Methodenartikel

Vergelijkende karyotype-analyse van Lycoris aurea-kruidenpopulaties met behulp van fluorochrome banden en 45S en 5S rDNA-FISH

DOI:

10.3791/67363

⸱

29 november 2024

 ,  , 
1Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province, Huaihua University, 2College of Biological and Food Engineering, Hunan University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol onderzoekt de heterochromatineverdeling in acht populaties van Lycoris aurea (L'Her) Herb, met behulp van gecombineerde PI- en DAPI-chromosoomkleuring, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) met 18S-5.8-26S rRNA-genregio's (45S rDNA-regio's) en 5S ribosomale DNA-sondes.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de variatie in het karyotype in acht populaties te begrijpen, werden gedetailleerde karyotypes minutieus vastgesteld met behulp van chromosomale metingen, fluorescentiebanden en rDNA FISH-signalen. Het aantal 45S rDNA-sites varieert van één tot vijf paren per populatie, waarbij het meest voorkomende aantal per karyotype vier paren is. De 45S rDNA-locus bevindt zich voornamelijk in de korte armen en terminale gebieden van chromosomen, terwijl de 5S rDNA-locus voornamelijk wordt aangetroffen in de korte arm en de terminale of proximale regio's. Populaties HBWF, HNXN, HBBD en HNZX vertoonden een vergelijkbare verdeling van 45S rDNA-sites, net als GXTL, HBFC en SCLS, wat wijst op een nauwe verwantschap tussen populaties met vergelijkbare 45S rDNA-sitedistributies. De karyotypes van alle bestudeerde populaties zijn symmetrisch en omvatten stabiele en metastabiele centromeren of uitsluitend stabiele centromeren. Spreidingsdiagrammen van MCA en CVCL onderscheiden effectief hun karyotypische structuren. De analyse omvat zes kwantitatieve parameters (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI). Bovendien geven de resultaten aan dat PCoA op basis van deze zes parameters een robuuste methode is voor het bepalen van biologische karyotyperelaties tussen de acht populaties. Het aantal chromosomen in Lycoris-populaties is x = 6-8. Op basis van de huidige studie en literatuur wordt genomische differentiatie van deze populaties besproken in termen van genoomgrootte, heterochromatine, 45S en 5S rDNA-sites en karyotype-asymmetrie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lycoris is een familie die verschillende belangrijke tuinbouwplanten omvat1. Lycoris aurea (L'Hér.) Kruid. is een traditionele Chinese geneeskrachtige plant met een lange geschiedenis. Fytochemische analyse heeft aangetoond dat Lycoris aurea (L'Her.) Kruid bevat galantamine en andere alkaloïden, die de gevoeligheid voor acetylcholine kunnen verbeteren en het potentieel hebben om de ziekte van Alzheimer te behandelen als cholinesteraseremmers2.

In hogere planten is karyotype-analyse cruciaal voor het integreren van genetische en fysische kaarten, met belangrijke praktische implicaties voor de plantenbiologie. Deze analyse maakt genoomkarakterisering op chromosomaal niveau mogelijk, verduidelijking van cellulaire taxonomische relaties tussen populaties, identificatie van genetische afwijkingen en begrip van trends in chromosomale evolutie 3,4,5. Doorgaans omvat een karyotypebeschrijving het aantal chromosomen, absolute en relatieve chromosoomlengtes, primaire en secundaire vernauwingslocaties, heterochromatische fragmentverdeling, rDNA-plaatsnummers en -locaties en andere DNA-sequentiekenmerken, evenals karyotype-asymmetrie 6,7,8. Onder de karyotypeparameters wordt asymmetrie bepaald door variaties in chromosoomlengte (interchromosomale asymmetrie) en centromeerpositie (intrachromosomale asymmetrie). Karyotype-asymmetrie is een belangrijk kenmerk dat de chromosoommorfologie weerspiegelt en wordt veel gebruikt in de taxonomievan plantencellen 9,10,11,12.

Vaak beperkt de afwezigheid van chromosoommarkers de analyse van karyotypes en belemmert het de identificatie van individuele chromosomen. In de afgelopen jaren zijn Giemsa-kleuring, fluorescentiebanden en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) populair geworden in de analyse van plantenchromosomen. Dubbele fluorescerende kleuringsmethoden, zoals CMA (chromomycine A3) / DAPI (4, 6-diamino-2-fenylindool) kleuring en PI (propyljodide) / DAPI-kleuring (bekend als CPD-kleuring), onthullen GC-rijke en AT-rijke heterochromatische gebieden op chromosomen 4,13. Tijdens de metafase of pachyteen van plantenmitose kunnen herhaalde DNA-sequenties of lange DNA-segmenten specifieke signalen in plantenpopulaties genereren door middel van FISH-hybridisatie 14,15,16.

Fluorescerende banden en FISH-signalen bieden nuttige markers voor chromosoomidentificatie. Door de chromosoomlengte te meten, de kenmerken van fluorescentiebanden te analyseren en FISH-signaalverschillen te vergelijken, kunnen gedetailleerde moleculaire cytogenetische karyotypes van verschillende plantenkiemplasma's of -populaties worden geconstrueerd. Deze karyotypen vertonen effectief chromosoommorfologie in verschillende kiemplasma's of populaties, waardoor vergelijkingen van heterochromatinedistributie en DNA-sequentielokalisatie mogelijk zijn en verder onderzoek wordt aangemoedigd 4,8,17. Moleculair cytogenetische karyotypevergelijkingen kunnen waardevolle inzichten bieden in de fylogenetische relaties en chromosomale evolutie van verwante populaties 8,14,18,19.

Het geslacht Lycoris , een diverse en intrigerende groep binnen de Amaryllisfamilie, staat bekend om zijn meerjarige bollen. Het bestaat uit ongeveer 20 soorten, waarvan er 15 endemisch zijn in China, en toont een rijke biodiversiteit. Dit geslacht komt uitsluitend voor in warme gematigde en subtropische regio's van Oost-Azië, waaronder Zuidwest-China, Zuid-Korea en Japan, met een paar populaties die zich uitstrekken tot Noord-India en Nepal20. Vroege cytogenetische studies betroffen voornamelijk het tellen van chromosomen om het basisaantal chromosomen van het geslacht vast te stellen en om de chromosoommorfologie in specifieke populaties te beschrijven, waarbij de nadruk grotendeels lag op Lycoris radiata21. Het totale aantal chromosomen dat in dit geslacht wordt waargenomen, varieert van 12 tot 33 of 44, wat respectievelijk diploïde, abnormale diploïde, triploïde, tetraploïde- en aneuploïde niveaus vertegenwoordigt. De basischromosoomnummers, x, zijn 6, 7, 8 en 11.

Lycoris aurea (L'Hér.) Kruid, een opmerkelijke soort binnen het geslacht Lycoris , is wijd verspreid in heel China22. Het gedijt goed in ontspannen, vochtige omgevingen en plant zich voort door kleine bollen. Deze bollen, die lycorine en galantamine bevatten - twee belangrijke geneeskrachtige verbindingen - worden al eeuwenlang gebruikt in de traditionele Chinese geneeskunde. Lycoris aurea fascineert ook tuinders met zijn opvallende rode bloemen in de herfst en groenblijvende bladeren in de winter. De morfologische gelijkenis tussen alle bestudeerde Lycoris aurea (L'Hér.) Kruidenpopulaties vormen een grote uitdaging voor chromosomale identificatie met behulp van conventionele cytologische methoden.

Klonen van FISH, fosmide of BAC (bacteriële kunstmatige chromosomen) met repetitieve DNA-sequenties en oligonucleotide-sondes op metafase- of pachydermato-chromosomen is gebruikt voor karyotype-analyse 23,24,25, vergelijkende cytogenetische analyse 26,27, cytogenetische kaartconstructie28,29 en chromosoomspecifieke assays30. Onlangs is de FISH-techniek toegepast op de chromosoomanalyse van Lycoris-populaties 31. Hoewel het aantal chromosomen en het karyotype variëren in Lycoris-populaties, blijft het totale aantal chromosomen constant, waarbij drie basistypen worden waargenomen: het centrale centromeerchromosoom (M-), het distale centromeerchromosoom (T-) en het proximale centromeerchromosoom (A-). Bovendien worden verschillende chromosoomvormen en -groottes waargenomen in natuurlijke populaties32.

RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is nuttig voor het detecteren van chromosomale veranderingen, zoals centromeerfusie, inversie, genamplificatie en fragmentdeletie. Fluorescentie In Situ Hybridisatie (RNA-FISH)-technologie maakt visuele analyse met hoge resolutie van chromosomen mogelijk om meerdere complexe veranderingen te detecteren en te identificeren, waaronder de fusie van centrale chromosoomregio's, vorming van nieuwe chromosoomstructuren, omkering van chromosomale regio's, amplificatie van genen of genfragmenten en verlies van gensequentie op specifieke chromosoomregio's33. Vijf van de 500 klonen vertoonden sterke FISH-signalen op het centromeergebied van het centrale centromeerchromosoom (M-), maar niet op het distale centromeerchromosoom (T-)34. Het unieke FISH-signaaldistributiepatroon op elk chromosoom maakte de identificatie van individuele chromosomen mogelijk, wat voorheen een uitdaging was in Lycoris-populaties met behulp van traditionele kleuringsmethoden31. Momenteel zijn er weinig studies over de moleculaire cytogenetica van Lycoris aurea (L'Hér.) Herb, wat de dringende noodzaak van verder onderzoek op dit gebied benadrukt.

In deze studie werden acht goed gedifferentieerde metafase-chromosomen van Lycoris aurea (L'Hér.) Kruidenpopulaties werden bereid met behulp van enzymonderdompeling en vlamdrogen (EMF) -methoden. CPD-kleuring en 45S en 5S rDNA-sondes werden gebruikt voor FISH-identificatie. Gedetailleerde moleculaire cytogenetische karyotypes van deze populaties werden geconstrueerd met behulp van gecombineerde gegevens van chromosomale metingen, fluorescerende banden en 45S en 5S rDNA FISH-signalen. Voor elke populatie werden zes verschillende karyotypische asymmetrie-indices berekend om karyotypische relaties tussen hen te identificeren. Evaluatie van de moleculaire cytogenetische karyotypegegevens leverde belangrijke inzichten op in de genomische differentiatie en evolutionaire relaties van de acht populaties, waardoor het begrip van Lycoris-chromosomen mogelijk een nieuwe vorm kreeg.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, worden gedetailleerd beschreven in de materiaaltabel, terwijl de gebruikte sondes worden vermeld in aanvullend bestand 1.

1. Preparaat van apicale chromosomen

  1. Wortel schieten door hydrocultuur. Nadat u het bovengrondse deel van de lamp hebt verwijderd, plaatst u deze in een taps toelopende fles gevuld met water en vervangt u het water om de 3 dagen, volgens de methode beschreven door Song et al.35.
  2. Snijd actief groeiende wortelpunten weg als ze ongeveer 1,0-2,0 cm lang zijn en behandel ze gedurende 1,0 uur in verzadigd α-broomaftaleen bij 28 °C.
  3. Snijd de wortelpunten af tot ongeveer 1 cm en plaats ze in een vers bereid mengsel van methanol en ijsazijn in een volumeverhouding van 3:1 bij kamertemperatuur (ongeveer 20-25 °C) gedurende 2-3 uur. Bewaar ze vervolgens in de koelkast bij 4 °C, zoals beschreven door She et al.36.
  4. Was de vaste wortelpunten (2-3 mm) grondig in dubbel gedestilleerd water.
  5. Bereid een mengsel van cellulase en pectinehydrolase in 0,01 mM citroenzuur-natriumcitraatbuffer bij pH 4,5, met cellulase en pectinehydrolase elk van 1%. Plaats de voorbehandelde wortelpunten in het mengsel en verteer bij 28 °C gedurende 1,0-1,5 uur.
  6. Was de verteerde wortelpunten met dubbel gedestilleerd water, leg ze op een glasplaatje en pureer ze grondig met het fixeermiddel met behulp van een tang met fijne punt.
  7. Droog de dia's boven de vlam van een alcohollamp tot de waternevel net is verdwenen. Selecteer onder een fasecontrastmicroscoop objectglaasjes met meer dan vijf gesplitste fasen en geen overlappende chromosomen. Bewaar de glaasjes bij -20 °C voor toekomstig gebruik.

2. CPD-kleuring

  1. Bereid een CPD-oplossing voor door PI en DAPI toe te voegen aan een 30% (v/v) anti-fluorescentiedemper, waarbij de concentratie PI 0,6 μg·ml-1 is en de concentratie DAPI 3 μg·ml-1.
  2. Droog het chromosoomplaatje 30 minuten bij 65 °C.
  3. Voeg 100 μL RNase A-verdunningsmiddel toe (de RNase A-opslagoplossing 100 keer verdund met 2x SSC (zoutoplossing natriumcitraat), resulterend in een uiteindelijke concentratie van 100 μg/ml) per chromosoomplaatje. Dek de dia af en verwarm hem 30-60 minuten in een vochtige kamer van 37 °C.
  4. Was het chromosoomplaatje met 2x SSC op kamertemperatuur met drie intervallen van elk 5 minuten.
  5. Was het chromosoomplaatje 1-2 minuten op kamertemperatuur.
  6. Voeg 200 μL pepsineverdunningsmiddel toe (de pepsinebewaaroplossing 100 maal verdund met 0,01 N HCl om een uiteindelijke concentratie van 5 μg/ml te bereiken) per chromosoomplaatje. Dek het glaasje af en incubeer het 5-20 minuten in een vochtige kamer bij 37 °C.
  7. Was de chromosoomsecties met ultrazuiver water op kamertemperatuur gedurende 2 minuten, gevolgd door wassen met 2 xSSC op kamertemperatuur met twee intervallen van elk 5 minuten.
  8. Fixeer de glaasjes met methanol: ijsazijn (3:1) oplossing gedurende 10 min.
  9. Wassen met 2x SSC op kamertemperatuur met drie intervallen van elk 5 minuten.
  10. Behandel met 70%, 95% en 100% ethanol bij -20 °C gedurende elk 5 minuten en droog vervolgens af bij kamertemperatuur.
  11. Neem de behandelde en gedroogde chromosoomglaasjes, voeg 30 μL CPD-kleuringsoplossing toe aan elk objectglaasje, dek af met een dekglaasje van 24 mm x 50 mm en kleur het langer dan 30 minuten in het donker. Uitgebreid chromosoommateriaal moet 's nachts worden gekleurd.
  12. Bekijk de chromosoomglaasjes onder een fluorescentiemicroscoop, met behulp van een groen excitatiefilter (WG) voor PI-kleuring en een ultravioletfilter (UV) voor DAPI-kleuring. Maak foto's met de compatibele software.
    1. Pas de belichtingstijd aan via de twee filters om vergelijkbare rode en blauwe fluorescentie-intensiteiten te bereiken tijdens het vastleggen van de foto. De CPD-afbeelding is verkregen uit de grijswaardenafbeeldingen die zijn gekleurd met PI en DAPI. Chromosoommetingen en beeldverwerking werden uitgevoerd met behulp van Adobe Photoshop-software.

3. Fluorescentie in situ hybridisatie

  1. Bereid de hybride oplossing voor: FAD (10 μl), ssDNA (2 μl), 20× SSC (2 μl), 5S rDNA (1 μl), 45S rDNA (1 μl) en 50% glucaansulfaat (4 μl). Centrifugeer na bereiding de hybride oplossing (2500 x g, 5-10 min, bij kamertemperatuur) en leg deze op ijs.
  2. Plaats de gescande objectglaasjes 30-60 minuten in de oven op 65 °C.
  3. Verwijder de gebakken glaasjes, voeg 100 μL 70% FAD-denaturatieoplossing toe, dek af met een afdekglas en denatureer gedurende 2,5 minuten in een moleculaire hybridisatieoven van 85 °C.
  4. Verwijder het afdekglas en dompel de objectglaasjes onmiddellijk onder in 70%, 90% en 100% koude ethanol, waarbij u achtereenvolgens 5 minuten per stuk dehydrateert.
  5. Verwijder de glaasjes en laat ze langer dan 30 minuten bij kamertemperatuur drogen.
  6. Voeg 20 μL hybride oplossing toe aan het glaasje, plaats het afdekglas er voorzichtig op totdat de vloeistof volledig diffuus is en laat het 10 minuten op kamertemperatuur staan om het afgedekte gedeelte van het glaasje te bevochtigen.
  7. Plaats de glaasjes in een hybride schaal gedrenkt in 2× SSC (de hybride schaal moet een grote petrischaal zijn met een deksel gewikkeld in aluminiumfolie om het gebruik uit de buurt van licht te vergemakkelijken) en incubeer ze een nacht bij 37 °C (gedurende ten minste 6 uur).
  8. Ga de chromosomen tegen door ze te monteren met 3 μg·ml-1 DAPI in een 30% (v/v) oplossing van Vectashield H-100. Leg het beeld vast met compatibele software, waarbij de blauwe fluorescentie van DAPI respectievelijk wordt opgewekt door het paarse licht van het filter en de rode fluorescentie van PI wordt opgewonden door het groene licht.
    OPMERKING: FISH-hybridisatie werd uitgevoerd met behulp van 45S en 5S rDNA-sondes op eerder CPD-gekleurde objectglaasjes, volgens de methode beschreven door She et al.36.

4. Karyotype-analyse

  1. Selecteer vijf metafase mitotische cellen voor elke populatie waarin de chromosomen goed gespreid zijn (zonder overlapping) en matig gecondenseerd (de chromosomen mogen niet maximaal worden geaggregeerd, maar de uiteinden mogen niet samenklonteren), volgens de methodologie beschreven door She et al.4.
  2. Bepaal de absolute lengte van elk chromosoom door vijf chromosomen met de hoogste concentratie te selecteren tijdens de celdeling.
  3. Meet nauwgezet en nauwkeurig de lengte van de lange arm (L) en korte arm (S) van elk chromosoom, evenals de grootte van elke fluorescerende pigmentband op het chromosoom.
  4. Bereken de volgende parameters: (1) relatieve chromosoomlengte (RL, haploïde percentage); (2) armverhouding (AR = L/S, lange arm/korte arm); (3) totale haploïde chromosoomlengte (TCL; karyotypelengte); (4) gemiddelde chromosoomlengte (C); (5) grootte van de fluorescentieband (het percentage van de fluorescentieband ten opzichte van de lengte van het chromosoom); (6) afstand van het centromeer tot de rDNA-site; (7) gemiddelde centromeerindex (BI, berekend als de korte armlengte van elk chromosoom gedeeld door de totale lengte van dat chromosoom, waarbij het gemiddelde van deze waarden wordt genomen); (8) vier verschillende indicatoren van karyotype-asymmetrie, waaronder de centromeerindex (CVCI), de variatiecoëfficiënt (CV), de chromosoomlengtecoëfficiënt (CVCL), de gemiddelde centromeerasymmetriecoëfficiënt (MCA) en de categorie Stebbins-asymmetrie.
    OPMERKING: Raadpleeg de methoden van Paszko10 en Peruzzi et al.11 om de asymmetrie-index te berekenen. Classificeer chromosomen met verschillende armverhoudingen volgens de vijf classificatiemethoden van Levan. Schik de chromosomen van Lycoris aurea (L'Hér.) Kruid in afnemende volgorde van lengte zoals beschreven in het Han et al. protocol37.
  5. Zorg voor de precisie en nauwkeurigheid van de methodologie door chromosoomkaryotypepatronen te tekenen op basis van chromosoommeetgegevens in combinatie met informatie over de fluorescentieband en de positie en grootte van de rDNA-FISH.
  6. Het visualiseren van de asymmetrische relaties van het karyotype van de acht populaties is een belangrijke stap die duidelijke inzichten oplevert. Dit wordt bereikt door middel van tweedimensionale spreidingsdiagrammen, die worden gebruikt om hun MCA en CVCL te verkrijgen.
  7. Voer hoofdcoördinatenanalyse (PCoA) uit met behulp van de Gower-gelijkeniscoëfficiënt, een cruciaal onderdeel, volgens de methoden van She et al.38.
  8. Bereken zes kwantitatieve parameters (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI) om de cytogenetische karyotypes van de acht populaties te bepalen.
  9. Voer statistische analyses uit met behulp van een gegevensanalyse- en visualisatieprogramma om het op UPGMA gebaseerde dendrogram en PCoA-spreidingsdiagram te genereren.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door gebruik te maken van de nauwgezette enzymonderdompeling en vlamdroging (EMF) methode, verspreide en goed gedifferentieerde metafasechromosomen van Lycoris aurea (L'Hér.) Kruiden werden verkregen en het cytogenetische chromosoomkaryotype van Lycoris aurea werd geconstrueerd (Figuur 1). De metafasechromosomen met de hoogste mate van condensatie zijn ongeschikt voor karyotype-analyse vanwege de verminderde morfologische verschillen. Aangezien de totale lengte van haploïde chromosomen (TCL) echter vergelijkbaar is tussen populaties, is het mogelijk om de karyotypes van verschillende Lycoris aurea-populaties te onderscheiden door verschillen in TCL-waarden te vergelijken. De kenmerken van het karyotype en het nucleaire DNA-gehalte van acht populaties van Lycoris aurea worden weergegeven in tabel 1. De verdeling van fluorescentiebanden en de locaties van de 45S en 5S rDNA-sites worden weergegeven in Tabel 2. Figuur 2 toont de metingen van de chromosomen samen met de fluorescentiebandkenmerken en de locatie en grootte van de 45S en 5S rDNA FISH-signalen.

De diploïde chromosoomnummers zijn als volgt: 2n = 16 = 8m + 8t voor GXTL, 2n = 14 = 8m + 6t voor HBFC, 2n = 14 = 8m + 6t voor GZDS, 2n = 16 = 6m + 10t voor HNZX, 2n = 14 = 8m + 6t voor HBBD, 2n = 14 = 8m + 6t voor HNXN, 2n = 16 = 6m + 10t voor HBWF, en 2n + 1 = 15 = 7m + 8t voor SCLS (Tabel 1). Zoals beschreven in het protocol van She et al.4, zijn de metafasechromosomen van de acht L. aurea-populaties klein, met gemiddelde chromosoomlengtes variërend van 1,01 μm (HNZX) tot 2,08 μm (GZDS) en een TCL variërend van 16,14 μm (HNZX) tot 29,13 μm (GZDS). De TCL's van de acht populaties correleren met de gerapporteerde nucleaire DNA-inhoud (Tabel 1). Het kleinste relatieve lengtebereik (RRL) wordt waargenomen bij HNXN (1,52-3,81), terwijl het grootste wordt waargenomen bij GZDS (2,73-5,86). Populaties HNXN en GZDS vertoonden respectievelijk de kleinste en grootste variatie in chromosoomlengte. De gemiddelde centromeerindex (CI) van het genoom varieerde tussen 61,02 ± 5,63 (populatie HBFC) en 70,70 ± 4,63 (populatie HBWF). Populatie HBFC vertoonde de minste verandering in de centromeerindex, terwijl populatie HBWF de meest uitgebreide veranderingen vertoonde.

De karyotypen zijn samengesteld uit metacentrische (m) en telocentrische (t) chromosomen (Tabel 1; Figuur 2), die de meest voorkomende chromosoomvormen vertegenwoordigen van de acht bestudeerde populaties. De acht verschillende asymmetrie-indices van het karyotype worden weergegeven in tabel 1. Van deze indices karakteriseren de variatiecoëfficiënt van de centromeerindex (CVCI) en de gemiddelde centromeerasymmetrie (MCA) de intrachromosomale asymmetrie, terwijl de variatiecoëfficiënt van de chromosoomlengte (CVCL) de interchromosomale asymmetrie meet. De bereiken voor CVCI en MCA zijn als volgt: CVCI = 10,97 (HBBD) tot 18,25 (HBWF) en MCA = 28,85 (HNZX) tot 39,30 (HBWF). Deze waarden geven consequent aan dat HBBD de laagste en HBWF de hoogste intrachromosomale asymmetrie heeft. Het bereik voor CVCL is 14,98 (GZDS) tot 23,32 (HBWF), wat suggereert dat GZDS het minst asymmetrische karyotype vertoont, terwijl HBWF het meest asymmetrische karyotype vertoont van de acht populaties. Volgens de classificatieprincipes van Stebbins9 behoren deze karyotypes tot klasse 1B, wat aangeeft dat alle bestudeerde populaties relatief symmetrische karyotypes hebben.

De asymmetrierelaties van het karyotype tussen de acht Lycoris aurea (L'Hérit.) Kruidenpopulaties worden geïllustreerd met behulp van tweedimensionale spreidingsdiagrammen van CVCI versus CVCL en MCA versus CVCL (Figuur 3). De karyotypestructuur van deze populaties, zoals onthuld door de drie paren parameters - CVCI, CVCL en MCA - heeft significante implicaties. Deze parameters vertonen vergelijkbare karyotype-asymmetrieën. De bevindingen van de spreidingsdiagrammen benadrukken de potentiële impact van het onderzoek, waaruit blijkt dat populatie HNXN het meest symmetrische karyotype heeft, terwijl populaties HBFC en HBWF respectievelijk de meeste intrachromosomale en interchromosomale asymmetrieën vertonen (Figuur 3).

Deze studie categoriseerde de acht Lycoris aurea-populaties nauwgezet in drie hoofdgroepen op basis van het UPGMA-boomdiagram met vijf karyotypeparameters (Figuur 4). De eerste cluster, vertegenwoordigd door populatie SCLS, vormt een onafhankelijke clade. De tweede groep bestaat uit HNXN en HBWF. Het derde cluster is verdeeld in twee subgroepen: de ene bevat alleen populatie HBFC, terwijl de andere populaties HBWF, GZDS en GXTL omvat, waarbij populatie HBBD en GZDS clusteren in een kleinere tak. De karyologische relaties tussen de bestudeerde populaties, zoals onthuld door de hoofdcoördinatenanalyse (PCoA), worden geïllustreerd in figuur 5. Het PCoA-spreidingsdiagram geeft aan dat de acht populaties kunnen worden onderverdeeld in twee groepen met een betrouwbaarheidsniveau van 68,36%. De eerste groep omvat HBWF, HBBD en GXTL, waarbij de eerste drie populaties nauw bij elkaar liggen. De tweede groep bestaat uit HBFC, HNXN, HNZX en SCLS, waarbij HBFC de middelste positie inneemt tussen de twee groepen en SCLS het meest geïsoleerd is (Figuur 5).

CPD (combinatie van propidiumjodide en DAPI) en DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindool) omgekeerde kleuring zijn standaardtechnieken die worden gebruikt om de nucleaire structuur en chromatineverdeling te observeren. De resultaten van deze studie onthulden schijnbare heterochromatineverschijnselen bij acht populaties van Lycoris aurea (L'Hérit.) kruid (Figuur 1 en Figuur 2; Tabel 2). FISH-hybridisatieresultaten voor elke populatie gaven aan dat alle chromosomale regio's overeenkomen met de 45S en 5S rDNA-loci. De kenmerken van de CPD-banden worden geïllustreerd in figuur 1A,C,E,G,I,K,M,O.

In populaties HBFC en HBBD werden CPD-banden waargenomen in de centromeer- en pericentromerische regio's (Figuur 1G,K; Figuur 2D,F). Bepaalde chromosomen vertoonden echter geen CPD-banden: het 3e en 8e chromosoom in SCLS, het 1e chromosoom in HNXN, het 1e chromosoom in HNZX, het 1e chromosoom in HBWF, het 2e chromosoom in GZDS en het 2e chromosoom in GXTL (Figuur 1A,C,E,I,J,M,O; Figuur 2A-C,E,G,H). Met name werden CPD-banden ook gevonden op de terminals van de korte armen van chromosoomparen 5, 6 en 7 in SCLS en HNXN, op paren 4, 5, 6, 7 en 8 in HNZX, en op paren 5, 6 en 7 in HBFC. Bovendien waren CPD-banden aanwezig op de korte armuiteinden van chromosomen 4, 5, 6, 7 en 8 in HBWF, op de korte armuiteinden van chromosomen 5, 6 en 7 in HBBD, en op de korte armuiteinden van chromosomen 5, 6, 7 en 8 in GXTL (Figuur 1A en Figuur 2A).

Na FISH-hybridisatie vormde DAPI omgekeerde kleuring heldere fluorescerende banden rond de centrische deeltjes van chromosomen 5, 6 en 7 in GZDS. Deze banden, post-FISH DAPI+-banden genoemd, geven aan dat deze heterochromatinegebieden een groot aantal AT-basenparen bevatten (Figuur 2G). Het bereik van (peri)centromerische CPD-banden waargenomen in de acht populaties was 25,00% tot 57,14% (Tabel 2), terwijl het totale aantal terminale CPD-banden varieerde van 40,00% tot 71,43% (Tabel 2). In populatie GZDS correleerden post-FISH DAPI+-banden met de karyotypelengte, goed voor 42,86% van het totaal. De groottes van rDNA CPD-banden, niet-rDNA CPD-banden en DAPI+-banden na FISH verschilden significant tussen de verschillende chromosoomparen van Lycoris aurea (L'Hérit.) kruid (Figuur 2; Tabel 2).

De FISH-techniek werd gebruikt om 45S en 5S rDNA-sondes in te brengen in CPD-gekleurde chromosomen, zoals geïllustreerd in figuur 1. De samenvatting van het aantal en de locatie van 45S en 5S rDNA-sites in de acht populaties van Lycoris aurea (L'Hérit.) Kruid wordt gepresenteerd in Tabel 2 en afgebeeld in Figuur 2. Met name significante verschillen in het aantal, de grootte en de locatie van rDNA-loci tussen de acht populaties benadrukken het belang van deze bevindingen. In totaal waren er 30 45S rDNA-loci in de acht populaties. Hiervan bevonden 4 loci (13,33%) zich in het centrale centromeergebied, 9 (30,00%) in het bijna-centrale centromeergebied en 17 (56,67%) in de terminale regio's van hun respectievelijke chromosoomarmen (Figuur 2; Tabel 2).

In de GXTL-populatie werd één 45S rDNA-locussignaal gevonden in het centromeergebied van de korte arm van chromosoom 4, terwijl vier extra signalen zich bevonden in het centromeergebied van de lange armen van chromosomen 5, 6, 7 en 8 (Figuur 1P; Figuur 2G). In de HBFC-populatie werd één 45S rDNA-locus gepositioneerd in het centromeergebied op de korte arm van chromosoom 4, met drie loci gevonden in pericentromerische heterochromatinegebieden op de korte armen van chromosomen 5, 6 en 8 (Figuur 1H; Figuur 2D). In de GZDS-populatie bevond een 45S-locus zich in het centromeergebied van de korte arm van metacentrisch chromosoom 4 (Figuur 1N; Figuur 2G). In HNZX werden vijf 45S rDNA-loci waargenomen in de terminale gebieden van de korte armen van chromosoomparen 4, 5, 6, 7 en 8 (Figuur 1H; Figuur 2D). De verdeling van 45S-locaties in HBBD (Figuur 1J; Figuur 2E) en HNXN (Figuur 1L; Figuur 2F) was vergelijkbaar, met één locus in het centromeergebied van de korte arm van chromosoom 4 en drie loci in het centromeergebied van de korte armen van chromosomen 5, 6 en 7.

In HBWF verschenen vijf 45S rDNA-loci-signalen in de centromeergebieden van de korte arm van chromosoomparen 4, 5, 6, 7 en 8 (Figuur 1N; Figuur 2G). In SCLS werd één 45S rDNA-locussignaal gevonden in de centromeergebieden met korte arm van chromosoomparen 1 en 2, evenals in de pericentromerische gebieden van de korte armen van chromosoomparen 5 en 6 (Figuur 1P; Figuur 2H). Voor de 5S rDNA-loci werden er in totaal negen geïdentificeerd in de acht taxa, waarvan er 3 (33,33%) zich in de proximale regio's bevinden, 3 (33,33%) in de pericentromerische regio's en 3 (33,33%) in de terminale regio's van de respectievelijke chromosoomarmen (Figuur 2; Tabel 2). In GXTL verscheen één 5S rDNA-locussignaal nabij het terminale uiteinde van de lange arm van chromosoompaar 6 (Figuur 1P; Figuur 2G). De verdeling van 5S-locaties was vergelijkbaar in HBFC (Figuur 1H; Figuur 2D) en GZDS (Figuur 1N; Figuur 2G), beide met één 5S rDNA-locus in het proximale gebied van de korte arm van chromosoom 7. In HNZX werd een 5S rDNA-locus gevonden nabij het terminale uiteinde van de lange arm van chromosoom 8 (Figuur 1H; Figuur 2D), terwijl in HBBD een 5S rDNA-locus werd geïdentificeerd in chromosoom 7 (Figuur 1J; Figuur 2E). In HBWF verschenen twee 5S rDNA-loci nabij het terminale uiteinde van de lange armen van chromosomen 4 en 8, nog twee in de lange arm van chromosoom 7, één in het centromeergebied en één aan het einde (Figuur 1N; Figuur 2G).

De combinatie van 45S en 5S rDNA FISH-signalen, samen met terminale CPD-segmentkenmerken, onderscheidde effectief alle mitotische chromosomen van verschillende populaties van Lycoris aurea (L'Hérit.) Kruid. In de SCLS-, HBFC-, HBBD-, GZDS- en GXTL-populaties vertoonde chromosoom 1 sterke CPD-signalen in het centromerische gebied. Chromosoom 2 vertoonde sterke CPD-signalen in het centromerische gebied, met uitzondering van GZDS en GXTL. Chromosoom 3 vertoonde een sterk CPD-signaal in het centromerische gebied, met uitzondering van SCLS. Chromosoom 4 vertoonde consequent sterke CPD-signalen in het centromerische gebied. Voor chromosomen 5, 6 en 7 werden sterke CPD-signalen waargenomen aan de uiteinden van de korte armen. Chromosoom 4 vertoonde ook sterke 45S rDNA-signalen aan het einde van de korte arm, terwijl chromosomen 5 en 6 sterke 45S-signalen hadden in hun terminale regio's, behalve bij GZDS. Met name was er een sterk DAPI-signaal aanwezig in de GZDS-populatie. Bovendien verscheen er een zwak 5S rDNA-signaal in het proximale gebied van chromosoom 7 in de HBFC-, HBWF-, HBBD- en GZDS-populaties.

figure-results-1
Figuur 1: Mitotische chromosomen van acht Lycoris aurea (L' Hér.) Kruid populaties. Onderzoek van mitotische metafase-chromosomen van acht verschillende Lycoris aurea (L' Herit.) Kruidenpopulaties worden getoond, waaronder populatie SCLS (A,B), populatie HNXN (C,D), populatie HNZX (E,F), populatie HBFC (G,H), populatie HBWF (I,J) en populatie HBBD (K,L). Hybridisatie van GZDS (M,N) en GXTL (O,P) werd uitgevoerd met behulp van FISH met biotine-gelabelde 45S en digoxine-gelabelde 5S rDNA-sondes na CPD-kleuring. De resulterende beelden van chromosomen na CPD-kleuring vertonen 45S (groen) en 5S (rood) rDNA-signalen. Het totale DNA werd omgekeerd geverfd met DAPI-kleurstof, wat resulteerde in een blauwe kleur. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Chromosoomkaryotypediagrammen van acht Lycoris aurea (L' Hér.) Kruid populaties. Het chromosoompatroondiagram voor acht populaties van Lycoris aurea (L' Herit.) Herb onthult fluorescentiebandkenmerken, samen met de locatie en grootte van 45S en 5S rDNA FISH-signalen. Populaties SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS en GXTL worden respectievelijk vertegenwoordigd door (A-H). De ordinaire schaal geeft de relatieve lengte van het chromosoom aan (het percentage van dat chromosoom in het haploïde genoom) en het getal bovenaan geeft het serienummer van het chromosoom aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Spreidingsdiagrammen voor acht Lycoris aurea (L' Hér.) Kruidenpopulaties op basis van drie karyotype-parameters. (A) De CVCI-index wordt uitgezet tegen de CVCL-index. (B) De MCA-index wordt uitgezet tegen de CVCL-index. Populaties SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS en GXTL zijn aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Het UPGMA-dendrogram van acht Lycoris aurea (L' Hér.) Kruid populaties. Het UPGMA-dendrogram is gebaseerd op de parameters x, 2n, TCL, MCA, CVCL en CVCI voor de acht Lycoris aurea (L' Hér.) Kruid populaties: SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS en GXTL. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: PCoA van de acht Lycoris aurea (L' Hér.) Kruidenvariëteiten op basis van zes karyotypeparameters. De PCoA is gebaseerd op de parameters x, 2n, TCL, MCA, CVCL en CVCI, die SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS en GXTL vertegenwoordigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Namen van acht Lycoris aurea (L' Hér.) Kruid populaties. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Verdeling van fluorochromebanden en rDNA-plaatsen in de acht Lycoris aurea (L' Hér.) Kruid populaties. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend dossier 1: De sondes die in dit onderzoek zijn gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bereiding van Lycoris aurea (L'Hér.) Kruidenwortelchromosomen omvatten verschillende cruciale stappen: (1) het kweken van wortels via hydrocultuur, (2) het behandelen van wortelpunten met verzadigd α-broomaftaleen, (3) het fixeren van wortels met een alcohol-azijnzuuroplossing, (4) het uitvoeren van enzymatische hydrolyse op wortelpunten met een enzymoplossing, en (5) het grondig pletten van de verteerde wortels en het drogen van de dia's boven een vlam van een alcohollamp.

Nauwkeurige chromosoommeting is essentieel voor karyotype-analyse in cytogenetische studies. Chromosomen moeten merkbare condensatie en duidelijk gedefinieerde grenzen vertonen; Anders wordt het nauwkeurig berekenen van chromosoomparameters een uitdaging5. Eerder cytogenetisch onderzoek heeft aangetoond dat de morfologische differentiatie van mitotische chromosomen afhankelijk is van de mate van condensatie 4,36. Wanneer de condensatie onvoldoende is, kunnen de uiteinden van de chromosoomarmen nog steeds gedeagglutineerd zijn, wat leidt tot onduidelijke chromosoomgrenzen. Wanneer chromosomen echter maximale condensatie bereiken, nemen de morfologische verschillen tussen chromosomen af. Daarom is het selecteren van chromosomen met matige condensatie cruciaal voor chromosoomidentificatie en -meting, vooral in populaties met minder chromosomen.

Sonde-labeling is cruciaal voor succesvolle FISH in situ hybridisatie, met name voor de 5S rDNA-sonde-oplossing. Vanwege de korte sequentie van 5S rDNA is de concentratie van doelsequenties die door PCR zijn gelabeld doorgaans laag, wat leidt tot zwakke hybridisatiesignalen. Het rechtstreeks synthetiseren van fluoresceïne-gelabelde sondes produceert echter sterkere hybridisatiesignalen en vereenvoudigt het proces. Voor de 45S rDNA-sonde-oplossing werden partiële sequenties uit de 5.8S, 18S en 25S rRNA-coderende regio's van Arabidopsis thaliana aan de 5'- en 3'-uiteinden gelabeld met 6-carboxyl-tetramethylrhodamine (TAMRA) en vervolgens gemengd. De fluoresceïne 5S rDNA-sondeoplossing werd verkregen met behulp van 1-59 en 60-118 nucleotidesequenties uit het Arabidopsis 5S rRNA-gencoderende gebied, waarbij elke sequentie aan het 5'-uiteinde werd gelabeld met 6-carboxylfluoresceïne (6-FAM) en vervolgens werd gemengd.

In deze studie hebben we gebruik gemaakt van de verschillen tussen DAPI- en PI-kleurstoffen in DNA-binding en deze gecombineerd om duidelijke fluorescerende banden te verkrijgen. PI-kleurstoffen (propidiumjodide) kunnen celmembranen binnendringen en zich binden aan DNA-moleculen in cellen. DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindool) daarentegen bindt bij voorkeur aan AT-rijke DNA-regio's, wat zorgt voor duidelijke, contrastrijke kleuring. Vanwege deze complementaire eigenschappen worden DAPI en PI vaak samen gebruikt, ook wel CPD-kleuring genoemd, om tegelijkertijd informatie over zowel de kern als het cytoplasma te verzamelen. Verschillen in de aanwezigheid, locatie en grootte van CPD- en DAPI+-banden onthulden significante heterochromatinedifferentiatie in de acht populaties van Lycoris aurea. CPD-kleuring toonde heterochromatinegebieden die rijk zijn aan GC-gehalte, zowel in centromerische en pericentromerische regio's als binnen telocentrische chromosomen.

De studie van karyotype-asymmetrie is een populaire, betaalbare en veelgebruikte cytogenetische taxonomische benadering die een reeks parameters en indicatoren omvat, waaronder zowel kwalitatieve als kwantitatieve metingen, Stebbins-classificatieparameters en verschillende kwantitatieve indices (bijv. Paszko10; Peruzzi et al.11). Hiervan worden de R-ratio en CVCL gebruikt om chromosoomasymmetrie te meten, terwijl CVCI en MCA belangrijke indicatoren van chromosomale asymmetrie vertegenwoordigen. CVCL wordt met name beschouwd als een robuuste statistische parameter voor het schatten van interchromosomale asymmetrie10, en de metriek voor chromosomale asymmetrie (MCA) wordt erkend als een effectieve maatstaf voor het beoordelen van intrachromosomale asymmetrie11. Om de asymmetrieën van het karyotype tussen populaties zo goed mogelijk weer te geven, wordt een tweedimensionaal spreidingsdiagram aanbevolen, met twee asymmetrieschatters op respectievelijk de x- en y-as, waarbij elke steekproef wordt weergegeven als een punt11,12. De resultaten toonden aan dat tweedimensionale spreidingsdiagrammen van CVCL vs. CVCI, evenals MCA vs. CVCL, illustreert effectief de asymmetrierelaties van het karyotype tussen de acht verschillende populaties van Lycoris aurea (L'Herit.) Kruid, dat de betrouwbaarheid van deze indices ondersteunt bij het beoordelen van chromosomale asymmetrie.

Om karyotypes te vergelijken en karyologische relaties tussen de acht populaties te reconstrueren, paste deze studie de methodologie toe die werd voorgesteld door Peruzzi et al.11, met behulp van de parameters x, 2n, TCL, MCA, CVCL en CVCI. Uit de bevindingen bleek dat HBWF-, GZDS-, HBBD- en GXTL-populaties nauw verwant waren, waarbij HBFC tussen deze groepen in stond. Bijgevolg bleek PCoA op basis van deze zes parameters een zeer effectieve methode te zijn om relaties tussen de acht populaties te differentiëren. Er kwamen echter ook bepaalde complexe patronen naar voren uit de geconstrueerde moleculaire evolutionaire boom. Hoewel HNZX bijvoorbeeld nauw verwant leek aan HBWF in de moleculaire fylogenetische boom, was het verder verwant in het PCoA-spreidingsdiagram. Deze complexiteit benadrukt het belang van het gebruik van meerdere kwantitatieve benaderingen om trends in de evolutie van het karyotype binnen Lycoris te voorspellen, als aanvulling op moleculaire classificatiekenmerken.

De planten voor deze studie werden bemonsterd uit Midden- en West-China, waaronder Tianlin County, Guangxi Province (GXTL), Fang County, Hubei Province (HBFC), Dushan County, Guizhou Province (GZDS), Zixing County, Hunan Province (HNZX), Badong County, Hubei Province (HBBD), Xinning County, Hunan Province (HNXN), Wufeng County, Hubei Province (HBWF) en Lushan County, Sichuan Province (SCLS). Een exemplaar van een voucher is bewaard gebleven in het herbarium van de Huaihua University. Uit deze studie bleek dat de combinatie van 45S en 5S rDNA FISH-signalen en terminale CPD-segmentkenmerken effectief alle mitotische chromosomen onderscheidde van verschillende populaties van Lycoris aurea (L'Herit.) Kruid. Het hier gepresenteerde protocol heeft tot doel de heterochromatineverdeling tussen verschillende populaties van Lycoris aurea (L'Herit.) te onderzoeken. Kruid. CPD (een combinatie van PI en DAPI) en DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindool) omgekeerde kleuring zijn gevestigde technieken voor het observeren van de nucleaire structuur en de chromatineverdeling. De directe fluorescerende labeling van 18S-5.8-26S rRNA-genregio's (45S rDNA-regio's) en 5S ribosomaal DNA voor chromosoom FISH-hybridisatie is eenvoudig en biedt robuuste hybridisatiesignalen. Dit kwalitatieve onderscheid zal steeds waardevoller worden bij het analyseren van verschillende populaties.

Deze methode is het meest geschikt voor plantensoorten die in staat zijn tot een snelle wortelpuntteelt, omdat wortelpuntcultuur nodig is tijdens actieve mitose. Vanwege de korte 5S-sequentie gebruikte de studie de 1-118bp nucleotidesequentie van het 5S rRNA-gencoderende gebied van Arabidopsis thaliana als de 5S rDNA-sonde. Vanwege de korte sequentie en het zwakke signaal is deze methode alleen effectief voor het identificeren van soorten met relatief geconserveerde basen in de 1-118bp-regio van het 5S rRNA-gen. Het selecteren van metafase-chromosomen met matige condensatie is cruciaal voor het succes van de methode. Chromosoomcondensatie hangt nauw samen met de timing van het oogsten van wortels, de duur van de voorbehandeling en het vlambakken. Daarom vereist de techniek nauwkeurige controle over elke stap om experimenteel succes te garanderen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben verklaard dat er geen concurrerende belangen bestaan.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Natural Science Foundation of China (32070367).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AlcoholSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A500737-0005(70%, 90%, 100%)
1× TNTSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481081×, 10×
2× SSCSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481092×, 20×
45S rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.TAMRA is toegevoegd aan beide uiteinden (5 'en 3' uiteinden)
4'6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E60730320ml
5S rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.5 'einde plus 6-FAM(FITC)
Adobe Photoshop-softwareAdobe Systems IncorporatedCS6
Alpha broom-naftaleenSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A602718Verzadiging
Anti-burnout-middelSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Vectashield H-100010 mL
Biochemische incubatorShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTDLRH-70
CellulaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42606810 g
CitroenzuurSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A50170210 g
Gedeïoniseerd formamide (FAD)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600211-05000.7
DextraansulfaatSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42822910 mL
Fluorescentie in situ hybridisatie-instrumentUSA/Abbott ThermoBriteS500-24
FluorescentiemicroscoopOlympus China Co.ltdBX60
IJsazijnzuurSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A501931500 mL
HClAladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)H399657500 mL
IJsmachineDan Ding Shanghai International Trade Co., Ltd.ST-70
Leica biologische microscoopGermany Leica Instrument Co., LTDDM6000B
MethylalcoholSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A601617500 mL
MetMorph-softwareMolecular DevicesVersion 7.35
OvenThermo Scientific™ Heratherm™THM#51028152
PectinaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A00429710 g
PepsineSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.1.07185100 g
Propidiumjodide(PI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A4252591 g
RNaseASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.R464210 mg
Zalmklier-DNA(ssDNA)Aladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)D1198711 g
NatriumcitraatAladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)S18918310 g
Statistica voor Windows 10.0 voor statistische analyse

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heywood, V., Casas, A., Ford-Lloyd, B., Kell, S., Maxted, N. Conservation and sustainable use of crop wild relatives. Agric Ecosyst Environ. 121 (3), 245-255 (2007).
  2. Rong, W., Sun, J., Zhang, H., Wang, H., Liu, H. Cloning and characterization of a tyrosine decarboxylase involved in the biosynthesis of galanthamine in Lycoris aurea. PeerJ. 7, e6729(2019).
  3. Guerra, M. Cytotaxonomy: The end of childhood. Plant Biosyst. 146 (3), 703-710 (2012).
  4. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Karyotype analysis of Lablab purpureus (L.) Sweet using fluorochrome banding and fluorescence in situ hybridization with rDNA probes. Czech J Genet Plant Breed. 51 (3), 110-116 (2015).
  5. Kadluczka, D., Grzebelus, E. Using carrot centromeric repeats to study karyotype relationships in the genus Daucus (Apiaceae). BMC Genomics. 22 (1), 508(2021).
  6. Levin, D. A. The role of chromosomal change in plant evolution. , Oxford Univ Press. 49-52 (2002).
  7. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Molecular cytogenetic characterization and comparison of the two cultivated Canavalia varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 11 (4), 579-600 (2017).
  8. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Comparative molecular cytogenetic characterization of five wild Vigna varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 14 (2), 243-264 (2020).
  9. Stebbins, G. L. Chromosomal evolution in higher plants. , Addison-Wesley. London. (1971).
  10. Paszko, B. A critical review and a new proposal of karyotype asymmetry indices. Plant Syst Evol. 258 (1-2), 39-48 (2006).
  11. Peruzzi, L., Eroglu, H. Karyotype asymmetry: Again, how to measure and what to measure. Comp Cytogenet. 7 (1), 1-9 (2013).
  12. Dehery, S. K., Tavakkoli, A., Jafari, M. Karyotype and chromosome pairing analysis in some Iranian upland cotton (Gossypium hirsutum). Nucleus. 64 (2), 167-179 (2021).
  13. Schweizer, D. Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI. Chromosoma. 58 (4), 307-324 (1976).
  14. Moscone, E. A., Debat, H. J., Salguero, N. Quantitative karyotyping and dual color FISH mapping of 5S and 18S-25S rDNA probes in the cultivated Phaseolus varieties (Leguminosae). Genome. 42 (6), 1224-1233 (1999).
  15. Hasterok, R., Sliwinska, E., Kwasniewski, M. Ribosomal DNA is an effective marker of Brassica chromosomes. Theor Appl Genet. 103 (4), 486-490 (2001).
  16. Koo, D. H., Han, Y., Lee, H. Molecular cytogenetic mapping of GXTL and C. melo using highly repetitive DNA sequences. Chromosome Res. 18 (3), 325-336 (2010).
  17. De Moraes, A. P., Ferreira, J. P., Marques, R. Karyotype diversity and the origin of grapefruit. Chromosome Res. 15 (1), 115-121 (2007).
  18. Weiss-Schneeweiss, H., Kiefer, C., Schneider, H. Karyotype diversification and evolution in diploid and polyploid South American Hypochaeris (Asteraceae) inferred from rDNA localization and genetic fingerprint data. Ann Bot. 101 (7), 909-918 (2008).
  19. Siljak-Yakovlev, S., Peruzzi, L. Cytogenetic characterization of endemics: Past and future. Plant Biosyst. 146 (3), 694-702 (2012).
  20. Miaohua, Q., Wang, Y., Zheng, Y. Reciprocal natural hybridization between Lycoris aurea and Lycoris radiata (Amaryllidaceae) identified by morphological, karyotypic, and chloroplast genomic data. BMC Plant Biol. 24 (1), 14-27 (2024).
  21. Shi, S., Wang, Y., Yu, J. Phylogenetic relationships and possible hybrid origin of Lycoris varieties (Amaryllidaceae) revealed by its sequences. Biochem Genet. 44, 198-208 (2006).
  22. Yumai, J., Wang, Y., Zheng, H. Characterization, validation, and cross-species transferability of EST-SSR markers developed from Lycoris aurea and their application in genetic evaluation of Lycoris species. BMC Plant Biol. 20 (1), 522-528 (2020).
  23. Koo, D. H., Shin, D., Lee, J. Karyotype analysis of a Korean cucumber cultivar (Cucumis sativus L. cv. Winter Long) using C-banding and bicolor fluorescence in situ hybridization. Molecules Cells. 13 (3), 413-418 (2002).
  24. Waminal, N. E., Kim, H. H. Dual-color FISH karyotype and rDNA distribution analyses on four Cucurbitaceae species. Hortic Environ Biotechnol. 53 (1), 49-56 (2012).
  25. Xie, W. J., Yang, X., Wang, F. Localization of 45S and 5S rDNA sequences on chromosomes of 20 varieties of Cucurbitaceous plants. J South China Agric Univ. 40 (6), 74-81 (2019).
  26. Han, Y., Zhang, H., Zhu, C. Centromere repositioning in cucurbit varieties: Implication of the genomic impact from centromere activation and inactivation. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (35), 14938-14941 (2009).
  27. Li, K. P., Yao, S., Li, Y. Cytogenetic relationships among Citrullus varieties in comparison with some genera of the tribe Benincaseae (Lycoris aurea (L' Hér.) Herb) as inferred from rDNA distribution patterns. BMC Evol Biol. 16, 85(2016).
  28. Ren, Y., Huang, H., Zhang, Z. An integrated genetic and cytogenetic map of the cucumber genome. PLoS One. 4 (6), e5795(2009).
  29. Han, Y., Wang, H., Liu, B. An integrated molecular cytogenetic map of Cucumis sativus L. chromosome. BMC Genet. 12, 18(2011).
  30. Han, Y., Zhang, H., Yu, C. Chromosome-specific painting in Cucumis varieties using bulked oligonucleotides. Genetics. 200 (3), 771-779 (2015).
  31. Liu, M. S., Zhang, S., Liu, Q. Chromosomal variations of Lycoris varieties revealed by FISH with rDNAs and centromeric histone H3 variant associated DNAs. PLoS One. 16 (9), e0258028(2021).
  32. Hayashi, A., Murota, K., Murata, J. Genetic variations in Lycoris radiate var. radiate in Japan. Genes Genet Syst. 80, 199-221 (2005).
  33. Nima, R. Fluorescence in situ hybridization: Methods and application in cancer diagnosis. Cancer Immunol. 2, 711-728 (2020).
  34. Liu, K., Yang, X., Wang, J. Cytogeography and chromosomal variation of the endemic East Asian herb Lycoris radiate. Ecol Evol. 9, 6849-6859 (2019).
  35. Song, Y. C., Zhang, L., Yan, B. Comparisons of G-banding patterns in six species of the Poaceae. Hereditas. 121, 31-38 (1994).
  36. She, C. W., Zhou, M., Zhang, L. CPD staining: An effective technique for detection of NORs and other GC-rich chromosomal regions in plants. Biotechnic Histochem. 81 (1), 13-21 (2006).
  37. Han, Y. H., Kim, J., Yoon, M. Distribution of the tandem repeat sequences and karyotyping in cucumber (Cucumis sativus L.) by fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 122 (1), 90-98 (2008).
  38. Chao-Wen, S., Chen, Z., Wang, S. Comparative karyotype analysis of eight Cucurbitaceae crops using fluorochrome banding and 45S rDNA-FISH. Comp Cytogenet. 17, 31-58 (2023).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

45S rDNA loci5S rDNA locichromosoomaantalkaryotypevariatiegenoomdifferentiatiekaryotypeasymmetrie
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen