS | Afbeelding naar IMARIS.
   7. Sla het op in de juiste map door te klikken op Bestand | Opslaan als.
   8. Om alle verkregen kanalen te visualiseren, klikt u op Bewerken | Weergaveaanpassing weergeven. Selecteer het externe kanaal en de tijd 1 (frame 2 onderaan het scherm).
   9. Maak een nieuw oppervlak dat het vasculaire lumen op tijdstip 1 definieert door het selectievakje nieuw oppervlak toevoegen (blauw object) aan te vinken
   10. Ga in Surface 1 naar Eigenschappen en verwijder het vinkje bij alle parameters in Algoritme-instellingen. Klik op de volgende stap (blauwe pijl)
   11. Selecteer het vasculaire kanaal (dextran in dit geval) onder bronkanaal en vink Vloeiend en achtergrond aftrekken aan. Laat alle andere parameters op standaardwaarden staan. Klik op de volgende stap (blauwe pijl).
   12. Pas de drempelwaarde aan op basis van het uiterlijk van het oppervlak in termen van dikte en dekking van alle positieve gebieden. Klik op de volgende stap (blauwe pijl).
   13. Sluit niet-specifieke oppervlakken (meestal kleine puntjes) uit met behulp van het filter standaard Aantal voxels. Klik op de laatste stap (groene pijl).
   14. Ga indien nodig verder met het handmatig aanpassen van het oppervlak door op bewerken (potloodpictogram) te klikken in Parameters instellen. Als u een object wilt selecteren dat u wilt verwijderen, klikt u er met de linkermuisknop op en verwijdert u het door verwijderen te selecteren. Als het te verwijderen object is samengevoegd met een ander object, koppelt u de twee gescheiden delen van het oppervlak los door tussen de twee op shift + klik links te klikken en Oppervlak knippen te selecteren. Herhaal deze stap zo vaak als nodig is.
   15. Combineer ten slotte alle segmenten met behulp van de selectiemodus (doelpictogram rechts) en druk op control + scrollen om alle objecten te herstellen. Wanneer ze allemaal zijn geselecteerd, klikt u met de linkermuisknop en klikt u op verenigen.
   16. Om het referentieoppervlak te genereren, kopieert u dit oppervlak naar de andere tijdstippen. Selecteer het globale oppervlak en dupliceer het door op Dupliceren te klikken en hernoem het als Intravasculair.
   17. Selecteer het oppervlak Intravasculair en klik op Dupliceren naar alle tijdstippen.
   18. Splits het dextran-signaal om onderscheid te maken tussen intra (IN) en extravasculaire (OUT) gebieden. Om een IN-kanaal voor alle tijdstippen te maken, klikt u op het oppervlak Intravasculair | Bewerken (potloodknop) | Maskeer alles.
   19. Selecteer in Kanaalselectie het juiste kanaal en vink duplicaat kanaal aan voordat u masker toepast. Vink in Maskerinstellingen alleen Constant binnen/buiten aan met stel het buitenoppervlak van voxels in op 0. Vink ten slotte ook Toepassen op alle tijdstippen aan.
   20. In Beeldschermaanpassing wordt standaard een nieuw kanaal gemaakt met de naam gemaskeerd. Hernoem het IN.
   21. Als u kanaal OUT voor alle tijdstippen wilt maken, herhaalt u de stappen 6.2.18-6.2.20, maar selecteert u Voxels in het oppervlak instellen op 0. Hernoem dit nieuwe kanaal naar OUT.
   22. Om statistische gegevens te extraheren, klikt u op het pictogram Statistiek | Exporteer alle statistieken naar bestand (pictogram met meerdere diskettes onder aan het scherm)
   23. Om lekkage te analyseren, deelt u het intensiteitssomkanaal buiten door het intensiteitssomkanaal binnen voor elk tijdstip.

Resultaten

In Figuur 1 en Figuur 2 wordt het CAD-model getoond van een titanium kopfixatie-implantaat gepositioneerd op een gescande muizenschedel, dat is ontworpen om de anatomische structuur van de schedel te volgen en een lichtgewicht en biocompatibel apparaat te bieden dat in staat is om stevig vast te houden aan het microscoopstadium en zorgt voor stabiliteit op cellulair niveau. Door dit stapsgewijze protocol te volgen, wordt het implantaat stabiel bevestigd aan de schedel van de muis en kan het stevig aan de microscoophouder worden bevestigd door de zwaluwstaart, waardoor een vlak beeldvormingsgebied mogelijk is voor het vasthouden van vloeistof en intravitale observatie in de loop van de tijd. Het kan worden afgesloten met een deksel om schade of infectie van de wond te minimaliseren, waardoor hetzelfde weefselgebied gedurende weken herhaaldelijk kan worden bekeken. Eenmaal wakker kan de muis met een hoofdimplantaat vrij rondlopen, eten en een regelmatige routine hebben.

Figuur 3 toont een tegelscan van het calvariale BM-vaatstelsel gemaakt van heterogene haarvaten, waaronder arteriolen, overgangscapillairen en sinusoïden. Bloedvaten zijn ingebed in een complexe weefselmicro-omgeving in nauw contact met het botoppervlak en perivasculaire mesenchymale cellen. Tijdens de ontwikkeling van leukemie kunnen afzonderlijke geïsoleerde leukemiecellen worden gedetecteerd in de BM-micro-omgeving in de nabijheid van bloedvaten, en hun implantatie neemt in de loop van de tijd toe, waardoor de calvaria in late stadia van de ziekte wordt gevuld.

Figuur 4 laat zien hoe afbeeldingen die met dit protocol zijn verkregen, kwantitatieve gegevens kunnen opleveren, die met statistische methoden kunnen worden geanalyseerd. We laten zien hoe bloedvaten kunnen worden gesegmenteerd met het IMARIS-filament en meten de lengte en diameter van vasculaire fragmenten, evenals hun rechtheid. De correlatie van deze parameters kan ook worden geëvalueerd.

Figuur 5 toont longitudinale beeldvorming van twee verschillende posities van het calvariale BM tijdens AML-progressie op dag 4, 7 en 10, waarbij dag 10 geassocieerd is met een ~50% implantatie van het BM met leukemische cellen, zoals gemeten via flowcytometrie (niet getoond). We kunnen een belangrijke hermodellering van de grootte van reeds bestaande bloedvaten waarnemen, evenals de vorming van nieuwe bloedvaten in specifieke gebieden die verband houden met lokaal botverlies.

Ten slotte laten we in figuur 6 zien hoe vasculaire permeabiliteit kan worden gemeten als een dynamische parameter met time-lapse-beeldvorming die het vermogen van verschillende vasculaire barrières laat zien om in de loop van de tijd een fluorescerende kleurstof vast te houden.

Figuur 1: Ontwerp en productie van een biocompatibele kophouder op basis van titanium. (A) Delen van het implantaat in situ: 1 observatiering, 2 cementeerfunctie, 3 stabiliserend anker, 4 staart, 5 zwaluwstaart, 6 schroefdraadgat, 7 Bregma. (B) Aansluiting van het hoofdimplantaat op de houder: 8 fixatielichaam, 9 klem, 10 excentrische hendel, 11 structuur, 12 microscoopobjectief. (C) Vervorming van het implantaat tegen belasting door FEM-simulatie waarbij de maximale verplaatsing 0,23 μm is tegen 0,04 N kracht. (D) Beschermkap en de schroef. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Voorbereiding van de muis op intravitale beeldvorming. (A) Weergave van het hoofdimplantaat en het beeldvormingsgebied dat chirurgisch is blootgesteld vóór de beeldvorming. (B) Hoofdimplantaat stevig bevestigd aan de schedel van de muis. (C) Muis wakker in de herstelkooi met het gesloten deksel op het hoofdimplantaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Intravitale beeldvorming van het calvaria-vaatstelsel. (A) Z-projectie van de tegelscan van het calvaria-vaatstelsel gelabeld door cdh5-DSRED. (B) Inzoomen op afgebeelde gebieden om verschillende soorten vaten te beschrijven die worden afgebeeld door pijlen, arteriolen door rode pijlen, overgangscapillairen door oranje pijlen, sinusoïden door gele pijlen. (i) en (ii) z-projecties van X μm weefsel; iii) enkel plakje. (C) Enkele plakjes van verschillende gezichtsvelden van BM-vaten, met het botoppervlak (SHG), de perivasculaire cellen (nes-GFP⁺) en het vasculaire lumen (dextran-TRITC). (D) Vasculaire niche geassocieerd met AML-progressie. Representatieve segmenten van vroege (boven) en late (onder) tijdstippen van AML-ontwikkeling. MLL-AF9-leukemie is gelabeld met tdTOMATO (rode pijlen), terwijl bloedvaten zijn gelabeld met pdgfb-GFP (groene pijlen), botoppervlak met SHG en macrofagen in geel (autofluorescentie, geel sterretje). Schaalbalken = 200 μm (A), 40 μm (B,D-onderste paneel), 50 μm (C). Afkortingen: BM = beenmerg; GFP = groen fluorescerend eiwit; AML = acute myeloïde leukemie; EC= Endotheelcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Kwantificering van vasculaire parameters. (A) Meting van vasculaire parameters via het IMARIS-filamentinstrument in een representatieve z-projectie van beenmergvaten gelabeld met TRITC-dextran. Lijn- en kegelvoorstellingen worden getoond. (B) Kwantificering van de scheepsparameters in de afbeelding weergegeven in A. (C) Correlatie tussen vasculaire parameters die een tegengestelde correlatie vertonen tussen rechtheid en lengte van het vat (negatief, Spearman r = -3523; p < 0,0001; R² = 0,2102) versus diameter (positief; Speerwerper r = 0,4110; p < 0,0001; R² = 0,1299). Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5: Longitudinale beeldvorming van twee verschillende posities van de calvaria BM over AML-ontwikkeling. Endotheelcellen die vaten bekleden, zijn gelabeld met cdh5-GFP, botoppervlak met SHG en macrofagen in geel (autofluorescentie). Remodellering van reeds bestaande schepen (rode pijlen) en vorming van nieuwe schepen (gele pijlen) worden getoond. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6: Vasculaire permeabiliteit. (A) Schema's van de meting van de vasculaire permeabiliteit via het IMARIS-oppervlaktegereedschap. (B) Z-projectie van hetzelfde gebied in de lengterichting afgebeeld over 1 uur. (C) Kwantificering van de vasculaire permeabiliteit binnen gebieden zoals weergegeven in A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur S1: Geprepareerde schedel. Maak in het middenvlak een as die tangentieel is aan de calvaria en sla vervolgens de voorbereide schedel op. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: Plannen met een onderlinge afstand van 2 mm. Hoe maak je een set van gelijk verdeelde vlakken (2 mm afstand) over de schedel. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S3: Waarneembare oppervlaktecontour. Maak een schets in het calvariale vlak en maak een peervormige spline van AP +6,5 tot -2, 6 mm breedte bij AP 0,0. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S4: Observatievindow. Maak een schets in het calvariale vlak en teken een 0,5 mm dikke C-vorm die aansluit op het observatievenster . Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S5: Klik op nieuwe studie. Navigeer naar het tabblad Simulatie (indien zichtbaar) of ga naar Simulatie | Studie. Kies in het dialoogvenster Studie de optie Statisch als studietype. Klik op OK om het nieuwe onderzoek te maken. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding S6: Klik met de rechtermuisknop om mesh te maken. Verfijn het net in gebieden waar hoge spanning of vervorming wordt verwacht. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De primaire kracht van intravitale microscopie is het vermogen om dynamische cellulaire processen in realtime vast te leggen in hun oorspronkelijke omgeving, waardoor de beperkingen van traditionele histologische en ex vivo beeldvormingsmethoden worden overwonnen. Door de calvariale BM direct te observeren met behulp van de geavanceerde beeldvormingstechnieken in combinatie met fluorescerende labeling zoals beschreven in dit protocol, kunnen onderzoekers niet alleen vasculaire functionele parameters bestuderen ^8,14, maar ook longitudinale processen zoals leukemische celimplantatie en migratie ^6,15, proliferatie en metabolische activiteit^16,17 Behoud van fysiologische relevantie en het vermijden van artefacten die verband houden met weefselfixatie en -verwerking.

De voordelen van de BM calvaria intravitale beeldvorming ten opzichte van alternatieve botlocaties zijn onder meer gemakkelijke toegankelijkheid, transparantie van het schedelbot voor een betere visualisatie zonder botbeschadiging, stabiliteit van het calvariumbot waardoor weefselbewegingsartefacten worden geminimaliseerd, en reproduceerbaarheid bij proefdieren die vergelijking tussen verschillende experimentele groepen vergemakkelijken. De mogelijkheid om de dieren te recupereren en longitudinale beeldvorming uit te voeren, maakt het ook mogelijk om het aantal dieren dat in een onderzoek wordt gebruikt, te verminderen. Het is vermeldenswaard dat, omdat stamspecifieke verschillen in groeipatronen van schedelvaten en de daaruit voortvloeiende osteogenese zijn waargenomen¹⁸, het belangrijk is om hiermee rekening te houden bij het ontwerpen van het specifieke beeldvormingsimplantaat voor de gewenste muizenstam om perfecte anatomische compatibiliteit en toegang tot de gewenste beeldvormingslocatie mogelijk te maken.

Een ander belangrijk punt om te vermelden zijn de mogelijke verschillen in vasculaire en hematopoëtische eigenschappen binnen de calvariale BM in vergelijking met andere botten, een tot voor kort slecht onderzochte vraag. Nieuwe studies suggereren gelokaliseerde functies voor verschillende botten, waarbij de calvariale BM verschilt van andere botten in termen van hematopoëse, bot- en vasculaire structuur en functie 19,20,21,22,23, evenals respons op neurologische pathologieën²⁴. Deze verschillen moeten verder worden onderzocht en in aanmerking worden genomen voordat specifieke calvaria-bevindingen worden veralgemen.

Het ontwerp en de constructie van een beeldvormend implantaat is een belangrijke stap voor deze experimentele opstelling, te beginnen bij de keuze van het materiaal. Biocompatibele implantaten spelen een cruciale rol in biomedisch onderzoek en vergemakkelijken een breed scala aan toepassingen, variërend van weefselmanipulatie en regeneratieve geneeskunde tot medicijnafgiftesystemen en in vivo bewakingsapparatuur. De materiaalkeuze voor een hoofdimplantaat dat is aangepast voor intravitale beeldvorming is van cruciaal belang. Idealiter zou het materiaal een uitstekende biocompatibiliteit moeten vertonen, mechanische eigenschappen die geschikt zijn om minimale flexibiliteit en algehele stabiliteit te garanderen, en ten slotte het vermogen om in de schedel te integreren zonder ontstekingen te veroorzaken. Titanium is ideaal vanwege zijn goede verdraagbaarheid in het dierlijk lichaam, zonder inductie van bijwerkingen in contact met biologische weefsels, evenals vanwege zijn weerstand tegen corrosie, waardoor stabiliteit op lange termijn wordt gegarandeerd, zelfs bij blootstelling aan lichaamsvloeistoffen of experimentele oplossingen. Bovendien maakt de mechanische sterkte het bestand tegen vervorming en breuk. Ondanks zijn sterkte heeft titanium een relatief lage dichtheid, wat resulteert in lichtgewicht intravitale beeldvormingsapparatuur die de belasting voor proefdieren en onderzoekers minimaliseert. Ten slotte maakt de veelzijdigheid in fabricage het mogelijk om intravitale beeldvormingsapparaten aan te passen aan specifieke experimentele vereisten, zoals grootte, vorm en functionaliteit.

Hier hebben we een biocompatibel hoofdfixatie-implantaat ontworpen met behulp van parametrische modellering CAD-software met ingebouwde Finite Element Analysis (FEA)-mogelijkheden, met name SolidWorks. Deze aanpak maakt nauwkeurige, iteratieve aanpassingen aan de structurele en ruimtelijke vereisten van het implantaat mogelijk, waardoor zowel anatomische compatibiliteit als mechanische veerkracht worden gegarandeerd. Gratis alternatieven, zoals FreeCAD, bieden vergelijkbare modellerings- en simulatiefunctionaliteiten. De primaire input voor het ontwerpproces omvat een anatomisch model met hoge resolutie van de schedel van de muis, een model van het microscoopobjectief en een model van het fixatiesysteem, die samen de afmetingen en configuratie van het implantaat bepalen. De uiteindelijke uitvoer is een platformonafhankelijk mesh-bestand, meestal in STL- of STEP-formaat, compatibel met de meeste 3D-printsoftware.

De eerste stap omvat het vastleggen van gedetailleerde anatomische kenmerken van het hoofd van de muis met behulp van beeldvormingstechnieken met hoge resolutie, zoals in vivo micro-CT-scanning. Deze benadering biedt de hoogste anatomische details en nauwkeurigheid, waarbij de microstructuren van de schedel worden vastgelegd. 3D-scannen van een voorbereide, naakte schedel zou ook een optie kunnen zijn. Deze methode, met behulp van laser- of gestructureerd lichtscanners, wordt vaak gebruikt op een geprepareerde schedel en biedt nauwkeurige oppervlaktecontouren, hoewel met minder interne details in vergelijking met micro-CT. Anders kunnen anatomiemodellen worden gedownload van open source publicaties en databases²⁵ of DigiMorph {https://www.digimorph.org/specimens/Mus_musculus/}. Hoewel ze handig zijn, missen deze modellen mogelijk monsterspecifieke details, dus er zijn vaak aanpassingen nodig voor het specifieke dier in het onderzoek, zoals het schalen naar de werkelijke Bregma-Lambda-afstand. De verkregen gegevens worden vervolgens gebruikt om een nauwkeurig 3D-model van de schedel van de muis te maken, dat dient als basissjabloon voor het implantaatontwerp.

Om het implantaat op de schedel te bevestigen, is een cementstructuur ontworpen om het resterende schedeloppervlak te bedekken dat niet wordt ingenomen door het observatievenster. Deze structuur moet robuuste bevestigingspunten bieden en tegelijkertijd kritische anatomische kenmerken vermijden. De cementstructuur heeft meerdere openingen om een optimale polymerisatie van het cement onder het implantaat door diffusie te garanderen. Bovendien hebben de wanden van de cementstructuur een kleine tochthoek, waardoor het cement stevig tegen deze schuine wanden kan verankeren. De staart van het implantaat, die zich uitstrekt van het hoofdlichaam tot het fixatiesysteem, is ontworpen. Dit onderdeel is cruciaal voor het uitlijnen en stabiliseren van het implantaat tijdens observatie, en het ontwerp moet rekening houden met de beschikbare ruimte en de anatomische beperkingen van het hoofd van de muis. Ten slotte is een zwaluwstaartmechanisme geïntegreerd in het implantaatontwerp voor eenvoudige bevestiging en loskoppeling van het implantaat van het fixatiesysteem. Deze functie verbetert de bruikbaarheid en bruikbaarheid van het implantaat tijdens herhaalde observaties. Het zwaluwstaartmechanisme zorgt voor herhaalbare fixatie voor het gemakkelijk ophalen van waargenomen weefsels voor herhaalde beeldvormingssessies.

Lezers die de toepassing van intravitale microscopiebeeldvorming van de calvariale BM overwegen, moeten hun onderzoeksdoelen en experimentele vereisten zorgvuldig evalueren om te bepalen of deze methode geschikt is voor hun studies. Hoewel intravitale microscopie ongeëvenaarde inzichten biedt in hematopoëse, regulatie van de weefselmicro-omgeving en vasculaire dynamiek in vivo, brengt het ook bepaalde technische uitdagingen en beperkingen met zich mee. Onderzoekers moeten bereid zijn om deze uitdagingen aan te gaan door middel van een zorgvuldig experimenteel ontwerp, optimalisatie van beeldvormingsparameters en het gebruik van de juiste controles. Bovendien moeten onderzoekers rekening houden met de beschikbaarheid van gespecialiseerde beeldvormingsapparatuur, expertise in fluorescerende labeltechnieken en computationele middelen voor beeldanalyse. Over het algemeen heeft intravitale microscopische beeldvorming van de calvariale BM een enorm potentieel voor het bevorderen van ons begrip van hematopoëse en vasculaire biologie, en biedt het een uniek venster op de dynamische processen die plaatsvinden in de BM-micro-omgeving.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Amira	Thermo ScientificTM
Anesthesie			Isofluraan 2% tot 3%
Anesthesiemasker (dier detectie)	Minerve
Anesthesie apparaat	Minerve
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze	Jackson laboratories	MGI:3809523
CalvariaVue	Ymetry	https://ymetry.com/site/head-fixation-implants/44-mouse-head-fixation-implant-for-calvaria.html
Tandcement	Kemdent	SUN527
Dextran 500 kDa-Cy5	Tebu-bio	DX500-S5-1	3 mg/muis
Dextran 70 kDa-TRITC	Sigma	T1162	3 mg/muis
Ontsmettingsmiddel	MP-Labo	Dermidine-60ml
Elektrisch scheerapparaat	Aescular	Isis
Ooggel	Ocry-gel	10g
Fiji	https://imagej.net/software/fiji/downloads	v 17 mei 30
Fiji plug-ins om te verbinden met Imaris	https://imagej.net/software/fiji/downloads	Imaris_Bridge96.jar ; ImarisBridgeUtils.jar
Verwarmingsbox	Datesand	Thermacage
Verwarmingspad voor chirurgie	Minerve
Beeldvorming verwarmingspad & rectale sonde	F. Haer
Imaris v9.6.0	Oxford instruments
Intrasite gel	Chinoxia	2390766
LAS AF Software	Leica	LAS X 3.5.7.23225
Medicatie			Buprecare, 0,01 mg/kg
Objectief HCX IRAPO L 25x/0.95 WATER	Leica	506374
Saline buffer (PBS 1x)	Sigma	P4417	Sterilisatie door autoclaaf
SP8 DIVE FALCON Multifoton Microscoop	Leica
Stereotoxische masker	Minerve	1201261
Sterilisatiekralen	Sigma	Z742555
Chirurgische gereedschappen	Moria	4877A; 2183
Overlevingsdeken	SECURIMED	11006
Watten/doekjes			Sterilisatie door autoclaaf
Spuit 1 mL 26 G	BD Plastipak	305501
Temperatuurregelaar	F. Haer	40-90-5D-02
Tg(Nes-EGFP)33Enik muizen	Jackson laboratories	MGI:5523870
Tg(Pdgfb-icre/ERT2)1Frut muizen	Jackson laboratories	MGI:3793852
Tg(Cdh5-cre/ERT2)1Rha muizen	Jackson laboratories	MGI:3848982
Ultrasone gel	Parker laboratories	Aquasonic 100