Multimodale studie van cardiovasculaire remodellering bij muizen: vierdimensionale echografie en massaspectrometriebeeldvorming

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor het gebruik van in vivo vierdimensionale echografie en ex vivo massaspectrometriebeeldvorming om biomechanische en biomoleculaire veranderingen in het cardiovasculaire systeem van muizen te beoordelen. Deze techniek wordt toegepast om cardiale remodellering te analyseren bij chirurgisch geïnduceerd myocardinfarct en vasculaire veranderingen bij ouder wordende dieren.

Samenvatting

Hart- en vaatziekten (HVZ) zijn de belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten. Schade aan het cardiovasculaire systeem kan te wijten zijn aan blootstelling aan het milieu, trauma, toxiciteit van geneesmiddelen of tal van andere factoren. Als gevolg hiervan ondergaan hartweefsel en vaatstelsel structurele veranderingen en vertonen ze een verminderde functie. De schade en de daaruit voortvloeiende remodellering kunnen worden gedetecteerd en gekwantificeerd met echografie (US) beeldvorming op orgaanniveau en massaspectrometriebeeldvorming (MSI) op moleculair niveau. Dit manuscript beschrijft een innovatieve methodologie voor het bestuderen van de cardiale pathofysiologie van muizen, waarbij in vivo vierdimensionale (4D) echografie en -analyse wordt gekoppeld aan ex vivo matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie (MADLI) MSI van het hart. 4D-echografie kan dynamische volumetrische metingen bieden, waaronder radiale verplaatsing, belasting van het oppervlak en longitudinale belasting gedurende een hele hartcyclus. In het vaatstelsel worden MSI en echografie gebruikt om de samenstelling van de vaatwand, de hemodynamica en de dynamiek van de vaatwand te beoordelen. De methodologie kan worden aangepast om een groot aantal CV ziekten te bestuderen door functionele metrieken van belang en/of het MALDI MSI protocol aan te passen om specifieke moleculen te targeten. MALDI MSI kan worden gebruikt om lipiden, kleine metabolieten, peptiden en glycanen te bestuderen. Dit protocol schetst het gebruik van MALDI MSI voor ongerichte lipidomische analyse en het gebruik van ultrasone beeldvorming voor cardiovasculaire hemodynamica en biomechanica.

Inleiding

Hart- en vaatziekten (HVZ) zijn wereldwijd een belangrijke doodsoorzaak¹. Preventie en behandeling van HVZ vereisen een diepgaand begrip van moleculaire aanpassingen aan biomechanische krachten en de daaruit voortvloeiende veranderingen in mechanische eigenschappen. In het hele cardiovasculaire systeem spelen biomechanische krachten een belangrijke rol in de functie en structuur van het weefsel². De mechanische eigenschappen van cardiovasculair (CV) weefsel worden beïnvloed door deze krachten, waardoor ze indicatoren zijn van gezondheid en ziekte 3,4,5,6. Om HVZ te voorkomen, diagnosticeren en behandelen, is het van cruciaal belang om methoden te ontwikkelen voor het begrijpen en observeren van de processen van ziekte-initiatie en -progressie. Biomedische beeldvorming is van cruciaal belang geweest bij het genereren van fysiologische en mechanistische inzichten, en nieuwe beeldvormingstechnologieën en analysetechnieken worden voortdurend ontwikkeld. Dit protocol demonstreert een methodologie voor het combineren van twee cardiovasculaire beeldvormings- en analysetechnieken om het potentieel van deze beeldvormingsmodaliteiten bij ischemische hartziekte en vasculaire veroudering te valideren.

Onderzoekers op biomechanisch gebied benaderen de studie van biomechanica vaak via een combinatie van in vivo, ex vivo en in silico methoden. Eerder onderzoek in de moleculaire biomechanica was voornamelijk gericht op eiwitten⁷ (met name extracellulaire matrixeiwitten collageen en elastine vanwege hun impact op biomechanische eigenschappen), en het werk om in vivo beeldvormingsbiomechanica te combineren met moleculaire studies is beperkt gebleven tot histologie en immunohistochemie. Hoewel deze benaderingen veel moleculaire indicatoren kunnen opleveren en voorgestelde mechanismen voor hermodellering van ECM en cellen hebben opgeleverd, zijn ze doorgaans beperkt tot respectievelijk de momenteel beschikbare kleuringen of antilichamen. In dit onderzoeksgebied ontbreken grote klassen van moleculen, bijvoorbeeld lipiden. Hoewel deze moleculaire klassen al dan niet mechanistisch betrokken kunnen zijn, zijn de resulterende moleculaire aanpassingen belangrijk om te begrijpen, omdat deze moleculen potentiële doelen kunnen zijn voor zowel diagnostische markers als therapieën. Analytische chemietechnieken, zoals vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS), kunnen worden toegepast; De ruimtelijke oriëntatie van de moleculen in deze technieken gaat echter verloren. Met massaspectrometriebeeldvorming (MSI) blijft de ruimtelijke verdeling van moleculen intact en kunnen meerdere analyttypen (klassen van moleculen) worden afgebeeld met seriële secties. MSI is een krachtig analytisch hulpmiddel om de ruimtelijke verdelingen van bijna alle soorten moleculen in biologisch weefsel te onderzoeken, inclusief metabolieten, lipiden, glycanen, peptiden en geneesmiddelen met een klein molecuulgewicht⁸. Matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie (MALDI) MSI is een type MSI dat zeer geschikt is voor op ontdekking gebaseerde analyse van molecuulgewichten in het bereik van 50-8000 Da. MALDI-MSI is een ionisatietechniek die een laserenergie-absorberende matrix op het monster toepast om te helpen bij de ionisatie van de analyten van belang. Deze aanpak voorkomt dat men beperkt is tot één moleculair doelwit en kan bio-informaticatools gebruiken om te bepalen welke moleculen een impact hebben op biomechanische eigenschappen en hermodellering.

Vierdimensionale echografie (4DUS) is een niet-invasieve in vivo methode die nuttig is voor zowel temporele als ruimtelijke karakterisering van het hart. 4DUS maakt gebruik van een reeks cine-loops met een hoge framesnelheid van verschillende vlakken en compileert ze tot een 3D-dataset die temporele informatie bevat. Dit maakt directe visualisatie en kwantificering mogelijk van de complexe 3D-vormveranderingen van de hartkamers gedurende de hartcyclus zonder te vertrouwen op geometrische aannames zoals vereist voor traditionele 2D-echocardiografie. 4DUS maakt het mogelijk om in vivo functionele metrieken te berekenen op basis van de complexe vorm en beweging van het hart ^9,10, en MALDI MSI maakt de ruimtelijke studie van biologische moleculen in het hartweefsel ex vivo¹¹ mogelijk. Om veranderingen in het hart met HVZ volledig te begrijpen, moeten zowel mechanische als moleculaire mechanismen worden onderzocht. Daarom wordt een gecombineerde methodologie voorgesteld voor het bestuderen van de pathofysiologie van het hart bij muizen, waarbij 4DUS-beeldvorming en -analyse wordt gekoppeld aan MALDI MSI van lipiden in het hart. Deze methodologie wordt gedemonstreerd in een muizenmodel van een hartinfarct.

Vasculaire biomechanica speelt ook een cruciale rol bij het reguleren van de cardiovasculaire functie². Vasculaire verstijving, die gepaard gaat met veroudering, is een risicofactor voor HVZ¹². De biomechanische en hemodynamische veranderingen in de bloedvaten kunnen worden afgebeeld met behulp van echografie. De moleculaire samenstelling van de vaatwanden zijn belangrijke componenten van de biomechanica en zijn ook buitengewoon gevoelig voor hemodynamische krachten. Oscillerende schuifspanning in de wand is bijvoorbeeld betrokken bij de ontwikkeling van atherosclerotische plaque³. De voorlopige gegevens van de vaatmechanica en hemodynamica bij oudere dieren zullen later worden gepresenteerd.

Het team is geïnteresseerd in de relatie tussen biomechanica en moleculaire samenstelling in verschillende ziektetoestanden. Preklinische echografie en MSI worden gebruikt om de ruimtelijke verdeling van moleculaire veranderingen in een weefsel en de bijbehorende biomechanische veranderingen die optreden tijdens ziekteprogressie te bepalen. Dit rapport beschrijft deze methodologieën in detail en presenteert voorlopige gegevens over het hart en het vaatstelsel van het hoofd/de nek.

Protocol

De beschreven dierproeven worden uitgevoerd met goedkeuring van de University of Tennessee, Knoxville Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Echografie¹³

1. Opstelling en voorbereiding van de dieren
   1. Voordat u met het experiment begint, controleert u het anesthesieniveau van isofluraan en vult u deze indien nodig bij. Controleer het zuurstoftankniveau voordat u het gas aanzet. Weeg de houtskool af en noteer dit op de container.
   2. Stel de beeldvormingsruimte in door verbruiksartikelen in de buurt van het beeldvormingsplatform te plaatsen. Benodigdheden omvatten voorgesneden tape, ontharingscrème, gaas, wattenstaafjes, geautoclaveerd water, hoornvliessmeermiddel, glijmiddel, rectale temperatuursonde, elektrodekabels, ultrasone gel, elektrodegel (indien van toepassing) en warmtelamp (Figuur 1A).
   3. Zet het echoapparaat aan en initialiseer de motor (het systeem is ook in staat om 4DUS-beeldgegevens te verzamelen). Stel een nieuw experiment in op het ultrasone systeem: selecteer Nieuw onderzoek of Nieuwe serie en vul de muisgegevens in. Zet de tablet aan voor fysiologische monitoring.
   4. Controleer de kraan om er zeker van te zijn dat de stroom open is naar de inductiebox en gesloten naar de neuskegel. Vul de anesthesie-inductiebox vooraf door de zuurstof op de verdamper in te schakelen op 1 l/min en de knop op 3%-5% te draaien.
   5. Haal de muis uit de behuizingskooi.
   6. Plaats de muis in de inductiebox totdat het dier volledig verdoofd is met isofluraan tussen 3%-5%.
   7. Schakel de kraan om de stroom naar de neuskegel op de ultrasone beeldplaat te veranderen. Draai de isofluraanknop tussen 1%-2%.
   8. Haal de muis uit de inductiebox en weeg het dier. Noteer het gewicht van het dier.
   9. Plaats de muis in rugligging op de beeldplaat.
   10. Breng hoornvliesglijmiddel aan op de ogen van het dier.
   11. Als er vacht aanwezig is, verwijder dan de vacht uit het beeldvormingsgebied met behulp van een in de handel verkrijgbare ontharingscrème en wattenstaafjes. Veeg de crème van de huid met water op sponzen om overtollige ontharingscrème van de huid te verwijderen en brandwonden te voorkomen.
   12. Breng de elektrocardiografie (ECG) draden subcutaan in aan weerszijden van de borst en achterpoot, afhankelijk van de positie van het dier.
       1. Eenmaal ingebracht, houdt u de ECG-kabels op hun plaats met tape. Als er geen ECG-afleidingen worden gebruikt (d.w.z. er zijn geen ECG-snoeren ingebracht), controleer dan het ECG via de beeldvormingsplaat van het dier.
       2. Voor elektrische geleiding van de huid naar de plaat, zoek de geleidende gel op de plaat en houd de ledematen van het dier op hun plaats.
   13. Houd de ledematen van het dier op hun plaats met tape of een elastische band die rond de plaat en over de ledematen wordt geplaatst (Figuur 1B).
   14. Gebruik glijmiddel om de rectale temperatuursonde in te brengen en zet de sonde vast met tape.
   15. Controleer ECG-, ademhalings- en temperatuursignalen op de tablet. Zorg ervoor dat de hartslag ~350-600 slagen per minuut is, de ademhaling ~50-100 ademhalingen/min en de rectale temperatuur tussen 35-37 °C. Pas de isofluraanspiegels indien nodig aan.
   16. Schakel indien nodig een warmtelamp in (bijv. 250 W infraroodgloeilamp)¹⁴ en pas de hoogte aan om de kerntemperatuur te behouden (Afbeelding 1C).
       1. Plaats de warmtelamp niet dichter dan 12 cm van het dier. Voor de eerste studies om de optimale afstand tussen lamp en dier te bepalen, past u de hoogte aan en registreert u de huidtemperatuur met behulp van een infraroodthermometer, die niet hoger mag zijn dan 42 °C¹⁵.
2. Cardiale 4D-echografie
   1. Plaats de transducer in de houder in een semi-vergrendelde positie.
   2. Richt de verhoogde stip op de transducer met de blauwe stip op het scherm. De conventie is om de stip naar de rechterkant van het dier te plaatsen.
   3. Draai de transducer zodat deze langs het sagittale vlak van de muis is gericht met een verhoogde inkeping die in de caudale richting wijst.
   4. Gebruik de hendel aan de onderkant van de ultrasone plaat om het dier te kantelen. Gebruik de hendel aan de onderkant van de transducer om de hoek van de transducer aan te passen.
   5. Breng een ruime hoeveelheid ultrasone gel aan op het ventrale oppervlak van de borstholte voor akoestische koppeling tussen het huidoppervlak en de transducer. Zorg ervoor dat er geen vacht achterblijft voordat u gaat koppelen.
   6. Laat de transducer zakken om contact te maken met de ultrasone gel.
   7. Maak micro-aanpassingen met X/Y-knoppen aan de onderkant van de plaat, of verplaats de hele plaat voor grote aanpassingen.
   8. Zorg ervoor dat een parasternale weergave van de lange as de apex, het uitstroomkanaal van de linkerventrikel en de aorta horizontaal op het scherm omvat voor een nauwkeuriger beeld met de korte as (Figuur 2A, B).
   9. Selecteer Naam Afbeelding in de benedenhoek om de afbeelding op te slaan in de huidige serie.
   10. Draai de transducer 90° met de klok mee om over te schakelen naar een parasternale korte-asweergave (Figuur 2C).
       OPMERKING: Voor de beste 4D-beeldkwaliteit moeten gebruikers proberen de stappenmotor uit te lijnen langs de parasternale lengteas van het ventrikel die niet altijd direct evenwijdig is aan het borstbeen. Het hart/LV zit vaak in een linkse neerwaartse hoek.
   11. Zorg ervoor dat de linkerventrikel zichtbaar is aan de rechterkant van het scherm en de rechterventrikel zich aan de linkerkant van het scherm bevindt (Figuur 2D).
   12. Als de muis een stabiel ademhalingsritme heeft, drukt u op het ECG-vak in de linkerbovenhoek van de afbeelding om ademhalingspoort in te schakelen voor het 4D-beeld. Als het niet stabiel is, voltooi dan deze stap tijdens de nabewerking.
   13. Selecteer de kubus in de linkerbovenhoek van het scherm om een 4D-afbeelding in te stellen.
   14. Reset de transducer voordat u de start - en stopposities van de transducer aanpast.
   15. Stel de startpositie in op net onder de apex en de stoppositie op de aortaboog.
   16. Stel de stapgrootte in op 0,08-0,13 mm en de framesnelheid op 200-300 Hz.
       OPMERKING: Kleinere stapgroottes kunnen een betere beeldresolutie bieden voor analyse, maar zullen de acquisitietijd verlengen. Grotere stapgroottes zijn acceptabel als de gegevens worden verzameld met een bijna perfecte uitlijning van het linkerventrikel en er minimale/geen heroriëntatie nodig is tijdens de analyse. Overweeg om de framefrequentie te verhogen bij het werken met dieren met een hogere hartslag (>450 slagen per minuut).
   17. Zorg ervoor dat de vitale functies en het ECG-signaal constant stabiel zijn (>350 bpm en ademhaling boven 50 resp/min) voordat u op de scan drukt.
   18. Zodra de scan en verwerking zijn voltooid, schakelt u EKV/4D-gegevens opslaan voor nabewerking en Respiration Gating in.
   19. Selecteer Naam afbeelding rechtsonder en neem de muis-ID op in de naam.
   20. Als u de beeldkwaliteit wilt controleren, drukt u op Meer bedieningselementen en selecteert u Laden in 4D.
   21. Bekijk elk vlak van het hart en zorg ervoor dat het midden van het hart niet beweegt tijdens de hartcyclus. Beweging van het centrum duidt op variabiliteit in ECG en/of respiratoire poort en bemoeilijkt dus het analyseproces. Stel de monitoren opnieuw af en herhaal de scan indien nodig.
3. Cardiale 4D-echografieanalyse
   1. Navigeer naar de studiebrowser. Exporteer alle B-Mode 2D-afbeeldingen naar Vevo Lab en exporteer 4D-gegevens als een ander bestandstype, waarbij u het gegevensformaat ".raw" naar een harde schijf selecteert.
      OPMERKING: De toolbox voor de grafische 4D-gebruikersinterface die in dit werk wordt gebruikt, is momenteel niet openbaar beschikbaar. Neem voor toegang en gedetailleerde instructies contact op met Dr. Craig Goergen, Purdue University.
   2. Voer een alternatieve analyse van 4D-gegevens uit met behulp van VevoLab-software. Als u dit framework wilt gebruiken, exporteert u 4D-gegevens van de machine naar Vevo Lab-bestanden.
4. Vasculaire beeldvorming
   1. Voor B-modusbeelden van de halsslagaders plaatst u de ultrasone transducer evenwijdig aan de halsslagaders, nabij de middellijn.
   2. Zodra de halsslagader zichtbaar is, beweegt u de transducer superieur om de halsslagadervertakking te vinden.
   3. Wanneer een duidelijk beeld van de vertakking van de halsslagader wordt gevonden, past u de versterkingsinstelling aan op 35 dB en legt u het beeld van de B-modus vast.
      1. Door de transducer naar links of rechts te kantelen, kan het beeld worden verbeterd. Pas de hoek van de transducer of trap aan zodat het vaartuig van belang niet direct parallel aan de transducer loopt. Hierdoor blijft de Dopplerhoek onder de 60°. Anders kan een verschuiving van +/- 15° nodig zijn.
   4. Schakel over naar de gepulseerde golf Doppler-modus om de snelheidsmetingen te verkrijgen.
   5. Plaats het monstervolume in het midden van het vat. Pas de hoek van de cursor aan zodat deze evenwijdig is aan de halsslagader. Druk vervolgens op play om de snelheidsmetingen te starten en sla op om ze op te nemen.
   6. Voor het B-modus beeld van de halsaders plaatst u de ultrasone transducer evenwijdig aan de halsaders. De halsaders zijn anterieur en lateraal van de halsslagaders.
   7. Zodra de halsader is gelokaliseerd, verplaatst u de transducer naar de locatie waar de interne en externe halsader samensmelten. Wanneer een helder beeld wordt gevonden, stelt u de versterkingsinstelling in op 35 dB en legt u het beeld in de B-modus vast.
   8. Schakel over naar de gepulseerde golf Doppler-modus om de snelheidsmetingen te verkrijgen.
   9. Plaats het monstervolume in het midden van het vat. Pas de cursorhoek aan zodat deze evenwijdig is aan de halsader. Druk vervolgens op play om de snelheidsmetingen te starten en sla op om ze op te nemen.
5. Vasculaire ultrasone analyse
   1. Na het verzamelen van de B-modusbeelden en gepulseerde golf Doppler-metingen, meet u de diameters en snelheden met behulp van de software.
   2. Zodra de afbeeldingen in de software zijn geladen, selecteert u vasculair pakket.
   3. Selecteer elke kant van het vat om de volledige diameter te krijgen.
   4. Voer voor de halsslagader diametermetingen uit in systole en diastole met behulp van de diameteroptie in het vaatpakket.
   5. Voer snelheidsmetingen uit met behulp van de snelheidsoptie in het vaatpakket.
   6. Selecteer voor de halsslagader de hoogste piek voor de snelheidsmeting in de systole en de laagste piek voor snelheidsmeting in de diastole.
   7. Gebruik de waarden van de diameters om de omtrekcomponent van de Green Lagrange-rektensor te berekenen met behulp van de volgende vergelijking:
      (1)
      waarbij D_s staat voor de diameter tijdens de systole en D d voor de diameter tijdens de diastole.
   8. Selecteer voor de halsader alle punten in de cyclus om de snelheidsmeting te verkrijgen.

2. Euthanasie en weefselafname

1. Bereid aluminiumfolieboten voor op het snel bevriezen van weefsel (Figuur 3).
2. Aan het einde van een onderzoek wordt het dier geëuthanaseerd door een overdosis isofluraan in een concentratie van 5% en bilaterale pneumothorax of cervicale dislocatie (alleen cardiaal onderzoek).
3. Gebruik een tang om de huid te tenten, knip de tenthuid met een schaar over de nek voor het vaatstelsel of net onder het borstbeen voor het hart.
4. Snijd de huid- en spierlagen om het vaatstelsel bloot te leggen of snijd door het bot om het hart bloot te leggen.
5. Gebruik stompe dissectie met wattenstaafjes om het hart of vaatstelsel te isoleren van omliggende weefsels, inclusief vet. Zorg ervoor dat u de halsslagader van de zenuw scheidt. Verwijder het hart en de bloedvaten met behulp van chirurgisch gereedschap.
   OPMERKING: Hechtingen kunnen worden gebruikt om het vaatstelsel te verwijderen door proximaal en distaal te hechten voordat de bloedvaten worden verwijderd.
6. Leg weefsel op een vooraf gelabelde boot van aluminiumfolie en plaats de boot in vloeibare stikstof (Figuur 3).
7. Bewaar weefsel bij -80 °C tot het tijd is voor cryosectie. Transporteer weefsel met droogijs om de temperatuur op peil te houden.

3. Beeldvorming met massaspectrometrie

1. Cryosecties en montage op optimale snijtemperatuur (OCT) op glazen geleiders
   1. Stel de cryostaattemperatuur in op -25 °C en plaats het mes.
   2. Bereid een metalen klauwplaat voor door OCT aan te brengen en deze in de cryostaat te laten bevriezen.
   3. Bevestig de basis van het hart aan de voorbereide metalen klauwplaat met behulp van OCT (Figuur 4A). Laat OCT het betreffende monstergebied niet raken, omdat OCT de massaspectra (polyethyleenglycol [PEG]-verontreiniging) zal besmetten en interessante lipidesignalen zal onderdrukken.
      OPMERKING: Optie om watermontage uit te voeren om verontreiniging van het sample te voorkomen. Zie het aanvullende protocol hieronder voor instructies.
   4. Op basis van het belang van ruimtelijke uitlijning in deze methodologie, kunt u de geschaalde digitale weergave van het hart gebruiken die door de MATLAB GUI wordt gegeven om de doorsnede te begeleiden (Figuur 4B).
   5. Tel elke omwenteling (10 μm) tijdens het snijden en noteer de diepte in millimeters voor elke plak die op de objectglaasje moet worden gemonteerd.
      OPMERKING: Het is noodzakelijk om specifieke locaties in het hart of vaatstelsel bij te houden voor een nauwkeurige overeenkomst met de digitale weergave van de ultrasone gegevens die door MATLAB worden verstrekt.
   6. Ontdooi monteer weefselsecties (10 μm dik) op microscoopglaasjes.
      OPMERKING: Het type objectglaasjes is afhankelijk van de gebruikte massaspectrometer. Elke dia bevat een sectie uit elk deel van het hart. Er zijn minimaal drie dia's nodig (positieve ionenmodus, negatieve ionenmodus, extra).
   7. Voor n = 1/groep doorsnijdt u het hart via de lange as om moleculaire veranderingen van top tot basis te visualiseren.
   8. Voor vasculatuur, sluit het weefsel in gelatine en vries het snel in voordat u¹¹ doorsnijdt.
   9. Bewaar de dia's in glaasjes bij -80°C tot massaspectrometrie-beeldvormingsexperimenten.
   10. Bij het uitvoeren van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) om lipiden of metabolieten verder te identificeren en te kwantificeren, snijdt u seriële weefselsecties van ~60-100 μm en verzamelt u ze in buisjes van 0,5-2 ml voordat u ze invriest.
2. Cryosectie en watermontageweefsel op glasplaatjes
   1. Vul een bekerglas met hoogwaardig vloeistofchromatografiewater (HPLC) en zet opzij met spuiten van 5 ml en 1 ml.
   2. Stel de cryostaattemperatuur in op -25 °C en plaats het mes.
   3. Plaats een tang in de cryostaat om af te koelen voordat u deze monteert.
   4. Zuig 5 ml HPLC-water op in een spuit en plaats het in de cryostaat.
   5. Vlak voordat de spuit volledig is ingevroren, giet u het water op de metalen boorkop en laat u het volledig bevriezen.
   6. Zuig 1 ml HPLC-water op en plaats de spuit in de cryostaat.
   7. Plaats na ongeveer 30-60 s een klein puntje gedeeltelijk gestold water op het midden van de klauwplaat. Pak het hart onmiddellijk met een tang vast en plaats het in de stip voordat het volledig bevriest. Houd het hart op zijn plaats totdat het omringende water volledig bevroren is.
      OPMERKING: Het hart kan worden gemonteerd door een top of basis, afhankelijk van het interessegebied. Voor dit onderzoek wordt de basis gemonteerd met de top naar buiten gericht.
   8. Voer de rest van de stappen voor deze methode uit zoals beschreven in stap 3.1.
3. Matrix toepassing
   1. Haal het glaasje uit de vriezer en plaats het in een exsiccator totdat het glaasje droog is.
   2. Zet de HTX M3+ sproeier aan, open de HTX app op de laptop en selecteer methode in het midden van het scherm. Standaard matrixconcentraties zijn te vinden in de opgeslagen methoden (methoden aan de linkerkant van het scherm > OI_usermethods > matrix).
      1. Stel voor dit werk de temperatuur van de sproeier in op 75 °C, het debiet op 100 μL/min en de druk op 10 psi.
   3. Noteer de voorbeeldnaam, polariteit, matrix, oplosmiddel en concentratie in het laboratoriumnotitieboekje. Bereken de hoeveelheid matrix die nodig is per concentratie (bijv. 5 ml bij 10 mg/ml = 50 mg matrix).
   4. Maak oplosmiddel (bijv. 70% MeOH).
      1. Bereid voor dit werk 40 mg/ml 2,5-dihydroxybenzoëzuur (DHB) matrixoplossing voor de positieve modus en 10 mg/ml 9-aminoacridine (9AA) matrixoplossing voor de negatieve modus. Maak beide matrices met een 70% MeOH-oplosmiddel. Volg de stappen 3.3.2 voor andere gangbare matrices en spuitparameters.
   5. Weeg de matrix en voeg de matrix toe aan een conische buis van 15 ml. Zorg ervoor dat het bedrag dicht bij het vereiste bedrag ligt dat in stap 3.3.3 is berekend, maar niet exact hoeft te zijn. Bereken de hoeveelheid oplosmiddel op basis van de gemeten massa.
   6. Voeg oplosmiddel toe aan de conische buis met behulp van een pipet.
      OPMERKING: Het volume is gebaseerd op de massa gemeten in stap 3.3.5.
   7. Sonificeer het mengsel gedurende 10 minuten. Terwijl de matrix wordt gesonificeerd, verwijdert u de dia van de exsiccator
   8. Open de spuitbak, plaats de dia in de linkerbenedenhoek en plak de randen vast.
      OPMERKING: Vouw het ene uiteinde van de tape om deze gemakkelijk te kunnen verwijderen.
   9. Selecteer het spuitgebied van het monster . Sluit de lade.
   10. Gebruik een spuit en een filter en giet de matrix in de spuit en filtreer vervolgens de matrix door de spuit in de injectieflacon met het zwarte deksel aan de linkerkant van de sproeier.
   11. Plaats de injectieflacon terug op zijn plaats op de sproeier en plaats de D-line-slang in de injectieflacon.
       OPMERKING: Zorg ervoor dat de buis de bodem van de injectieflacon niet raakt en volledig is ondergedompeld in de vloeistof.
   12. Zet het inerte gas aan en zorg ervoor dat de meter op de sproeier 10 psi aangeeft. Druk op start. Zodra de sproeier op de gewenste temperatuur is, selecteert u de knipperende start.
   13. Nadat de spray is voltooid, opent u de tray, verwijdert u het monster en plaatst u het in de MALDI-glaasjeshouder of terug in de exsiccator (Figuur 4C).
   14. Scan de MALDI diahouder en schuif de scanner erop, of maak een foto met een telefoon. Sla de foto op een flashstation op voor gebruik met MSI.
   15. Selecteer de juiste wasbeurt of de volgende spray op de sproeier. Verplaats de D-lijn van de matrixflacon in de afvalbeker als u ze wast.
   16. Spuit methanol op de bak en veeg af om schoon te maken. Schakel stikstof uit.
4. MALDI MSI
   1. Navigeer op de computer naar Synapt, controleer of de polariteit is gewijzigd in de gewenste modus en schakel over als dat niet het geval is.
   2. Laad de dia in het instrument op de MALDI-bron en klik met behulp van de software op de laadknop op de computer.
   3. Verplaats de afbeelding (stap 1.2.17) naar de map Afbeeldingen in de map Project .
   4. Navigeer naar HD-beeldvorming en open het vorige project (een project dat dezelfde matrix gebruikt).
   5. Registreer in een laboratoriumnotebook het massabereik, de botsingsenergie en de overdracht ervan, laserenergie, neg/pos-modus.
   6. Navigeer in HD Imaging naar het pictogram voor de witte pagina. Klik vervolgens op de vervolgkeuzepijl en selecteer nieuwe plaat.
   7. Blader om de afbeelding te vinden in de projectmap > de map Afbeeldingen en open deze.
   8. Verander het plaattype naar MALDI-standaard en definieer de randen van de plaat (kies 4 hoeken die hieronder worden weergegeven met rode plustekens).
      OPMERKING: Het vak linksboven is bedoeld om naar elke hoek te navigeren. Het vak rechtsboven is voor het selecteren van de hoeken. Het onderste vak is alleen voor het visualiseren van de hele dia.
   9. Navigeer naar het kleine patroontabblad in de linkerbovenhoek en klik op potlood of andere rechthoek- of cirkelopties om weefsel te schetsen. Omlijn het weefsel met de linkermuisknop en klik met de rechtermuisknop om te voltooien.
   10. De pixelgrootte is standaard 50 μm. Verander indien nodig.
   11. Klik op Opslaan als en navigeer naar Project Imaging AcqFolder en label als dianaam (JJJJMMDD-indeling). Sla dan op.
   12. Klik op de knop Mass Lynx in het midden bovenaan om te exporteren naar Mass Lynx.
   13. Navigeer naar Mass Lynx-software.
   14. Klik op Bestand > open de projectmap. Bewerk de bestandsnaam en tekstnaam van de dia (JJJJMMDD-indeling).
   15. Klik met de rechtermuisknop op het MS-bestand, blader en kies de huidige dia.
   16. Klik nogmaals met de rechtermuisknop op het MS-bestand en klik op Bewerken. Dubbelklik met de linkermuisknop op het blauwe vak.
   17. Navigeer naar scancondities. Zoek broninstellingen en wijzig deze in door de gebruiker gedefinieerd. Navigeer vervolgens naar de juiste projectmap > verkregen map > huidige dia > OKAY.
   18. Sla op door op Opslaan als te klikken en voeg de naam van de dia toe.
   19. Kalibreer het instrument met behulp van een referentieverbinding (bijv. rode fosfor)
       1. Navigeer naar Synapt (kalibreren). Klik op de afspeelknop om te beginnen met het verzamelen van gegevens. Label als YYYYMMDD_cal1 (bijvoorbeeld 20230614_cal1).
       2. Zorg ervoor dat het hetzelfde massabereik heeft van 50 - 2000. Laserenergie kan ongeveer 175 zijn.
       3. Druk op laserplay en klik vervolgens op de volgende knop. Laat het oplopen tot ongeveer 15 of 20. Klik op de rode stop.
       4. Navigeer naar W-console.
       5. Maak een kalibratie en klik op start. Klik onder Kalibratieprofieleditor op bestand > nieuw. Typ YYYYMMDD_cal1.
       6. Bewerk het massabereik naar het gewenste massabereik voor het project (bijvoorbeeld 50-2000).
       7. Kies voor handmatige kalibratie. Kies de resolutiemodus en klik op bewerken. Selecteer rode fosfor als referentieverbinding.
       8. Klik op het bestand met onbewerkte gegevens en scrol helemaal naar beneden (het zou moeten zijn wat zojuist is verkregen).
       9. Ga onderaan naar de geschiedenis, selecteer Acc-massa > oké > oké.
       10. Blijf op volgende en oké klikken totdat de startknop wordt weergegeven en druk op start.
       11. Navigeer naar het groene vinkje en kijk welke pieken niet zijn gevonden.
   20. Navigeer naar Mass Lynx (Start de daadwerkelijke run voor experimentele samples).
   21. Druk op de afspeelknop en controleer of het aantal samples correct is
   22. Navigeer naar HD-beeldvorming.
   23. Controleer of de pixelgrootte nog steeds is ingesteld op
   24. Navigeer naar Synapt om de polariteit te controleren.
   25. Klik op de cameraknop om er zeker van te zijn dat deze beweegt en de laser afvuurt.
   26. Controleer en zorg ervoor dat het gegevens verzamelt. Het verkregen massaspectrum moet worden weergegeven op de Synapt-pagina.
5. MS-analyse
   1. Gebruik HD Imaging-software en Mass Lynx voor analyse.
   2. Verwerk beeldvormingsgegevens met behulp van het tabblad Proces in HD Imaging.
   3. Visualiseer moleculaire ionenbeelden, ook wel MS-beelden genoemd, in HD-beeldvorming op het tabblad Analyse . Een heatmap van een moleculair ionbeeld geeft de intensiteit van dat m/z-ion over een gebied weer (Figuur 5). Gebruik de overlays van MS-afbeeldingen om de ruimtelijke verdeling van moleculen weer te geven (Figuur 6 en Figuur 7).
   4. Normaliseer gegevens met behulp van TIC of geschikte normalisatie voor beeldvorming.
   5. Identificeer m/z-pieken die ruimtelijk correleren met interessegebieden. Voer een ruimtelijke correlatie (R > 0,65) uit op HD-beeldvorming om co-gelokaliseerde pieken te identificeren.
   6. Zoeken naar vermeende lipide-identificatie van deze pieken met LipidMaps¹⁶ en METASPACE¹⁷.
   7. Bevestig lipide-annotaties met daaropvolgende LC-MS-gegevens. Gebruik Metaboanalyst voor statistische analyse van LC-MS-gegevens.

Resultaten

De hierboven beschreven beeldvormingsprotocollen werden gebruikt voor twee voorbereidende onderzoeken: myocardinfarct (MI) remodellering en vasculaire veroudering. Voor de cardiale experimenten werd een permanente kransslagaderligatieoperatie uitgevoerd om een acuut myocardinfarct te induceren^18,19. 4D-echografie en MALDI MSI werden progressief uitgevoerd op hetzelfde weefsel, waarbij fysiologische en moleculaire veranderingen aa...

Discussie

Beeldvorming in de VS kan afhankelijk zijn van de operator, maar het gebruik van anatomische oriëntatiepunten en adequate training kan de vooringenomenheid van de gebruiker beperken. 2D-echografie is bijzonder gevoelig voor variabiliteit tussen gebruikers omdat weergaven hoekafhankelijk zijn, terwijl 4DUS minder gevoelig is omdat acquisitie het hele volume omvat en hoekonafhankelijk is. Er werd ook vastgesteld dat de reproduceerbaarheid van het beeld gemakkelijker te bereiken is vanwege ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB)	Supelco,  >99.0% (HPLC)	85707-10MG-F	DHB matrixsubstance voor MALDI-MS; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/85707?cm_sp=Insite-_-wimsShippingEmailRecs_wims EmailAPI_wimsGruCrossEntropy-_-wimsEmailAPI10-3
9-aminoacridine (9AA)	Supelco,  ≥99.5% (HPLC)	92817-1G	9-Aminoacridine matrixsubstance voor MALDI-MS; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/92817?srsltid=AfmBOooiQjQ4pWv_XxITkU 4Lkm0UnHXKekGS_ dFl7V40V9QLWoPpNLoc
Aquasonic Ultrasound Gel	Parker Laboratories	Parker 01-02	Ultrasound Gel; https://www.parkerlabs.com/products/aquasonic-100-ultrasound-transmission-gel/
Benchtop Dewar Flasks	ThermoScientific	4150-2000	Container voor vloeibare stikstof; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4150-4000?gclid=Cj0KCQjwpvK4BhDUARIsA DHt9sQVc2f-NxN04Nb5Mv F6TZ7GLHWWDEeqDYmEvtKJSQ YHDeVgZ9qylvYaAs27EALw_wcB &source=google_shopping&ISO_ CODE=us&LANG_CODE=en&ef_id =Cj0KCQjwpvK4BhDUARIsADHt9 sQVc2f-NxN04Nb5MvF6TZ7GLHWWDE eqDYmEvtKJSQYHDeVgZ9qylvYa As27EALw_wcB:G:s&s_kwcid=AL!3652 !3!716188292869!!!g!2366243726129 !!21787513085!171591181194&ev_chn =shop&cid=0se_gaw_30092024_ PBYTXL&source=google_shopping &ISO_CODE=us&LANG_CODE= en&gad_source=1
Cryostat	Leica Biosystems	CM Series	https://www.leicabiosystems.com/us/histology-equipment/cryostats/
Dessicator	VWR	89054-052	https://us.vwr.com/store/product/9104882/desiccator-plastic-ace-glass-incorporated
Epredia MX35 Premier Disposable Low-profile Microtome Blades	Fisher Scientific	3052835	Cryostat blade; https://www.fishersci.com/shop/products/mx35-premier-disposable-low-profile-microtome-blades/3052835
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-53A	Conical Tubes; https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-15ml-conical-centrifuge-tubes-5/1495953A?gclid=Cj0KCQjwpvK4BhDUARIsA DHt9sSBcy5n-lhShligJUOX5KKVGn0bt87 8AB2_muOD2PPTue1phpZgeqwa AqgiEALw_wcB&ef_id=Cj0KCQjw pvK4BhDUARIsADHt9sSBcy5n-lhS hligJUOX5KKVGn0bt878AB2_muO D2PPTue1phpZgeqwaAqgiEALw_ wcB:G:s&ppc_id=PLA_goog_20861 45674_81843405034_1495953A__ 386247001345_165426395473886 37329&ev_chn=shop&s_kwcid=AL!4428!3 !386247001345!!!g!856907751004!& gad_source=1
Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	EP022364120	Centrifuge tubes; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/ep022364120?utm_source=google%2Cgoogle&utm _medium=organicshopping%2Ccpc&utm _campaign=21043330280&utm_ content=&gclid=Cj0KCQjwpv K4BhDUARIsADHt9sTHRD35k CHPtfI2A41axodnMVr6a1eBKk zM4bSUYQAyfEKo3UgTAEQa Ap7wEALw_wcB
Gas Nitrogen	Airgas	N/A
Glass microscope slides	Electron Microscopy Sciences	71873-02	https://www.emsdiasum.com/positive-charge-microscope-slides
Liquid Nitrogen	Airgas	N/A
Mass Spectrometer	Waters	Synapt G2-Si	https://www.waters.com/waters/en_US/SYNAPT-G2-Si-Mass-Spectrometry/nav.htm?locale=en_mkcid=1000251Foodety%3C/a%3E&cid=134740653&bcid= 134528734
Matrix Sprayer	HTX Technologies	M3+	https://www.htximaging.com/htx-m3-sprayer
Methanol (HPLC), >99.9%	Fisher Chemical	A4524	Methanol; https://www.fishersci.com/shop/products/methanol-hplc-fisher-chemical-9/A4524?crossRef=A4524#?keyword=A4524
Preclinical Ultrasound System	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 3100	https://www.visualsonics.com/product/imaging-systems/vevo-3100; Vevo F2 heeft de Vevo 3100 in productie vervangen. Systeem bevat isofluraan verdamper en inductiebox.
Reynolds Wrap	N/A