Methodenartikel

Microbiota van attine mierentuinen: visualisatie van een microbieel landschap door scanning elektronenmicroscopie

DOI:

10.3791/67334

⸱

4 oktober 2024

 ,  ,  , 
1Institute of Biosciences, Rio Claro, Department of General and Applied Biology, São Paulo State University (UNESP), 2Plant Pathology and Nematology Department, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, University of São Paulo (USP)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We stellen een geoptimaliseerd Scanning Electron Microscopie-protocol voor voor het visualiseren van zeer heterogene en delicate monsters die planten- en schimmelbiomassa bevatten, samen met microbiota en biofilm. Dit protocol maakt het mogelijk om de ruimtelijke dimensies van de microbiota-organisatie te beschrijven.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In ecosystemen op macroschaal, zoals regenwouden of koraalriffen, is de ruimtelijke lokalisatie van organismen de basis van ons begrip van gemeenschapsecologie. Ook in de microbiële wereld zijn ecosystemen op microschaal verre van een willekeurige en homogene mix van organismen en habitats. Toegang tot de ruimtelijke verspreiding van microben is van fundamenteel belang voor het begrijpen van het functioneren en de ecologie van de microbiota, aangezien samenwonende soorten meer kans hebben om met elkaar om te gaan en elkaars fysiologie te beïnvloeden.

Een microbieel ecosysteem tussen koninkrijken vormt de kern van schimmelgroeiende mierenkolonies, die basidiomycete-schimmels cultiveren als voedingsbron. Tandmieren foerageren naar diverse substraten (meestal plantaardig), gemetaboliseerd door de gecultiveerde schimmel terwijl ze een sponsachtige structuur vormen, een "microbiële tuin" die fungeert als een externe darm. De tuin is een met elkaar verweven netwerk van schimmeldraden die groeien door het substraat te metaboliseren, waardoor nissen worden geopend voor een karakteristieke en aangepaste microbiota om zich te vestigen. Aangenomen wordt dat de microbiota een bijdrage levert aan de afbraak van het substraat en de groei van schimmels, hoewel de ruimtelijke organisatie nog moet worden bepaald.

Hier beschrijven we hoe we Scanning Electron Microscopy (SEM) gebruiken om met ongekend detail de ruimtelijke organisatie van microbiota en biofilm in verschillende schimmelteeltsystemen van schimmelgroeiende mieren te onderzoeken. SEM beeldvorming heeft een beschrijving gegeven van de ruimtelijke structuur en organisatie van de microbiota. SEM onthulde dat microbiota zich gewoonlijk assembleren in biofilms, een wijdverbreide structuur van de microbiële landschappen in de schimmelteelt. We presenteren de protocollen die worden gebruikt om zo'n complexe gemeenschap te fixeren, uit te drogen, te drogen, te sputteren en in beeld te brengen. Deze protocollen werden geoptimaliseerd om delicate en heterogene monsters aan te pakken, bestaande uit plantaardige en schimmelbiomassa, evenals de microbiota en de biofilm.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ecosystemen zijn samengesteld uit organismen die met elkaar verbonden zijn door processen op een specifieke geografische locatie (d.w.z. de omgeving). Organismen interageren in de loop van de tijd met hun omgeving, waaruit complexe en heterogene ruimtelijke patronen ontstaan. Ruimtelijke patronen bepalen de ecologische diversiteit en stabiliteit en uiteindelijk het functioneren van ecosystemen 1,2,3,4. In ecosystemen op macroschaal, zoals wetlands, savannes, koraalriffen en droge ecosystemen, zijn ruimtelijke patronen gecorreleerd met de stroom en concentratie van hulpbronnen. Door optimalisatie van hulpbronnen mogelijk te maken, resulteren ruimtelijke heterogeniteit en patroonvorming in veerkrachtigere ecosystemen dan homogeneecosystemen 2. De ruimtelijke lokalisatie van organismen, die aan de basis ligt van de ecologie van de gemeenschap, wordt ook vertaald naar de microbiële wereld.

Microbiële ecosystemen, verre van organismen die willekeurig en homogeen zijn gemengd in microhabitats, vertonen ruimtelijke patronen die een groot deel van hun functioneren bepalen 5,6,7. Van Winogradsky-kolommen tot omgevings- en gastheer-geassocieerde microbiota, deze ecosystemen zijn heterogeen georganiseerd in de ruimte, met ruimtelijke arrangementen die verschillende fenotypische reacties oproepen. Samenwonende soorten hebben meer kans om met elkaar om te gaan en elkaars fysiologie te beïnvloeden. De ruimtelijke organisatie van de gemeenschap, meer dan haar samenstelling op zich, bakent dus ecosysteemeigenschappen en ecologische niches af 5,7,8. Ter illustratie van deze concepten lijken veranderingen in ruimtelijke patronen gecorreleerd te zijn met de pathologische progressie van tandplak, cariës, tandvleesaandoeningen 9,10, inflammatoire darmaandoeningen11, cystische fibrose, longinfecties, chronische wondinfecties12,13, colorectale kanker en adenomen14.

In het kader van microbiële biogeografie (de studie van de verdeling van biodiversiteit en patronen in ruimte en tijd op microschaal), wordt de kennis van microbiële ecosystemen enorm benut door het begrijpen van hun ruimtelijke patronen 6,13,15,16,17. We hebben gekeken naar ruimtelijke patronen van een door insecten gebouwd microbieel ecosysteem, gevonden in de kern van de charismatische schimmelgroeiende attinemier (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae: Attini: Attina) kolonies. Er bevindt zich een "microbiële tuin", gecentreerd rond een basidiomycete schimmel in de stam Leucocoprinae (Basidiomycota: Agaricaceae) of in de familie Pterulaceae (Basidiomycota: Agaricales)18,19,20,21,22. De tuin is een sponsachtige structuur die voortkomt uit een verweven netwerk van hyfen dat groeit door het grotendeels plantaardige substraat te metaboliseren dat door de mieren is opgenomen (Figuur 1). Deze kunnen zijn, volgens de attine-geslachten: droge plantendelen, insectenfrass en karkassen, vers gesneden bladeren, zaden en bloemendelen23,24. Analoog aan een externe herbivore darm, zet de tuin enzymatisch en chemisch recalcitrante polymeren om in labiele voedingsbronnen, waardoor de mieren worden voorzien van essentiële aminozuren, lipiden en oplosbare suikers 21,25,26,27,28.

Ultrastructurele, enzymatische en transcriptomische analyses die zijn uitgevoerd voor tuinen van de bladsnijdende geslachten Atta en Acromyrmex suggereren dat deze omgevingen een continuüm van substraatdegradatie en voedingspleisters structureren 26,29,30,31,32. Jonge delen van de tuin hebben de neiging om donkerder te zijn als gevolg van vers opgenomen substraat nadat ze zijn gefragmenteerd. Deze recent toegevoegde substraten worden vaak gekoloniseerd vanaf de randen, die werden gesneden door mierenwerkers en geïnoculeerd met myceliumklonten. Uitstralend vanaf afgesneden randen, verspreiden schimmeldraden zich over het substraat 29,32,33. De overvloed aan schimmeldraden neemt toe naarmate de afbraak van het substraat vordert, wat resulteert in witachtige en metabolisch actieve regio's 30,31,32. Oudere regio's, met een meer aangetast substraat en een overvloedige microbiota29,32, hebben de neiging om bruinachtige tinten en een hogere luchtvochtigheid te vertonen. Werknemers verwijderen fragmenten van dit gebied en scheiden ze af in afvalhopen, waar ze ook substraten nemen die schadelijk zijn voor de schimmelsymbiont 34,35,36. Afvalhopen, hoewel fysiek losgekoppeld van de tuin, zijn een plek van continue afbraak van het substraat en nutriëntenkringloop door de overvloedige bewoner microbiota 29,32,37,38,39.

Een microbiota die voornamelijk bestaat uit Enterobacter, Klebsiella, Pantoea, Pseudomonas en Serratia, bewoont ook de tuin en wordt blijkbaar gedeeld door verschillende attine-schimmelteeltsystemen. Door te coderen voor metabole routes die het metabolisme van schimmels zouden kunnen aanvullen, neemt de microbiota mogelijk deel aan de fysiologische reacties van de tuin 40,41,42,43,44. Niet alleen gaven metagenomische gegevens aan dat de microbiota er was41,42, maar ook Scanning Electron Microscopy (SEM) analyse van de schimmelteelt van bladsnijdende mieren toonde voornamelijk staafvormige bacteriën over plantsubstraat32. Hoewel bacteriën (inclusief cellulolytische stammen) uit de hele tuin werden geïsoleerd, werden ze alleen gevisualiseerd in oudere delen van de tuin en in afvalhopen, evenals in de eerste pellet die door stichteressenkoninginnen werd gedragen 29,32. Het was ook onzeker of de microbiota in vivo (d.w.z. in de tuin en het afval) biofilms konden vormen, zoals gesuggereerd door hun metabolische capaciteit42 en waargenomen in vitro44.

Hier hebben we SEM gebruikt om de ruimtelijke organisatie van de microbiota in de tuinregio's verder te begrijpen, waarbij we de fysische interacties tussen microbiota en substraat en microbiota en hyfen in detail beschrijven. Door beelden met een grotere brandpuntsdiepte te bieden, maakt SEM observaties van driedimensionale microscopische structuren in hoge resolutie mogelijk, waardoor een grondige analyse van de ruimtelijke patronen van de tuinmicrobiota mogelijk is. We beschrijven stappen om dergelijke heterogene en delicate monsters op basis van schimmels te fixeren, uit te drogen, te drogen, te sputteren en in beeld te brengen. Door de nafixatiestap met osmiumtetroxide (OsO4) te verwijderen en de uitdrogingstijd te verkorten, hebben we de protocollen 32,33,45 vereenvoudigd voor het voorbereiden van tuin- en afvalmonsters voor SEM-analyse. Dit aangepaste protocol behoudt de structurele patronen van de hyphal, evenals de ruimtelijke organisatie van de microbiota en de biofilm, en kan worden toegepast op andere delicate microbiële ecosystemen en biofilms.

figure-introduction-1
Figuur 1: Attine microbiële tuinen. De tuin is een sponsachtige structuur die het resultaat is van een verweven netwerk van hyfen dat groeit door het grotendeels plantaardige substraat van de mieren te metaboliseren. In de tuin bevindt zich ook de microbiota, die codeert voor metabole routes die het schimmelmetabolisme kunnen aanvullen. Metagenomische gegevens en eerdere analyse van scanning-elektronenmicroscopie wezen op de aanwezigheid ervan, hoewel we nauwelijks kennis hadden van de ruimtelijke organisatie en fysische interacties met het substraat en schimmeldraden. We hebben SEM ingezet om de ruimtelijke organisatie en patronen van de microbiota en biofilm te onthullen. Illustraties door Mariana Barcoto (tuin en microbiota aangepast van Barcoto en Rodrigues 94), en foto's door Mariana Barcoto en Enzo Sorrentino. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bemonstering van veldkolonies

OPMERKING: Bij het verzamelen van mierenkolonies, certificeer dat alle toestemmingen die vereist zijn door de lokale wetgeving zijn verkregen voordat u ze verzamelt. In ons geval is de verzamelvergunning #74585 afgegeven door het Instituto Chico Mendes de Conservação e Biodiversidade (ICMBio). Als de monsters afkomstig zijn uit een laboratoriumkolonie, ga dan naar sectie 2.

  1. Zoek en markeer de kolonie. Graaf een greppel rond het nestgebied totdat de tuinkamer bloot komt te liggen (Figuur 2A).
    OPMERKING: Sommige attinesoorten kunnen hun kolonies bouwen onder het bladafval of in rotte boomstammen. Draai in dergelijke gevallen het strooisel voorzichtig rond of breek voorzichtig de houtblokken voor het verzamelen van de monsters. Voor gedetailleerde informatie over het lokaliseren, verzamelen en onderhouden van levende kolonies van diverse attinemierensoorten, zie Sosa-Calvo et al.46.
  2. Open de tuinkamer zijdelings om te voorkomen dat de grond op het tuinoppervlak valt. Verzamel zorgvuldig tuinmonsters met behulp van een entomologische tang, een lepel of een keukenschuimspaan, afhankelijk van de grootte van de tuin.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat u het gereedschap steriliseert voordat u het verzamelt. Draag bij het verzamelen van tuinen van bladsnijdende mieren dikke stoffen handschoenen om beten van werksters te voorkomen (of op zijn minst te verminderen). Voor andere attinesoorten zijn stoffen handschoenen optioneel.
  3. Breng de tuinmonsters over naar een schone plastic bak met een laag gips om de vochtigheid van de tuin in evenwicht te houden. Na het overbrengen van de tuin- en mierenwerkers, sluit u de recipiënt hermetisch af om uitdroging van het monster te voorkomen. Bewaar tuinmonsters bij 23-25 °C tot verwerking.
  4. Sluit de sleuf af met eerder verwijderde grond.

figure-protocol-1
Figuur 2: Protocol voor de voorbereiding van het monster. (A) Bemonstering van veldkolonies. (B) Verwerking van monsters. (C) Korte grondbeginselen en workflow voor monstervoorbereiding: 1. Fixatie: voor het versterken en behouden van de monsterstructuur. 2. Dehydratatie: het watergehalte van de monsters wordt omgewisseld voor ethanol. 3. Drogen op kritiek punt: vloeibare CO2 vervangt ethanol en wordt verdampt. 4. Montage: monster weergegeven voor analyse. 5. Sputtercoating met goud: voorkom het opladen van monsters. 6. Beeldvorming. Illustraties en foto's door Mariana Barcoto. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Reagentia

OPMERKING: Houd er rekening mee dat de volgende oplossingen van tevoren moeten worden voorbereid.

  1. Bereid 0,2 M natriumcacodylaatbuffer voor. Los hiervoor 42,8 g natriumcacodylaat op in 800 ml gedestilleerd water, roer tot het is opgelost en stabiliseer de pH op 7,2 (pas indien nodig de pH aan met zoutzuur). Vul het volume van de oplossing aan tot 1 l door gedestilleerd water toe te voegen. Bewaar de oplossing bij 4 °C (gedurende ~1 maand).
    LET OP: Glutaaraldehyde en paraformaldehyde zijn giftig en moeten in een zuurkast worden behandeld. Draag altijd nitrilhandschoenen en een veiligheidsbril tijdens het hanteren van dergelijke reagentia.
  2. Bereid Karnovsky's fixatief voor (aangepast van Karnovsky)47. Voeg hiervoor 10 ml 25% glutaaraldehyde waterige oplossing en 10 ml 20% paraformaldehyde waterige oplossing toe aan 25 ml 0,2 M natriumcacodylaatbuffer en meng. Voeg 1 ml 0,1 M calciumchloride (CaCl2) toe en vul het volume aan tot 100 ml door gedestilleerd water toe te voegen. Bewaar de oplossing bij 4 °C (maximaal 1 maand).
    LET OP: Het fixeermiddel van Karnovsky is schadelijk bij inademing en kan huid- en oogirritatie veroorzaken. Vermijd dus het inademen van dampen, gebruik het alleen buitenshuis of in een goed geventileerde ruimte. Draag altijd nitrilhandschoenen en een veiligheidsbril bij het hanteren van de oplossing.
  3. Gebruik absolute ethanol (analytische kwaliteit) om 30%, 50%, 70% en 90% ethanoloplossingen in gedestilleerd water te bereiden; 100% ethanol is ook vereist.

3. Fixatie van het monster

OPMERKING: Fixatieven verharden en conserveren monsters, met behoud van morfologische kenmerken. Aldehyden (zoals paraformaldehyde en glutaaraldehyde) zijn niet-stollingsbindende fixatieven van het verknopingstype, die verknopingsverbindingen induceren binnen en tussen eiwitten en nucleïnezuren48.

  1. Verwijder werksters, eieren, poppen en larven uit de tuinmonsters met behulp van een entomologische tang (Figuur 2B). Zet tuinfragmenten niet groter dan 5 mm3 uit elkaar. Voeg de fragmenten toe aan een buis van 2 ml (Figuur 2C).
  2. Gebruik een glazen pasteurpipet om ~1 ml Karnovsky-fixeeroplossing toe te voegen aan de buisjes met de monsters (zorg ervoor dat het monster volledig bedekt is). Meng door het monster zachtjes te schudden om het te laten weken en incubeer het gedurende ten minste 24 uur bij 4 °C alvorens de verwerking van het monster voort te zetten (figuur 2C.1).
    OPMERKING: Wanneer de volgende dehydratatiestappen niet onmiddellijk na de fixatie worden uitgevoerd, kan het protocol in deze stap worden gepauzeerd en kunnen monsters ~1 jaar bij 4 °C worden bewaard.
    We raden aan om een Pasteur-glazen pipet te gebruiken, omdat deze is samengesteld uit een inert materiaal en gemakkelijker schoon te maken is voor hergebruik achteraf. Tuinmateriaal is zeer hydrofoob en heeft de neiging om over het oppervlak van de fixatieve oplossing te zweven. Het duurt meestal tot 5 minuten voordat het fixatief volledig in het fixatief is gedrenkt. Zorg ervoor dat het fixeermiddel de tuinfragmenten bedekt, omdat het volume de neiging heeft te verminderen wanneer het de poriën van het monster binnendringt. We hebben empirisch geverifieerd dat nadat het monster was geweekt en nat was geworden, de componenten (in het bijzonder het delicate schimmelmycelium) vatbaar werden voor verbrijzeling wanneer het verder werd gemengd. Daarom raden we aan om het schudden van de monsters zoveel mogelijk te vermijden.

4. Monster uitdroging

OPMERKING: De ethanolwasserie verwisselt het water in monsters geleidelijk voor ethanol. Het is belangrijk om te beginnen met een ethanoloplossing met een lage concentratie (zie hieronder) om te voorkomen dat dergelijke delicate monsters overmatig worden beschadigd of instorten49.

  1. Verwijder de fixeeroplossing van Karnovsky volledig met behulp van een glazen pipet en zorg ervoor dat u het monster niet verstoort (Figuur 2C.1).
    OPMERKING: Gooi het fixeermiddel van Karnovsky weg in een recipiënt dat correct is geëtiketteerd voor het beheer van giftige chemische residuen.
  2. Voeg onmiddellijk na het verwijderen van het fixeermiddel 1 ml 30% ethanol toe, zorg ervoor dat het monster niet wordt verstoord, en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (Figuur 2C.2).
    OPMERKING: Monsters moeten altijd in oplossing worden gedrenkt. Zorg ervoor dat u snel oplossingen vervangt tijdens de geleidelijke wasserie ethanol. Omdat de tuin zijn poreuze aspect verliest en zich op de bodem van de buis ophoopt, is 1 ml ethanol meestal voldoende om het monster te bedekken (wanneer het monster niet groter is dan 5 mm3). Als de monsters echter niet volledig bedekt zijn, voeg dan ethanol toe totdat het monster volledig bedekt is.
  3. Verwijder 30% ethanol volledig met een glazen pipet en zorg ervoor dat u het monster niet verstoort. Gooi 30% ethanol op de juiste manier weg.
    OPMERKING: Gooi voor de hele serie geleidelijke wasbeurten van ethanol ethanol weg in een recipiënt dat op de juiste manier is geëtiketteerd voor het beheer van giftige chemische residuen.
  4. Voeg 1 ml 50% ethanol toe en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder 50% ethanol volledig met een glazen pipet en zorg ervoor dat u het monster niet verstoort. Gooi 50% ethanol op de juiste manier weg.
  5. Voeg 1 ml 70% ethanol toe en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder 70% ethanol volledig met een glazen pipet en zorg ervoor dat u het monster niet verstoort. Gooi 70% ethanol op de juiste manier weg.
    OPMERKING: Bij de wasstap van 70% ethanol kan de gebruiker het protocol indien nodig pauzeren, aangezien monsterbuisjes een nacht bij 4 °C kunnen worden bewaard, wanneer het materiaal niet onmiddellijk wordt verwerkt.
  6. Voeg 1 ml 90% ethanol toe en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder 90% ethanol volledig met een glazen pipet en zorg ervoor dat u het monster niet verstoort. Gooi 90% ethanol op de juiste manier weg.
  7. Voeg 1 ml 100% ethanol toe en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder 100% ethanol volledig met een glazen pipet en zorg ervoor dat het monster niet wordt verstoord. Gooi 100% ethanol op de juiste manier weg.
  8. Breng de monsters met behulp van een tang en/of een spatel voorzichtig over in monstercontainers voor de Critical Point Dryer (CPD), met monsteridentificatielabels (eerder gemaakt van papier en potlood). Om uitdroging van de monsters te voorkomen, wordt deze overdracht uitgevoerd met de container in een petrischaal bedekt met 100% ethanol.
  9. Doe de deksels op de bakjes en dompel ze onder in een glazen bekerglas met schaalverdeling dat 100% ethanol bevat, genoeg om de bakjes onder te dompelen. Dek het glazen bekerglas af en broed gedurende 10 minuten op kamertemperatuur; Gooi vervolgens 100% ethanol op de juiste manier weg.
  10. Breng de monsterrecipiënten over in een ander glazen bekerglas met schaalverdeling dat voldoende 100% ethanol bevat om de recipiënten onder te dompelen. Dek het glazen bekerglas af en broed gedurende 10 minuten op kamertemperatuur; Breng vervolgens de monstercontainers over naar de droger voor kritieke punten.
    OPMERKING: Na de wasserie moeten glazen pipetten en bekers overvloedig worden gespoeld met gedestilleerd water en dit restwater moet worden weggegooid in een recipiënt dat op de juiste manier is geëtiketteerd voor het beheer van giftige chemische residuen. Na het spoelen kunnen glazen voorwerpen worden gewassen met een neutraal schoonmaakmiddel, worden afgespoeld met kraanwater en aan de lucht worden gedroogd.

5. Het kritieke punt drogen

OPMERKING: Een Critical Point Dryer verwisselt de ethanol in monsters voor vloeibare kooldioxide (CO2), die bij hogere temperatuur en druk uit het monster verdampt. Volg de instructies van de fabrikant voor dergelijke procedures.

  1. Schakel de apparatuur in.
  2. Open de kamer, plaats de monstercontainers erin en voeg 100% ethanol toe totdat het de containers bedekt. Sluit de kamer.
  3. Activeer de optie Koelen en wacht tot de temperatuur 10 °C bereikt.
  4. Open de CO2 -cilinderklep en activeer de Stirrer-optie .
  5. Activeer de optie CO2 in en controleer altijd de kamer om te controleren hoeveel CO2 deze al heeft gevuld. Wanneer de kamer bijna gevuld is, deactiveert u de CO2 in-optie en activeert u de Exchange-optie , waarbij u deze geactiveerd houdt totdat er voldoende CO2 is om de containers te bedekken. Zorg ervoor dat de containers altijd bedekt zijn met CO2 (dwz deactiveer de vervangingsoptie voordat alle CO2 de kamer heeft verlaten). Herhaal stap 5.5 6x.
  6. Activeer CO2 nog een laatste keer en vul de kamer totdat de containers bedekt zijn.
  7. Activeer de optie Warmte en deactiveer de optie Roerder . Sluit de CO2 -cilinderklep.
  8. Wacht tot de temperatuur stijgt tot 35 °C; activeer vervolgens de optie Gas uit .
    OPMERKING: Bij ongeveer 30 °C bereikt de kamer een druk van 70-80 bar, waardoor het kritieke punt wordt bereikt waar de vloeistof verdwijnt.
  9. Wanneer de kamerdruk 1 bar bereikt, is alle gasinhoud verwijderd. Open de kamer en verwijder de containers.
  10. Schakel de apparatuur uit.

6. Bevestiging

  1. Bereid SEM-monsterhouders voor (d.w.z. aluminium stompjes; Figuur 2C.4).
    1. Wikkel de stompjes in een stuk aluminiumfolie en bedek alleen de bovenkant, om het schoonmaken van de stomp na de analyse te vergemakkelijken.
    2. Identificeer de stubs door de voorbeeldcode/het voorbeeldcode/nummer op de bodem van de houder te schrijven, zodat de identificatie van wat er bovenop wordt geplaatst wordt gegarandeerd.
    3. Bedek het bovenste gedeelte met dubbelzijdige carbontape. Plaats de stompjes in een preparaathouder.
  2. Open het deksel van de monstercontainer en breng het gedroogde monster voorzichtig met een tang en spatel over in een glazen petrischaaltje.
    OPMERKING: Kritieke, in punt gedroogde tuinen hebben de neiging om samen te klontereren en sterk opeengepakte monsters te vormen die zorgvuldig moeten worden gescheiden als fragmenten die niet groter zijn dan 1 mm3.
  3. Plaats de fragmenten voorzichtig op het kleverige oppervlak van de met tape bedekte stomp. Zodra het tuinfragment de tape raakt, is het erg moeilijk om het te (her)verwijderen, dus pas op dat u het niet op ongewenste plaatsen of posities plaatst. Voeg maximaal negen fragmenten per stomp toe.
  4. Herhaal stap 6.2 en 6.3 voor elk monster.

7. Sputtercoating met goud

OPMERKING: Het coaten van het monster is vereist om te voorkomen dat het wordt opgeladen. Volg de instructies van de fabrikant voor het aanpassen van instellingen, zoals de gasdruk in werking (0.5 × 10-1 mm Hg gasdruk in dit protocol), de sputtertijd (220 s), dikte van de goudlaag (~120 Å), de stroom (50 mA) en de voltage voeding. Sputteren heeft de neiging om een gemeenschappelijke workflow te volgen, hoewel de apparatuur van verschillende fabrikanten iets anders kan werken.

  1. Open de scharnierende doelarm en plaats de stompjes op de monstertafel.
  2. Sluit de scharnierende doelarm en controleer of het splinterschild van de glazen vacuümkamer goed is ingebed.
  3. Open de argonflesklep en schakel de hoofdschakelaar in.
  4. Volg de vacuümstijging op het display van de apparatuur totdat deze de markering van 0.5 × 10-1 mm Hg op het display bereikt; activeer vervolgens Spoelen. Herhaal de handeling 5x.
  5. Schakel het watercirculatiesysteem in, activeer de optie HV On en open het goudfilmdeksel. Controleer of de plasmakleur roze is. Om dit protocol te volgen, stelt u 220 s sputteren in met een spanning van 50 mA, waardoor een goudlaag van ~120 Å (12 nm) wordt afgezet.
  6. HV On wordt automatisch uitgeschakeld. Schakel het watercirculatiesysteem uit en sluit het deksel van de goudfilm.
  7. Zet de hoofdschakelaar uit, zodat er lucht in de vacuümkamer kan komen. Herhaal voor tuin- en afvalmonsters stap 7.1-7.7 3x.
    OPMERKING: Als de beeldvorming niet onmiddellijk na de voorbereiding van het monster plaatsvindt, bewaar de stompjes dan in een hermetische container gevuld met een silicalaag om te voorkomen dat de monsters opnieuw worden gehydrateerd.

8. Beeldvorming

NOTITIE: Volg de instructies van de fabrikant voor het aanpassen van SEM-instellingen, zoals de diameter van de objectiefopening, de bedrijfsspanning, de uitlijning van het elektronenbundelsysteem, de axiale uitlijning en de stigmators.

  1. Plaats de stompjes in de monsterhouder en maak aantekeningen over de positie van elk monster.
    NOTITIE: Draag handschoenen bij het plaatsen of verwijderen van de monsterhouder en houd de houder zo schoon mogelijk.
  2. Start de besturingssoftware vanaf het bureaublad.
  3. Selecteer de instrumentinstellingen. Visualiseer tuinmonsters met een objectieve diafragmadiameter van 30 μm (d.w.z. in de tweede fase), werkend in hoog vacuüm, detecteren van signalen van secundaire elektronen (SED), versnellen van spanning van 20 kV, werkafstand van 15 - 20 mm, sondestroom van 40,0 (in hoge stroommodus) en variëren van de vergroting op basis van het monster.
  4. Volg de navigatie-instructies, druk op het ontluchtingspictogram en wacht tot de monsterkamer wordt ontlucht. Een voortgangsbalk geeft de vacuümstatus aan.
  5. Wanneer de atmosferische druk is bereikt, opent u de monsterkamer en plaatst u voorzichtig de monsterhouder.
  6. Sluit de kamerdeur voorzichtig en druk op het Evac-pictogram om het instrument te evacueren, waarbij u de vacuümstatus volgt via de voortgangsbalk. Het navigatiesysteem toont de positie van de bewegende etappe en geeft een houdergrafiek wanneer de beweging is voltooid. Druk op het camerapictogram om een foto van de houder op te nemen om een bovenaanzicht te krijgen dat helpt bij het navigeren tussen monsters tijdens het beeldvorming.
  7. Druk op het pictogram Observatie om het elektronenkanon in te schakelen en wacht tot het beeld zich vormt. Gebruik de handmatige gebruikersinterface (handmatige bediening) om de Z-as handmatig naar de juiste hoogte te verplaatsen (op basis van de monsterhoogte en de bepaalde werkafstand).
    NOTITIE: Om de levensduur van de wolfraamgloeidraad te verlengen, pauzeert u de observatiefunctie wanneer u niet actief beeldt.
  8. Gebruik de opties die op het scherm worden weergegeven of de handmatige bediening om de rastersnelheid en afbeeldingspositie te wijzigen. Verplaats het podium om een grondig beeld van het monster te krijgen, waarbij de RDC-functie wordt gebruikt om zich op specifieke gebieden te concentreren. Bij het observeren van een doelstructuur (of een interessante) structuur, past u de vergroting, focus, helderheid, contrast en stigmatisering dienovereenkomstig aan. Corrigeer stigmatisering door de handmatige gebruikersinterface te gebruiken om het podium in de X- en Y-richting te verplaatsen.
    1. Pas de vergroting aan tussen 100x en 700x om algemene tuinaspecten te visualiseren (zoals hyfhaldichtheid, substraat en kolonisatiepatronen).
    2. Pas de vergroting aan tussen 700x en 1.500x om de ruimtelijke patronen van de microbiota te visualiseren.
    3. Pas de vergroting aan tussen 1.500x en 3.000x om de fysische interacties van de microbiota en de biofilm te observeren.
    4. Pas de vergroting aan tussen 3.000x en 4.000x om scherp te stellen op specifieke microbiële clusters.
  9. Om een afbeelding op te slaan, gebruikt u de functie Bevriezen , klikt u op het pictogram Foto en stelt u het bestandspad in. Analyseer standaard ten minste drie tuinfragmenten en beeld ze elk af in alle vergrotingsbereiken die in stap 8.8 worden genoemd. Dit resulteert in ten minste 12 afbeeldingen per steekproef, hoewel meer afbeeldingen meer gedetailleerde beschrijvingen kunnen ondersteunen. We raden aan dat 15-25 afbeeldingen per monster, waarbij alle vergrotingen in stap 8.8 worden gevarieerd, de neiging hebben om fijne details te bieden voor de beschrijving van het monster.
    OPMERKING: Het rasteren en opslaan van een afbeelding duurt enkele seconden, waarbij trillingen op de zwevende SEM-tafel moeten worden vermeden.
  10. Nadat u klaar bent met beeldvorming, drukt u op de optie Vent om de kamer te ontluchten, waarbij u de vacuümstatus volgt via de voortgangsbalk. Verwijder voorzichtig de houder, sluit de kamerdeur voorzichtig en druk op Evac om de kamer te evacueren.
  11. Zodra de evacuatie is voltooid, verlaat u de bedieningssoftware.
  12. Pas de helderheid en het contrast aan om de visualisatie te verbeteren met behulp van een afbeeldingseditor.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteerden we een vereenvoudigd protocol om de componenten van attine tuin- en afvalmonsters, zoals schimmeldraden, substraat, microbiota en biofilms, te visualiseren. SEM heeft ons begrip vergroot van hoe de tuin en het afval de structurele patronen van de microbiota ondersteunen (Figuur 3). In attinetuinen zijn schimmeldraden, takachtige structuren die delen van het substraatoppervlak bedekken. Aangezien schimmeldraden vaak erg gevoelig zijn voor uitdroging en scheuren, kan de gebruiker zich laten leiden door het schimmeldradenaspect om de resultaten van de monstervoorbereiding te evalueren. Zoals ook in eerdere werken 32,33,45 is opgemerkt, vertonen hyfen een buisvormig aspect; intacte, buisvormige hyfen duiden op een effectieve monstervoorbereiding (Figuur 3A en Figuur 4C). Wanneer hyfen lintvormig zijn, is een dergelijke afplatting mogelijk een artefact van de techniek (Figuur 4C).

De oppervlakken van het plantsubstraat zijn te herkennen aan de schubbenlaag en epidermale lagen, maar ook aan huidmondjes en trichomen. Dergelijke structuren zijn beter herkenbaar wanneer substraten nog niet zijn gekoloniseerd door de schimmeldraden en de microbiota (Figuur 3A en Figuur 4C). Wanneer het substraat wordt gekoloniseerd, bedekken de microbiota en/of schimmeldraden het oppervlak zodat specifieke plantstructuren niet gemakkelijk te onderscheiden zijn (Figuur 3A). De microbiota kan de schimmeldraden of het substraat koloniseren, elk van deze in een schijnbaar verschillende ruimtelijke organisatie. In Figuur 3 werden dergelijke ruimtelijke patronen schematisch geïllustreerd en omkaderd in respectievelijke SEM-afbeeldingen waar ze werden geïdentificeerd; dit kan het verband tussen SEM-resultaten en de interpretatie ervan vergemakkelijken.

Hyphal-koloniserende microbiota worden minder vaak waargenomen en wanneer ze worden gevonden, zijn ze samengesteld uit staaf- of coccoïde cellen die geïsoleerd of in kleine groepen aan het hyphaloppervlak zijn bevestigd. Biofilm exopolysaccharidische matrix (EPS), die eruitziet als een "kantstof"-structuur, kan worden waargenomen rond hyfen in kleine klonten (Figuur 3A). Vrij gebruikelijker is de substraatkoloniserende microbiota, die wordt aangetroffen in tuinen van verschillende attinemierensoorten. Kolonisatiepatronen lijken tot op zekere hoogte te worden bepaald door de stadia van substraatverslechtering. Dus, tijdens het koloniseren van nog niet-gedegradeerde substraten, kan de microbiota ofwel als individuele cellen voorkomen of zich in kleine groepen verzamelen. De microbiota kan het substraat in lagen aanbrengen wanneer het microscopisch kleine tekenen van achteruitgang vertoont (d.w.z. wanneer de cuticulaire/epidermale lagen van de plant en andere plantstructuren niet waarneembaar zijn en er veel groeven en inkepingen zijn).

In deze "microbiële matten" is de morfologie van cellen beter herkenbaar wanneer de EPS-matrix afwezig is. In gevallen waarin microbiële cellen zijn ingebed in de EPS-matrix, is hun morfologie niet gemakkelijk te onderscheiden. Afhankelijk van hun ruimtelijke organisatie hebben we de biofilms gekarakteriseerd als "verspreid" of als "3-dimensionaal". Wanneer de biofilm wordt verspreid, bedekken microbiële cellen en de EPS-matrix met tussenpozen het substraatoppervlak en vormen ze een platte laag van 1-3 cellen dik (Figuur 3B). Wanneer de biofilm 3-dimensionaal is, stapelen microbiële cellen en de EPS-matrix zich op en vormen clusters met verschillende celdiktes. Tuingebieden gevormd door verslechterde substraten (zoals oude tuinen en afvalstoffen) beschermen de microbiota in zijn groeven en inkepingen, waar ze dikke gemeenschappen vormen (Figuur 3C). Met name de sterk gedegradeerde substraten in afvalmonsters herbergen een overvloedige microbiota, de morfologisch meest diverse van alle regio's. Gisten voegen meer complexiteit toe aan deze gemeenschap en hebben fysieke interactie met de prokaryoten via biofilm. In Atta sexdens en Acromyrmex sp. afvalmonsters werden de EPS-matrices waargenomen die een opvallend fibrillair netwerk vormden rond staafvormige en coccoïde prokaryoten, evenals spoelvormige en bolvormige gisten (Figuur 3C).

Als gevolg van een verweven netwerk van schimmeldraden, vereist de sponsachtige structuur van de tuin extra sputteren om het monster gelijkmatiger te coaten. Dergelijke stappen vermijden de elektronenverstrooiing die het beeld vervormt en de resolutie belemmert (Figuur 4A). Door de voorbereidingsstappen van het monster werd het grootste deel van de tuinstructuur bewaard en werd de ruimtelijke verdeling en organisatie van de microbiota onthuld. Het is echter de moeite waard om te herhalen dat structuren zoals schimmeldraden en EPS-matrix zeer gevoelig zijn voor uitdroging en zeer moeilijk te behouden zijn, vooral voor SEM. De hyphalstructuur was relatief goed bewaard gebleven, maar het is redelijk om aan te nemen dat de biofilm die in sommige tuinmonsters werd gevisualiseerd, enkele structurele componenten van de EPS-matrix zou kunnen missen. Hoewel de gladde buitenste laag polysachariden die de microbiota omhult, in sommige monsters bewaard was gebleven (Figuur 3A, B), hadden sommige ervan de morfologische kenmerken van de microbiota behouden, maar hadden ze geen EPS-matrix. Het is echter niet duidelijk of de EPS-matrix inderdaad afwezig was of dat deze tijdens de monstervoorbereiding is verwijderd.

Aan de ene kant schaadt het verwijderen van de gladde laag van de biofilm het begrip van de precieze biofilmstructuur. Aan de andere kant onthult het de morfologie, ruimtelijke organisatie en fysieke interacties van cellen die onder de laag wonen, wat onze belangrijkste onderzoeksfocus is. Eerdere studies rapporteerden het behoud van zowel schimmeldraden als de biofilmmatrix door gebruik te maken van osmiumtetroxide (OsO4) damp als het primaire fixatief 44,50,51,52,53,54. Vervolgens voerden we een vergelijkend experiment uit waarbij verse tuinmonsters werden gefixeerd met OsO4-damp, waardoor blijkbaar het gladde aspect van biofilms behouden bleef (Figuur 4B). Deze methode veroorzaakte echter een uitgebreide afplatting van schimmeldraden en microbiota. Deze afvlakking resulteerde in het verlies van algemene ruimtelijke aspecten van de tuin die eerder beschrevenwaren 29,33,32,45, waardoor verder onderzoek naar structurele patronen van de tuin werd beperkt. Fixatie met OsO4 maakte het moeilijk om zowel de microbiële morfologie en distributie te onderscheiden als om celstructuren te onderscheiden van technische artefacten, waardoor de interpretatie van de gegevens werd bemoeilijkt.

figure-results-1
Figuur 3: Architecturale patronen van de microbiota. De microbiota koloniseert ofwel de schimmeldraden als het substraat in een duidelijke ruimtelijke organisatie. Dergelijke ruimtelijke patronen werden schematisch geïllustreerd en werden omkaderd bij de respectievelijke SEM-afbeeldingen waar ze werden geïdentificeerd (in de figuur afgebakend door witte vierkanten): (A) Hyphal-koloniserende microbiota zijn samengesteld uit geïsoleerde of kleine groepen cellen, met biofilm exopolysaccharidische matrix die in sommige monsters kan worden gedetecteerd. (B) Substraatkoloniserende microbiota verspreiden zich door het substraat, waarbij de EPS-matrix de cellen bedekt zodat hun morfologie niet gemakkelijk te onderscheiden is. (C) Substraatkoloniserende microbiota die 3-dimensionale groepen vormen, die mono- of multimorfologische biofilms vormen, in sommige gevallen die de EPS-matrix bewijzen. Illustraties door Mariana Barcoto. Afkorting: EPS = exopolysaccharidic matrix. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 4: Vruchteloze beeldvorming. Afbeeldingen van lage kwaliteit die ineffectieve resultaten opleveren en/of de interpretatie van architecturale patronen belemmeren. (A) Elektronenverstrooiing vervormt het beeld, waardoor de resolutie en bijgevolg de morfologische identificatie worden belemmerd. Dit werd vaak waargenomen in monsters die slechts één keer met sputters waren gecoat en werd verminderd door extra coating. (B) Het fixeren van verse tuinmonsters met osmiumtetroxide (OsO4) damp als primair fixeermiddel 44,50,51,52,53,54 behield blijkbaar het gladde aspect van biofilms. Het veroorzaakte echter uitgebreide afvlakking van schimmeldraden en microbiota, waardoor architecturale patronen in de tuin werden beschadigd. (C) Monstervoorbereiding met behulp van Karnovsky's fixatief leverde beelden van hogere kwaliteit op in vergelijking met preparaten met OsO4, waarbij het grootste deel van de hyfhalstructuur, de verdeling van de microbiota en de ruimtelijke patronen van tuinen behouden bleven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SEM gebruikt een elektronenbundel om het monster te scannen en genereert er een vergroot beeld van, zodat men driedimensionale microstructuren in hoge resolutie kan visualiseren. Aangezien SEM onder hoog vacuüm werkt, is het verwijderen van tot/meer dan 99% van het water uit monsters vereist. In de SEM-vacuümkamer kunnen gedeeltelijk gehydrateerde monsters uitdrogen en instorten, naast het verstrooien van elektronen. Voor beeldvorming met hoge resolutie in SEM moet de monstervoorbereiding procedures bevatten voor het verwijderen van water terwijl de veranderingen in volume en morfologie tot een minimum worden beperkt, evenals een coating om opladen tijdens beeldvorming te voorkomen 55,56,57.

Eerst wordt het monster chemisch gefixeerd door de eiwitten en nucleïnezuren te verknopen, wat wordt bereikt door diverse technieken. Een veelgebruikte methode is het combineren van glutaaraldehyde en formaldehyde (of paraformaldehyde) in een buffer, zoals piperazine-1,4-bis [2-ethaansulfonzuur] (PIPES); N-[2-hydroxyethyl]-piperazine-N'-2-ethaansulfonzuur (HEPES); fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS); of natriumcakodylaat. Chemische fixatie versterkt het monster en behoudt de structuur voor drogen. Afhankelijk van hun aard kunnen monsters een secundaire fixatie (in osmiumtetroxide) en zelfs een tertiaire fixatie (in uranylacetaat) nodig hebben. Ten tweede moeten monsters worden gedehydrateerd. Aangezien drogen aan de lucht een grote instorting van fijne structuren veroorzaakt, is een veelgebruikte alternatieve techniek kritische puntdroging (CPD). Bij CPD wordt het monster niet onderworpen aan oppervlaktespanning, waardoor de vorming van artefacten wordt voorkomen. Aan de ene kant bereikt het water het kritieke punt bij 228,5 bar en 374 °C, waardoor het monster gemakkelijk zou worden vernietigd. Aan de andere kant is het CO2 -kritische punt 73,8 bar en 31 °C, wat het gebruik ervan als overgangsvloeistof rechtvaardigt. Bij het verhogen van de temperatuur wordt CO2 omgezet in gasvorm en uit het monster verwijderd 58,59,60,61,62,63. Ten derde moeten niet-geleidende monsters worden gecoat om te voorkomen dat ze worden opgeladen en om de secundaire elektronenopbrengst te verhogen, wat bijgevolg bijdraagt aan het verkrijgen van scherpe beeldsignalen64.

Het hier gepresenteerde protocol combineert procedures voor het bewaren van monsters op basis van schimmels 32,33,45,65,66,67,68 en biofilms 69,70, hoewel het proces wordt vereenvoudigd door postfixatiestappen te verwijderen en de uitdrogingstijd te verkorten. Toch behield het de delicate tuinstructuur, waarbij de fysieke interacties van de microbiota verder werden beschreven en de ruimtelijke structuur van de biofilm werd onthuld. De ruimtelijke assemblage van microbiota is essentieel voor zowel het tot stand brengen van interacties als het instellen van hun regulerende patronen. Ruimtelijke verdeling geeft vorm aan de microbiële sociale dynamiek, waaruit intrinsieke eigenschappen kunnen voortkomen. Deze zijn nodig om het hoofd te bieden aan de variabiliteit en complexiteit waarmee microbiële ecosystemen worden geconfronteerd 71,72,73. Onze bevindingen versterken de microbiota die structurele patronen in de tuin integreren, wat hun veronderstelde deelname aan fysiologische reacties ondersteunt 32,42,43,44. We leverden het in situ bewijs dat biofilms relevant zijn voor microbiële interacties in de attine-schimmelcultuur42,44. Biofilms zijn complexe en heterogene meercellige systemen, waarbij micro-organismen ingebed in een zelfuitgescheiden EPS-matrix sociale netwerken vormen. Coöperatief en/of antagonistisch bepalen interacties binnen de biofilm het openen, bezetten en modificeren van niches 71,72,73,74. SEM maakte een beter begrip mogelijk van de ruimtelijke organisatie van de microbiota in de tuinregio's, waarbij de fysische interacties tussen microbiota en substraat en microbiota en hyfen werden beschreven, terwijl de methoden voor toekomstig onderzoek op dit gebied werden vereenvoudigd.

Onderzoek naar de tuinmicrobiota krijgt steeds meer aandacht, met name gericht op processen die de samenstelling van deze unieke gemeenschappen kunnen vormen75,76, evenals hun functie en interacties 42,43,44. Bacterie-schimmel gewasinteracties kunnen de schimmel helpen bij het oplossen van fosfaat, het produceren van sideroforen en het afbreken van cellulose en chitine. Dergelijke interacties, die kunnen optreden als een continuüm van mutualisme en antagonisme, zouden het functioneren van de tuin kunnen reguleren44. De methodologische benadering die we hier presenteren, maakt het mogelijk om ter plaatse een blik te werpen op de structurele dimensie waarin interacties zouden kunnen plaatsvinden. Het benadrukt dat, zoals de meeste van de reeds bestudeerde microbiële ecosystemen, attinetuinen een patroon hebben, heterogeen georganiseerd in de ruimte 5,7,8. SEM bood al in situ een ruimtelijk perspectief op de dynamiek van de microbiota in diverse gastheer-geassocieerde gemeenschappen, zoals cyanosonzen77, bultrughuid78, paddenstoelen66, cnidarians79, menselijke darm80, korstmossen81, en droegen ook bij aan de beschrijving van de plastisfeer (een nieuw antropogeen afgeleid ecosysteem)82. Elk van deze onderzoeken maakte echter gebruik van een enigszins verschillende stapsgewijze methode voor de voorbereiding van monsters.

Tuinmonsters zijn zeer delicaat en heterogeen, met schimmeldraden waarvan wordt aangenomen dat ze zijn aangepast om geen water te verliezen26, naast een gevarieerde reeks opgenomen substraten24, de microbiota en zijn biofilm. Toch heeft het monstervoorbereidingsprotocol dat we hebben aangepast de meeste van dergelijke structuren bewaard en ons in staat gesteld de karakterisering van de ruimtelijke structuur van de microbiota uit te breiden. We beschouwen fixatie op de oplossing van Karnovsky als de cruciale stap in het protocol, omdat het 3-dimensionale aspect van zo'n delicaat monster op dit punt kan instorten en/of afvlakken. Complexe monsters op basis van schimmels worden meestal voorbereid op SEM door te fixeren met glutaaraldehyde en na te fixeren met OsO4 65,66,67,68. Er is echter gemeld dat het combineren van aldehyden (paraformaldehyde en glutaaraldehyde) de conservering van biofilm verbetert voor SEM69,70. Methoden voor het conserveren van biofilms kunnen ook 0,15% Alcian Blue of 0,15% Ruthenium Red omvatten voor het initiële fixeermiddel van Karnovsky, evenals 1% looizuur tot 1% osmium voor postfixatie. Het fixeren van attine tuinen en afval met Karnovsky's en het nafixeren met OsO4 geconserveerde bacteriën in oude tuin- en afvalmonsters, hoewel het de biofilm32 niet bewijst. Omdat onze monsters de tuinstructuur, microbiota en biofilms hadden geconserveerd zonder de osmium-postfixatiestap die in eerdere protocollen 32,33,69,70 werd gebruikt, gaven we er de voorkeur aan het protocol te vereenvoudigen door deze stap te verwijderen. OsO4 is een oxidatiemiddel dat wordt gebruikt voor het fixeren van (vooral) lipide celcomponenten83. Omdat het zeer corrosief is, kan OsO4 ernstige brandwonden veroorzaken bij contact met huid en slijmvliezen, naast beschadiging van de luchtwegen of het maagdarmkanaal bij inademing of inname84,85. Door de OsO4 post-fixatie te verwijderen, vermindert het protocol bijgevolg het aantal te manipuleren toxische regenten.

We raden ook de ethanolwasserie aan in plaats van aceton, wat te hard kan zijn voor delicate monsters86. De ethanolwasserie met stappen van 10 minuten vereenvoudigt ook de voormalige SEM-protocollen45 zonder de beeldresolutie te belemmeren. Bovendien hebben we empirisch geverifieerd dat extra sputterstappen beelden van hogere kwaliteit opleverden, wat consistent was voor tuinmonsters van alle soorten die we hebben getest. Dergelijke extra stappen bedekten de monsters mogelijk gelijkmatiger, omdat elektronenverstrooiing veel vaker voorkwam in monsters die slechts één keer werden gecoat (Figuur 4A). Daarom moedigen we toekomstig werk aan bij het testen van additieven en omstandigheden die een verbeterd protocol voor biofilmvisualisatie in tuinmonsters zouden kunnen opleveren.

SEM is een krachtig hulpmiddel voor het detailleren van de cellulaire morfologie van de microbiota en de ruimtelijke rangschikking van EPS in oppervlakken, waarbij de topografie en textuur van tuinmonsters in hoge resolutie en vergroting worden onthuld70,87. Toch biedt het geen taxonomische discriminatie voor de leden van de gemeenschap, en bijgevolg hebben we geen onderscheid tussen wie waar is. Verder geeft het, ondanks de grote brandpuntsdiepte van SEM, geen informatie over de 3-dimensionale kenmerken van het monster. Voor een volledige beschrijving van de attine microbiële tuin, inclusief taxonomische biogeografie en 3-dimensionale ruimtelijke resolutie, kan SEM-analyse worden beschouwd als een eerste procedure in stapsgewijze beeldvormingstechnieken voor tuinmonsters. Voor taxonomische resolutie kan SEM worden gekoppeld aan fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)88,89 en zijn varianten, zoals FISH (HiPR-FISH)90 met hoge fylogenetische resolutie, combinatorische labeling en spectrale beeldvorming FISH (CLASI-FISH)9,91, en 3D-projecties92. Driedimensionale microstructuuranalyse kan verder worden gedetailleerd door middel van röntgenmicrotomografie (röntgenμCT)93. Tot nu toe heeft SEM ons in staat gesteld om de ruimtelijke organisatie van de microbiota rond hyfen en in het substraatoppervlak, groeven en inkepingen in detail te observeren. Dergelijke microbiële patronen vergroten onze kennis van vermeende microbiële interacties in attinetuinen. Wij zijn van mening dat de voorbereidende stappen die we hebben gepresenteerd, op grote schaal kunnen worden toegepast om studies naar microbiële ruimtelijke organisatie in andere delicate microbiële ecosystemen te verfijnen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) bedanken voor het verstrekken van financiële steun (Grant #2019/03746-0). MOB bedankt voor PhD-beurs ontvangen van FAPESP (proces 2021/08013-0) en Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brazilië (CAPES) - Finance Code 001. AR bedankt ook Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) voor een onderzoeksbeurs (#305269/2018). De auteurs willen Marcia Regina de Moura Aouada en Antonio Teruyoshi Yabuki bedanken voor hun hulp bij pilottests voor de voorbereiding van monsters, Renato Barbosa Salaroli voor technische assistentie en Enzo Sorrentino voor hun hulp bij het maken van foto's. Deze studie werd uitgevoerd onder de toegangsvergunning genetisch erfgoed # SISGen AA39A6D.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2 mL tubeAxygenMCT-200-C-BRAOm monsters te fixeren en te dehydrateren
Calcium chloride anhydrousMerckC4901CaCl2 anhydrous voor het bereiden van Karnovsky’s fixatief
Critical point dryerLeicaEM CPD 300Voor drogen op kritisch punt
Double Sided Carbon Conductive Tape, 12 mm (W) X 5 M (L)Electron Microscopy Sciences77819-12Voor het bevestigen van monsters
Entomological forcepsGeen specifieke leverancierOm tuinmonsters te manipuleren
Ethyl alcohol (=ethanol), puur (≥99,5%)Sigma-Aldrich459836Voor dehydratatie
ForcepsGeen specifieke leverancierOm tuinmonsters te manipuleren
Glass beakerGeen specifieke leverancierVoor dehydratatie
Glass Petri dishGeen specifieke leverancierOm tuinmonsters te manipuleren
Glass pipetteGeen specifieke leverancierOm monsters te fixeren en te dehydrateren
Glutaraldehyde (Aqueous Glutaraldehyde EM Grade 25%)Electron Microscopy Sciences16220Voor het bereiden van Karnovsky’s fixatief
Gold target Ted Pella, Inc.8071Om te sputter coaten met goud
Hydrochloric acidSigma-Aldrich320331Voor het aanpassen van de pH van oplossingen
Image editorPhotoshopelke versieOm afbeeldingen aan te passen
Paraformaldehyde (Paraformaldehyde 20% Aqueous Solution EM Grade)Electron Microscopy Sciences15713Voor het bereiden van Karnovsky’s fixatief
Propilene recipientGeen specifieke leverancierVoor het onderhouden van levende mierenkolonies
Scanning Electron MicroscopeJEOL IT300 SEMVoor beeldvorming van monsters 
Sodium cacodylate trihydrateSigma-AldrichC0250Voor het bereiden van natriumcacodylaatbuffer
SpatulaGeen specifieke leverancierOm tuinmonsters te manipuleren
Specimen containers with 15 mm dia. x 10 mm highTed Pella, Inc.4591Voor drogen op kritisch punt
Sputter coaterBaltec SCD 050Om te coaten met goud
Stub (Aluminium mount, flat end pin) 12.7 mm x 8 mm Electron Microscopy Sciences75520Voor het bevestigen van monsters

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Turner, M. G. Landscape ecology: the effect of pattern on process. Annu Rev Ecol Evol Syst. 20 (1), 171-197 (1989).
  2. Rietkerk, M., Van de Koppel, J. Regular pattern formation in real ecosystems. Trends Ecol Evol. 23 (3), 169-175 (2008).
  3. Schmitz, O. J. Spatial dynamics and ecosystem functioning. PLOS Biol. 8 (5), e1000378(2010).
  4. Pringle, R. M., Doak, D. F., Brody, A. K., Jocqué, R., Palmer, T. M. Spatial pattern enhances ecosystem functioning in an African savanna. PLOS Biol. 8 (5), e1000377(2010).
  5. Wimpenny, J. W. Spatial order in microbial ecosystems. Biol Rev. 56 (3), 295-342 (1981).
  6. Martiny, J. B. H., et al. Microbial biogeography: putting microorganisms on the map. Nat Rev. Microbiol. 4 (2), 102-112 (2006).
  7. McCallum, G., Tropini, C. The gut microbiota and its biogeography. Nat Rev Microbiol. 22 (2), 105-118 (2024).
  8. Lamont, R. J., Hajishengallis, G., Koo, H. Social networking at the microbiome-host interface. Infec Immun. 91 (9), e00124-e00223 (2023).
  9. Welch, J. L. M., Rossetti, B. J., Rieken, C. W., Dewhirst, F. E., Borisy, G. G. Biogeography of a human oral microbiome at the micron scale. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (6), E791-E800 (2016).
  10. Kim, D., et al. Spatial mapping of polymicrobial communities reveals a precise biogeography associated with human dental caries. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (22), 12375-12386 (2020).
  11. Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. Spatial organization and composition of the mucosal flora in patients with inflammatory bowel disease. J Clin Microbiol. 43 (7), 3380-3389 (2005).
  12. Ibberson, C. B., Barraza, J. P., Holmes, A. L., Cao, P., Whiteley, M. Precise spatial structure impacts antimicrobial susceptibility of S. aureus in polymicrobial wound infections. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (51), e2212340119(2022).
  13. Azimi, S., Lewin, G. R., Whiteley, M. The biogeography of infection revisited. Nat Rev Microbiol. 20 (10), 579-592 (2022).
  14. Dejea, C. M., et al. Microbiota organization is a distinct feature of proximal colorectal cancers. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (51), 18321-18326 (2014).
  15. Hanson, C. A., Fuhrman, J. A., Horner-Devine, M. C., Martiny, J. B. Beyond biogeographic patterns: processes shaping the microbial landscape. Nat Rev Microbiol. 10 (7), 497-506 (2012).
  16. Adade, E. E., Al Lakhen, K., Lemus, A. A., Valm, A. M. Recent progress in analyzing the spatial structure of the human microbiome: Distinguishing biogeography and architecture in the oral and gut communities. Curr Opin Endocr. 18, 275-283 (2021).
  17. Mony, C., Bohannan, B. J., Leibold, M. A., Peay, K., Vandenkoornhuyse, P. Microbial landscape ecology: Highlights on the invisible corridors. Front Ecol Evol. 9, 753213(2021).
  18. Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Harvard University Press. (1990).
  19. Chapela, I. H., Rehner, S. A., Schultz, T. R., Mueller, U. G. Evolutionary history of the symbiosis between fungus-growing ants and their fungi. Science. 266 (5191), 1691-1694 (1994).
  20. Mueller, U. G., Rehner, S. A., Schultz, T. R. The evolution of agriculture in ants. Science. 281 (5385), 2034-2038 (1998).
  21. Mueller, U. G., Gerardo, N. M., Aanen, D. K., Six, D. L., Schultz, T. R. The evolution of agriculture in insects. Annu Rev Ecol Evol Syst. 36, 563-595 (2005).
  22. Dentinger, B. T., Lodge, D. J., Munkacsi, A. B., Desjardin, D. E., McLaughlin, D. J. Phylogenetic placement of an unusual coral mushroom challenges the classic hypothesis of strict coevolution in the Apterostigma pilosum group ant-fungus mutualism. Evolution. 63 (8), 2172-2178 (2009).
  23. Schultz, T. R., Brady, S. G. Major evolutionary transitions in ant agriculture. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 5435-5440 (2008).
  24. de Fine Licht, H. H., Boomsma, J. J. Forage collection, substrate preparation, and diet composition in fungus-growing ants. Ecol Entomol. 35 (3), 259-269 (2010).
  25. Martin, M. M. The biochemical basis of the fungus-attine ant symbiosis: A complex symbiosis is based upon integration of the carbon and nitrogen metabolisms of the two organisms. Science. 169 (3940), 16-20 (1970).
  26. Grell, M. N., et al. The fungal symbiont of Acromyrmex leaf-cutting ants expresses the full spectrum of genes to degrade cellulose and other plant cell wall polysaccharides. BMC Genomics. 14, 928(2013).
  27. Lange, L., Grell, M. N. The prominent role of fungi and fungal enzymes in the ant-fungus biomass conversion symbiosis. Appl Microbiol Biotechnol. 98, 4839-4851 (2014).
  28. Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6 (4), 389-395 (2014).
  29. Craven, S. E., Dix, M. W., Michaels, G. E. Attine fungus gardens contain yeasts. Science. 169 (3941), 184-186 (1970).
  30. De Fine Licht, H. H., Boomsma, J. J., Tunlid, A. Symbiotic adaptations in the fungal cultivar of leaf-cutting ants. Nat Commun. 5 (1), 5675(2014).
  31. Aylward, F. O., et al. Enrichment and broad representation of plant biomass-degrading enzymes in the specialized hyphal swellings of Leucoagaricus gongylophorus, the fungal symbiont of leaf-cutter ants. PLoS One. 10 (8), e0134752(2015).
  32. Moreira-Soto, R. D., Sanchez, E., Currie, C. R., Pinto-Tomás, A. A. Ultrastructural and microbial analyses of cellulose degradation in leaf-cutter ant colonies. Microbiology. 163 (11), 1578-1589 (2017).
  33. Erthal Jr, M., Silva, C. P., Cooper, R. M., Samuels, R. I. Hydrolytic enzymes of leaf-cutting ant fungi. Comp Biochem. 152 (1), 54-59 (2009).
  34. North, R. D., Jackson, C. W., Howse, P. E. Communication between the fungus garden and workers of the leaf-cutting ant, Atta sexdens rubropilosa, regarding choice of substrate for the fungus. Physiol Entomol. 24 (2), 127-133 (1999).
  35. Herz, H., Hölldobler, B., Roces, F. Delayed rejection in a leaf-cutting ant after foraging on plants unsuitable for the symbiotic fungus. Behav Ecol. 19 (3), 575-582 (2008).
  36. Schiøtt, M., De Fine Licht, H. H., Lange, L., Boomsma, J. J. Towards a molecular understanding of symbiont function: identification of a fungal gene for the degradation of xylan in the fungus gardens of leaf-cutting ants. BMC Microbiol. 8, 40(2008).
  37. Bot, A. N., Currie, C. R., Hart, A. G., Boomsma, J. J. Waste management in leaf-cutting ants. Ethol Ecol Evol. 13 (3), 225-237 (2001).
  38. Scott, J. J., et al. Microbial community structure of leaf-cutter ant fungus gardens and refuse dumps. PLOS One. 5 (3), e9922(2010).
  39. Lewin, G. R., et al. Cellulose-enriched microbial communities from leaf-cutter ant (Atta colombica) refuse dumps vary in taxonomic composition and degradation ability. PLOS One. 11 (3), e0151840(2016).
  40. Suen, G., et al. An insect herbivore microbiome with high plant biomass-degrading capacity. PLOS Genet. 6 (9), e1001129(2010).
  41. Aylward, F. O., et al. Convergent bacterial microbiotas in the fungal agricultural systems of insects. MBio. 5 (6), e02077(2014).
  42. Barcoto, M. O., et al. Fungus-growing insects host a distinctive microbiota apparently adapted to the fungiculture environment. Sci Rep. 10 (1), 12384(2020).
  43. Francoeur, C. B., et al. Bacteria contribute to plant secondary compound degradation in a generalist herbivore system. mBio. 11, e02146-e02220 (2020).
  44. Martiarena, M. J. S., Deveau, A., Montoya, Q. V., Flórez, L. V., Rodrigues, A. The hyphosphere of leaf-cutting ant cultivars is enriched with helper bacteria. Microb Ecol. 86 (3), 1773-1788 (2023).
  45. Leal-Dutra, C. A., et al. Evidence that the domesticated fungus Leucoagaricus gongylophorus recycles its cytoplasmic contents as nutritional rewards to feed its leafcutter ant farmers. IMA Fungus. 14 (1), 19(2023).
  46. Sosa-Calvo, J., Jesovnik, A., Okonski, E., Schultz, T. R. Locating, collecting, and maintaining colonies of fungus-farming ants (Hymenoptera: Myrmicinae: Attini). Sociobiology. 62 (2), 300-320 (2015).
  47. Karnovsky, M. J. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-138 (1965).
  48. Eltoum, I., Fredenburgh, J., Myers, R. B., Grizzle, W. E. Introduction to the theory and practice of fixation of tissues. J Histotechnol. 24 (3), 173-190 (2001).
  49. Gusnard, D., Kirschner, R. H. Cell and organelle shrinkage during preparation for scanning electron microscopy: effects of fixation, dehydration and critical point drying. J Microsc. 110 (1), 51-57 (1977).
  50. Surman, S. B., et al. Comparison of microscope techniques for the examination of biofilms. J Microbiol Methods. 25 (1), 57-70 (1996).
  51. Augustin, J. O., et al. Yet more "weeds" in the garden: fungal novelties from nests of leaf-cutting ants. PLOS One. 8 (12), e82265(2013).
  52. Montoya, Q. V., Martiarena, M. J. S., Polezel, D. A., Rodrigues, A. More pieces to a huge puzzle: Two new Escovopsis species from fungus gardens of attine ants. MycoKeys. 46, 97(2019).
  53. Varanda-Haifig, S. S., et al. Nature of the interactions between hypocrealean fungi and the mutualistic fungus of leaf-cutter ants. Antonie van Leeuwenhoek. 110, 593-605 (2017).
  54. Custodio, B. C., Rodrigues, A. Escovopsis kreiselii specialization to its native hosts in the fungiculture of the lower attine ant Mycetophylax morschi. Antonie van Leeuwenhoek. 112, 305-317 (2019).
  55. Schröttner, H., Schmied, M., Scherer, S. Comparison of 3D surface reconstruction data from certified depth standards obtained by SEM and an Infinite Focus Measurement Machine (IFM). Microchim Acta. 155, 279-284 (2006).
  56. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z. L., Joy, D. Fundamentals of scanning electron microscopy (SEM). Scanning microscopy for nanotechnology: Techniques and applications. Zhou, W., Wang, Z. L. , Springer. New York, NY. 1-40 (2007).
  57. Kannan, M. Scanning electron microscopy: Principle, components and applications. A Textbook on Fundamentals and Applications of Nanotechnology. Raja, K., Subramanian, K. S., Kannan, M. , Daya Publishing House. 81-92 (2018).
  58. Ruffolo, J. J. Jr Critical point drying of protozoan cells and other biological specimens for scanning electron microscopy: apparatus and methods of specimen preparation. Trans Am Microsc. 93 (1), 124-131 (1974).
  59. Echlin, P. Recent advances in specimen coating techniques for electron microscopy. Scanning Electron Microscopy 1981/1. , IITRI. Chicago. 79-90 (1981).
  60. Ris, H. The cytoplasmic filament system in critical point-dried whole mounts and plastic-embedded sections. J Cell Biol. 100 (5), 1474-1487 (1985).
  61. Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical-point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microsc Res Tech. 26 (6), 489-495 (1993).
  62. Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. Int Endod J. 38 (11), 775-788 (2005).
  63. Kirk, S. E., Skepper, J. N., Donald, A. M. Application of environmental scanning electron microscopy to determine biological surface structure. J Microsc. 233 (2), 205-224 (2009).
  64. Kemmenoe, B. H., Bullock, G. R. Structure analysis of sputter-coated and ion-beam sputter-coated films: a comparative study. J Microsc. 132 (2), 153-163 (1983).
  65. Kinden, D. A., Brown, M. F. Technique for scanning electron microscopy of fungal structures within plant cells. Phytopathology. 65, 74-76 (1975).
  66. Masaphy, S., Levanon, D., Tchelet, R., Henis, Y. Scanning electron microscope studies of interactions between Agaricus bisporus (Lang) Sing hyphae and bacteria in casing soil. Appl Environ Microbiol. 53 (5), 1132-1137 (1987).
  67. Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. Scanning electron microscopy of ectomycorrhizae potential and limitations. Scanning Microsc. 1 (3), 58(1987).
  68. Visen, A., Singh, P. N., Chakraborty, B., Singh, A., Bisht, T. S. Scanning electron microscopy indicates Pseudomonad strains facilitate AMF mycorrhization in litchi (Litchi chinensis Sonn.) air-layers and improving survivability, growth and leaf nutrient status. Curr Res Microb Sci. 2, 100063(2021).
  69. Fleeman, R. M., Mikesh, M., Davies, B. W. Investigating Klebsiella pneumoniae biofilm preservation for scanning electron microscopy. Access Microbiol. 5 (2), 000470-000473 (2023).
  70. Wells, M., Mikesh, M., Gordon, V. Structure-preserving fixation allows scanning electron microscopy to reveal biofilm microstructure and interactions with immune cells. J Microsc. 293 (1), 59-68 (2024).
  71. Nadell, C. D., Drescher, K., Foster, K. R. Spatial structure, cooperation and competition in biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 589-600 (2016).
  72. Madsen, J. S., et al. Coexistence facilitates interspecific biofilm formation in complex microbial communities. Environ Microbiol. 18 (8), 2565-2574 (2016).
  73. Madsen, J. S., Sørensen, S. J., Burmølle, M. Bacterial social interactions and the emergence of community-intrinsic properties. Curr Opin Microbiol. 42, 104-109 (2018).
  74. Flemming, H. C., Wuertz, S. Bacteria and archaea on Earth and their abundance in biofilms. Nat Rev Microbiol. 17 (4), 247-260 (2019).
  75. Bringhurst, B., Allert, M., Greenwold, M., Kellner, K., Seal, J. N. Environments and hosts structure the bacterial microbiomes of fungus-gardening ants and their symbiotic fungus gardens. Microb Ecol. 86 (2), 1374-1392 (2023).
  76. Bringhurst, B., Greenwold, M., Kellner, K., Seal, J. N. Symbiosis, dysbiosis and the impact of horizontal exchange on bacterial microbiomes in higher fungus-gardening ants. Sci Rep. 14 (1), 3231(2024).
  77. Vargas, S., et al. Body-plan reorganization in a sponge correlates with microbiome change. Mol Biol Evol. 40 (6), msad138(2023).
  78. Apprill, A., et al. Humpback whale populations share a core skin bacterial community: towards a health index for marine mammals. PLOS One. 9 (3), e90785(2014).
  79. Fraune, S., et al. Bacteria-bacteria interactions within the microbiota of the ancestral metazoan Hydra contribute to fungal resistance. ISME J. 9 (7), 1543-1556 (2015).
  80. Gowen, R., Gamal, A., Di Martino, L., McCormick, T. S., Ghannoum, M. A. Modulating the microbiome for Crohn's disease treatment. Gastroenterology. 164 (5), 828-840 (2023).
  81. Moya, P., et al. Molecular phylogeny and ultrastructure of the lichen microalga Asterochloris mediterranea sp. nov. from Mediterranean and Canary Islands ecosystems. Int J Syst Evol Microbiol. 65 (6), 1838-1854 (2015).
  82. Zettler, E. R., Mincer, T. J., Amaral-Zettler, L. A. Life in the "plastisphere": microbial communities on plastic marine debris. Environ Sci Technol. 47 (13), 7137-7146 (2013).
  83. Porter, K. R., Kallman, F. The properties and effects of osmium tetroxide as a tissue fixative with special reference to its use for electron microscopy. Exp Cell Res. 4 (1), 127-141 (1953).
  84. Ligon, J. J., Abraham, J. L., Boyd, A. S. Traumatic osmium tetroxide inoculation. J Am Acad Dermatol. 45 (6), 949-952 (2001).
  85. Friedova, N., et al. Osmium absorption after osmium tetroxide skin and eye exposure. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 127 (5), 429-433 (2020).
  86. Fratesi, S. E., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. J Sediment. 74 (6), 858-867 (2004).
  87. Dassanayake, R. P., et al. Identification of a reliable fixative solution to preserve the complex architecture of bacterial biofilms for scanning electron microscopy evaluation. PLOS One. 15 (5), e0233973(2020).
  88. Desiro, A., et al. Detection of a novel intracellular microbiome hosted in arbuscular mycorrhizal fungi. ISME J. 8 (2), 257-270 (2014).
  89. Morales, D. P., et al. Advances and challenges in fluorescence in situ hybridization for visualizing fungal endobacteria. Front Microbiol. 13, 892227(2022).
  90. Shi, H., et al. Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities. Nature. 588 (7839), 676-681 (2020).
  91. Valm, A. M., Welch, J. L. M., Borisy, G. G. CLASI-FISH: principles of combinatorial labeling and spectral imaging. Syst Appl Microbiol. 35 (8), 496-502 (2012).
  92. Fernandez-Brime, S., Muggia, L., Maier, S., Grube, M., Wedin, M. Bacterial communities in an optional lichen symbiosis are determined by substrate, not algal photobionts. FEMS Microbiol Ecol. 95 (3), fiz012(2019).
  93. Schluter, S., Eickhorst, T., Mueller, C. W. Correlative imaging reveals holistic view of soil microenvironments. Environ Sci Technol. 53 (2), 829-837 (2018).
  94. Barcoto, M. O., Rodrigues, A. Lessons from insect fungiculture: from microbial ecology to plastics degradation. Front Microbiol. 13, 812143(2022).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Schimmeltuinenmicrobi le biofilmsruimtelijke organisatie van microbiotaschimmelhyfenbiofilmstructuurmonstervoorbereidingkritisch punt drogensputter coating

Gerelateerde artikelen