Methodenartikel

Het meten van enzymatische activiteit van met neurologische ontwikkelingsstoornissen geassocieerde deubiquitylerende enzymen via een in vitro ubiquitineketensplitsingstest

DOI:

10.3791/67367

⸱

27 september 2024

 ,  , 
1Pediatrics and Rare Diseases Group, Sanford Research, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic, 3Department of Pediatrics, Sanford School of Medicine, University of South Dakota

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol legt uit hoe het effect van genetische variatie geassocieerd met neurologische ontwikkelingsstoornissen op de deubiquitylerende enzymactiviteit kan worden gemeten door recombinante eiwitzuivering te combineren met ubiquitineketensplitsingstesten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurologische ontwikkelingsstoornissen (NDD's) worden in verband gebracht met stoornissen in de functie van het zenuwstelsel, maar worden op moleculair niveau vaak slecht begrepen. Discrete aandoeningen veroorzaakt door afzonderlijke genen bieden modellen om mechanismen te onderzoeken die atypische neurologische ontwikkeling stimuleren. Varianten van genen die coderen voor eiwitten van de familie deubiquitylerend enzym (DUB) zijn geassocieerd met verschillende NDD's, maar er is behoefte aan het bepalen van de pathogene mechanismen van aandoeningen die door deze genvarianten worden veroorzaakt. De impact van genvarianten op de activiteit van DUB kan experimenteel worden bepaald met behulp van een substraatonafhankelijke in vitro ubiquitine-splitsingstest. Deze test vereist geen kennis van stroomafwaartse substraten om de katalytische activiteit direct te meten. Hier wordt het protocol voor het bepalen van de impact van genvarianten op enzymatische activiteit gemodelleerd met behulp van de DUB Ubiquitin Specific Protease 27, X-gebonden (USP27X), die is gemuteerd in X-gebonden intellectuele handicap 105 (XLID105). Deze experimentele pijplijn kan worden gebruikt om de mechanismen te verduidelijken die ten grondslag liggen aan neurologische ontwikkelingsstoornissen die worden aangedreven door varianten in DUB-genen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurologische ontwikkelingsstoornissen (NDD's) komen voort uit verschillende etiologieën met omgevings- of genetische determinanten die de ontwikkeling van atypisch zenuwstelsel stimuleren. Genetische tests voor sequencing van de volgende generatie hebben een toenemend aantal varianten in ubiquitine-systeemgerelateerde genen in verband gebracht met genetische NDD's2. Het ubiquitinesysteem katalyseert de ligatie van de kleine eiwitmodificator ubiquitine tot voornamelijk lysineresiduen in eiwitsubstraten om veranderingen in cellulair gedrag te stimuleren, waaronder lokalisatie, stabiliteit, eiwit-eiwitinteracties of activiteit3. Ubiquitylering wordt gemedieerd door E1-activerende, E2-conjugerende en E3-ligase-enzymen4 en is omkeerbaar door de activiteit van deubiquitylerende enzymen (DUB's) die de splitsing en verwijdering van ubiquitine uit eiwitsubstraten katalyseren5. Ubiquitine kan aan het substraat worden geligeerd als een monomeer (monoubiquitylering) of polymere ketens (polyubiquitylering) die worden gevormd op een van de zeven lysineresiduen (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) of het M1-residu van ubiquitine. Deze verschillende topologieën van de ubiquitineketen en hun combinaties creëren een cellulaire code die essentieel is voor signaaltransductie6.

DUB's zoals USP27X, USP7, USP9X, USP48, STAMBP, OTUD4, OTUD6B en OTUD5 zijn in verband gebracht met NDD's 2,7,8,9,10,11. Voor de meeste NDD's blijven de moleculaire mechanismen die de pathogenese aansturen experimenteel ongedefinieerd. Sommige van de DUB's die recent beschreven aandoeningen veroorzaken, worden slecht begrepen en missen bekende cellulaire uitlezingen die kunnen worden gebruikt om de impact van genetische variatie op de eiwitfunctie te beoordelen. In vitro overwinnen ubiquitineketensplitsingstesten deze beperking als substraatonafhankelijke DUB-activiteitsuitlezingen die de impact van genvarianten op enzymatische activiteit kunnen meten12.

Sinds de jaren 1980 worden in-vitro-ubiquitine-splitsingstesten gebruikt. Deze tests met behulp van radioactief gelabelde substraten maakten de ontdekking mogelijk van de eerste DUB's, waaronder isopeptidase, geïdentificeerd vanwege zijn vermogen om histon H2A13 te deubiquityleren, en ubiquitine carboxyl-terminale hydrolase (UCH), geïdentificeerd door zijn vermogen om ubiquitine te hydrolyseren uit een verscheidenheid aan chemische conjugaten 14,15,16 . Verder werden radioactief gelabelde polyubiquityleerde eiwitten of peptiden van volledige lengte gebruikt om isopeptidase T en verschillende UCH's en ubiquitine-specifieke proteasen (UBP's) te identificeren uit respectievelijk erytrocyten en skeletspieren 17,18,19,20. Ubiquitineketens met een bepaalde lengte en koppelingstype (K48-gebonden tetra-ubiquitine) werden voor het eerst gebruikt om de DUB-activiteit van Isopeptidase T21 te meten. Sindsdien is deze test de gouden standaard geworden om de DUB-activiteit te meten in mutatieanalyses22,23. De verfijning van deze test maakt momenteel visualisatie van ubiquitine-splitsing mogelijk via elektroforese en conventionele gelvlekken zoals Coomassie blauw, SYPRO oranje, robijn en zilvervlek of fluorescerende of immunoblotting-gebaseerde detectie12,24. Moleculaire aspecten van DUB-activiteit, zoals minimale ketenlengte en koppelingsspecificiteit 25,26,27,28, kunnen worden opgehelderd door ubiquitineketens van verschillende lengtes (bijv. di-, tri-, tetra-ubiquitine) en bindingen (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63, lineair) te gebruiken in functionele assays. NDD-geassocieerde varianten kunnen DUB-activiteitsdefecten veroorzaken die specifiek zijn voor ubiquitinekettingverbindingen11.

Een di-ubiquitine-splitsingstest met behulp van gezuiverde recombinante DUB-eiwitten kan de impact van NDD-varianten op de DUB-activiteit direct meten. USP27X, dat is gemuteerd in de NDD X-gebonden verstandelijke beperkingsstoornis 105 (XLID105)7,28 modelleert het hier gepresenteerde proces. Met deze benadering kan worden bepaald hoe DUB-activiteit wordt verstoord door genvarianten in bestaande en onbekende DUB-geassocieerde NDD's.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het volgende protocol kan worden aangepast voor recombinante eiwitten met behulp van verschillende affiniteitstags die tot expressie worden gebracht in verschillende stammen van competente cellen. Afhankelijk van het eiwit dat tot expressie wordt gebracht, kunnen de kweek- en nachtexpressieomstandigheden optimalisatie van de OD600 vereisen bij expressie-inductie, expressietijd, expressietemperatuur en IPTG-concentratie. Een overzicht van het protocol wordt geïllustreerd in figuur 1. De details van de reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Transformatie van competente Rosetta 2 E. coli-cellen met het recombinante GST-USP27X-expressieplasmide

NOTITIE: Om de steriliteit van de bacteriecultuur te behouden, voert u stappen uit waarbij mediacontainers open zijn onder een vlam van een bunsenbrander. Om een optimale zuurstofoverdracht mogelijk te maken, schudt u de bacteriecultuur in een tafelmodel temperatuurgeregelde schudder met een omloop van 19 mm tot 50 mm en een snelheid van 200 tpm29.

  1. Ontdooi 20 μl chemisch competente Rosetta 2 E. coli-cellen op ijs onmiddellijk voor gebruik. Voeg 1-10 ng van het pGEX6P1-USP27X-expressieplasmide toe (coderend voor N-terminaal glutathion-S-transferase (GST)30 -gelabeld USP27X en met ampicillineresistentie) en incubeer 5 minuten op ijs.
  2. Hitteschok gedurende 30 s bij 42 °C in een droog bad. Incubeer 2 minuten op ijs.
  3. Voeg 80 μL SOC-medium op kamertemperatuur (RT) toe. Incubeer gedurende 60 minuten bij 37 °C met een rotatie van 200 rpm in een 19 mm orbit bench-top temperatuurgecontroleerde shaker.
  4. Plaat 50 μL cultuur op een LB agar plaat aangevuld met 25 μg/L chlooramfenicol en 50 μg/l ampicilline. Incubeer gedurende 20 uur bij 37 °C met het deksel naar beneden in een temperatuurgecontroleerde incubator.

2. Nachtelijke bacteriële expressie van recombinant eiwit uit expressieplasmide

OPMERKINGEN: Om de steriliteit van de bacteriecultuur te behouden, voert u stappen uit waarbij mediacontainers open zijn onder een vlam van een bunsenbrander. Om een optimale zuurstofoverdracht mogelijk te maken, schudt u de bacteriecultuur in een tafelmodel temperatuurgeregelde schudder met een omloop van 19 mm tot 50 mm en een snelheid van 200 tpm29. Meet de cultuur OD600 met behulp van een spectrofotometer.

  1. Bereid 1 L Terrific Broth (TB) medium door 47,6 g TB-poeder toe te voegen aan 1 L ultrapuur water met 0,4% glycerol in een 2 L verbijsterde kweekkolf. Autoclaaf medium gedurende 30 minuten en afkoelen tot RT.
  2. Kies een enkele kolonie getransformeerde bacteriën en voeg toe aan 10 ml steriel LB-medium aangevuld met 25 μg/L chlooramfenicol en 50 μg/L ampicilline. Incubeer gedurende 20 uur bij 37 °C met een rotatie van 200 rpm in een 19 mm orbit-tafelmodel temperatuurgecontroleerde shaker.
  3. Voeg 10 ml 's nachts cultuur toe aan 1 L TB-medium aangevuld met 25 μg/L chlooramfenicol en 50 μg/L ampicilline (1:100 verhouding van startcultuur tot expressiecultuur). Incubeer bij 37 °C met een rotatie van 200 rpm in een 19 mm orbitande, tafelmodel temperatuurgecontroleerde schudder tot de cultuur OD600 tussen 0,5-0,6 ligt.
  4. Voeg 50 μM IPTG toe aan de cultuur om expressie te induceren, koel af tot 16 °C en incubeer gedurende 20 uur bij 16 °C met rotatie van 200 rpm.
  5. Pelletcellen uit expressiecultuur door centrifugeren gedurende 20 minuten bij ≥3.000 x g en 4 °C. Bewaar de pellet minimaal 1 uur bij -80 °C.
    OPMERKING: Op dit punt kan het experiment worden gepauzeerd en later opnieuw worden gestart (bij voorkeur dezelfde week). De korrel kan voor langere tijd worden bewaard bij -80 °C.

3. Eiwitzuivering door zwaartekracht-stroming affiniteitskolom

OPMERKING: De hars-, bindings-, was-, elutie- en opslagbuffers die geschikt zijn voor elke zuivering, zijn afhankelijk van het recombinante eiwit dat wordt gezuiverd. Verzamel monsters van de celpellet, supernatant, doorstroom, wasfracties en elutiefracties in de SDS-PAGE-buffer. Voer SDS-PAGE- en Coomassie-kleuring uit voor de monsters om het succes van de zuivering te evalueren. Voer de zuivering uit bij 4 °C en behandel fracties op ijs. Splitsing van eiwitlabels kan op of buiten de kolom worden uitgevoerd met behulp van de juiste protease om de relevante protease-specifieke splitsingsplaats te targeten.

  1. Zet de lege zwaartekrachtstroomkolom vast in de retortstandaard en vul deze met glutathion-agarosehars. Gebruik 2-3 ml hars om een celpellet te zuiveren die is verzameld uit 1 L expressiecultuur.
  2. Was de kolom met een harsbed van 20% ethanol. Was de kolom 3 keer met één harsbedvolume MS500-buffer (20 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,5 mM TCEP). Stop de kolom zodat de hars bedekt blijft met buffer om uitdroging te voorkomen tijdens het bereiden van de celpellet.
  3. Ontdooi de celkorrel bij 4 °C. Voeg 30 ml MS500-buffer (20 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,5 mM TCEP, 60 mg lysozym en één proteaseremmertablet) toe aan de ontdooide pellet. Lyseer gedurende 30 minuten bij 4 °C met zachte end-over-end rotatie.
  4. Sonicaat gelyseerde cellen in een centrifugebuisje van 50 ml of een metalen bekerglas op ijs totdat het lysaat vrij stroomt wanneer het uit een pipetpunt wordt gedoseerd. Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 4 °C en ≥20.000 x g om het supernatant te klaren.
    OPMERKING: Bepaal de instellingen van de sonicator empirisch. Stel de sonicator zo in dat de totale tijd van 120 s voldoende is om het viskeuze lysaat terug te brengen tot een vrij stromende en transparante vloeistof.
  5. Doe het supernatans in een bekerglas en laad het geklaarde lysaat op de kolom. Laat lysaat door de kolom lopen door zwaartekrachtstroming terwijl u de stroom opvangt. Laad de kolom met de verzamelde stroom door en voer deze door de kolom.
  6. Was de kolom 5 keer met ten minste twee harsbedvolumes MS500-wasbuffer (20 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.5 mM TCEP). Vang de wasstroom op in fracties van 5 ml. Voeg 1 μL van elke fractie toe aan 100 μL Bradford-reagens om visueel te controleren op eiwitaanwezigheid. Was totdat er geen ongebonden eiwit meer aanwezig is in de laatste wasbeurt en voeg indien nodig extra wasstappen toe.
  7. Recupereer eiwit door de MS500-elutiebuffer (MS500-buffer aangevuld met 10 mM glutathion en 10 mM NaOH) door de kolom te laten lopen en 5 ml elutiefracties te verzamelen. Controleer de aanwezigheid van eiwitten door 1 μL eluaat toe te voegen aan 100 μL Bradford-reagens. Stop met het verzamelen van fracties wanneer het Bradford-reagens niet langer aangeeft dat er eiwitten aanwezig zijn.
  8. Voer bufferuitwisseling uit door precipitatie en centrifugatie. Sla het eiwit neer door 2 volumes van 4 M ammoniumsulfaat aan het eluaat toe te voegen, voorzichtig om te keren tot het troebel is, en vervolgens 30 minuten te centrifugeren bij 4 °C en ≥20.000 x g en opnieuw gedurende nog eens 5 minuten. Verwijder het supernatans na elke centrifugatie zonder de eiwitkorrel te verstoren.
  9. Los eiwit op en bewaar het in MS500 aangevuld met 25% glycerol. Bewaar eiwitkorrels of eiwit in opslagbuffer bij -80 °C.

4. In vitro differentiatietest van de ubiquitineketen

OPMERKING: Selecteer de lengte en het type koppeling van de ubiquitineketen op basis van de DUB-specificiteit die in eerdere rapporten31 is beschreven of empirisch is bepaald. Indien nodig kan dit protocol worden gebruikt om de activiteit van de wild-type DUB van belang te testen op een panel van in de handel verkrijgbare ubiquitineketens met een bepaalde lengte en koppelingstype. Een hoeveelheid di-ubiquitineketen van 375-750 ng en een DUB-concentratie van 1-2 μM kunnen als uitgangspunt voor de test worden gebruikt27.

  1. Bereid 10x DUB-activeringsbuffer voor (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM NaCl en 100 mM TCEP).
  2. Bereid voor elk tijdstip voor elke DUB in totaal 10 μL van 2 μM gezuiverde GST-USP27X in 1x DUB-activeringsbuffer (DUB-mix). Bereid mastermixen voor en splits ze op in tijdstippen.
  3. Incubeer de DUB-mix gedurende 10 minuten bij RT.
  4. Voeg 7 μL SDS-PAGE-laadbuffer toe aan tijd 0 voordat u ubiquitineketens toevoegt om te voorkomen dat de deubiquityleringsreactie begint.
  5. Voeg aan elk tijdstip voor elke DUB 375 ng K-63 di-ubiquitineketens toe, verdund in 10 μL 1x DUB-activeringsbuffer. Het totale volume is 20 μL per reactie.
  6. Incubeer de buizen bij 30 °C en stop elk tijdstip met 7 μL SDS-PAGE-laadbuffer.
  7. Voer SDS-PAGE uit met een 4%-12% gradiëntgel en immunoblot 7,32 voor ubiquitine en USP27X om de verandering in de aanwezigheid van mono-ubiquitine op geselecteerde tijdstippen te analyseren.

figure-protocol-1
Figuur 1: Schema van de onderzoeksopzet. (A) Transformatie van competente E. coli-cellen met recombinant eiwitexpressieplasmide. (B) Nachtelijke bacteriële expressie van recombinant deubiquitylase-eiwit. (C) Eiwitzuivering van recombinant deubiquitylase met behulp van een zwaartekracht-stroming affiniteitskolom. (D) In vitro ubiquitineketensplitsingstest om de deubiquitylerende activiteit te evalueren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de impact van XLID105-geassocieerde varianten op de katalytische activiteit van USP27X te bepalen, werden GST-gelabelde wildtype USP27X en de XLID105-geassocieerde variant F313V-, Y381H- en S404N USP27X-eiwitten gezuiverd van bacteriën. Deze varianten bevinden zich binnen het USP-katalytische domein van USP27X (Figuur 2A). Omdat eerder werd gemeld dat USP27X K63-ubiquitineketens31 splitst, werden wildtype USP27X en de XLID105-geassocieerde variant F313V, Y381H en S404N USP27X-eiwitten gedurende 1 uur geïncubeerd met K63-gekoppelde di-ubiquitineketens. Deze monsters werden gescheiden via SDS-PAGE32 en ubiquitine- en USP27X-eiwitten werden geanalyseerd via immunoblotting. Wild-type USP27X induceert di-ubiquitine-splitsing, waarbij mono-ubiquitine wordt gegenereerd (Figuur 2B en aanvullende figuur 1). XLID105-geassocieerde eiwitten van de F313V-, Y381H- en S404N USP27X-variant splitsten deze ketens niet. Omdat de varianten F313V, Y381H en S404N de katalytische activiteit van USP27X verstoren, lijkt de functionele verstoring van USP27X het belangrijkste mechanisme te zijn dat ten grondslag ligt aan XLID1057. Aanvullende kwantificering en aanvullende experimenten werden eerder gerapporteerd7.

figure-results-1
Figuur 2: Impact van XLID105 varianten op de deubiquitylerende activiteit van USP27X. (A) Diagram van de humane USP27X-eiwitstructuur, met het aantal residuen en de locatie van de XLID105 varianten die in het USP-domein zijn geëvalueerd (paars). (B) GST-gelabelde wild-type USP27X en XLID105 varianten (F313V, Y381H en S404N) werden geïncubeerd met K63-di-ubiquitineketens voor de aangegeven tijden. Immunoblotanalyse werd uitgevoerd met behulp van anti-GST (USP27X) en ubiquitine-antilichamen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 1: Niet-bijgesneden vlekken van Figuur 2B. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel presenteert een protocol voor de expressie en zuivering van recombinante USP27X DUB's en een in vitro ubiquitineketensplitsingstest om de deubiquitylerende activiteit van wildtype USP27X en NDD-geassocieerde varianteiwitten te vergelijken. Deze test stelde vast dat XLID105-geassocieerde varianten de katalytische activiteit van USP27X verstoren7. Dit mechanistische inzicht hielp ons XLID105 te definiëren als een USP27X functionele disruptiestoornis.

Dit protocol kan worden aangepast aan andere DUB's die in verband worden gebracht met genetische ziekten met slecht begrepen moleculaire mechanismen. De optimalisatie van het expressie- en zuiveringsprotocol voor een specifieke DUB van belang is cruciaal. Als er geen specifieke protocollen zijn beschreven voor een bepaalde DUB die van belang is, kan de hier beschreven methode als uitgangspunt dienen. Bij het optimaliseren van een eiwitexpressie- en zuiveringsprotocol omvatten kritieke stappen het selecteren van de juiste parameters voor (1) het expressiesysteem (bijv. bacteriestammen, insectencellen of zoogdiercellen), (2) de expressievectoren, (3) de tag en affiniteitshars die moeten worden gebruikt, (4) de groeiomstandigheden, (5) de hoeveelheden cultuur en (6) de noodzaak van verdere zuivering (bijv. via uitsluiting van grootte of ionenuitwisselingschromatografie). Specifieke aanbevelingen voor deze en andere aspecten van de methode zijn besproken33.

De in vitro ubiquitineketensplitsingstest is een eenvoudige manier om de deubiquitylerende activiteit van wildtype of mutante DUB's te meten. Een tijdsafhankelijke analyse van ubiquitine-splitsing kan inzicht geven in de effecten van genetische variatie op de enzymatische kinetiek van DUB door de bepaling van parameters zoals de K,m en Vmax mogelijk te maken. Dit zou het mogelijk maken een onderscheid te maken tussen defecten in de actieve DUB-site die de katalyse belemmeren (verlaagde Vmax) en defecten die de herkenning van het substraat belemmeren (verhoogde Km). De veelzijdigheid van deze test komt voort uit de verscheidenheid aan ubiquitineketens die kunnen worden gebruikt om duidelijke mechanistische informatie te verstrekken over een DUB van belang. Ubiquitineketens van verschillende lengtes en koppelingstopologieën zijn in de handel verkrijgbaar, waardoor deze test toegankelijk is voor niet-experts. Specifieke DUB's hebben unieke eigenschappen voor enzymatische kinetiek, koppelingsherkenning en splitsing. Cruciale stappen voor deze test zijn onder meer (1) het definiëren van een werkconcentratie van de DUB, (2) het bepalen van de optimale reactietijd, (3) het kiezen van het type en de lengte van de ubiquitinekettingkoppeling, en (4) het selecteren van een detectiemethode.

Ubiquitineketensplitsingstesten meten de impact van NDD-varianten op DUB-activiteit 7,11, en helpen bij het identificeren van varianten die de DUB-activiteit verstoren en atypische ontwikkeling stimuleren. Deze test kan worden gebruikt in een reeks situaties waarin genetische variatie de pathologie stimuleert, waaronder kanker en neurodegeneratie. Als substraatonafhankelijke test is voorafgaande identificatie van een specifiek geubiquityleerd eiwitsubstraat niet vereist. De test is echter beperkt tot het meten van veranderingen in de splitsingsactiviteit van de ubiquitineketen en kan de effecten van varianten op DUB-functies zoals eiwit-eiwitinteracties, subcellulaire lokalisatie en posttranslationele modificaties niet beoordelen. Identificatie van de brede signaleringsroutes waar een DUB van belang werkt, is nodig om specifieke tests te ontwikkelen om te bepalen hoe deze varianten discrete NDD's aansturen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door Sanford Research startup fondsen aan FB en de NIH subsidie R01CA233700 aan MJS. Het kunstwerk is gemaakt door Felipe G. Serrano (www.illustrative-science.com). We danken Dr. Greg Findlay (Universiteit van Dundee) voor het GST-USP27X-plasmide.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Amersham Protran 0.45 NC 200 mm × 200 mm 25/PKCytiva10600041
Ammonium sulfateFisher ScientificAC205872500
AmpicillinFisher ScientificBP1760 25
Anti- Ubiquitin (Muis monoklonaal)BiolegendCat# 646302, RRID:AB_1659269(WB: 1:1000)
Anti-GST (Schapen polyklonaal)MRC-PPU Reagents and ServicesCat# S902A Derde afgifte(WB: 1:1000) https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
Baffled Cultuurkolven 2 LFisher Scientific10-042-5N
Bradford ReagensMillipore SigmaB6916-500ML
ChloramfenicolGold BiotechnologyC-105-25
Complete, Protease Inhibitor tablettenMillipore Sigma5056489001
Econo-Column 1.5 × 5 cmBio-Rad7371507
Eppendorf ThermoMixer F1.5 Eppendorf5384000020
ExcelMicrosofthttps://www.microsoft.com/nl-nl/microsoft-365/excel
GlycerolGenesee Scientific18-205
IllustratorAdobehttps://www.adobe.com/nl/products/illustrator.html
Image StudioLI-COR Bioscienceshttps://www.licor.com/bio/image-studio/
InkscapeInkscapehttps://inkscape.org/
Invitrogen 4-12% NuPAGE 1mm 12 wel gelThermo Fisher ScientificNP0322BOX
IPTG (Isopropyl-b-D-Thiogalactopyranosid)Genesee Scientific20-109
IRDye 800CW Donkey anti-Geit IgG Secundair AntilichaamLI-COR BiosciencesCat# 926-32214(WB: 1:10000)
IRDye 800CW Donkey anti-Muis IgG Secundair AntilichaamLI-COR BiosciencesCat# 926-32212(WB: 1:10000)
Isotemp Digital DroogbadFisher Scientific88860022
K63 Di-UbiquitinSouth Bay Bio LLCSBB-UP0072
LB AgarGenesee Scientific11-119
LB BrothGenesee Scientific11-118
LysozymGold BiotechnologyL-040-100
MaxQ 4000 Benchtop Orbital ShakerThermo Fisher ScientificSHKE4000-7
MES-SDS Running BufferBoston Bioproducts IncBP-177
Mini Tube RotatorFisher Scientific88-861-051
NuPage LDS Sample buffer 4xThermo Fisher ScientificNP0007
Odyssey Fc ImagerLI-COR Biosciences43214
PageRuler Plus LadderThermo Fisher Scientific26620
pGEX6P1 menselijk USP27XMRC-PPU Reagents and ServicesDU21193https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
pGEX6P1 menselijk USP27X F313VAddgene225715Koch et al. 2024 (PMID: 38182161)
pGEX6P1 menselijk USP27X S404NAddgene225717Koch et al. 2024 (PMID: 38182161)
pGEX6P1 menselijk USP27X Y381HAddgene225716Koch et al. 2024 (PMID: 38182161)
Pierce Glutathione AgaroseThermo Fisher Scientific16100
PMSF (Fenylmethylsulfonylfluoride)Gold BiotechnologyP-470-10
Polysorbaat 20 (Tween 20)Fisher ScientificAC233360010
Rosetta 2 Competente CellenMillipore Sigma71402-M
SimplyBlue SafeStainThermo Fisher ScientificLC6060
SmartSpec 3000Bio-Rad170-2501
SOC mediumThermo Fisher Scientific15544034
NatriumchlorideGenesee Scientific18-216
Sonifier 250Branson100-132-135
Sorvall RC 6 Plus CentrifugeThermo Fisher Scientific46910
TCEP (Tris-(carboxyethyl)fosfinehydrochloride)Gold BiotechnologyTCEP10
Terrific Broth PoederGenesee Scientific18-225
Tris BaseGenesee Scientific18-146
XCell SureLock Mini-Cell en XCell II Blot Module Thermo Fisher ScientificEI0002

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morris-Rosendahl, D. J., Crocq, M. -A. Neurodevelopmental disorders: the history and future of a diagnostic concept. Dialogues Clin Neurosci. 22 (1), 65-72 (2020).
  2. Ebstein, F., Küry, S., Papendorf, J. J., Krüger, E. Neurodevelopmental disorders (NDD) caused by genomic alterations of the ubiquitin-proteasome system (UPS): the possible contribution of immune dysregulation to disease pathogenesis. Front Mol Neurosci. 14, 733012(2021).
  3. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67 (10), 425-479 (1998).
  4. Pickart, C. M. Mechanisms underlying ubiquitination. Annu Rev Biochem. 70 (1), 503-533 (2001).
  5. Komander, D., Clague, M. J., Urbé, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 550-563 (2009).
  6. Yau, R., Rape, M. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nat Cell Biol. 18 (6), 579-586 (2016).
  7. Koch, I., et al. USP27X variants underlying X-linked intellectual disability disrupt protein function via distinct mechanisms. Life Sci Alliance. 7 (3), e202302258(2024).
  8. Hao, Y. -H., et al. USP7 acts as a molecular rheostat to promote WASH-dependent endosomal protein recycling and is mutated in a human neurodevelopmental disorder. Mol Cell. 59 (6), 956-969 (2015).
  9. Fountain, M. D., et al. Pathogenic variants in USP7 cause a neurodevelopmental disorder with speech delays, altered behavior, and neurologic anomalies. Genet Med. 21 (8), 1797-1807 (2019).
  10. Santiago-Sim, T., et al. Biallelic variants in OTUD6B cause an intellectual disability syndrome associated with seizures and dysmorphic features. Am J Hum Genet. 100 (4), 676-688 (2017).
  11. Beck, D. B., et al. Linkage-specific deubiquitylation by OTUD5 defines an embryonic pathway intolerant to genomic variation. Sci Adv. 7 (4), eabe2116(2021).
  12. Cho, J., Park, J., Kim, E. E., Song, E. J. Assay systems for profiling deubiquitinating activity. Int J Mol Sci. 21 (16), 1-16 (2020).
  13. Matsui, S., Sandberg, A. A., Negoro, S., Seon, B. K., Goldstein, G. Isopeptidase: A novel eukaryotic enzyme that cleaves isopeptide bonds. Proc Natl Acad Sci USA. 79 (5), 1535-1539 (1982).
  14. Rose, I. A., Warms, J. V. B. An enzyme with ubiquitin carboxy-terminal esterase activity from reticulocytes. Biochemistry. 22 (18), 4234-4237 (1983).
  15. Wilkinson, K. D., Cox, M. J., Mayer, A. N., Frey, T. Synthesis and characterization of ubiquitin ethyl ester, a new substrate for ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase. Biochemistry. 25 (21), 6644-6649 (1986).
  16. Pickart, C. M., Rose, I. A. Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase acts on ubiquitin carboxyl-terminal amides. J Biol Chem. 260 (13), 7903-7910 (1985).
  17. Hadari, T., Warms, J. V. B., Rose, I. A., Hershko, A. A ubiquitin C-terminal isopeptidase that acts on polyubiquitin chains: Role in protein degradation. J Biol Chem. 267 (2), 719-727 (1992).
  18. Woo, S. K., et al. Multiple ubiquitin C-terminal hydrolases from chick skeletal muscle. J Biol Chem. 270 (32), 18766-18773 (1995).
  19. Woo, S. K., et al. Purification and characterization of a new ubiquitin C-terminal hydrolase (UCH-1) with isopeptidase activity from chick skeletal muscle. J Biochem. 121 (4), 684-689 (1997).
  20. Baek, S. H., et al. Molecular cloning of a novel ubiquitin-specific protease, UBP41, with isopeptidase activity in chick skeletal muscle. J Biol Chem. 272 (41), 25560-25565 (1997).
  21. Wilkinson, K. D., et al. Metabolism of the polyubiquitin degradation signal: Structure, mechanism, and role of isopeptidase T. Biochemistry. 34 (44), 14535-14546 (1995).
  22. Hu, M., et al. Crystal structure of a UBP-family deubiquitinating enzyme in isolation and in complex with ubiquitin aldehyde. Cell. 111 (7), 1041-1054 (2002).
  23. Hu, M., et al. Structure and mechanisms of the proteasome-associated deubiquitinating enzyme USP14. EMBO J. 24 (21), 3747-3756 (2005).
  24. Gorka, M., Magnussen, H. M., Kulathu, Y. Chemical biology tools to study deubiquitinases and UBL proteases. Semin Cell Dev Biol. 132, 86-96 (2022).
  25. Faesen, A. C., et al. The differential modulation of USP activity by internal regulatory domains, interactors, and eight ubiquitin chain types. Chem Biol. 18 (12), 1550-1561 (2011).
  26. Mevissen, T. E. T., et al. OTU deubiquitinases reveal mechanisms of linkage specificity and enable ubiquitin chain restriction analysis. Cell. 154 (1), 169-184 (2013).
  27. Kwasna, D., et al. Discovery and characterization of ZUFSP/ZUP1, a distinct deubiquitinase class important for genome stability. Mol Cell. 70 (1), 150-164.e6 (2018).
  28. Hu, H., et al. X-exome sequencing of 405 unresolved families identifies seven novel intellectual disability genes. Mol Psychiatry. 21 (1), 133-148 (2016).
  29. Hartmann, I. Shaker Orbit - Revolving in Space Around the Samples? Eppendorf Lab Academy. Eppendorf Lab Academy. , at https://www.eppendorf.com/us-en/lab-academy/lab-solutions/others/shaker-orbit-revolving-in-space-around-the-samples (2020).
  30. Smith, D. B., Johnson, K. S. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene. 67 (1), 31-40 (1988).
  31. Ritorto, M. S., et al. Screening of DUB activity and specificity by MALDI-TOF mass spectrometry. Nat Commun. 5, 4763(2014).
  32. Bustos, F., Bustos, F. Immunoblotting using precast gels. , protocols.io (2024).
  33. Wingfield, P. T. Overview of the purification of recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. 80, 6.1.1-6.1.35 (2015).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Neuro ontwikkelingsstoornissenenzymatische activiteitsassayUSP27X mutatiein vitro assayeiwitzuiveringSDS PAGEK63 gekoppeld ubiquitinegenvariantanalyse

Gerelateerde artikelen