Dit protocol beschrijft een methode voor het induceren van de verspreiding van juvenielen van de derde fase (pre-dauer juvenielen, JIII.) van Bursaphelenchus xylophilus in cryptobiose door osmotische regulatie van kaliumchloride (KCl) ionen. Deze methode kan technische ondersteuning bieden voor onderzoek naar de stressbestendigheidsmechanismen van B. xylophilus.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Induceren van de inducatie van verspreidingsjuvenielen van Bursaphelenchus xylophilus in de derde fase in cryptobiose door osmotische regulatie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cryptobiose is een toestand waarin organismen bijna al hun interne water verliezen en onder extreme omgevingsstress anhydrobiose ingaan. De verspreide juvenielen van het derde stadium (pre-dauer juvenielen, 
) van Bursaphelenchus xylophilus kunnen cryptobiose binnendringen door uitdroging en herleven bij rehydratatie wanneer de omgevingsomstandigheden verbeteren. Osmotische regulatie is cruciaal voor hun overleving in dit proces. In deze studie werden exemplaren van B. xylophilus verzameld uit dode Pinus massoniana als gevolg van dennenverwelkingsziekte in Ningbo, provincie Zhejiang, China. Na onderdompeling in een oplossing van 8% kaliumchloride (KCl) kwam B. xylophilus in een cryptobiotische toestand na geleidelijke dehydratatie als gevolg van verhoogde externe osmotische druk door natuurlijke waterverdamping. B. xylophilus kon bestand zijn tegen stress bij lage temperaturen bij -20 °C. B. xylophilus kon herleven bij rehydratatie, met een overlevingspercentage van 92,1%. Dit proces kan de toegang van B. xylophilus tot cryptobiose reguleren, waardoor ze bestand zijn tegen extreme omgevingen. Deze methode die in onze studie wordt beschreven, is eenvoudig en betrouwbaar en biedt technische ondersteuning voor het bestuderen van de stressweerstandsmechanismen van B. xylophilus.
Inleiding
Dennenverwelkingsziekte is een van de ernstigste bosziekten in China1. Het dennenaaltje Bursaphelenchus xylophilus (B. xylophilus) vormt een aanzienlijke bedreiging voor dennensoorten zoals Pinus massoniana (P. massoniana) door zich in de gastheer voort te planten, wat leidt tot snelle verwelking en dood. Onder ongunstige omgevingsomstandigheden na de dood van de gastheer kunnen de reproductieve juvenielen van B. xylophilus pre-dauer juvenielen (). Deze jonge exemplaren zoeken insectenvectoren om hun overdracht en verspreiding voort te zetten, waardoor dennenbossen op grote schaal afsterven2.
Cryptobiose is een toestand waarin organismen bijna al hun interne water verliezen en onder extreme omgevingsstress in anhydrobiose terechtkomen3. In dit proces drogen organismen geleidelijk uit, wat resulteert in gestopte beweging, verminderd metabolisme en een opgeschorte levenscyclus4. Onder geschikte omstandigheden kunnen ze herstellen na rehydratatie. Cryptobiose stelt organismen in staat om extreme omgevingen, zoals lage temperaturen, te weerstaan en hun levensduur te verlengen5. Nematoden die 30.000 jaar in cryptobiose overleefden, werden gevonden in Antarctische permafrost6.
Eerdere studies hebben aangetoond dat nematoden zich tijdens uitdroging kunnen aanpassen aan verschillende abiotische stressoren - zoals lage temperatuur, droogte en hoge osmotische druk - door hun oppervlaktedoorlaatbaarheid aan te passen7. Bovendien kunnen nematoden hun lichaam krullen om het oppervlak te verkleinen en waterverlies te minimaliseren. Caenorhabditis elegans reguleert bijvoorbeeld het osmotische evenwicht, waardoor ionen en kleine moleculen vrij door de cuticula kunnen gaan, terwijl grotere moleculen dat niet kunnen8. B. xylophilus vertoont ook cryptobiose. Tijdens de uitdrogings- en rehydratatiefasen van cryptobiose is osmotische regulatie essentieel voor het beheersen van de uitwisseling van stoffen over de cuticula, waardoor het cruciaal is voor het betreden of herstellen van cryptobiose9.
De huidige studie introduceert een methode voor het induceren van cryptobiose in B. xylophilus door middel van osmotische regulatie. Deze methode is eenvoudig, efficiënt en zeer betrouwbaar en biedt technische ondersteuning voor het onderzoeken van de stressbestendigheidsmechanismen van B. xylophilus.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Verzameling van 
B. xylophilus
- Verzameling van geïnfecteerde schijven van P. massoniana
OPMERKING: Alle procedures voldeden aan de administratieve maatregelen voor Pine Wilt Disease Epidemic Area en Infected Wood en andere toepasselijke voorschriften. Een P. massoniana-bos geïnfecteerd door B. xylophilus in Xiangshan County, Ningbo City, provincie Zhejiang, werd geselecteerd als de monsterlocatie. P. massoniana, die stierf aan dennenverwelkingsziekte, werd geveld op de bemonsteringslocatie.- Verzamel ronde boomstammen (5 cm dik) van de bovenste, middelste en onderste delen van de hoofdstam van de gekapte bomen.
- Snijd de verzamelde ronde stammen van P. massoniana in plakjes van 0,5-1 cm dik en snijd ze vervolgens in kleine reepjes van 2-3 cm lang.
- Doe de kleine houtstrips in afgesloten zakken en bewaar ze in een laboratorium voor verder gebruik.
- Extractie van B. xylophilus
- Bevestig een rubberen buis aan het smalle uiteinde van een glazen trechter met lange hals met een diameter van ongeveer 15 cm. Zet de rubberen slang vast met een knijpkraan. Plaats de gemonteerde trechter op een trechterstandaard.
- Wikkel de kleine houtreepjes volledig in een enkele laag tissuepapier en plaats ze vervolgens in de trechter. Voeg gedestilleerd water toe aan de trechter totdat alle houtstroken onder staan.
OPMERKING: Na 12-24 uur te hebben gestaan, migreerden de nematoden uit de houtstroken en nestelden zich op de bodem van de trechter10. Tissuepapier voorkwam dat houtresten zich nestelden en liet nematoden door. - Laat de knijpkraan op de bodem van de trechter langzaam los en laat 2000-5000 μL van het mengsel in een petrischaal (5 cm in diameter) lekken voor microscopisch onderzoek en morfologische identificatie.
- Identificeer B. xylophilus door kenmerken te observeren zoals stiletten, mediane slokdarmbollen, lipidedruppels en "vingerachtige" staartvormen11.
- Breng onder een microscoop de individuele B. xylophilus over op een objectglaasje door 10 μL vloeistof samen met één nematode op te zuigen met telkens een pipet van 10 μL. Herhaal dit proces 30 keer om ongeveer 300 μL van het mengsel met nematoden te verzamelen.
- Steriliseer na extractie van B. xylophilus de resterende houtstrips en geïnfecteerde houtmaterialen om verdere besmetting te voorkomen.
2. Osmotische regeling procesbesturing
- Bereiding van osmotisch regulatiemengsel
- Bereid een waterige oplossing van 8% KCl voor.
- Voeg met behulp van een pipet 10 μl van de 8% KCl-waterige oplossing toe aan het objectglaasje met het mengsel van B. xylophilus, wat ongeveer 310 μl van een mengsel van de nematoden en de KCl-oplossing oplevert.
- Regeling van verhoogde osmotische druk en uitdroging van B. xylophilus
- Plaats het objectglaasje op de microscooptafel en laat het water op natuurlijke wijze verdampen. Het zou de osmotische druk van de omgeving geleidelijk verhogen, waardoor nematoden gedurende ongeveer 30-60 minuten zouden uitdrogen.
OPMERKING: De bediener hoeft alleen maar te wachten tot het water op natuurlijke wijze is verdampt totdat de KCL-kristallen neerslaan en de toestand van de nematoden onder een microscoop te observeren. Het duurt ongeveer 30-60 minuten voordat 310 μL van het mengsel op natuurlijke wijze is verdampt totdat de KCL-kristallen neerslaan. - Observeer het uitdrogingsproces (bijv. body curling, aggregatie, enz.) van B. xylophilus onder de microscoop. Wanneer het water volledig verdampt is en KCl-kristallen neerslaan, stopt B. xylophilus met bewegen en gaat hij cryptobiose binnen.
- Plaats het objectglaasje op de microscooptafel en laat het water op natuurlijke wijze verdampen. Het zou de osmotische druk van de omgeving geleidelijk verhogen, waardoor nematoden gedurende ongeveer 30-60 minuten zouden uitdrogen.
- Behandeling van stress bij lage temperatuur van cryptobiotische B. xylophilus
- Plaats de cryptobiotische B. xylophilus gedurende 24 uur in een omgeving met constante temperatuur van -20 °C.
- Plaats de cryptobiotische
- Regulatie van verminderde osmotische druk en rehydratatie van B. xylophilus
- Voeg ongeveer 300 μL gedestilleerd water toe rond de jonge exemplaren die een behandeling bij lage temperatuur met een pipet hebben ondergaan. Het rehydratatieproces, dat ongeveer 30-60 minuten duurt, vermindert geleidelijk de osmotische druk van hun omgeving.
- Observeer het rehydratatieproces van B. xylophilus (bijv. strekken van het lichaam, hervatting van de beweging, enz.) onder de microscoop. Bereken het overlevingspercentage na 24 uur.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In de 8% KCl-oplossing vertoonde B. xylophilus, toen het water verdampte, aanvankelijk een merkbare "krul" terwijl hij beweeglijk bleef (Figuur 1A). Toen het water volledig was verdampt, stopten de nematoden met bewegen en krulden ze, met ingezakte oppervlakken en opgehoopte lipidedruppeltjes (Figuur 1B), wat aangeeft dat ze in de c...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze studie werd B. xylophilus verzameld uit dode P. massoniana in Ningbo, provincie Zhejiang. Opgemerkt moet worden dat B. xylophilus werd geselecteerd uit een gemengde populatie met verschillende instars. Specifiek werd gekozen voor ronde logs met een hoge dichtheid van B. xylo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gefinancierd door het Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund van het State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding (subsidienummer CAFYBB2020ZY001-2), onderzoeksprojecten van ondernemingen (202404016-4320) en de National Natural Science Foundation of China (NSFC 32271896).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Glass slide | Bioland | GS7101-7525 | 75 mm × 25 mm × 1 mm |
| Long necked glass funnel | Nanjing Kangluoda Experimental Technology | N/A | 150 mm |
| Microscope | Phenix | XSP-35-1600X | PH100-2B41L-IPL |
| Petri dish | Nanjing Kangluoda Experimental Technology | TB-624935792745 | 50 mm × 50 mm |
| Pinchcock | Nanjing Kangluoda Experimental Technology | TB-624973311743 | 36 mm × 11 mm × 55 mm |
| Pipette | Eppendorf | 3123000012 | 10–100 µL |
| Potassium chloride (KCL) | Solarbio Life Science | P9921 | 500 g |
| Rubber tube | Nanjing Kangluoda Experimental Technology | TB-624923457094 | 7 mm × 5 mm |
| Sterilizer | BinJiang | https://detail.1688.com/offer/644766597053.html?_t=1730892390541&spm= a2615.7691456.co_0_0_wangpu _score_0_0_0_0_1_0_0000_0.0 | 75L |
| Tissue paper | Heart to heart imprint | M3 | 22,5 cm × 21,5 cm |
Referenties
- Li, Y., Zhang, X. Analysis on the trend of invasion and expansion of Bursaphelenchus xylophilus. Forest Pest and Disease. 37 (5), 1-4 (2018).
- Futai, K. Pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Annu Rev Phytopathol. 51 (51), ?61(2013).
- Crowe, J. H., Cooper, A. F. Cryptobiosis. Sci Am. 225, 30-36 (1971).
- Wharton, D. A. Anhydrobiosis. Curr Biol. 25, 1107-1125 (2015).
- Browne, J., Tunnacliffe, A., Burnell, A. Anhydrobiosis: plant desiccation gene found in a nematode. Nature. 416 (6876), 38(2002).
- Shatilovich, A. V., et al. Viable nematodes from late Pleistocene permafrost of the Kolyma river lowland. Dokl Biol Sci. 480 (1), 100-102 (2018).
- Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Osmotic regulation of seamless tube growth. Nat Cell Biol. 15 (2), 137-139 (2013).
- Erkut, C., et al. Trehalose renders the dauer larva of Caenorhabditis elegans resistant to extreme desiccation. Curr Biol. 21 (1), 1331-1336 (2012).
- Pan, L., et al. Third-stage dispersal juveniles of Bursaphelenchus xylophilus can resist low-temperature stress by entering cryptobiosis. Biology. 10 (8), 785(2021).
- Mao, X. F., Li, H. X., Chen, X. Y., Hu, F. Extraction efficiency of soil nematodes by different methods. Chinese J Ecol. 23 (3), 149-151 (2004).
- Pan, L., et al. Isolation and identification of pine wood nematode in Pinus koraiensis in Fengcheng, Liaoning province. Forest Pest and Disease. 38 (1), 4(2019).
- Pan, L., Cui, R., Li, Y., Feng, Y., Zhang, X. Investigation of pinewood nematodes in Pinus tabuliformis Carr. under low-temperature conditions in Fushun, China. Forests. 11 (9), 993(2020).
- Madin, K. A. C., Crowe, J. H. Anhydrobiosis in nematodes: Carbohydrate and lipid metabolism during dehydration. J Exp Zool. 3, 193(2010).
- Wharton, D. A. Anhydrobiosis: The model worm as a model. Curr Biol. 21 (15), 578-579 (2011).
- Li, Y., Zhang, X. High risk of invasion and expansion of pine wood nematode in the middle temperate zone of China. J Temperate Res. 1 (1), 4(2018).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
