Methodenartikel

Larvale RNA-interferentie in zijderups Bombyx mori door Chitosan/dsRNA-afgifte van nanodeeltjes

2.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67360

⸱

4 oktober 2024

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Guangzhou University

In dit artikel

Samenvatting

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de afgifte van chitosan/dsRNA-nanodeeltjes in larven van zijderups Bombyx mori om genuitschakeling te induceren door inslikken.

Samenvatting

De zijderups, Bombyx mori, is een belangrijk economisch insect met duizenden jaren geschiedenis in China. Ondertussen is de zijderups het modelinsect van Lepidoptera met een goede opeenstapeling van fundamenteel onderzoek. Het is ook het eerste insect in Lepidoptera waarvan het volledige genoom is gesequenced en geassembleerd, wat een solide basis biedt voor onderzoek naar genfunctionaliteit. Hoewel RNA-interferentie (RNAi) veel wordt gebruikt in omgekeerd genfunctioneel onderzoek, is het vuurvast bij zijderupsen en andere Lepidoptera-soorten. Eerder succesvol RNAi-gerelateerd onderzoek om dubbelstrengs RNA (dsRNA) af te leveren, werd alleen via injectie uitgevoerd. Toediening van dsRNA via voeding wordt nooit gemeld. In dit artikel beschrijven we stap-voor-stap procedures om de chitosan/dsRNA nanodeeltjes te bereiden, die door inslikken aan de zijderupslarven worden gevoerd. Het protocol omvat (i) selectie van het juiste stadium van zijderupslarven, (ii) synthese van dsRNA, (iii) bereiding van de chitosan/dsRNA-nanodeeltjes en (iv) het voeden van de zijderupslarven met chitosan/dsRNA-nanodeeltjes. Representatieve resultaten, waaronder bevestiging van gentranscriptie en observatie van fenotype, worden gepresenteerd. dsRNA-voeding is een eenvoudige techniek voor RNAi in zijderupslarven. Omdat zijderupslarven gemakkelijk te kweken zijn en groot genoeg om te bedienen, biedt het een goed model om larvale RNAi in insecten aan te tonen. Bovendien stimuleert de eenvoud van deze techniek meer betrokkenheid van studenten bij onderzoek, waardoor zijderupslarven een ideaal genetisch systeem zijn voor gebruik in een klaslokaal.

Inleiding

De zijderups, Bombyx mori, is een insect dat meer dan 5000 jaar geleden in China werd gedomesticeerd. Vanwege zijn vermogen om zijde te produceren, is de zijderups een belangrijk economisch insect in de Chinese land- en zijdeteelt. De zijderups komt op de tweede plaats na de fruitvlieg als modelinsect. Als modelinsect in Lepidoptera is de zijderups gemakkelijk te kweken, met een grote lichaamsgrootte en veel mutanten. Ondertussen is de zijderups het eerste Lepidoptera-insect waarvan het volledige genoom is gesequenced1. Veel databases met informatie over genoom2, transcriptoom3, expressieve sequentietag (EST)4, niet-coderend RNA5 en microsatelliet6 zijn ook beschikbaar voor het publiek. Bovenstaande feiten maken de zijderups tot een perfect model voor genetisch onderzoek.

RNA-interferentie (RNAi) is een cellulair proces waarbij dubbelstrengs RNA (dsRNA)-moleculen het complementaire boodschapper-RNA (mRNA) binden en snijden, waardoor het uitschakeleffect van het doelgen wordt bereikt. Dit mechanisme is van nature aanwezig in bacteriën om zich te verdedigen tegen de invasie van virussen7. Later werd ontdekt dat RNAi geconserveerd is in dieren, planten en microben. Vanwege zijn krachtige sequentiespecifieke uitschakelingseffect wordt RNAi gebruikt in fundamenteel onderzoek om genexpressie te manipuleren en de genfunctie te bestuderen. RNAi wordt bereikt door de afgifte van dsRNA in cellen.

Bij insecten zijn er drie veelgebruikte manieren om dsRNA af te geven, namelijk micro-injectie, voeding en weken8. Op dit moment worden succesvolle RNAi-meldingen in de zijderupsen door naakte dsRNA-afgifte uitgevoerd door dsRNA-injectie9. De voordelen van micro-injectie zijn de onmiddellijke afgifte van dsRNA in de hemolymfe en een nauwkeurige controle van de dsRNA-hoeveelheid. Er zijn echter ook bepaalde nadelen van micro-injectie. Het is bijvoorbeeld tijdrovend en er zijn delicate apparaten voor nodig. Het is ook belangrijk om de injectienaalden, het injectievolume en de hoeveelheid dsRNA te optimaliseren. Daarom wordt een alternatieve manier nodig om dsRNA aan zijderupsen af te leveren. Omdat het exoskelet van een insect een waterdichte barrière is die is gemaakt van chitine, wordt het weken van insectenlarven om RNAi te bereiken zelden gemeld, wat geen goede optie is voor RNAi bij insecten. Het voeden van dsRNA is arbeidsbesparend, kosteneffectief en gemakkelijk uit te voeren10. Deze methode is ook toepasbaar voor high-throughput genscreening11. Het blijkt echter dat een niet-specifiek DNA/RNA-nuclease, namelijk BmdsRNase, aanwezig is in het sap van de middendarm en de middendarm van de zijderupslarven12. Van dit nuclease is aangetoond dat het dsRNA verteert, bij voorkeur13. Daarom lijkt het moeilijk om naakt dsRNA aan de zijderups te voeren om de genexpressie tot zwijgen te brengen.

Onlangs is bewezen dat dsRNA met nanodeeltjes een goed alternatief is om de RNAi-efficiëntie te verhogen door14 te voeden. Chitosan is een goedkoop, niet-toxisch en biologisch afbreekbaar polymeer, dat kan worden bereid door deacetylering van chitine, een natuurlijk voorkomend en het op één na meest voorkomende biopolymeer na cellulose15. Omdat de aminogroep in de chitosan positief geladen is en de fosfaatgroep op de ruggengraat van het dsRNA negatief geladen is, kunnen de chitosan/dsRNA nanodeeltjes worden gevormd door zelfassemblage van polykationen16. Chitosan/dsRNA-nanodeeltjes zijn effectief in het bereiken van RNAi door larvale voeding in muggen Aedes aegypti en Anopheles gambiae17, katoengevlekte bolworm Earias vittella18 en karmijnrode spintmijt Tetranychus cinnabarinus19.

Om een methodologie te ontwikkelen voor dsRNA-afgifte door zijderupsen te voeden om succesvolle RNAi-efficiëntie te verkrijgen, richt dit rapport zich op het beschrijven van stapsgewijze procedures voor het bereiden van de chitosan/dsRNA-nanodeeltjes en het voeren van de nanodeeltjes aan de zijderupslarven. Deze methodologie is relatief goedkoop, arbeidsbesparend en gemakkelijk te volgen, die kan worden aangepast voor gen-uitschakelingsstudies bij andere insecten. We streven ernaar om een eenvoudiger protocol te bieden voor de Lepidoptera dsRNA-toedieningsmethode met een hogere RNAi-efficiëntie.

Protocol

1. Zijderupssoorten en kweek

  1. Kweek ten minste 120 pas uitgekomen 1einstar zijderupslarven van de B. mori P50-stam met verse moerbeibladeren bij 25 ± 1 °C, fotoperiode 12 uur Licht: 12 uur donker en 75% ± 5% relatieve vochtigheid.

2. Selectie van zijderupslarven

  1. Kies dag 1 van de5e instar-larven voor het RNAi-experiment; De larven van de zijderups groeien snel na dag 3 van de 5einstar , wat ideaal is om de verschillen in het uiterlijk van de larven te vergelijken.
    OPMERKING: Als alternatief kunnen jongere stadia, zoals de 3eof 4einstar , worden gebruikt voor het RNAi-experiment. Het vereist echter een constante dsRNA-behandeling tot de 5einstar , wat relatief duur en materiaalduur is.

3. Synthese van dsRNA

  1. Identificatie van dsRNA-doelfragment: Selecteer de coderende sequentie van een doelgen en stem deze af op andere homologe genen om het geconserveerde gebied te bepalen. Ontwerp genspecifieke primers in het niet-geconserveerde gebied voor daaropvolgende amplificatie van dsRNA-doelfragmenten. Voor RNAi-experimenten bij insecten is het typische dsRNA-doelfragment over het algemeen 400-600 bp. De minimale grootte zou 200 bp kunnen zijn.
    OPMERKING: Om de efficiëntie en het succes van RNAi-experimenten te verbeteren, kan een webgebaseerd hulpmiddel worden gebruikt om het dsRNA-doelwit te ontwerpen, zoals dsRNA Engineer (https://dsrna-engineer.cn/).
  2. Productiesjabloon voor PCR-producten: Voeg een T7 RNA-polymerasepromotor (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') toe aan het 5'-uiteinde van een van de hierboven ontworpen primers. Voer standaard PCR uit om het dsRNA-doelfragment te amplificeren. Laat een 1% agarosegel in 1x TAE lopen om een enkel PCR-product van de verwachte grootte te verifiëren. Zuiver daarna het PCR-product met een zuiveringskit (Tabel met materialen) en gebruik het voor latere transcriptie.
    OPMERKING: Om het doel-PCR-product voor lange termijn op te slaan en hoge opbrengsten te verkrijgen, wordt voorgesteld om het PCR-product aan een plasmide te koppelen. Het plasmide moet vóór de PCR-reactie worden gelineariseerd.
  3. Generatie van dsRNA: Gebruik een T7 RNAi-systeem (tabel met materialen) om het dsRNA te genereren. Stel de reactie in door de componenten bij kamertemperatuur toe te voegen volgens de instructies van de fabrikant. Meng de reactie door voorzichtig te pipetteren en gedurende 30 minuten bij 37 °C te incuberen.
    OPMERKING: Om de opbrengst te maximaliseren, kan de incubatie bij 37 °C worden verlengd tot 2-6 uur. Voor sjablonen die een secundaire structuur of GC-rijk bevatten, kan in plaats daarvan incubatie worden uitgevoerd bij 42 °C om de opbrengst van dsRNA te verbeteren.
  4. Gloeien om dsRNA te vormen: Incubeer de reactie bij 70 °C gedurende 10 minuten en koel vervolgens langzaam af tot kamertemperatuur (~20 min). Hierdoor wordt het dsRNA uitgegloeid.
  5. DNase- en RNase-behandeling: Pipetteer 1 μL van de meegeleverde RNase-oplossing op 199 μL nucleasevrij water om een vers verdunde RNase-oplossing te maken. Voeg 1 μL vers verdunde RNase-oplossing en 1 μL van het meegeleverde RQ1 RNasevrije DNase toe per reactievolume van 20 μL, meng voorzichtig en incubeer bij 37 °C gedurende 30 min. Het enkelstrengs RNA (ssRNA) en het sjabloon-DNA in de reactie worden na deze behandeling verwijderd.
  6. Alcoholprecipitatie: Voeg 1 volume isopropanol of 2,5 volume 95% ethanol samen met 0,1 volume 3 M natriumacetaat (pH 5,2) toe aan de reactie. Meng de reactie door vortexen en incubeer gedurende 5 minuten op ijs om een troebele massa te vormen. Draai gedurende 10 minuten op maximale snelheid in een centrifuge om een witte pellet op de bodem van de buis te verzamelen. Gooi het supernatans weg en was de pellet met 0,5 ml koude 70% ethanol om het resterende zout te verwijderen. Verwijder de ethanol na het wassen. Laat de pellet 15 minuten aan de lucht drogen op kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet met nucleasevrij water in 2-5 keer het initiële reactievolume. Bewaren bij -20 °C of -70 °C.
    OPMERKING: De dsRNA-pellet mag niet te droog worden gedroogd, omdat dit het moeilijk kan maken om volledig te resuspenderen. Om voldoende resuspensie te garanderen, zijn minimaal 2 volumes nodig.
  7. Kwantiteits- en kwaliteitscontrole van dsRNA: Verdun het dsRNA in nucleasevrij water in een verhouding van 1:100 tot 1:300. Bepaal de concentratie van dsRNA met behulp van een microvolumespectrofotometer (Tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant. Om dsRNA te kwantificeren, vermenigvuldigt u de concentratie met het volume. Gebruik agarosegelelektroforese om de kwaliteit van dsRNA te beoordelen. Bereid een 1% agarosegel in 1x TAE en verdun het dsRNA op 1:50 met nucleasevrij water. Gebruik 5 μL verdund dsRNA per baan en kleur de gel in 0,5 mg/ml ethidiumbromide gedurende ten minste 15 minuten voor visualisatie.
    LET OP: dsRNA migreert langzamer dan dsDNA.

4. Bereiding van de chitosan/dsRNA nanodeeltjes

  1. Maak bij kamertemperatuur een buffer van 100 mM natriumacetaat (0,1 M NaC2H3O2 en 0,1 M azijnzuur, pH 4,5 in gedeïoniseerd water) en 100 mM natriumsulfaat (100 mM Na2SO4 in gedeïoniseerd water).
  2. Los gecommercialiseerde chitosan op (uit garnalenschelpen, ≥75% gedeacetyleerd; Tabel met materialen) in 100 mM natriumacetaatbuffer om een 0,02% (m/v) chitosanoplossing te maken.
  3. Los 20 μg dsRNA op in 50 μl nucleasevrij water en voeg het toe aan 50 μl 100 mM natriumsulfaatbuffer om een dsRNA-oplossing van 100 μl te maken.
  4. Voeg 100 μL chitosanoplossing toe aan 100 μL dsRNA-oplossing. Bereid tegelijkertijd een controle voor door 100 μl chitosanoplossing toe te voegen aan 100 μl 50 mM natriumsulfaat. Meng en verwarm de mengsels op 55 °C gedurende 1 min.
  5. Draai het mengsel onmiddellijk met een snelle vortex gedurende 30 s om de vorming van de nanodeeltjes mogelijk te maken.
  6. Centrifugeer het mengsel bij 13.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten om een witte korrel te verkrijgen. Breng het supernatans over in een vers buisje van 1,5 ml. Laat de pellet 10 minuten aan de lucht drogen op kamertemperatuur.
  7. Bepaal de concentratie van dsRNA in het supernatans met behulp van een microvolumespectrofotometer (Tabel met materialen). Gebruik het supernatans van de besturing als een blanco. Vermenigvuldig de concentratie in volume om de totale hoeveelheid dsRNA te berekenen die in het supernatant achterblijft. Bereken het percentage dsRNA dat in de nanodeeltjes is ingekapseld door de hoeveelheid die in het supernatans achterblijft te delen door de starthoeveelheid dsRNA.
    OPMERKING: Hoewel de nanodeeltjes ten minste 15 dagen voor gebruik14 bij 4-37 °C kunnen worden bewaard, wordt aangeraden de nanodeeltjes zo snel mogelijk te gebruiken.

5. De larven van de zijderupsen voeden met chitosan/dsRNA nanodeeltjes

  1. Pluk vers vermolten larven van zijderupsen van de 5einstar (d.w.z. dag 1 van de5e instar ) van dezelfde grootte voor het voedingsexperiment. Plaats de larven afzonderlijk in elk putje van een plaat met 6 putjes voordat u het deksel sluit en verhonger ze gedurende 24 uur.
  2. Spoel verse moerbeibladeren af met gedeïoniseerd water en droog ze af met schoon keukenpapier. De moerbeibladeren moeten droog zijn zonder waterdruppels. Snijd in schijven van moerbeiblad van 1 cm x 1 cm.
  3. Los chitosan/dsRNA-nanodeeltjes voor gebruik op in nucleasevrij water van 500 ng/μl. Verdun de controle-chitosan-nanodeeltjes (bereid in 4.4) met hetzelfde volume nucleasevrij water. Bereid naakt dsRNA voor tot 500 ng/μL in nucleasevrij water.
  4. Gebruik de chitosan/dsRNA-nanodeeltjes voor het RNAi-knockdown-experiment, de controlechitosan-nanodeeltjes als een blanco/negatieve controle. Gebruik het naakte dsRNA om de verschillen met chitosan/dsRNA nanodeeltjes te vergelijken.
  5. Smeer respectievelijk 10 μL chitosan/dsRNA-nanodeeltjes, chitosan en naakt dsRNA op het oppervlak van elke bladschijf. Laat de nanodeeltjesoplossing en dsRNA-oplossing 5 minuten aan de lucht drogen op de bladschijven bij kamertemperatuur.
  6. Voed elke larve met één met nanodeeltjes of dsRNA gecoate bladschijf per dag. Geef de larven gedurende 5 dagen continu met nanodeeltjes of dsRNA-beklede bladschijven. Verse moerbeibladeren kunnen worden verstrekt nadat de gecoate bladschijf elke dag volledig is opgegeten door de larven.
  7. Verdoof op dag 6 de larven op ijs totdat ze niet meer bewegen en ontleed de larven voor bemonstering. Knip de borstkas af met een schaar op een schoon petrischaaltje. Trek de middendarm eruit met een pincet. Verwijder de inhoud in de middendarm en was de middendarm in een andere petrischaal gevuld met nucleasevrij water. Bewaar de middendarm in een buisje van 1,5 ml en bewaar op -70 °C.

6. Bevestiging van gen-uitschakeling

  1. Voer kwantitatieve Real-time PCR (qRT-PCR) uit om de relatieve transcriptkwantificering te berekenen. Er zijn ten minste drie biologische replicaten en drie technische replicaten voor elk biologisch duploat vereist. Ten minste twee referentiegenen worden aanbevolen om het relatieve transcript te normaliseren. Een Bombyx Toll9-2 (BmToll9-2) gen wordt getest. Evalueer de efficiëntie van gen-uitschakeling door de gemiddelde waarde van het relatieve transcript te vergelijken met die van de controlegroep en deze om te zetten in percentages.
    OPMERKING: De qRT-PCR-amplificatieconditie, primerinformatie en relatieve transcriptieberekening zijn te vinden in onze recente publicatie20.
  2. Analyseer het RNAi-fenotype om het gen-uitschakelingseffect te evalueren. Let op de grootte van de larven en cocons. Maak dagelijks foto's om optredens vast te leggen.
    OPMERKING: RNAi kan de morfologie, metamorfose, fysiologie en gedrag beïnvloeden. De observatie van RNAi-gerelateerde fenotypes hangt af van de genen die het doelwit zijn.

Resultaten

Om de RNAi-efficiëntie te evalueren, werd een immuungen gericht tegen BmToll9-2 gekozen voor analyse. Het BmToll9-2-gen is goed gekarakteriseerd in het laboratorium, en gen-uitschakeling door dsRNA-injectie resulteert in lichtere en kleinere larven in onze recente publicatie20. Om de werkzaamheid van RNAi te bevestigen door inname via chitosan/dsRNA-nanodeeltjes, werden chitosan-nanodeeltjes gebruikt als controle en werd naakt dsRNA tegelijkertijd vergeleken.

Vergeleken met de controlegroep, chitosan nanodeeltjes zonder dsRNA, vertoont naakt dsRNA gericht op het BmToll9-2 gen geen uitschakelingseffect. Het voeden van chitosan/dsRNA-nanodeeltjes in de zijderups remt het transcript aanzienlijk, met een knockdown van 79% (Figuur 1). De remming van het relatieve transcript geeft aan dat het BmToll9-2-gen met succes tot zwijgen werd gebracht door inname van chitosan/dsRNA.

De knockdown van het BmToll9-2-gen heeft een aanzienlijke invloed op de groei van de zijderups. Bij het observeren van de larven zijn de BmToll9-2-gedempte larven kleiner dan de controlelarven (Figuur 2A). Bij het vergelijken van de cocons zijn de BmToll9-2-gedempte cocons ook kleiner (Figuur 2B). Chitosan/dsRNA-nanodeeltjes vertonen succesvolle RNAi-effecten in zowel transcript als fenotype in de zijderups.

figure-results-1
Figuur 1: Relatieve transcriptie van BmToll9-2 na inname van chitosan/dsBmToll9-2 nanodeeltjes in B. mori 5e instar-larven. De relatieve mRNA-niveaus van BmToll9-2 in de larven die worden gevoed met chitosan-nanodeeltjes als controle-, naakte dsRNA- en chitosan/dsRNA-nanodeeltjes. Gegevens werden weergegeven als gemiddelden ± standaarddeviatie van drie biologische replicaties. Voor elke biologische replicatie waren er drie technische replicaties. Verschillende letters op de balken geven significante verschillen aan op basis van eenrichtings-ANOVA-analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Fenotype-waarneming na het voeden met chitosan/dsBmToll9-2 nanodeeltjes. Chitosan nanodeeltjes worden gebruikt als controle. (A) Het verschijnen van zijderupslarven na inname van nanodeeltjes. (B) Het verschijnen van cocons van zijderupsen na inname van nanodeeltjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Een goed stadium is belangrijk voor de observatie van het RNAi-fenotype, afhankelijk van de genen die het doelwit zijn. Onze voorlopige resultaten toonden aan dat Toll9-2 betrokken is bij de groei van de zijderups. De grootte en het gewicht van de larven van de zijderupsen nemen snel toe bij de 5einstar 21. Daarom worden de larven vande 5e instar geselecteerd als het stadium voor het chitosan/dsRNA-voedingsexperiment met nanodeeltjes. Het is ook mogelijk om de larven van de 3eof 4einstar te selecteren voor voedingsexperimenten en de ontwikkelingsverschillen bij de 5einstar te observeren. De experimenten met het voeden van nanodeeltjes vereisen echter dagelijks continue voeding14. Het voeden van de larven in een jonger stadium vereist meer dsRNA-preparaat, wat relatief duurder is. Om de bovenstaande redenen stellen we voor om de vers vervellende zijderupslarven van de 5einstar te selecteren als startpunt van het voedingsexperiment met nanodeeltjes.

Optimalisatie van de parameters voor de toevoer van nanodeeltjes is ook belangrijk. Een constante voeding van nanodeeltjes gedurende 5-7 dagen om efficiënt RNAi te bereiken is gebruikelijk in de huidige studies 14,18,22,23. Omdat dsRNA het duurste ingrediënt is in RNAi-experimenten, kunnen nanodeeltjes om de dag aan de larven worden gevoerd, wat kan helpen om de helft van de kosten van dsRNA-bereiding te verminderen. Een andere manier om de kosten te verlagen, is door de hoeveelheid dsRNA die bij het voeren wordt gebruikt te optimaliseren. In dit protocol wordt voor elke larve 5 μg chitosan/dsRNA-nanodeeltjes gebruikt, wat de universele dosis is voor dsRNA-injectie in het laboratorium. Aangezien 5 μg dsRNA een hoge dosis is en remming door toevoer van nanodeeltjes aanzienlijk is. Er wordt gesuggereerd om de hoeveelheid dsRNA in het experiment te verminderen. De impact van de bovenstaande twee parameters op de RNAi-efficiëntie moet echter in toekomstige experimenten worden geëvalueerd.

De verhouding tussen chitosan en dsRNA kan worden geoptimaliseerd. In dit protocol wordt 20 μg chitosan in 100 μL natriumacetaat gemengd met 20 μg dsRNA in 100 μL natriumsulfaat. In het eerste chitosan/dsRNA-rapport over nanodeeltjes wordt 20 μg chitosan in 100 μl natriumacetaat gemengd met 32 μg dsRNA in 100 μl natriumsulfaat16. In sommige andere rapporten wordt 1 μg chitosan in 100 μL natriumacetaat gemengd met 1 μg dsRNA in 100 μL natriumsulfaat18,23. Daarom kon de hoeveelheid chitosan en dsRNA worden geoptimaliseerd om de beste laadefficiëntie van de nanodeeltjes en een optimaal RNAi-uitschakeleffect te bereiken.

Er moet rekening worden gehouden met de opslag van chitosan/dsRNA-nanodeeltjes. De chitosan/dsRNA-nanodeeltjes worden voorafgaand aan het voedingsexperiment bereid en er wordt gesuggereerd dat ze onmiddellijk worden gebruikt. Een recent rapport toonde aan dat chitosan/dsRNA-nanodeeltjes gedurende 15 dagen bij 4 °C, 24 °C en 37 °C werden bewaard en nog steeds stabiel waren19. De chitosan/dsRNA-nanodeeltjes kunnen dus van tevoren worden bereid en bij 4 °C in de koelkast worden bewaard, aangezien dsRNA stabieler is bij lage temperaturen.

Naast dsRNA kan wat klein RNA, zoals klein interfererend RNA (siRNA) en kort haarspeld-RNA (shRNA), worden gebruikt bij de bereiding van nanodeeltjes voor RNAi-experimenten. SiRNA-nanodeeltjes verbeteren bijvoorbeeld de weerstand van planten tegen Pseudomonas syringae24. Levering van shRNA-nanodeeltjes veroorzaakte een succesvol RNAi-effect in de neotropische bruine stinkwants Euschistus heros25. Daarom kunnen nanodeeltjes worden toegepast op alle RNA-moleculen die in het RNAi-experiment worden gebruikt.

De RNAi-efficiëntie in Lepidoptera, inclusief zijderupsen, is naar verluidt refractair26. Toediening van dsRNA gebeurt alleen via injectie in zijderupsen, wat tijdrovend en arbeidskostend is. Met deze chitosan/dsRNA nanodeeltjesafgiftemethode wordt een significant uitschakeleffect waargenomen, hetzij in transcript of fenotype in de larven en cocons van de zijderupsen, mogelijk als gevolg van de verminderde afbraak van dsRNA door de bescherming van chitosan19. Deze methode is arbeidsbesparend en eenvoudig uit te voeren, die kan worden aangepast aan andere insecten. Het gemak van dit protocol kan niet alleen worden toegepast in wetenschappelijk onderzoek, maar ook in klassikaal onderwijs, demonstratie en praktijk. De methode voor de afgifte van nanodeeltjes is een nieuwe richting voor toekomstige biologische bestrijding en plaagbestrijding27.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (31501898), het Science and Technology Program of Guangzhou (202102010465), het Guangzhou Higher Education Teaching Quality and Teaching Reform Project (2022JXGG057) en het onderzoeksproject van de Open Online Course Steering Committee van Guangdong Provincial Universities (2022ZXKC381).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL centrifuge tubeSangonF601620voor dsRNA- of nanodeeltjesreactie
10 μl pipetteEppendorfP13473Gom vloeistof af te zuigen of op te schorsen
100 μl pipetteEppendorfQ12115Gom vloeistof af te zuigen of op te schorsen
2.5 μl pipetteEppendorfP20777Gom vloeistof af te zuigen of op te schorsen
20 μl pipetteEppendorfH19229Eom vloeistof af te zuigen of op te schorsen
200 μl pipetteEppendorfH20588Eom vloeistof af te zuigen of op te schorsen
6-well Clear TC-treated Multiple Well PlatesCostar3516voor het individueel kweken van zijderupsen
AzijnzuurAladdinA116165om TAE te maken
Agarose MBBI Life SciencesA610013voor agarose gel electrophosis
Analytische balansSartoriusBSA224Som ingrediënten te wegen
Centrifuge SartoriusCentrisart A-14Com te centrifugeren om dsRNA of nanodeeltjes te vormen
ChitosanSigma-AldrichC3646om te combineren met dsRNA voor de bereiding van nanodeeltjes
EDTASangonA500895om TAE te maken
EthanolAladdinE130059om TAE te maken, of voor dsRNA precipitatie
DiepvriezerSiemensiQ300om dsRNA of nanodeeltjes op te slaan
GoTaq Green Master MixPromegaM712voor PCR-reactie
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6002voor qRT-PCR-reactie
Isopropanol AladdinI112011voor dsRNA precipitatie
NanoDrop Microvolume UV-Vis SpectrofotometerThermoFisherOneom de concentratie van dsRNA te bepalen
pH meterSartorius PB-10om buffers voor te bereiden
SanPrep Column PCR Product Purification KitSangonB518141voor PCR product zuivering
NatriumacetaatSigma-AldrichS2889om 100 mM natriumacetaatbuffer te maken
Natriumsulfaat Sigma-Aldrich239313om 100 mM natriumsulfaatbuffer te maken
T7 RiboMAX Express RNAi SystemPromegaP1700voor dsRNA synthese
ThermoMixerEppendorfCvoor dsRNA generatie of verwarming van nanodeeltjes
TrisSangonA501492om TAE te maken
Vortex IKAVortex 3om chitosan/dsRNA nanodeeltjes te bereiden

Referenties

  1. Xia, Q., et al. A draft sequence for the genome of the domesticated silkworm (bombyx mori). Science. 306 (5703), 1937-1940 (2004).
  2. Kawamoto, M., Kiuchi, T., Katsuma, S. Silkbase: An integrated transcriptomic and genomic database for bombyx mori and related species. Database (Oxford). 2022, (2022).
  3. Yokoi, K., Tsubota, T., Jouraku, A., Sezutsu, H., Bono, H. Reference transcriptome data in silkworm bombyx mori. Insects. 12 (6), (2021).
  4. Mita, K., et al. The construction of an est database for bombyx mori and its application. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14121-14126 (2003).
  5. Zhou, Q. Z., Zhang, B., Yu, Q. Y., Zhang, Z. Bmncrnadb: A comprehensive database of non-coding rnas in the silkworm, bombyx mori. BMC Bioinformatics. 17 (1), 370(2016).
  6. Prasad, M. D., et al. Silksatdb: A microsatellite database of the silkworm, bombyx mori. Nucleic Acids Res. 33 (Database issue), D403-D406 (2005).
  7. Ding, S. W. Rna-based antiviral immunity. Nat Rev Immunol. 10 (9), 632-644 (2010).
  8. Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: An overview and future directions. Insect Sci. 20 (1), 4-14 (2013).
  9. Liang, Y., et al. Silencing of the immune gene bmpgrp-l4 in the midgut affects the growth of silkworm (bombyx mori) larvae. Insect Mol Biol. 32 (4), 340-351 (2023).
  10. Tian, H., et al. Developmental control of a lepidopteran pest Spodoptera exigua by ingestion of bacteria expressing dsrna of a non-midgut gene. PLoS One. 4 (7), e6225(2009).
  11. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific rna-mediated interference through ingested double-stranded rna in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002(2001).
  12. Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cdna encoding extracellular dsrnase and its expression in the silkworm Bombyx Mori. Insect Biochem Mol Biol. 37 (2), 176-183 (2007).
  13. Liu, J., Swevers, L., Iatrou, K., Huvenne, H., Smagghe, G. Bombyx mori DNA/rna non-specific nuclease: Expression of isoforms in insect culture cells, subcellular localization and functional assays. J Insect Physiol. 58 (8), 1166-1176 (2012).
  14. Christiaens, O., et al. Increased rnai efficacy in Spodoptera exigua via the formulation of dsrna with guanylated polymers. Front Physiol. 9, 316(2018).
  15. Dass, C. R., Choong, P. F. The use of chitosan formulations in cancer therapy. J Microencapsul. 25 (4), 275-279 (2008).
  16. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Mol Biol. 19 (5), 683-693 (2010).
  17. Zhang, X., et al. Chitosan/interfering rna nanoparticle mediated gene silencing in disease vector mosquito larvae. J Vis Exp. (97), e52523(2015).
  18. Sandal, S., et al. Nanoparticle-shielded dsrna delivery for enhancing rnai efficiency in cotton spotted bollworm Earias vittella (lepidoptera: Nolidae). Int J Mol Sci. 24 (11), 9161(2023).
  19. Zhou, H., et al. Chitosan/dsrna polyplex nanoparticles advance environmental rna interference efficiency through activating clathrin-dependent endocytosis. Int J Biol Macromol. 253 (Pt 4), 127021(2023).
  20. Liu, J., et al. Immunological function of bombyx toll9-2 in the silkworm (Bombyx mori) larval midgut: Activation by escherichia coli/lipopolysaccharide and regulation of growth. Arch Insect Biochem Physiol. 116 (4), e22130(2024).
  21. Cheng, L., et al. Characterization of silkworm larvae growth and properties of silk fibres after direct feeding of copper or silver nanoparticles. Mater Design. 129, 125-134 (2017).
  22. Wang, K., et al. Comparison of efficacy of rnai mediated by various nanoparticles in the rice striped stem borer (Chilo suppressalis). Pestic Biochem Physiol. 165, 104467(2020).
  23. Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Chitosan nanoparticles help double-stranded rna escape from endosomes and improve rna interference in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda. Arch Insect Biochem Physiol. 104 (4), e21677(2020).
  24. Qi, J., et al. Rational design of ros scavenging and fluorescent gold nanoparticles to deliver sirna to improve plant resistance to Pseudomonas syringae. J Nanobiotechnol. 22 (1), 446(2024).
  25. Laisney, J., Loczenski Rose, V., Watters, K., Donohue, K. V., Unrine, J. M. Delivery of short hairpin rna in the neotropical brown stink bug, Euschistus heros, using a composite nanomaterial. Pestic Biochem Physiol. 177, 104906(2021).
  26. Terenius, O., et al. Rna interference in Lepidoptera: An overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. J Insect Physiol. 57 (2), 231-245 (2011).
  27. Kolge, H., Kadam, K., Ghormade, V. Chitosan nanocarriers mediated dsrna delivery in gene silencing for Helicoverpa armigera biocontrol. Pestic Biochem Physiol. 189, 105292(2023).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ChitosaananodeeltjesdsRNA afgiftegenstilteRNAi voedingdubbelstrengs RNAvorming van nanodeeltjesfunctionele genstudieLepidoptera model

Gerelateerde artikelen