Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Screening en isolatie van C-glycoside-splitsende darmbacteriën

944 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67346

⸱

28 februari 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie stelt een reeks standaard operationele procedures (SOP's) vast voor het efficiënt screenen en isoleren van darmbacteriën die in staat zijn om C-glycosiden te splitsen.

Samenvatting

C-glycosiden worden vaak aangetroffen in geneeskrachtige planten en vertonen een uitgebreide structurele diversiteit, samen met verschillende bioactiviteiten, waaronder antibacteriële, ontstekingsremmende, antivirale, antioxiderende en antineoplastische activiteiten. In C-glycosiden is de anomere koolstof van het suikerdeel direct verbonden met een aglycon door middel van koolstof-koolstofbinding. In vergelijking met O-glycosiden zijn C-glycosiden structureel stabiel en bestand tegen zuren en enzymen. Bijgevolg zijn ze meestal onbreekbaar, wat resulteert in een slechte opneembaarheid en een lage biologische beschikbaarheid. Interessant is dat sommige darmbacteriën CC-glycosidische bindingen kunnen splitsen, wat een specifieke en milieuvriendelijke biologische benadering biedt om C-glycosiden af te breken. In deze studie werd een reeks standaard operationele procedures (SOP's) ontwikkeld voor het screenen van darmbacteriën die in staat zijn om CC-glycosidische bindingen te splitsen op basis van het biotransformatiemodel van natuurlijke verbindingen. De SOP's omvatten de voorbereiding en verrijking van darmbacteriën, activiteitsgerichte screening en activiteitsvalidatie in een koolstofarm bronmedium. Deze methodologie biedt een fundamentele referentie voor onderzoekers die deze gespecialiseerde functionele bacteriën willen isoleren en bestuderen.

Inleiding

C-glycosiden zijn een groep verbindingen die worden gekenmerkt door de directe koppeling van glycosylgroepen aan aglyconen via C-C-bindingen1. In de natuur worden orientine, vitexine, puerair en hun derivaten gewoonlijk geïdentificeerd als C-glycosiden2. Deze verbindingen worden vaak aangetroffen in geneeskrachtige planten zoals Trollius chinensis3 en in dieren zoals Styela plicata4. Studies hebben aangetoond dat deze verbindingen gezondheidsvoordelen bieden en verschillende bio-activiteiten vertonen, waaronder antibacterieel 5,6,7, ontstekingsremmend 8,9,10,11,12, antiviraal 3,12,13, antioxidant 14,15,16 en antineoplastische activiteiten17.

Vanwege de koppeling van glycosylgroepen aan het skelet via C-C-bindingen, vertonen deze verbindingen een hoge stabiliteit en weerstand tegen zure en enzymatische hydrolyse18, wat leidt tot slechte opneembaarheid en lage biologische beschikbaarheid19. Deze beperking beïnvloedt de ontwikkeling en het gebruik van C-glycosiden. Geneesmiddelen die C-glycosiden bevatten, vaak oraal toegediend, worden echter gedeglycosyleerd door specifieke enzymen, waardoor krachtigere bioactieve aglyconen worden geproduceerd 20,21,22,23. Hoewel de eigen enzymen van de gastheer niet in staat zijn om C-glycosiden te deglycosyleren, is gemeld dat darmbacteriën bepaalde typen metaboliseren. Sommige darmbacteriën zetten bijvoorbeeld mangiferine om in norathyriol, dat een grotere potentie vertoont als antidiabeticum of antineoplastisch middel24. Ondanks deze bevindingen is slechts een beperkt aantal bacteriën gekarakteriseerd die in staat zijn om C-glycosiden te splitsen, en de onderliggende mechanismen blijven slecht begrepen. Efficiënte en gestandaardiseerde screening van deze bacteriën zal het begrip van hun functies vergroten en de ontwikkeling van C-glycosiden versnellen.

De screeningsmethode is in de loop van de tijd ontwikkeld en verfijnd tot een volwassen systeem. De kernbenaderingen omvatten verrijking, activiteitsgerichte screening en activiteitsvalidatie in koolstofarme bronmedia. Deze methode vergemakkelijkt de isolatie van zuivere doelstammen, evenals de identificatie van soorten, genomische gegevens en eigenschappen van doelmicro-organismen. Met behulp van dit systeem kunnen darmbacteriën die in staat zijn om C-glycosiden te splitsen, effectief worden gescreend en geïsoleerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De uitgevoerde experimenten voldeden aan de lokale, nationale en internationale voorschriften voor bioveiligheidsinperking die geschikt zijn voor de specifieke bioveiligheidsgevaren die aan elke stam zijn verbonden. Er werden fecale monsters verzameld van gezonde vrijwilligers die gedurende ten minste een week geen medicijnen hadden gebruikt. Nadere gegevens over de gebruikte reagentia en apparatuur zijn te vinden in de materiaaltabel.

1. Constructie van een bacterietransformatiemodel in de menselijke darm in vitro

  1. Bereiding van algemeen anaëroob medium (GAM)25
    1. Bereiding van oplossing A
      1. Combineer 10,0 g trypton, 10,0 g proteose pepton, 3,0 g sojapepton, 13,5 g spijsverteringsserumpoeder, 1,2 g leverextractpoeder, 2,2 g runderextract en 5,0 g gistextract in een erlenmeyer van 500 ml.
      2. Voeg 500 ml gedestilleerd water toe en roer onder verhitting tot de stoffen volledig zijn opgelost.
    2. Bereiding van oplossing B
      1. Bereid oplossing B volgens dezelfde procedure als oplossing A, maar combineer 3,0 g glucose, 5,0 g oplosbaar zetmeel, 2,5 g dikaliumwaterstoffosfaat en 3,0 g natriumchloride in een erlenmeyer van 250 ml.
    3. Bereiding van oplossing C
      1. Bereid oplossing C volgens dezelfde procedure als de oplossingen A en B, maar combineer 0,3 g L-cysteïnehydrochloride en 0,3 g natriumthioglycolaat in een erlenmeyer van 100 ml.
      2. Meng alle drie de oplossingen in een erlenmeyer van 1000 ml, pas de pH aan op 7,2 met behulp van een 10% natriumhydroxideoplossing en voeg gedestilleerd water toe om een eindvolume van 1000 ml te vormen.
      3. Verdeel het medium over erlenmeyers van 250 ml en autoclaaf gedurende 30 minuten bij 121 °C. Koel af tot kamertemperatuur en bewaar bij 4 °C.
    4. Bereiding van vast algemeen anaëroob medium
      1. Voeg 1%-2% agar toe aan het GAM vloeibare medium en verwarm tot het volledig is opgelost. Verdeel over erlenmeyers van 250 ml en autoclaaf bij 121 °C gedurende 30 min.
    5. Bereiding van koolstofarm bronmedium
      1. Bereid het koolstofarme bronmedium voor volgens dezelfde procedure als GAM, maar laat gistextract, glucose en oplosbaar zetmeel weg.
  2. Preparaat van gemengde menselijke darmflora
    1. Verzamel 1-2 g verse menselijke uitwerpselen in een steriele wegwerpontlastingsbuis gevuld met stikstofgas. Sluit de tube onmiddellijk af. Voeg 5 ml GAM-medium, afdichting en cultuur toe bij 37 °C gedurende 24 uur in een steriele anaërobe incubator.
      NOTITIE: Gebruik een zuurstofmeter om het zuurstofgehalte van de anaërobe incubator te controleren en vervang indien nodig stikstofgas om de anaërobe omstandigheden te behouden.
  3. Activering van gemengde menselijke darmflora
    1. Breng na 24 uur 0,5 ml van de menselijke darmbacteriële suspensie over in een nieuwe microcentrifugebuis met 4,5 ml vers GAM-medium.
    2. Sluit af en incubeer bij 37 °C gedurende 24 uur onder anaërobe omstandigheden om een actieve gemengde menselijke darmflora te verkrijgen.
  4. Bereiding van referentieoplossingen
    1. Weeg 5 mg orientine en luteoline af en los ze afzonderlijk op in 1 ml DMSO om oriëntine en luteoline referentieoplossingen te bereiden in een concentratie van 5 mg/ml.
  5. Screening van actieve darmflora die in staat is C-glycosiden te splitsen
    1. Meng 260 μl geactiveerde darmflora met 6 ml vers koolstofarm bronmedium dat 40 μl oriëntine-referentieoplossing bevat, en incubeer bij 37 °C.
    2. Neem een controlegroep op (6 ml koolstofarm bronmedium, 40 μl oriëntine-referentieoplossing en 260 μl normale zoutoplossing) en een blanco groep (6 ml koolstofarm bronmedium, 40 μl normale zoutoplossing en 260 μl geactiveerde darmflora).
      OPMERKING: Voer alle tests in drievoud uit in een anaërobe incubator.
  6. Voorbehandeling van transformatieoplossingen
    1. Na 24 uur en 48 uur pipetteer je 1 ml reactieoplossingen in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml en centrifugeer je 15 minuten bij kamertemperatuur bij 13.400 x g om bacteriën te verwijderen.
    2. Voeg 200 μL van het bovenstaande toe aan 600 μL methanol, meng en centrifugeer op 13.400 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om eiwitten te verwijderen.
  7. Detectie van transformatieproducten
    1. Filtreer het bovenstaande met behulp van een microporeus membraan van 0,22 μm en analyseer het filtraat via hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC). Voer HPLC-analyse uit op een instrument dat is uitgerust met een C18-kolom (4,6 mm × 250 mm, 5 μm).
    2. Houd de temperatuur van de kolomoven op 40 °C, met een debiet van 1 ml/min. Gebruik acetonitril als mobiele fase A en 0,1% mierenzuur in gezuiverd water als mobiele fase B.
      OPMERKING: Gebruik een lineair gradiëntsysteem als volgt: 5%-55% A bij 0-20 min, 55%-95% A bij 20-25 min, 95%-5% A bij 25-30 min en 5% A bij 30-32 min.

2. Isolatie van enkelvoudige stammen uit de bacteriële flora van de menselijke darm

  1. Activering van gemengde menselijke darmbacteriële flora
    1. Activeer de gemengde bacteriële darmflora die in staat is orientine te splitsen, zoals beschreven in stap 1.3, om de geactiveerde oplossing van de bacteriële darmflora te verkrijgen.
  2. Voorbereiding van massieve GAM-platen
    1. Los het voorbereide vaste GAM-medium op door het te verhitten en giet het in steriele petrischaaltjes voor eenmalig gebruik in een anaërobe incubator. Laat het medium stollen om stevige GAM-platen voor te bereiden.
  3. Voorlopige screening van enkelvoudige stammen uit de bacteriële flora van de menselijke darm
    1. Pipetteer 100 μl van de geactiveerde bacteriële oplossing in een microcentrifugebuis van 1,5 ml die 1 ml normale zoutoplossing bevat.
    2. Inoculeer een geschikt volume van de bacteriële oplossing op een petrischaaltje met behulp van een wegwerpinoculatiering. Sluit de schaal af en broed deze uit in een anaërobe incubator.
  4. Observatie van de morfologie van de kolonie
    1. Observeer na 48 uur incubatie bij 37 °C de grootte, morfologie en kleur van de kolonies op de plaat.
  5. Selectie van individuele kolonies om enkelvoudige stammen te verkrijgen
    1. Selecteer afzonderlijke bacteriekolonies en kweek ze in microcentrifugebuisjes van 10 ml met 4,5 ml vers GAM-medium. Incubeer onder anaërobe omstandigheden bij 37 °C gedurende 24 uur om enkelvoudige stammen te verkrijgen.
  6. Verificatie van de activiteit van één stam
    1. Controleer de activiteit van afzonderlijke stammen zoals beschreven in stap 1.5, 1.6 en 1.7. Voer activiteitsverificatie uit met behulp van hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) en plaatmarkering25.
  7. Zuivering van enkelvoudige stammen uit de bacteriële flora van de menselijke darm
    1. Zuiver de actieve enkelvoudige stam zoals beschreven in stap 2.1. Verifieer de activiteit door middel van transformatie-experimenten met orientin, volgens de procedures die worden beschreven in de stappen 1.5, 1.6 en 1.7.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Fecale monsters van tien gezonde vrijwilligers werden gescreend met behulp van transformatie-experimenten, wat resulteerde in één monster dat activiteit aantoonde bij het deglycosyleren van orientine. Deze bevinding bevestigde de haalbaarheid van screening op actieve monsters. Het actieve monster werd geïsoleerd met behulp van de plaatmarkeringsmethode. Op basis van de morfologie en kenmerken van de kolonies werden ongeveer 18 afzonderlijke bacteriekolonies met gele of witte kleur, gevar...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er werd een standaardprocedure (SOP) vastgesteld voor het screenen van menselijke darmbacteriën die in staat zijn C-glycosiden te splitsen. Met behulp van deze procedures werd met succes een zuivere actieve stam verkregen en werd de deglycosyleringseigenschap bevestigd door middel van transformatietests. De SOP bestaat uit de preparatie en verrijking van darmbacteriën, activiteitsgerichte screening en activiteitsvalidatie in een koolstofarm bronmedium.

Het bel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Het werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China 82374134.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AcetonitrileThermo Fisher ScientificF2408R205HPLC
Anaërobe IncubatorShanghai CIMO Medical Instrument Manufacturing Co., LTDYQX- II
Runder ExtractBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-009BR
DarmserumpoederBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-087BR
DipotassiumwaterstoffosfaatBeijing Chemical WorksM26298AR
Bepaald steriele ontlastingcollectiebuisLang Fu Co., LTD5 mL
Gedestilleerd waterDepartment of Biopharmaceutical, Beijing University of Traditional Chinese Medicine
DMSOSigma-Aldrich CorporationWXBD2861VAR
EP buisBeijing Biodee Biotechnology Co., LTD10 mL/1.5 mL
Eppendorf CentrifugeEppendorf AG5418
GlucoseBeijing Chemical WorksGC205003AR
Hogedruk vloeistof chromatograafShimadzu CorporationLC-20
Hogedruk stoomsterilisatorSanyo Denki Shanghai Co., LTDMLS-3780
Innoval C18 Chromatografische kolomAgela Technologies Co., LTD4.6 mm × 250 mm, 5 µm
L-cysteïne hydrochlorideBeijing Abxing Biotechnology Co., LTDBGASY01BR
Lever ExtractpoederBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-085BR
LuteolineNational Institutes for Food and Drug Control>98%
Magnetische roerderIka Werke Co., LTDRCT basic
MethanolThermo Fisher Scientific20240901312AR
Millipore FiltermembraanSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.0.22 µL × 50 mm
OrientineYishiming (Beijing) Biotechnology Co., LTD19120601>98%
PeptoneBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD1685787BR
PetrischaalBeijing Biodee Biotechnology Co., LTD150 mm
NatriumchlorideBeijing Abxing Biotechnology Co., LTDBN20008AR
NatriumthioglycolaatShanghai Jianglai Biotechnology Co., LTDJ031S219019AR
Oplosbare zetmeelBeijing Abxing Biotechnology Co., LTDS9765BR
SojapeptoneBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD2147955BR
TryptonAgela Technologies Co., LTD1685787BR
UltrasoonreinigerKun Shan Ultrasonic Instruments Co., LTDKQ-500DE
Gist ExtractBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-014BR
```

Referenties

  1. Zhang, Y. Q., Zhang, M., Wang, Z. L., Qiao, X., Ye, M. Advances in plant-derived C-glycosides: phytochemistry, bioactivities, and biotechnological production. Biotechnol Adv. 60, 108030(2022).
  2. Franz, G., Grun, M. Chemistry, occurrence and biosynthesis of C-glycosyl compounds in plants. Planta Med. 47 (3), 131-140 (1983).
  3. Cai, S., et al. Antiviral flavonoid-type C-glycosides from the flowers of Trollius chinensis. Chem Biodivers. 3 (3), 343-348 (2006).
  4. Shi, X., et al. A flavone C-glycoside from Styela plicata. Biochem Syst Ecol. 86, 103924(2019).
  5. Xiao, J., Capanoglu, E., Jassbi, A. R., Miron, A. Advance on the flavonoid C-glycosides and health benefits. Crit Rev Food Sci Nutr. 56 (Suppl 1), S29-S45 (2016).
  6. Ma, R., Cheng, S., Sun, J., Zhu, W., Fu, P. Antibacterial gilvocarcin-type aryl-C-glycosides from a soil-derived Streptomyces species. J Nat Prod. 85 (10), 2282-2289 (2022).
  7. Le Dang, Q., et al. Desmodinosides A-E: New flavonoid C-glycosides from Desmodium heterocarpon var. stigosum with hepatoprotective and antifungal activity. Fitoterapia. 169, 105609(2023).
  8. Choi, J. S., et al. Effects of C-glycosylation on antidiabetic, anti-Alzheimers disease and anti-inflammatory potential of apigenin. Food Chem Toxicol. 64, 27-33 (2014).
  9. Courts, F. L., Williamson, G. The occurrence, fate and biological activities of C-glycosyl flavonoids in the human diet. Crit Rev Food Sci Nutr. 55 (10), 1352-1367 (2015).
  10. Thao, N. P., et al. Anti-inflammatory flavonoid C-glycosides from Piper aduncum leaves. Planta Med. 82 (17), 1475-1481 (2016).
  11. Kim, M. K., Yun, K. J., Lim, D. H., Kim, J., Jang, Y. P. Anti-inflammatory properties of flavone di-C-glycosides as active principles of camellia mistletoe, Korthalsella japonica. Biomol Ther (Seoul). 24 (6), 630-637 (2016).
  12. Chen, Y. L., Chen, C. Y., Lai, K. H., Chang, Y. C., Hwang, T. L. Anti-inflammatory and antiviral activities of flavone C-glycosides of Lophatherum gracile for COVID-19. J Funct Foods. 101, 105407(2023).
  13. Wang, Y., et al. Flavone C-glycosides from the leaves of Lophatherum gracile and their in vitro antiviral activity. Planta Med. 78 (1), 46-51 (2012).
  14. Devkota, H. P., Fukusako, K., Ishiguro, K., Yahara, S. Flavone C-glycosides from Lychnis senno and their antioxidative activity. Nat Prod Commun. 8 (10), 1413-1414 (2013).
  15. Stark, T. D., et al. Isolation and structure elucidation of highly antioxidative 3,8-linked biflavanones and flavanone-C-glycosides from Garcinia buchananii bark. J Agric Food Chem. 60 (8), 2053-2062 (2012).
  16. Stark, T. D., Germann, D., Balemba, O. B., Wakamatsu, J., Hofmann, T. New highly in vitro antioxidative 3,8-linked biflav(an)ones and flavanone-C-glycosides from Garcinia buchananii stem bark. J Agric Food Chem. 61 (51), 12572-12581 (2013).
  17. Xiao, J., Capanoglu, E., Jassbi, A. R., Miron, A. Advance on the flavonoid C-glycosides and health benefits. Crit Rev Food Sci Nutr. 56 (Suppl 1), 29-45 (2016).
  18. Xie, K., Zhang, X., Sui, S., Ye, F., Dai, J. Exploring and applying the substrate promiscuity of a C-glycosyltransferase in the chemo-enzymatic synthesis of bioactive C-glycosides. Nat Commun. 11 (1), 5162(2020).
  19. Liu, L., et al. Characterization of the intestinal absorption of seven flavonoids from the flowers of Trollius chinensis using the Caco-2 cell monolayer model. PLoS One. 10 (3), e0119263(2015).
  20. Xu, M., et al. Mechanism and application of microbial transformation of glycosides in traditional Chinese medicine. World Sci Technol. 2, 24-27 (2006).
  21. Xie, L., et al. Comparison of flavonoid O-glycoside, C-glycoside and their aglycones on antioxidant capacity and metabolism during in vitro digestion and in vivo. Foods. 11 (6), 882(2022).
  22. Hostetler, G. L., Ralston, R. A., Schwartz, S. J. Flavones: Food sources, bioavailability, metabolism, and bioactivity. Adv Nutr. 8 (3), 423-435 (2017).
  23. Xiao, J. Dietary flavonoid aglycones and their glycosides: which show better biological significance. Crit Rev Food Sci Nutr. 57 (9), 1874-1905 (2017).
  24. Hasanah, U., Miki, K., Nitoda, T., Kanzaki, H. Aerobic bioconversion of C-glycoside mangiferin into its aglycone norathyriol by an isolated mouse intestinal bacterium. Biosci Biotechnol Biochem. 85 (4), 989-997 (2021).
  25. Yang, X., Xu, W. Establishment of model and standard operation procedure for biotransformation of chemical constituents of traditional Chinese medicine by human intestinal bacteria. China J Chin Mater Med. 36 (1), 19-26 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

C-glycoside-splitsingbacteriële screeningbacteriële isolatiekoolstofarm mediumanaerobe incubatiehogedrukvloeistofchromatografiemenselijke darmflorakoloniemorfologiedeglycosyleringsactiviteit
Screening en isolatie van C-glycoside-splitsende darmbacteriën
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.