Methodenartikel

Induceren van de inducatie van verspreidingsjuvenielen van Bursaphelenchus xylophilus in de derde fase in cryptobiose door osmotische regulatie

859 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67350

⸱

27 december 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
11State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Institute of Ecological Conservation and Restoration, Chinese Academy of Forestry, 2Comprehensive Experimental Center in Yellow River Delta of Chinese Academy of Forestry, 3Tianjin Institute of Forestry Science, Chinese Academy of Forestry, 4Ningbo Yongsen Biotechnology Co. Ltd, 5Xiangshan Natural Resources and Planning Bureau of Zhejiang

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode voor het induceren van de verspreiding van juvenielen van de derde fase (pre-dauer juvenielen, JIII.) van Bursaphelenchus xylophilus in cryptobiose door osmotische regulatie van kaliumchloride (KCl) ionen. Deze methode kan technische ondersteuning bieden voor onderzoek naar de stressbestendigheidsmechanismen van B. xylophilus.

Samenvatting

Cryptobiose is een toestand waarin organismen bijna al hun interne water verliezen en onder extreme omgevingsstress anhydrobiose ingaan. De verspreide juvenielen van het derde stadium (pre-dauer juvenielen, figure-abstract-1) van Bursaphelenchus xylophilus kunnen cryptobiose binnendringen door uitdroging en herleven bij rehydratatie wanneer de omgevingsomstandigheden verbeteren. Osmotische regulatie is cruciaal voor hun overleving in dit proces. In deze studie werden exemplaren van B. xylophilus verzameld uit dode Pinus massoniana als gevolg van figure-abstract-2 dennenverwelkingsziekte in Ningbo, provincie Zhejiang, China. Na onderdompeling in een oplossing van 8% kaliumchloride (KCl) figure-abstract-3 kwam B. xylophilus in een cryptobiotische toestand na geleidelijke dehydratatie als gevolg van verhoogde externe osmotische druk door natuurlijke waterverdamping. figure-abstract-4 B. xylophilus kon bestand zijn tegen stress bij lage temperaturen bij -20 °C. B. figure-abstract-5 xylophilus kon herleven bij rehydratatie, met een overlevingspercentage van 92,1%. Dit proces kan de toegang van figure-abstract-6 B. xylophilus tot cryptobiose reguleren, waardoor ze bestand zijn tegen extreme omgevingen. Deze methode die in onze studie wordt beschreven, is eenvoudig en betrouwbaar en biedt technische ondersteuning voor het bestuderen van de stressweerstandsmechanismen van B. xylophilus.

Inleiding

Dennenverwelkingsziekte is een van de ernstigste bosziekten in China1. Het dennenaaltje Bursaphelenchus xylophilus (B. xylophilus) vormt een aanzienlijke bedreiging voor dennensoorten zoals Pinus massoniana (P. massoniana) door zich in de gastheer voort te planten, wat leidt tot snelle verwelking en dood. Onder ongunstige omgevingsomstandigheden na de dood van de gastheer kunnen de reproductieve juvenielen van B. xylophilus pre-dauer juvenielenfigure-introduction-1 (). Deze jonge exemplaren zoeken insectenvectoren om hun overdracht en verspreiding voort te zetten, waardoor dennenbossen op grote schaal afsterven2.

Cryptobiose is een toestand waarin organismen bijna al hun interne water verliezen en onder extreme omgevingsstress in anhydrobiose terechtkomen3. In dit proces drogen organismen geleidelijk uit, wat resulteert in gestopte beweging, verminderd metabolisme en een opgeschorte levenscyclus4. Onder geschikte omstandigheden kunnen ze herstellen na rehydratatie. Cryptobiose stelt organismen in staat om extreme omgevingen, zoals lage temperaturen, te weerstaan en hun levensduur te verlengen5. Nematoden die 30.000 jaar in cryptobiose overleefden, werden gevonden in Antarctische permafrost6.

Eerdere studies hebben aangetoond dat nematoden zich tijdens uitdroging kunnen aanpassen aan verschillende abiotische stressoren - zoals lage temperatuur, droogte en hoge osmotische druk - door hun oppervlaktedoorlaatbaarheid aan te passen7. Bovendien kunnen nematoden hun lichaam krullen om het oppervlak te verkleinen en waterverlies te minimaliseren. Caenorhabditis elegans reguleert bijvoorbeeld het osmotische evenwicht, waardoor ionen en kleine moleculen vrij door de cuticula kunnen gaan, terwijl grotere moleculen dat niet kunnen8. figure-introduction-2 B. xylophilus vertoont ook cryptobiose. Tijdens de uitdrogings- en rehydratatiefasen van cryptobiose is osmotische regulatie essentieel voor het beheersen van de uitwisseling van stoffen over de cuticula, waardoor het cruciaal is voor het betreden of herstellen van cryptobiose9.

De huidige studie introduceert een methode voor het induceren van cryptobiose in figure-introduction-3 B. xylophilus door middel van osmotische regulatie. Deze methode is eenvoudig, efficiënt en zeer betrouwbaar en biedt technische ondersteuning voor het onderzoeken van de stressbestendigheidsmechanismen van figure-introduction-4 B. xylophilus.

Protocol

1. Verzameling van figure-protocol-1 B. xylophilus

  1. Verzameling van geïnfecteerde schijven van P. massoniana
    OPMERKING: Alle procedures voldeden aan de administratieve maatregelen voor Pine Wilt Disease Epidemic Area en Infected Wood en andere toepasselijke voorschriften. Een P. massoniana-bos geïnfecteerd door B. xylophilus in Xiangshan County, Ningbo City, provincie Zhejiang, werd geselecteerd als de monsterlocatie. P. massoniana, die stierf aan dennenverwelkingsziekte, werd geveld op de bemonsteringslocatie.
    1. Verzamel ronde boomstammen (5 cm dik) van de bovenste, middelste en onderste delen van de hoofdstam van de gekapte bomen.
    2. Snijd de verzamelde ronde stammen van P. massoniana in plakjes van 0,5-1 cm dik en snijd ze vervolgens in kleine reepjes van 2-3 cm lang.
    3. Doe de kleine houtstrips in afgesloten zakken en bewaar ze in een laboratorium voor verder gebruik.
  2. Extractie van figure-protocol-2 B. xylophilus
    1. Bevestig een rubberen buis aan het smalle uiteinde van een glazen trechter met lange hals met een diameter van ongeveer 15 cm. Zet de rubberen slang vast met een knijpkraan. Plaats de gemonteerde trechter op een trechterstandaard.
    2. Wikkel de kleine houtreepjes volledig in een enkele laag tissuepapier en plaats ze vervolgens in de trechter. Voeg gedestilleerd water toe aan de trechter totdat alle houtstroken onder staan.
      OPMERKING: Na 12-24 uur te hebben gestaan, migreerden de nematoden uit de houtstroken en nestelden zich op de bodem van de trechter10. Tissuepapier voorkwam dat houtresten zich nestelden en liet nematoden door.
    3. Laat de knijpkraan op de bodem van de trechter langzaam los en laat 2000-5000 μL van het mengsel in een petrischaal (5 cm in diameter) lekken voor microscopisch onderzoek en morfologische identificatie.
    4. Identificeer figure-protocol-3 B. xylophilus door kenmerken te observeren zoals stiletten, mediane slokdarmbollen, lipidedruppels en "vingerachtige" staartvormen11.
    5. Breng onder een microscoop de individuele figure-protocol-4 B. xylophilus over op een objectglaasje door 10 μL vloeistof samen met één nematode op te zuigen met telkens een pipet van 10 μL. Herhaal dit proces 30 keer om ongeveer 300 μL van het mengsel met nematoden te verzamelen.
    6. Steriliseer na extractie van figure-protocol-5 B. xylophilus de resterende houtstrips en geïnfecteerde houtmaterialen om verdere besmetting te voorkomen.

2. Osmotische regeling procesbesturing

  1. Bereiding van osmotisch regulatiemengsel
    1. Bereid een waterige oplossing van 8% KCl voor.
    2. Voeg met behulp van een pipet 10 μl van de 8% KCl-waterige oplossing toe aan het objectglaasje met het mengsel van figure-protocol-6 B. xylophilus, wat ongeveer 310 μl van een mengsel van de nematoden en de KCl-oplossing oplevert.
  2. Regeling van verhoogde osmotische druk en uitdroging van figure-protocol-7 B. xylophilus
    1. Plaats het objectglaasje op de microscooptafel en laat het water op natuurlijke wijze verdampen. Het zou de osmotische druk van de omgeving geleidelijk verhogen, waardoor nematoden gedurende ongeveer 30-60 minuten zouden uitdrogen.
      OPMERKING: De bediener hoeft alleen maar te wachten tot het water op natuurlijke wijze is verdampt totdat de KCL-kristallen neerslaan en de toestand van de nematoden onder een microscoop te observeren. Het duurt ongeveer 30-60 minuten voordat 310 μL van het mengsel op natuurlijke wijze is verdampt totdat de KCL-kristallen neerslaan.
    2. Observeer het uitdrogingsproces (bijv. body curling, aggregatie, enz.) van figure-protocol-8 B. xylophilus onder de microscoop. Wanneer het water volledig verdampt is en KCl-kristallen neerslaan, figure-protocol-9 stopt B. xylophilus met bewegen en gaat hij cryptobiose binnen.
  3. Behandeling van stress bij lage temperatuur van cryptobiotische figure-protocol-10 B. xylophilus
    1. Plaats de cryptobiotische figure-protocol-11 B. xylophilus gedurende 24 uur in een omgeving met constante temperatuur van -20 °C.
  4. Regulatie van verminderde osmotische druk en rehydratatie van figure-protocol-12 B. xylophilus
    1. Voeg ongeveer 300 μL gedestilleerd water toe rond de jonge exemplaren die een behandeling bij lage temperatuur met een pipet hebben ondergaan. Het rehydratatieproces, dat ongeveer 30-60 minuten duurt, vermindert geleidelijk de osmotische druk van hun omgeving.
    2. Observeer het rehydratatieproces van figure-protocol-13 B. xylophilus (bijv. strekken van het lichaam, hervatting van de beweging, enz.) onder de microscoop. Bereken het overlevingspercentage na 24 uur.

Resultaten

In de 8% KCl-oplossing vertoonde B. xylophilus, toen het water verdampte, figure-results-1 aanvankelijk een merkbare "krul" terwijl hij beweeglijk bleef (Figuur 1A). Toen het water volledig was verdampt, stopten de nematoden met bewegen en krulden ze, met ingezakte oppervlakken en opgehoopte lipidedruppeltjes (Figuur 1B), wat aangeeft dat ze in de cryptobiotische toestand zijn gekomen. Na toevoeging van gedestilleerd water aan hun omgeving, rehydrateerden de nematoden en herleefden ze (Figuur 1C). Nadat het water is verdampt, verschijnen er KCL-kristallen (Figuur 1D). Figuur 1E toont de morfologische kenmerken van figure-results-2 B. xylophilus.

Een uitdrogingsexperiment toonde aan dat in een initiële 8% KCl-oplossing waterverdamping ervoor zorgde figure-results-3 dat B. xylophilus water verloor. Na uitdroging figure-results-4 werd B. xylophilus gedurende 24 uur blootgesteld aan stress bij lage temperaturen bij -20 °C; het gemiddelde overlevingspercentage was 92,1%11. Vergeleken met een overlevingspercentage van 0% in de controlegroep die nog niet in een cryptobiotische toestand was gekomen, suggereerden de bovenstaande gegevens dat uitdroging de overlevingskans van figure-results-5 B. xylophilus onder lage temperaturen aanzienlijk zou kunnen verbeteren.

Tijdens de rehydratatiefase na de cryptobiose van figure-results-6 B. xylophilus, zagen we dat 100% van de nematoden in vivo "bubbels" vertoonden wanneer ze werden overgebracht van 40% KCl-oplossing naar gedestilleerd water (Figuur 2).

figure-results-7
Figuur 1: Het dehydratie-cryptobiose-rehydratatieproces van figure-results-8 B. xylophilus. Deze afbeelding illustreert het cryptobioseproces in figure-results-9 B. xylophilus, inclusief de (A) dehydratatiefase, (B) cryptobiosefase, (C) rehydratatiefase, (D) KCL-kristallisatiefase en (E) figure-results-10 B. xylophilus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-11
Figuur 2: Accumulatie van vetkorrels in niet-gereanimeerde figure-results-12 B. xylophilus. Deze afbeelding toont de toestand van figure-results-13 B. xylophilus na rehydratatie, gekenmerkt door de aanwezigheid van in vivo belvormige vetkorrels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

In deze studie figure-discussion-1 werd B. xylophilus verzameld uit dode P. massoniana in Ningbo, provincie Zhejiang. Opgemerkt moet worden dat figure-discussion-2 B. xylophilus werd geselecteerd uit een gemengde populatie met verschillende instars. Specifiek werd gekozen voor ronde logs met een hoge dichtheid van B. xylophilus , gevolgd door de screening van figure-discussion-3 B. xylophilus. In de winter, wanneer de dagelijkse minimumtemperatuur in de provincie Liaoning rond de -20 °C ligt, kan een groot aantal single-instar figure-discussion-4 B. xylophilus worden verkregen uit dode Pinus tabuliformis, wat het selectieproces in dit experiment vereenvoudigde12.

Tijdens het cryptobiotische proces komt de langzame uitdroging van de nematoden hun overleving ten goede en voorkomt structurele schade aan hun eiwitten13. De uitdrogingstijd is van cruciaal belang bij het bepalen van het overlevingspercentage van figure-discussion-5 B. xylophilus. In deze studie werd een KCl-oplossing met een beginconcentratie van 8% gebruikt, en de concentratie werd geleidelijk verhoogd met de natuurlijke verdamping van water, waardoor figure-discussion-6 B. xylophilus langzaam kon uitdrogen en cryptobiose kon binnendringen. Als het water te snel verdampt of als de nematoden rechtstreeks in een KCl-oplossing met een hoge concentratie worden geplaatst, neemt hun overlevingskans aanzienlijk af.

De methode die in dit onderzoek wordt beschreven, heeft verschillende voordelen. De experimentele materialen zijn gemakkelijk toegankelijk en vereisen alleen KCl-oplossing en gedestilleerd water om de uitdroging en rehydratatie van figure-discussion-7 B. xylophilus te reguleren. De procedures zijn eenvoudig: uitdroging vond plaats door natuurlijke verdamping en rehydratatie werd bereikt door gedestilleerd water toe te voegen. Het hele proces kan binnen 2 uur worden voltooid. Deze methode heeft hoge slagings- en overlevingspercentages, waarbij de meeste figure-discussion-8 B. xylophilus cryptobiose binnengaat na uitdroging en de meerderheid herleeft na rehydratatie, respectievelijk11.

De voorgestelde methode is toepasbaar voor het reguleren van de cryptobiotische toestand van zowel figure-discussion-9 B. xylophilus als de verspreidingsjuvenielen in het vierde stadium (figure-discussion-10)14. Het is echter mogelijk dat het niet effectief is voor de voortplantingsplichtige B. xylophilus.

In de afgelopen jaren heeft de verwelkingsziekte van de pijnboom, veroorzaakt door B. xylophilus , zich uitgebreid van Zuid-China naar noordelijke gebieden. figure-discussion-11 B. xylophilus, die in de pijnbomen in deze koudere noordelijke regio's leeft, heeft de neiging om een grotere kouderesistentie te vertonen15. De voorgestelde methode kan cryptobiose induceren in figure-discussion-12 B. xylophilus, waardoor hun weerstand tegen kou en droogte wordt verbeterd. Gezamenlijk kan deze methode technische ondersteuning bieden voor het bestuderen van de stressbestendigheidsmechanismen van B. xylophilus en het transmissiemechanisme van dennenverwelkingsziekte.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door het Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund van het State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding (subsidienummer CAFYBB2020ZY001-2), onderzoeksprojecten van ondernemingen (202404016-4320) en de National Natural Science Foundation of China (NSFC 32271896).

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Glass slideBiolandGS7101-752575 mm × 25 mm × 1 mm
Long necked glass funnelNanjing Kangluoda Experimental TechnologyN/A150 mm
MicroscopePhenixXSP-35-1600XPH100-2B41L-IPL
Petri dishNanjing Kangluoda Experimental Technology TB-62493579274550 mm × 50 mm
PinchcockNanjing Kangluoda Experimental Technology TB-62497331174336 mm × 11 mm  × 55 mm
PipetteEppendorf312300001210–100 µL
Potassium chloride (KCL)Solarbio Life ScienceP9921500 g
Rubber tubeNanjing Kangluoda Experimental TechnologyTB-6249234570947 mm × 5 mm
SterilizerBinJiang https://detail.1688.com/offer/644766597053.html?_t=1730892390541&spm=
a2615.7691456.co_0_0_wangpu
_score_0_0_0_0_1_0_0000_0.0		75L
Tissue paper Heart to heart imprintM322,5 cm × 21,5 cm
```

Referenties

  1. Li, Y., Zhang, X. Analysis on the trend of invasion and expansion of Bursaphelenchus xylophilus. Forest Pest and Disease. 37 (5), 1-4 (2018).
  2. Futai, K. Pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Annu Rev Phytopathol. 51 (51), ?61(2013).
  3. Crowe, J. H., Cooper, A. F. Cryptobiosis. Sci Am. 225, 30-36 (1971).
  4. Wharton, D. A. Anhydrobiosis. Curr Biol. 25, 1107-1125 (2015).
  5. Browne, J., Tunnacliffe, A., Burnell, A. Anhydrobiosis: plant desiccation gene found in a nematode. Nature. 416 (6876), 38(2002).
  6. Shatilovich, A. V., et al. Viable nematodes from late Pleistocene permafrost of the Kolyma river lowland. Dokl Biol Sci. 480 (1), 100-102 (2018).
  7. Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Osmotic regulation of seamless tube growth. Nat Cell Biol. 15 (2), 137-139 (2013).
  8. Erkut, C., et al. Trehalose renders the dauer larva of Caenorhabditis elegans resistant to extreme desiccation. Curr Biol. 21 (1), 1331-1336 (2012).
  9. Pan, L., et al. Third-stage dispersal juveniles of Bursaphelenchus xylophilus can resist low-temperature stress by entering cryptobiosis. Biology. 10 (8), 785(2021).
  10. Mao, X. F., Li, H. X., Chen, X. Y., Hu, F. Extraction efficiency of soil nematodes by different methods. Chinese J Ecol. 23 (3), 149-151 (2004).
  11. Pan, L., et al. Isolation and identification of pine wood nematode in Pinus koraiensis in Fengcheng, Liaoning province. Forest Pest and Disease. 38 (1), 4(2019).
  12. Pan, L., Cui, R., Li, Y., Feng, Y., Zhang, X. Investigation of pinewood nematodes in Pinus tabuliformis Carr. under low-temperature conditions in Fushun, China. Forests. 11 (9), 993(2020).
  13. Madin, K. A. C., Crowe, J. H. Anhydrobiosis in nematodes: Carbohydrate and lipid metabolism during dehydration. J Exp Zool. 3, 193(2010).
  14. Wharton, D. A. Anhydrobiosis: The model worm as a model. Curr Biol. 21 (15), 578-579 (2011).
  15. Li, Y., Zhang, X. High risk of invasion and expansion of pine wood nematode in the middle temperate zone of China. J Temperate Res. 1 (1), 4(2018).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Inductie van cryptobiosedennenhouthaalwormjuvenielen in het derde stadiumanhydrobiosedehydratieprotocolstress door lage temperatuurkaliumchloride oplossingoverleving na rehydratie
Induceren van de inducatie van verspreidingsjuvenielen van Bursaphelenchus xylophilus in de derde fase in cryptobiose door osmotische regulatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.