Methodenartikel

Preklinische positronemissietomografie met lichaamsconforme dierlijke mallen voor cloudgebaseerde geautomatiseerde beeldanalyse bij muizen

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67370

⸱

25 oktober 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Drug Safety R&D, Discovery & Early Development, Pfizer, Inc., 2Comparative Medicine, Discovery & Early Development, Pfizer, Inc.

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de procedure voor het uitvoeren van in vivo PET-beeldvorming op muizen met behulp van Body Conforming Animal Molds (BCAM's) in de G8 PET/CT-scanner. Technische details over de voorbereiding van de muis, waaronder de juiste implantatie van de tumor, optimale positionering, BCAM-geassisteerde PET/CT-beeldacquisitie en gegevensanalyse, worden verstrekt.

Samenvatting

Positronemissietomografie (PET) is een moleculaire beeldvormingsmodaliteit die kan worden gebruikt om een groot aantal farmacologische vragen te onderzoeken, zoals biomarkermodulatie, receptorbezetting en biodistributie van interessante verbindingen. In biodistributiestudies worden proefpersonen vaak longitudinaal in beeld gebracht na ontvangst van het testartikel. De beelden worden vervolgens geanalyseerd om het distributieprofiel van de verbinding in verschillende organen op verschillende tijdstippen af te leiden. Dit vormt een cruciale stap in de ontwikkeling van geneesmiddelen om de distributie en het mogelijk bindende profiel van een onderzoeksmiddel te begrijpen. Standaard/handmatige methoden voor biodistributieanalyses op basis van PET-beeldvorming zijn echter arbeidsintensief en tijdrovend en gaan vaak gepaard met een hoge variabiliteit tussen operators. Verder is het een uitdaging om de posities van de dieren consistent te houden op verschillende tijdstippen. Om deze tekortkomingen aan te pakken, werd een reeks muizen Body Conforming Animal Molds (BCAM's) gebruikt om een stijve en consistente positionering van dieren mogelijk te maken tijdens PET/CT-beeldvorming. Verder werd een Software-as-a-Service (SaaS)-platform gebruikt, bestaande uit een cloudgebaseerde Organ Probability Map (OPM) en een door kunstmatige intelligentie aangedreven segmentatietool om betrouwbare en geautomatiseerde kwantificering van in vivo PET-beeldvormingsgegevens mogelijk te maken. De hier gepresenteerde workflow omvat (1) het voorbereiden van muizen op beeldvorming met de BCAM's, inclusief de juiste implantatie van onderhuidse tumoren om compatibel te zijn met de mallen, (2) het verkrijgen van PET/CT-beelden met BCAM's met behulp van de G8-scanner, en 3) het uitvoeren van geautomatiseerde orgaansegmentatie en biodistributieanalyse met behulp van de cloudgebaseerde SaaS. [18E.F]FDG werd hier gebruikt als een voorbeeldtracer, maar andere biomarkers en/of radioactief gelabelde verbindingen kunnen gemakkelijk worden aangepast aan de workflow. Deze procedure kan nauwkeurig en effectief worden uitgevoerd met minimale training, en de geautomatiseerde PET-gegevensanalyse leverde bevredigende resultaten op die consistent waren met de handmatige methode.

Inleiding

In vivo moleculaire beeldvormingstechnologieën zijn belangrijke hulpmiddelen bij de ontwikkeling van geneesmiddelen om de beoordeling van alle drie de pijlers van de farmacologie te vergemakkelijken - biodistributie, doelbetrokkenheid en modulatie van de farmacodynamiek 1,2,3. Positronemissietomografie (PET), met zijn klinische vertaalbaarheid en hoge gevoeligheid, is een van de meest gebruikte moleculaire beeldvormingsmodaliteiten in zowel de kliniek als de preklinische onderzoeks- en ontwikkelingsruimte. Het bloeiende veld van preklinische PET-beeldvorming en radiotheranostiek is waardevol voor de ontwikkeling van zowel tumor-intrinsieke therapieën, gerichte therapieën als nieuwe immuno-oncologie (IO) therapieën. De voortdurende opkomst en ontwikkeling van nieuwe Immuno-PET-radiotracers hebben het potentieel om specifieke op maat gemaakte IO-medicijnregimes te beïnvloeden en responders versus non-responders te identificeren 4,5,6. Ondertussen kunnen metabole-specifieke radiotracers, zoals [18F]FDG en [18F]FLT, de reactie van een tumor op therapie volgen en respectievelijk licht werpen op de vraag of een tumor zich actief vermenigvuldigt of glucoseconsumeert 7, of dat tumorcellen een celcyclusstilstand ondergaan door middel van remming 8,9.

Niet-invasieve in vivo beeldvorming biedt meerdere voordelen in vergelijking met traditionele, niet-beeldvormende farmacologische experimenten. Beeldvorming maakt bijvoorbeeld een systemische, holistische evaluatie mogelijk van de distributie en/of het farmacologische effect van een geneesmiddel in de hele proefpersoon, waardoor niet alleen de werkzaamheid op de doellocatie kan worden gemonitord, maar ook onverwachte activiteiten buiten de locatie kunnen worden gedetecteerd. Vanwege het niet-invasieve karakter kan dezelfde set dieren longitudinaal worden beoordeeld op verschillende tijdstippen en/of met verschillende biomarkers om verschillende biologische vragen te beantwoorden10. Dit vermindert niet alleen het aantal dieren dat nodig is voor het onderzoek aanzienlijk, maar het biedt ook een orthogonale controle over tijdpunten en helpt daarom om correlaties te verbeteren en individuele variabiliteit te verminderen. Ondanks een veelbelovende ontwikkeling van beeldvormende biomarkers, wordt aan de noodzaak om onderzoeksverbindingen in vivo te evalueren met biodistributiestudies op basis van PET-beeldvorming echter voldaan door een gebrek aan efficiënte geautomatiseerde processen voor analyse. PET-biodistributiestudies genereren waardevolle informatie over de kinetiek, weefselaccumulatie, binding en metabolisme van een verbinding. Het verkrijgen van zeer reproduceerbare kwantitatieve gegevens is van cruciaal belang voor de ontwikkeling van farmaceutische therapieën.

Om tegemoet te komen aan deze onvervulde behoeften op het gebied van geautomatiseerde PET-beeldanalyse, heeft InVivo Analytics een set Body Conforming Animal Molds (BCAM's) van muizen ontworpen11. Dit zijn 3D-geprinte plastic mallen die het hoofd, de romp (en inwendige organen), de staart en de ledematen van een muis in stijve, vooraf gedefinieerde posities houden. Mallen van verschillende grootte kunnen worden geselecteerd op basis van het lichaamsgewicht van het dier, en er kunnen uitsparingen worden gemaakt in specifieke regio's, zoals de schouder of onderflank, om onderhuidse tumoren te laten uitsteken. PET/CT-beelden die met deze BCAM's zijn verkregen, zijn zeer uniform en kunnen in batches worden geanalyseerd door het cloudgebaseerde geautomatiseerde segmentatieplatform van het bedrijf11. Dit artikel presenteert een geautomatiseerde in vivo workflow voor biodistributieanalyse die wordt aangedreven door het fysiek verwerven van afbeeldingen met BCAM's en het uitvoeren van beeldsegmentatie en -analyse door de SaaS.

Protocol

Alle procedures die op dieren werden uitgevoerd, volgden de voorschriften en vastgestelde richtlijnen en werden beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van Pfizer of via een ethisch beoordelingsproces. PET-beeldvormingsonderzoek werd uitgevoerd volgens alle institutionele stralingsveiligheidsprotocollen. Vrouwelijke C57BL/6-muizen van 10-12 weken oud, met een lichaamsgewicht van 18-26 g, werden in deze studie gebruikt. De details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiden en ensceneren van dieren

OPMERKING: Deze stap omvat het ensceneren van de dieren voor PET-beeldvorming met BCAM-sjabloongeleide tumorimplantatie.

  1. Scheer voorafgaand aan de celimplantatie de vacht van de muizen in het gewenste gebied van tumorgroei.
  2. Stel het anesthesiestation in en bevestig een BCAM-mal van de juiste maat aan de pre-clip met de bovenkant 90 graden omhooggeklapt. Dit zal dienen als basis voor de implantatie van de tumor (Figuur 1A).
  3. Verdoof de dieren in een geschikte inductiebox met 2,0% isofluraan en 98% zuurstof met een debiet van 0,5-1,5 l/min.
    OPMERKING: Alle anesthesiesystemen zijn variabel.
    1. Gebruik een gekalibreerd systeem en test voor gebruik. Plaats een verdoofde muis op de basis en strek zijn ledematen uit (Figuur 1B).
  4. Plaats voorzichtig een BCAM-tumorinjectiesjabloonmal (Figuur 1C) op de dorsale zijde van de muis (Figuur 1D).
  5. Maak voorzichtig een tijdelijke cirkelvormige referentiemarkering op de gewenste uitsparingslocatie (bijv. schouder of flank, links of rechts) met een markering (Figuur 1D). Verwijder de sjabloonvorm.
  6. Bereid de cellen voor op injectie door het gewenste volume in een spuit op te zuigen. Bevestig een naald van 27 G aan de spuit en vul de lege volumeruimte. Een volume van 0,1-0,2 ml per inoculatie wordt aanbevolen.
  7. Til de huid op met de vingers of een tang met behulp van de tijdelijke markeringen uit stap 1.5 als referentie om een tent te maken, steek de naald langzaam in en injecteer de cellen subcutaan op de gewenste plaats. Gooi de naald weg in een container voor biologisch gevaarlijke scherpe voorwerpen.
  8. Bewaak de tumorgroei. Het gemiddelde tumorvolume bij inschrijving in dit voorbeeld was 200-300 mm3.
    NOTITIE: Vermijd het gebruik van metalen onderdelen zoals oormerken of microchips om CT-beeldvormingsartefacten te voorkomen.

2. Radioactieve doses afnemen

  1. Volg alle institutionele stralingsveiligheidsprotocollen en trek zorgvuldig een doeldosis van [18F]FDG in het bereik van ongeveer 70-80 μCi op in een steriele spuit die geschikt is voor intraveneuze injectie.
    OPMERKING: Het bereik van 70-80 μCi is optimaal voor het dynamische bereik van de Sofie G8 PET-scanner. Andere imagers kunnen verschillende dynamische bereiken hebben die een andere doeldosis vereisen.
  2. Meet de radioactieve dosis zorgvuldig af in een dosiskalibrator door de spuit in de putkamer te plaatsen en de dipper te laten zakken. Let erop dat u de juiste isotoop of het juiste kalibratienummer selecteert voordat u gaat meten.
  3. Doe een stabiele meting. Noteer datum en tijd. Pas de dosis indien nodig aan.
  4. (Optioneel) Gebruik steriele zoutoplossing om het uiteindelijke dosisvolume op 0,1-0,2 ml te brengen.
    OPMERKING: Het gewenste injectievolume kan variëren.
  5. De dosis is klaar om te worden toegediend.

3. Toediening van intraveneuze doses

  1. Volg de institutionele IACUC- en stralingsveiligheidsprotocollen en bereid de muizenstaart voor op IV-injectie door de staartader te verwijden. In dit onderzoek werd de staartader verwijd door de dierenkooi of inductiekamer op een schuifverwarmer te plaatsen die op 42 °C was ingesteld.
    OPMERKING: Het kan tot 10 minuten opwarmen duren voordat de staartader volledig is verwijd.
  2. Registreer vóór de injectie het gewicht van de muis. Dit zal bepalen welke gewichtsspecifieke BCAM moet worden gebruikt voor PET/CT-beeldvorming.
  3. Als u klaar bent, brengt u de muis over naar een geschikte fixator (bijv. in dit onderzoek werd een injectieplatform voor de staartader gebruikt) en zoekt u de staartader.
  4. Pak de radioactieve spuit voorzichtig aan en injecteer de dosis in een muis die bij bewustzijn is. Noteer de injectietijd.
  5. Zet de spuit voorzichtig opzij en verwijder overtollige bloeddruppels van de staart met gaas. Haal de muis uit de houder en plaats deze terug in de daarvoor bestemde behuizing.
  6. Plaats de spuit voorzichtig terug in de dosiskalibratorkamer en noteer eventuele resterende metingen voor de juiste dosisberekeningen. Noteer de datum en tijd van de meting van de restactiviteit.
  7. Zodra de injecties zijn voltooid, wees dan voorzichtig en plaats cohorten muizen achter loden omhulsels en/of uit de buurt van personeel, volgens instellingsveilige stralingspraktijken. Let op: alle gebruikte materialen zijn onderhevig aan lichte radioactieve besmetting. Bewaak alle gebieden met een gekalibreerde geigerteller en reinig volgens de stralingsveiligheidsrichtlijnen.

4. Verdoving en positionering van de dieren voor PET-beeldvorming

  1. Schakel op een geschikt tijdstip (bijv. 10-15 minuten voor het einde van de opnameperiode van de tracer) alle anesthesieapparatuur en opwarmingsinstrumenten voor dieren in die nodig zijn voor zowel anesthesie-inductie als PET-beeldvorming. Anesthesie kan worden ingesteld op 2,0%-2,5% isofluraan in 98% zuurstof (instellingen kunnen variëren afhankelijk van de muizenstam en het ziektemodel).
  2. Controleer of alle adapters en kleppen zijn ingeschakeld en of het gasdebiet 0.5-1.0 l/min is. Specifieke stroomsnelheden kunnen variëren tussen anesthesiesystemen en beeldvormingssystemen.
  3. Plaats het juiste dier of de geschikte dieren in een inductiebox en wacht tot de proefpersoon de juiste anesthesiediepte heeft bereikt.
  4. Breng oogsmeerzalf aan op elk oog.
  5. Breng de muis over naar een BCAM van de juiste grootte op basis van lichaamsgewicht.
  6. Pak de muis voorzichtig bij de nek op, steek de staart in de staartgleuf en wikkel deze onder de BCAM. Plaats de staart op het staartplatform en plak hem vast om de positie vast te zetten. Controleer of de rug recht is. Sluit de BCAM voorzichtig (Figuur 2A,B).
  7. Plaats voorzichtig alle vier de ledematen om op elk van de BCAM-pootplatforms te rusten. Gebruik indien nodig tape om de poten aan elk platform te bevestigen (Figuur 2B).
  8. Klik de BCAM voorzichtig in de beeldvormende bedshuttle door eerst de voorkant in te brengen (Afbeelding 2C). De shuttle moet al zijn aangesloten op het laadperron G8 met anesthesiestroom (Figuur 2D). Duw de achterkant van de BCAM naar beneden en een klik geeft aan dat deze is bevestigd aan de G8-shuttle.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de anesthesievoorraad zo is dat het dier tijdens de beeldvorming in het gewenste anesthesievlak blijft.

5. Beeldacquisitie

  1. Open de G8 PET-acquisitiesoftware. Studiemappen, scanparameters en onderwerp-ID's kunnen vooraf worden aangemaakt.
    1. Voer onderzoeksgegevens in de software in: muisgewicht, datum/tijd en hoeveelheid van de afgenomen startdosis, datum/tijd van injectie en datum/tijd en hoeveelheid restactiviteit.
  2. Steek de shuttle met de muis in de scanneropening. Een blauw indicatielampje geeft aan dat het systeem correct is gekoppeld.
  3. Selecteer de juiste PET/CT-parameters. Verkrijg beeldgegevens.
    OPMERKING: In deze studie werd een statische 18F PET-scan van 7 minuten uitgevoerd, gevolgd door een standaard CT-scan van 70 seconden, en een 3D-reconstructiealgoritme voor maximale waarschijnlijkheidsverwachtingsmaximalisatie (standaard en enige optie in de G8-scanner) werd toegepast om de gegevens te reconstrueren12.
  4. Na voltooiing van de overname keert de shuttle terug naar zijn oorspronkelijke startpositie. Verwijder de shuttle met de muis en plaats deze in het dock. Druk op de achterkant van het verticale lipje van de BCAM om het van de G8-shuttle te verwijderen, en trek de BCAM voorzichtig omhoog en verwijder deze met de muis.
  5. Druk op de twee bevestigingslipjes om de bovenkant van de BCAM omhoog te klappen en te openen.
  6. Verwijder de muis voorzichtig. Zorg ervoor dat de muis volledig is hersteld van de anesthesie en helder, alert en responsief is (BAR) voordat u terugkeert naar zijn thuiskooi.
  7. Ga door met de procedure met vaste tijdsintervallen om het hele cohort/de groep muizen te scannen.

6. Afbeeldingen uploaden naar de SaaS

  1. Log in op app.invivo.ax en maak een project aan.
  2. Klik op het rode uploadtabblad rechtsboven in het venster. Selecteer een beeldvormingssysteem en een reporter die worden gebruikt in het beeldvormingsonderzoek (d.w.z. [18F]FDG). Selecteer de map met beeldgegevens.
  3. Navigeer naar het tabblad Aantekeningen in de projectmap. Klik op Annoteren om relevante scaninformatie toe te voegen (naam van de proefpersoon, geslacht, BCAM-grootte, gewicht van de proefpersoon, naam van het cohort, tijdstip en waarde van de geïnjecteerde dosis). De meeste metagegevens worden automatisch ingevuld.

7. Geautomatiseerde data-analyse

  1. In de projectmap moeten alle scans worden ingevuld. Klik op scans om te navigeren van project-, groeps- en individuele onderwerpniveaus. Selecteer Analyseren in de rechterbovenhoek.
  2. Selecteer in de rechterbovenhoek van het lintvenster voor analyse onder Project het plusteken en selecteer ROI voor orgaanwaarschijnlijkheidstoewijzing. De Organ Probability Map (OPM) is een statistische muizenorgaanatlas die meerdere vooraf gedefinieerde organen en weefsels omvat. Selecteer individuele organen van belang op basis van onderzoeksbehoeften.
    OPMERKING: In dit voorbeeld werden handmatige segmentatie en analyse uitgevoerd met behulp van VivoQuant, met behulp van de spline-tool, gevolgd door interpolatie binnen de 3D ROI-operator. Geautomatiseerde analyseresultaten werden vergeleken met de handmatige segmentatieresultaten als benchmark.

Resultaten

Eenmaal geüpload, kunnen de PET-gegevens op de SaaS-website worden bekeken als een paneel van coronale, sagittale en transversale afbeeldingen bedekt met de geselecteerde orgaan-ROI's die worden gedicteerd door de OPM (Figuur 3A). Niet alleen kan de software individuele afbeeldingen laden, maar meerdere muizen uit een groep of een hele studie kunnen tegelijk worden bekeken als een enkele, samengevouwen afbeelding. Binnen dit analysevenster zijn er opties om ROI-kleuren, schaalbalkintensiteit en andere algemene parameters aan te passen. Zodra de ideale analytische metrieken zijn geselecteerd, genereert de SaaS een downloadbaar biodistributiestaafdiagram van de geselecteerde organen (Figuur 3B).

Om de prestaties van het op OPM gebaseerde SaaS-platform te evalueren, werden de resultaten van de geautomatiseerde analyse vergeleken met de resultaten die door een ervaren beeldvormingsanalist werden afgeleid als de gouden standaard. Fit lineaire regressie werd uitgevoerd op de [18F]FDG-opnamewaarden van hersenen, hart, nier (rechts) en milt. Merk op dat het platform een uitgebreide lijst met organen biedt waaruit gebruikers kunnen kiezen, waaronder het skelet, de hersenen, de blaas, het hart, de nieren (rechts en links), de lever, de milt, de longen en de quadricepsspieren (rechts en links). De vier bovenstaande organen zijn in deze studie alleen ter illustratie geselecteerd. Verder wordt de tumor, vanwege de variabele grootte, vorm en diepte/locatie van geïmplanteerde tumoren, niet opgenomen als orgaan in de OPM en daarom uitgesloten van deze vergelijkende analyse. Zoals te zien is in figuur 4, leverden de geautomatiseerde analyse en handmatige analyse over het algemeen consistente resultaten op, waarbij de hersenen de hoogste correlatie vertoonden (r2 = 0,8466). Dit is te verwachten vanwege de grote omvang van het orgaan en de zeer constante positie van de hersenen in de schedel. De rechternier en het hart vertoonden ook redelijke r2-waarden van respectievelijk 0,6874 en 0,4849. Daarentegen genereerde de correlatieanalyse voor de milt een r2-waarde van 0,3922, wat de laagste is van de geteste organen. Dit is niet verwonderlijk, aangezien de milt is genesteld in de alvleesklier en vetweefsels die geen gedefinieerde morfologie hebben en dezelfde dichtheid van zacht weefsel op CT veronderstellen. De milt is daarom moeilijk handmatig te segmenteren en de OPM kan een nauwkeuriger middel zijn om dit orgaan af te bakenen (d.w.z. beter presteren dan de gouden standaard). De helling en het Y-snijpunt van deze correlatieanalyses zijn ook weergegeven in figuur 4. In overeenstemming met de r2-waarden hadden de hersenen een helling die het dichtst bij 1 lag (d.w.z. een perfecte correlatie tussen OPM en handmatige resultaten) en het kleinste Y-snijpunt (d.w.z. minimale systemische vertekening), terwijl de andere organen een grotere en variabele afwijking vertoonden van een perfecte correlatie.

figure-results-1
Figuur 1: BCAM en sjabloongeleide tumorimplantatie. (A) De voorclip (1) wordt bevestigd aan het onderste stuk van een BCAM-mal (2) met een aangesloten anesthesielijn (3). Dit dient als basis voor de implantatie van de tumor. (B) Een muis met de doelimplantaatplaats geschoren (in dit geval de rechterschouder) wordt onder narcose op de basis geplaatst voorafgaand aan de celinjectie. (C) Sjabloon voor tumorimplantatie (4) met vooraf gedefinieerde uitsparingen om de plaatsing van tumorcelinoculatie te begeleiden. (D) Het maken van een tijdelijke referentiemarkering voorafgaand aan celinjectie met de sjabloonmal op de dorsale zijde van de muis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Een muis in een BCAM plaatsen. (A) Bovenaanzicht - Plaats een muis stevig in een BCAM van de juiste grootte (5). (B) Zijaanzicht - Tape wordt gebruikt om de achterpoten aan de platforms te bevestigen (6). De staart wordt met tape vastgezet aan het staartplatform (7) direct onder de muis. (C) De muis wordt in de BCAM in de beeldvormingsshuttle (8) ingebracht. (D) Muis, BCAM en shuttle zijn aangesloten op een anesthesie-draaiend dockingstation (9). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Representatieve afbeeldingen en gegevensuitvoer zoals respectievelijk bekeken en geanalyseerd door de SaaS-tool. (A) Representatieve afbeeldingen zoals bekeken op de SaaS-website. Coronale, sagitale en transversale weergaven van het PET/CT-beeld bedekt met orgaan-ROI's geselecteerd uit de Organ Probability Map (OPM). Roze: hersenen; rood: hart; donkerblauw: long; zalm: lever; oranje: nier (rechts). Tumor wordt niet gedefinieerd door de OPM. (B) Een representatieve downloadbare grafiek die is gegenereerd op basis van de geautomatiseerde analyse. Een lijst van de geselecteerde organen is te zien in het paneel linksboven. De gegevens worden hier gerapporteerd in %ID/ml. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Lineaire regressieanalyse waarin orgaan- [18F]FDG-opnamewaarden worden vergeleken die zijn afgeleid door handmatige analyse en de op OPM gebaseerde automatiseringsworkflow. Er werden tien PET/CT-scans van vrouwelijke C57BL/6-muizen gebruikt. r2-waarden , 95% betrouwbaarheidslijnen, helling en Y-snijpunten worden weergegeven in de grafiek voor elk aangegeven orgaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het huidige rapport beschrijft de procedure voor het uitvoeren van in vivo PET-beeldvorming van muizen met de BCAM-mallen en het analyseren van gegevens met de geautomatiseerde SaaS-tool. Er worden stapsgewijze instructies gegeven over het voorbereiden van muizen, het verzamelen van beeldvorming en gegevensverwerking. Deze automatiseringsworkflow leverde ook gegevens op die consistent waren met handmatige analyse. Hieronder worden enkele belangrijke technische overwegingen toegelicht.

Hoewel een tumor niet een van de organen is die door de OPM worden gedefinieerd, is een cruciale stap in dit protocol de juiste implantatie van onderhuidse tumoren om uiteindelijk te zorgen voor een optimale uitlijning van alle muizenorganen in de lichaamsholte en BCAM. De OPM kan alleen nauwkeurige gegevens produceren als de ruggengraat van een muis relatief recht is en de inwendige organen neutraal gepositioneerd zijn. Te grote of misplaatste tumoren kunnen de houding van de muis beïnvloeden en in zijn lichaamsholte drukken, waardoor de inwendige organen verschuiven. Deze verschuiving zal op zijn beurt de resulterende kwantitatieve analyse van het OPM-algoritme vertekenen. Anderen hebben de impact gemeld van een niet-rechte wervelkolom op de uitlijning van inwendige organen met behulp van verschillende beeldvormingsmodaliteiten en segmentatie-algoritmen13,14. Daarom is het van cruciaal belang om de sjabloon te gebruiken om de implantatie van tumoren te begeleiden en de tumorgroei nauwlettend te volgen om ervoor te zorgen dat de tumoren zowel goed gepositioneerd zijn als in het ideale groottebereik.

Een ander gebied van mogelijke afwijking is de selectie van een BCAM met de juiste grootte. BCAM's worden gemaakt in integralen van 2 g, met een bereik van 18-26 g. Aangezien muizen met verschillende lichaamssamenstellingen (bijv. meer spieren versus meer vet) hetzelfde lichaamsgewicht maar verschillende fysieke afmetingen kunnen hebben, is het echter belangrijk om de meest geschikte BCAM te kiezen terwijl u hun lichaamsgewicht als algemene referentie gebruikt. Ga met vallen en opstaan naar boven of naar beneden en houd er rekening mee dat een goede uitlijning van cruciaal belang is. Als u een BCAM kiest die te groot is, zullen de inwendige organen van de muis dichter bij de bodem van het bed 'zinken', wat met name van invloed zal zijn op de nauwkeurigheid van de analyse van de dorsale organen zoals de nieren en de wervelkolom. Daarentegen kan het plaatsen van een te kleine muis in BCAM op hun lichaamsholten drukken, de positie van organen scheef trekken en mogelijk ademhalingsmoeilijkheden veroorzaken. Het gebruik van tape om ervoor te zorgen dat ledematen op pootplatforms worden vastgezet, zal helpen bij het instellen en positioneren.

Hoewel deze gerapporteerde workflow gestandaardiseerde en geautomatiseerde PET-beeldanalyse mogelijk maakt, is het de moeite waard om erop te wijzen dat de huidige OPM is geconstrueerd op basis van de immunocompetente C57BL/6-muizenstam en gezonde muizen. Andere stammen en gezondheidsproblemen van muizen kunnen verschillende anatomische kenmerken vertonen die extra aanpassing, optimalisatie en validatie van het algoritme vereisen. Immuundeficiënte stammen zoals NSG of NCG hebben bijvoorbeeld kleinere milten. Evenzo kunnen muizen met orthotope tumorimplantaten verschillende maten, vormen en locaties van inwendige organen hebben, afhankelijk van hun ziektestatus. Een andere beperking van deze workflow is de algehele doorvoer tijdens de acquisitiefase van een experiment. Dit komt vooral door de extra tijd die nodig is om een muis goed in te stellen in de BCAM. Training en oefening kunnen de efficiëntie van de operator bij de juiste plaatsing verhogen. De toevoeging van een tweede dockingstation kan ook de algehele doorvoer verhogen, waarbij het ene dock kan dienen voor BCAM-installatie en het andere kan dienen voor het verwijderen van een muis naar een herstelkooi. Desalniettemin, zelfs met de langere tijd die nodig is voor de BCAM-installatie voorafgaand aan het scannen, loont de investering in tijd door tijd te besparen op het gebied van gegevensanalyse. In het huidige onderzoek duurde het bijvoorbeeld minder dan 10 minuten voordat de OPM tien afbeeldingen had geanalyseerd (met 4 ROI's), terwijl het 3-4 uur duurde voordat een zeer ervaren analist dezelfde set afbeeldingen en ROI's handmatig had gesegmenteerd en geanalyseerd. Een onervaren analist zou nog meer tijd nodig hebben voor handmatige analyse. Het SaaS-platform maakt de analyse van PET-scans in grote batches mogelijk, waarbij de volledige in vivo biodistributieanalyse binnen enkele minuten na het uploaden van de gegevens kan worden voltooid. Dit is een uiterst nuttige functie bij het verwerken van grote hoeveelheden gegevens uit meerdere groepen en/of over verschillende tijdstippen, zoals hieronder wordt besproken.

Handmatige segmentatie van organen voor een enkel onderwerp kan tijdrovend zijn en vereist meestal een aanzienlijke training vooraf van de operator. Zelfs met de juiste training hebben handmatige analyses onvermijdelijk te maken met variabiliteit tussen operators, wat de kwantitatieve resultaten kan vertekenen15,16. Geautomatiseerde segmentatie en gegevensanalyse daarentegen kunnen de algehele biodistributie van een radiotracer nauwkeurig en efficiënt bepalen en variabiliteit elimineren die zijn geworteld in menselijke operaties. Dergelijke voordelen van automatisering zijn zowel gezien bij de analyse van klinische beelden als in de preklinische ruimte. Sluis et al. toonden bijvoorbeeld aan dat een enkele scan 4 uur nodig had om de organen van belang te segmenteren, vergeleken met 30 minuten met AI-cloudgebaseerde methoden17. Een andere studie van Nazari et al. meldde ook dat op algoritmen gebaseerde analyse van de lever en de nieren nauwkeurige resultaten liet zien binnen 7,0% in vergelijking met twee menselijke medische fysici18. De gegevens in figuur 4 toonden ook duidelijk de betrouwbaarheid van de SaaS-gebaseerde workflow voor PET-beeldvormingsanalyse, en dat geautomatiseerde analyse consistente resultaten opleverde in vergelijking met handmatige analyse.

Samenvattend illustreert dit artikel de workflow van het gebruik van BCAM-mallen om gestandaardiseerde preklinische PET/CT-beeldacquisitie en SaaS-compatibele geautomatiseerde PET-gegevensanalyse mogelijk te maken. Het is aangetoond dat deze platformtechnologie relatief eenvoudig te gebruiken is en dat de kwaliteit van door automatisering gegenereerde gegevens consistent is met handmatige analyse, maar aanzienlijke tijdbesparende voordelen biedt. Daarom kan deze workflow onderzoekers honderden uren aan data-analysetijd besparen en helpen bij het standaardiseren en verminderen van de variabiliteit tussen operators. Deze procedure kan helpen bij de ontwikkeling van een groot aantal geneesmiddelen in verschillende modaliteiten en indicaties. Met name modaliteiten met grote moleculen, zoals therapeutische antilichamen, bispecifieke antilichaam-immuuncel-engagers, antilichaam-geneesmiddelconjugaten en zelfs nanodeeltjes, kunnen gemakkelijk worden gelabeld met radiometalen (bijv. Zr-89, Cu-64) om PET-beeldvorming-gemedieerde biodistributiebeoordeling mogelijk te maken19,20. Op dezelfde manier kan deze platformtechnologie helpen bij het bepalen van de dosimetrie van nieuwe radiotherapieën bij muizen21. De toepassing van deze procedure zal een grote toegevoegde waarde zijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen.

Openbaarmakingen

Alle auteurs zijn huidige of voormalige werknemers van Pfizer, Inc.

Dankbetuigingen

Speciale dank aan Pfizer La Jolla Comparative Medicine Research en technisch personeel.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
[18F]FDGPETNet Solutions, Culver City, CANARadiotracer gebruikt voor PET-beeldvorming
27 G naald Becton, Dickinson and Company, San Diego, CA305136Gebruikt voor celinjectie 
app.invivo.ax/loginInvivo Analytics, Seattle, WANASoftware as a Service webpagina
Body Conforming Animal MoldsInvivo Analytics, Seattle, WANABCAM's met gewichtsbereik van 18 - 26 g
Dose Calibrator; CRC-55twCapintec, Florham Park, NJCRC-55twMeting van radioactieve doses
G8 PET/CT scannerSofie Biosciences/Xodus Imaging, Torrence, CANABenchtop scanner met laaddock
G8-Docking stationSofie Biosciences/Xodus Imaging, Torrence, CANADockingstation voor staging
Implantation Mold TemplateInvivo Analytics, Seattle, WANASjabloon voor optimale tumorimplantatie
Smeermiddel oogzalfBAUSCH & LOMB, Ontario, CanadaSoothe NighttimeOogsmeer voor muizen
Gemodificeerde G8 shuttleInvivo Analytics, Seattle, WANAShuttle voor BCAM-accommodatie
Muisanesthesie InductieboxPatterson Scientific, Waukesha, WI78933388Gebruikt voor het anestheseren van een muis
PRE-ClipInvivo Analytics, Seattle, WANABCAM-adapter voor anesthesieaansluiting
Premiere Slide warmerLabScientific, Danvers, MAXH-2001Instelbare temperatuurwarmer gebruikt voor staartvenendilatatie en anesthesie-inductie
Spuit (1 mL)Becton, Dickinson and Company, San Diego, CA309659Gebruikt voor celinjectie 
Staartvene injectieplatform Braintree Scientific, Pembroke, MAIL-300Begrenzer gebruikt voor het toedienen van intraveneuze injecties. 
Vivoqaunt Software Invicro, Needham, MANASoftware gebruikt voor handmatige segmentatie

Referenties

  1. Huang, R., Wang, M., Zhu, Y., S Conti, P., Chen, K. Development of pet probes for cancer imaging. Curr Top Med Chem. 15 (8), 795-819 (2015).
  2. Schwenck, J., et al. Advances in pet imaging of cancer. Nat Rev Cancer. 23 (7), 474-490 (2023).
  3. Matthews, P. M., Rabiner, E. A., Passchier, J., Gunn, R. N. Positron emission tomography molecular imaging for drug development. Br J Clin Pharmacol. 73 (2), 175-186 (2012).
  4. Tavaré, R., et al. An effective immuno-pet imaging method to monitor CD8-dependent responses to immunotherapy. Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).
  5. Maresca, K. P., et al. Preclinical evaluation of 89ZR-DF-IAB22M2C PET as an imaging biomarker for the development of the gucy2c-cd3 bispecific pf-07062119 as a t-cell engaging therapy. Mol Imaging Biol. 23 (6), 941-951 (2021).
  6. Nisnboym, M., et al. Immuno-pet imaging of cd69 visualizes t-cell activation and predicts survival following immunotherapy in murine glioblastoma. Cancer Res Commun. 3 (7), 1173-1188 (2023).
  7. Lee, C., et al. Efficacy and imaging-enabled pharmacodynamic profiling of Kras g12c inhibitors in xenograft and genetically engineered mouse models of cancer. Mol Cancer Ther. 22 (7), 891-900 (2023).
  8. Bollineni, V., Kramer, G., Jansma, E. P., Liu, Y., Oyen, W. J. A systematic review on [18f] flt-pet uptake as a measure of treatment response in cancer patients. Eur J Cancer. 55, 81-97 (2016).
  9. Everitt, S., et al. Imaging cellular proliferation during chemo-radiotherapy: A pilot study of serial 18f-flt positron emission tomography/computed tomography imaging for non-non-small-cell lung cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 75 (4), 1098-1104 (2009).
  10. Rashidian, M., et al. Predicting the response to CTLA-4 blockade by longitudinal non-invasive monitoring of cd8 t cells. J Exp Med. 214 (8), 2243-2255 (2017).
  11. Klose, A. D., Paragas, N. Automated quantification of bioluminescence images. Nat Commun. 9 (1), 4262(2018).
  12. Gu, Z., et al. Performance Evaluation of G8, a high-sensitivity benchtop preclinical PET/CT Tomograph. J Nucl Med. 60 (1), 142-149 (2019).
  13. Bongratz, F., Rickmann, A. -M., Wachinger, C. Abdominal organ segmentation via deep diffeomorphic mesh deformations. Sci Rep. 13 (1), 18270(2023).
  14. Wang, H., Stout, D. B., Chatziioannou, A. F. Mouse atlas registration with non-tomographic imaging modalities-a pilot study based on simulation. Mol Imaging Biol. 14, 408-419 (2012).
  15. Montgomery, M. K., et al. Mouse lung automated segmentation tool for quantifying lung tumors after micro-computed tomography. PLoS One. 16 (6), e0252950(2021).
  16. Montgomery, M. K., et al. Applying deep learning to segmentation of murine lung tumors in preclinical micro-computed tomography. Transl. Oncol. 40, 101833(2024).
  17. Van Sluis, J., et al. Manual versus artificial intelligence-based segmentation as a pre-processing step in whole-body pet dosimetry calculations. Mol Imaging Biol. 25 (2), 435-441 (2023).
  18. Nazari, M., et al. Automated and robust organ segmentation for 3D-based internal dose calculation. EJNMMI Res. 11, 1-13 (2021).
  19. Goel, S., England, C. G., Chen, F., Cai, W. Positron emission tomography and nanotechnology: A dynamic duo for cancer theranostics. Adv Drug Deliv Rev. 113, 157-176 (2017).
  20. Campbell, D. O., et al. Preclinical evaluation of an anti-nectin-4 immunopet reagent in tumor-bearing mice and biodistribution studies in cynomolgus monkeys. Mol Imaging Biol. 18, 768-775 (2016).
  21. Bednarz, B., et al. Murine-specific internal dosimetry for preclinical investigations of imaging and therapeutic agents. Health Phys. 114 (4), 450-459 (2018).

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Preklinische PET-beeldvorminglichaamsondersteunende mallencloudgebaseerde segmentatieorgaanwaarschijnlijkheidskaartbiodistributieanalysesubcutane tumorimplantatiefluor-18 FDGPET-CT-beeldvorming
Preklinische positronemissietomografie met lichaamsconforme dierlijke mallen voor cloudgebaseerde geautomatiseerde beeldanalyse bij muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.