Method Article

Analyse van craniomaxillofaciale misvormingen bij muizen met behulp van driedimensionale microcomputertomografie

DOI:

10.3791/67340

⸱

January 17th, 2025

 ,  ,  , 
1The 2nd Dental Center, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Stomatology, Zhang Zhiyuan Academician Work Station, Hainan, Western Central Hospital, 3Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Science, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 4College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we in detail een methode, die is gebaseerd op microcomputertomografie, om 3D-modellen van craniomaxillofaciale botten bij muizen te segmenteren en te meten, voor een betere beoordeling van de craniomaxillofaciale botontwikkeling bij muizen dan wat mogelijk is met de huidige methoden.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om craniofaciale misvormingen veroorzaakt door vitamine A-deficiëntie (VAD) te modelleren, brachten we een dominant-negatieve retinoïdereceptormutatie in osteoblasten tot expressie om specifiek de RAR-transcriptieactiviteit bij muizen te remmen. Deze benadering stelde ons in staat om de effecten van VAD op craniale hypomineralisatie, mandibulaire misvorming en claviculaire hypoplasie in klinische gevallen te onderzoeken. In deze studie was microcomputertomografie (microCT) scannen van het craniomaxillofaciale gebied van muizen een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van de groei en ontwikkeling van dit diermodel. Het handmatig schatten van afbeeldingen is zowel tijdrovend als onnauwkeurig. Daarom presenteren we hier een eenvoudige, efficiënte en nauwkeurige benadering voor het segmenteren en kwantificeren van de microCT-beelden van elk craniomaxillofaciaal bot. MicroCT-software werd gebruikt om de onderkaak, het voorhoofdsbeen, het pariëtale bot, het neusbeen, de premaxilla, de bovenkaak, het interpariëtale bot en het achterhoofdsbeen van muizen door te snijden en de overeenkomstige lengtes en breedtes te meten. Deze segmentatiemethode kan worden toegepast om groei en ontwikkeling in ontwikkelingsbiologie, biogeneeskunde en andere gerelateerde wetenschappen te bestuderen en stelt onderzoekers in staat om de effecten van genetische mutaties op individuele craniofaciale botten te analyseren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ingewikkelde ontwikkeling van de menselijke schedel en het gezicht omvat een geavanceerd 3D-morfogenetisch proces, ingewikkeld georkestreerd door talloze genen. Deze genen spelen een cruciale rol bij het reguleren van de ingewikkelde patronen, proliferatie en differentiatie van weefsels die zijn afgeleid van verschillende embryonale bronnen. Dit sterk gecoördineerde proces onderstreept de complexiteit van de groei en ontwikkeling van de menselijke craniofaciale huid. Craniofaciale misvormingen (waaronder gespleten lip en gehemelte, sluiting van schedelhechtingen, en hypoplasie van het gelaat) die optreden als gevolg van ontwikkelingsafwijkingen zijn verantwoordelijk voor meer dan een derde van alle congenitale geboorteafwijkingen. Als veelgebruikt modeldier in biomedisch onderzoek heeft de muis een complexe en delicate craniomaxillofaciale botstructuur die qua anatomie en fysiologie sterk lijkt op het menselijke craniomaxillofaciale bot. De studie van de craniomaxillofaciale ontwikkelingsbiologie heeft de afgelopen jaren een lange weg afgelegd met de komst van nieuwe technieken in de genetica van muizen, vooral bij misvormingen1.

Retinoïnezuur (RA) is de in vivo metaboliet van vitamine A2. Vitamine A-tekort (VAD) wordt in verband gebracht met een reeks ernstige multisysteemaandoeningen, zoals slechte botremodellering, breuken, evenals craniofaciale misvormingen en skeletmisvormingen die worden gekenmerkt door dwerggroei 3,4 . Retinoïde receptoren (RAR's) zijn cruciale transcriptiefactoren bij retinoïde signalering5. Er werd een dominant-negatieve RARα403-mutant (dnRARα) ontworpen6 en er werd een muismodel opgesteld waarin osteoblasten dnRARα tot expressie brachten. Dit resulteerde in de muizen die dwerggroei, craniofaciale misvormingen, onvolledige corticale botvorming en verhoogd maar slecht gehermodelleerd trabeculair bot vertoonden.

Microcomputertomografie (microCT) heeft een groot potentieel voor de studie van craniomaxillofaciale misvormingen. Het beschikt over het vermogen om de evolutie van zowel aangeboren als verworven skeletafwijkingen in knaagdiermodellen te detecteren en te volgen. MicroCT-beeldvormingsanalyse biedt een diepgaande verkenning van craniofaciale groeistoornissen in genetisch gemodificeerde muismodellen 7,8 . Bovendien komt 3D-beeldvorming naar voren als een essentieel hulpmiddel voor het afbakenen van morfologische kenmerken, waardoor op maat gemaakte analyse- en visualisatiebenaderingen mogelijk worden9. Micro-CT is in verschillende onderzoeken gebruikt om craniofaciale fenotypes te analyseren, waaronder het definiëren van anatomische oriëntatiepunten bij mensen en muizen en volumetrische analyse van elk craniofaciale bot 10,11,12. Hier beschrijven we in detail een methode op basis van microCT-technologie om 3D-modellen van craniomaxillofaciale botten van muizen te scheiden en te meten om een betere evaluatie en analyse van de ontwikkeling van het craniomaxillofaciale skelet van muizen mogelijk te maken dan mogelijk is met de huidige methoden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben voldaan aan alle relevante ethische voorschriften voor dierproeven en dieronderzoek. Alle procedures voor proefdieren werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Research Advisory Committee van het Shanghai Ninth People's Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University.

Zowel de Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403-stam (R26dn/dn) als de Osterix-Cre (OsxCre) (nr. 006361) stam van muizen die hier werden gebruikt, werden gehandhaafd op de C57BL/6-achtergrond. R26dn/dn-muizen werden gekruist met OsxCre-muizen om OSXCre te genereren; R26dn/dn muizen. Alle muizen werden gefokt en onderhouden onder specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden.

1. Fokken van muizen

OPMERKING: F betekent het aantal generaties muizen; N betekent het aantal generaties van paring tussen zygote muizen en achtergrondmuizen. F2+N vertegenwoordigt dus de tweede generatie, evenals alle daaropvolgende muizenfokprogramma's. F0 betekent primaire muizen.

  1. Koppel een geslachtsrijpe mannelijke muis aan een paar vrouwelijke muizen van een vergelijkbare leeftijd. Begin met dagelijkse inspecties voor pasgeboren pups na een eerste periode van 18 dagen. Bij het identificeren van drachtige vrouwtjes, isoleer ze dan indien nodig om optimale moederzorg te garanderen. In het geval dat er binnen een maand na de eerste koppeling geen zwangerschappen worden waargenomen, overweeg dan om de mannelijke muis af te wisselen tussen verschillende fokopstellingen om de bevruchting te bevorderen.
  2. Kruis R26dn/dnmuizen met OSXCre muizen (F0). Knip de staarten af voor genotypering en houd de mannelijke OSXCre; R26dn/+muizen in kooien tot ze geslachtsrijp zijn, dat is ~6 weken oud (F1).
  3. Kruising zes weken oude reu OSXCre; R26dn/+muizen met vrouwelijke R26dn/dnmuizen (F2). Knip de staarten af voor genotypering en vervang de oude fokmuizen op tijd door jongere muizen (F2+N).

2. Voorbereiding

  1. Bereid vier paar OsxCre, OSXCre van 4 weken oud; R26dn/+, en OSXCre; R26dn/dn muizen. Euthanasie van de muizen individueel door toediening van kooldioxide-verstikking.
    OPMERKING: Om efficiënte euthanasie te garanderen, moet de CO2 -stroomsnelheid worden aangepast om elke minuut ongeveer 30% van het volume van de kooi te verplaatsen. In een kooi van 45 cm x 30 cm x 30 cm wordt bijvoorbeeld een debiet van 40 l/min aanbevolen.
  2. Knip de nek van de muis af met een schaar terwijl hij zijn lichaam vasthoudt, waarbij de schedel intact blijft.
    OPMERKING: Om een volledige schedel te verkrijgen, opent u de mond van de muis, knipt u langs de hoek van de mond met een oogheelkundige schaar, trekt u beide handen naar beide kanten en draait u om de huid van het hoofd van de muis af te pellen.
  3. Dompel de muizenschedels 48 uur onder in 4% paraformaldehyde en bewaar ze vervolgens in 70% ethanol.
    LET OP: Paraformaldehyde is giftig; Draag de juiste bescherming.
  4. Scan de verzamelde schedels met een microCT-scanner - resolutie: 4,5 μm; spanning: 70 kV; stroom: 114 μA; filter: 0,5 mm Al; rotatiestap: 0,5°.
  5. Sla CT-scanbeelden op. Afbeeldingen in DICOM-formaat worden geselecteerd om in de software te importeren en geanalyseerd.

3. MicroCT-beeldvorming en 3D-reconstructie

OPMERKING: Alle botten die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn handmatig gesegmenteerd.

  1. Klik met de rechtermuisknop op de pagina MASKs en selecteer Nieuw masker; er verschijnt een nieuwe laag met de naam Groen .
  2. Selecteer het drempelbereik van 671-2.566 op de pagina Drempelwaarde die verschijnt. Herhaal dit proces voor alle gerelateerde lagen. (Figuur 1A).
  3. Gebruik de gum in het menu Bewerken om handmatig de botten te wissen die aan de onderkaak zijn bevestigd in elke laag op het 2D sagittale vlak (Figuur 1B).
  4. Selecteer het gebied van de onderkaak op het 2D sagittale vlak nadat u op de optie Regio Groei hebt geklikt (Figuur 1C).
    LET OP: Zorg ervoor dat het onderkaakgebied in elke laag volledig is geselecteerd; Anders resulteert dit in een onvolledige onderkaak na reconstructie.
  5. Klik op de nieuw gemaakte laag Onderkaak op de pagina MASKERS en selecteer 3D berekenen in het vervolgkeuzemenu (Figuur 1D).
  6. Klik in de interface voor 3D-objecten met de rechtermuisknop op Onderkaak en klik op Eigenschappen. Klik om de kleur te wijzigen. Kleurcode voor alle 3D-modellen die zijn gereconstrueerd met verschillende botten.
  7. Klik op Meten in de linkerbovenhoek en selecteer afstand in het vervolgkeuzemenu dat verschijnt. Bereken de lengte door punten in het 3D-beeld te markeren (Figuur 1E).
    LET OP: De referentie voor het meten van de botbreedte is het breedste deel van het bot.
  8. Klik in de interface voor 3D-objecten met de rechtermuisknop op Onderkaak en klik op Eigenschappen. Eigenschappen-Info-Volume module voor het uitlezen van de gereconstrueerde volumewaarden voor elk craniomaxillofaciaal botblok. (Figuur 1F).
  9. Meet de onderkaak, het voorhoofdsbeen, het pariëtale bot, het neusbeen, de premaxilla, de bovenkaak, het interpariëtale bot en het achterhoofdsbeen op dezelfde manier als hierboven en markeer ze afzonderlijk met verschillende kleuren.

4. Statistische analyse

  1. Voer statistische analyses uit met behulp van de software van uw keuze. Voer tweezijdige Student's t-testen uit (n = 4/groep).
  2. Gebruik voor alle grafieken foutbalken om standaarddeviaties weer te geven. Beschouw P-waarden < 0,05 als statistisch significant.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uitgebreid onderzoek onderstreept de veelzijdige impact van genetische mutaties op de groei, ontwikkeling en orgaansystemen van muizen. Een uitgebreide evaluatie van craniofaciale botten bij mutante muizen vereist vanwege hun beperkingen methoden die verder gaan dan analyse van enkelvoudige weefsels of 2D-beelden. Daarom is het ophelderen van de ontwikkeling van craniofaciale botten van het grootste belang voor het onderzoeken van craniofaciale aandoening...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroCT is een krachtig hulpmiddel voor het verkrijgen van realistische en isotrope 3D-informatie uit dichte en ondoorzichtige biologische monsters met een micrometerresolutie. De gegevens verkregen uit microCT zijn gekalibreerd voor geometrie en intensiteit, waardoor het vooral nuttig is voor kwantitatieve studies 13,14,15,16,17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (824MS152).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GraphPad Prism 6.01 SoftwareGraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA/
Micro-CTQuantum GX micro CT, PerkinElmer,
Waltham, MA, USA		/
Mimics Medical 19.0 Materialise, Leuven, Belgium/
Osterix-Cre (OsxCre) //van het Jackson Laboratory
Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 strain//van de Columbia University, USA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chai, Y., Maxson, R. E. Jr Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn. 235 (9), 2353-2375 (2006).
  2. Mason, J. B., et al. Should universal distribution of high dose vitamin A to children cease. BMJ. 360, k927(2018).
  3. Roulier, S., Rochette-Egly, C., Rebut-Bonneton, C., Porquet, D., Evain-Brion, D. Nuclear retinoic acid receptor characterization in cultured human trophoblast cells: Effect of retinoic acid on epidermal growth factor receptor expression. Mol Cell Endocrinol. 105 (2), 165-173 (1994).
  4. Hayes, K. C., Cousins, R. J. Vitamin A deficiency and bone growth. I. Altered drift patterns. Calcif Tissue Res. 6 (2), 120-132 (1970).
  5. Ghyselinck, N. B., Duester, G. Retinoic acid signaling pathways. Development. 146 (13), dev167502(2019).
  6. Damm, K., Heyman, R. A., Umesono, K., Evans, R. M. Functional inhibition of retinoic acid response by dominant negative retinoic acid receptor mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (7), 2989-2993 (1993).
  7. Ford-Hutchinson, A. F., Cooper, D. M., Hallgrímsson, B., Jirik, F. R. Imaging skeletal pathology in mutant mice by microcomputed tomography. J Rheumatol. 30 (12), 2659-2665 (2003).
  8. Brewer, S., Feng, W., Huang, J., Sullivan, S., Williams, T. Wnt1-cre-mediated deletion of ap-2alpha causes multiple neural crest-related defects. Dev Biol. 267 (1), 135-152 (2004).
  9. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3d mouse embryo atlas based on micro-ct. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  10. Motch Perrine, S. M., et al. Craniofacial divergence by distinct prenatal growth patterns in fgfr2 mutant mice. BMC Dev Biol. 14, 8(2014).
  11. Percival, C. J., Huang, Y., Jabs, E. W., Li, R., Richtsmeier, J. T. Embryonic craniofacial bone volume and bone mineral density in fgfr2(+/p253r) and nonmutant mice. Dev Dyn. 243 (4), 541-551 (2014).
  12. Titiz, I., Laubinger, M., Keller, T., Hertrich, K., Hirschfelder, U. Repeatability and reproducibility of landmarks--a three-dimensional computed tomography study. Eur J Orthod. 34 (3), 276-286 (2012).
  13. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43 (2-3), 104-115 (2012).
  14. Salomé, M., et al. A synchrotron radiation microtomography system for the analysis of trabecular bone samples. Med Phys. 26 (10), 2194-2204 (1999).
  15. Mizutani, R., et al. Three-dimensional microtomographic imaging of human brain cortex. Brain Res. 1199, 53-61 (2008).
  16. De Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. J Neurosci Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
  17. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61(2006).
  18. Zou, W., Hunter, N., Swain, M. V. Application of polychromatic µct for mineral density determination. J Dent Res. 90 (1), 18-30 (2011).
  19. Neues, F., Epple, M. X-ray microcomputer tomography for the study of biomineralized endo- and exoskeletons of animals. Chem Rev. 108 (11), 4734-4741 (2008).
  20. Gabner, S., Böck, P., Fink, D., Glösmann, M., Handschuh, S. The visible skeleton 2.0: Phenotyping of cartilage and bone in fixed vertebrate embryos and foetuses based on x-ray microCT. Development. 147 (11), dev187633(2020).
  21. Ermakova, O., Orsini, T., Gambadoro, A., Chiani, F., Tocchini-Valentini, G. P. Three-dimensional microCT imaging of murine embryonic development from immediate post-implantation to organogenesis: Application for phenotyping analysis of early embryonic lethality in mutant animals. Mamm Genome. 29 (3-4), 245-259 (2018).
  22. Wong, M. D., Maezawa, Y., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. Automated pipeline for anatomical phenotyping of mouse embryos using micro-ct. Development. 141 (12), 2533-2541 (2014).
  23. Rajion, Z. A., et al. A three-dimensional computed tomographic analysis of the cervical spine in unoperated infants with cleft lip and palate. Cleft Palate Craniofac J. 43 (5), 513-518 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Craniomaxillofacial MalformationsMicrocomputed TomographyCraniofacial BonesMouse ModelBone SegmentationMandibular DeformityCranial HypomineralizationRAR MutationOsteoblastsSkeletal Defects

Related Articles