Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een muismodel van hemorragische transformatie geïnduceerd door acute hyperglykemie in combinatie met voorbijgaande focale ischemie

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67371

⸱

15 november 2024

 ,  ,  , 
1Hubei Key Laboratory of Cognitive and Affective Disorder, Institute of Biomedical Sciences, School of Medicine, Jianghan University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

Deze studie presenteert een protocol voor het opstellen van een zeer reproduceerbaar diermodel van hemorragische transformatie (HT) met behulp van occlusie/reperfusie van de middelste hersenslagader (MCAO/R) bij C57BL/6-muizen met acute hyperglykemie.

Samenvatting

Hemorragische transformatie (HT) is een ernstige complicatie die kan optreden als gevolg van trombolytische therapie na ischemische beroerte (IS), en het brengt aanzienlijke beperkingen met zich mee voor de klinische toepassing van recombinante weefselplasminogeenactivator (rt-PA). Helaas zijn er momenteel geen effectieve interventies beschikbaar voor HT in de klinische praktijk. Daarom is er dringend behoefte aan stabiele en betrouwbare proefdiermodellen om de pathogenese van HT op te helderen en effectieve interventiestrategieën te ontwikkelen. Deze studie presenteerde een protocol voor het opstellen van een muismodel van HT geïnduceerd door acute hyperglykemie in combinatie met voorbijgaande focale ischemie (tMCAO). Mannelijke C57BL/6J-muizen werden geïnjecteerd met 30% glucose om hyperglykemie te induceren en vervolgens onderworpen aan 60 minuten tMCAO met reperfusie. Het infarctvolume, de integriteit van de bloed-hersenbarrière (BBB) en de mate van intracraniële bloeding werden 24 uur na MCAO beoordeeld. De resultaten toonden aan dat glucose-injectie leidde tot voorbijgaande hyperglykemie (14,3-20,3 mmol/L), wat zowel het infarctvolume als de incidentie van HT significant verhoogde. Hematoxyline-eosine (H&E) kleuring duidde op significante hemorragische laesies binnen de infarctzone bij hyperglykemische muizen. Bovendien vertoonden hyperglykemische muizen een verergerde BBB-verstoring, zoals blijkt uit ernstigere lekkage van Evans-blauw (EB) en FITC-Dextran. Concluderend resulteerde acute hyperglykemie betrouwbaar en consistent in macroscopische HT in een muismodel van tMCAO. Dit reproduceerbare model biedt een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van de pathologische mechanismen van HT en het ontwikkelen van overeenkomstige therapeutische interventies.

Inleiding

Herseninfarct is de primaire oorzaak van invaliditeit en de op één na belangrijkste doodsoorzaak bij volwassenen wereldwijd1. De acute fase speelt een cruciale rol in de progressie van een herseninfarct en dient als een cruciaal tijdstip voor de behandeling van ziekten. Vroeg en tijdig herstel van de bloedstroom in het penumbragebied is essentieel om verdere dood van hersencellen te voorkomen, waarbij trombolyse en interventionele therapie de steunpilaren zijn voor de behandeling van een acuut herseninfarct (ACI). Hemorragische transformatie (HT) vormt echter een significante complicatie na trombolyse en interventionele therapie, die optreedt bij 15%-30% van de patiënten met een ischemische beroerte, waardoor de toepassing ervan tot op zekere hoogte wordt beperkt 2,3. Het optreden van HT verhoogt het risico op mortaliteit en invaliditeit aanzienlijk, wat de prognose van ACI beïnvloedt. Daarom is het van groot klinisch belang om de pathologische mechanismen van HT te onderzoeken en effectieve therapeutische doelen te identificeren.

Momenteel wordt door draadembolie geïnduceerde occlusie van de middelste hersenslagader (MCAO) vaak gebruikt als een model van HT bij knaagdieren4. Langdurige obstructie kan resulteren in een enorm herseninfarct waarbij de cortex en het striatum betrokken zijn, wat mogelijk kan leiden tot secundaire HT. Thread MCAO vereist geen craniotomie, is zeer reproduceerbaar en produceert focale hersenbeschadiging en HT vergelijkbaar met een menselijke beroerte. Dit mechanische model heeft echter enkele duidelijke nadelen, waaronder hoge vroege sterftecijfers en lage overlevingspercentages op lange termijn5. Een ander veelgebruikt HT-model is het trombolysemodel, waarbij de vorming van bloedstolsels eerst in het doelvat wordt geïnduceerd, gevolgd door het gebruik van trombolytica (bijv. rt-PA, warfarine) om het stolsel op te lossen, waarbij het klinische proces van HT bij ischemische beroertewordt nagebootst 6,7. Ondanks het feit dat het pathologische proces van klinische trombolytische therapie in grote mate wordt gerepliceerd, zijn HT-diermodellen geïnduceerd door rt-PA of warfarine ingewikkeld om te implementeren en geassocieerd met hoge diersterfte, evenals variabele incidentie en locatie van bloedingen. Om fundamenteel en klinisch translationeel onderzoek naar HT na een herseninfarct vooruit te helpen, is het essentieel om een reproduceerbaar diermodel van HT op te stellen dat gemakkelijk te bedienen is en een hoge stabiliteit biedt.

Hyperglykemie levert een belangrijke bijdrage aan HT na cerebrale ischemie/reperfusie (I/R)8. Verschillende retrospectieve onderzoeken hebben de klinische gegevens geanalyseerd van patiënten die een mechanische trombectomie ondergaan, waaruit blijkt dat verhoogde bloedglucosespiegels bij opname verband houden met een hogere incidentie van spontane HT3. Bij patiënten met een beroerte met diabetes verhoogt hyperglykemie het risico op HT aanzienlijk en leidt het tot ernstigere neurologische uitval 9,10. Onderzoekers hebben HT-modellen ontwikkeld door cerebrale I/R te induceren in diabetische diermodellen via MCAO. Het diabetes-MCAO-model heeft echter een lange experimentele duur, een complexe procedure en hoge kosten 11,12. Een betrouwbaar model van HT kan worden vastgesteld door acute hyperglykemie te induceren door middel van intraperitoneale injectie van glucose en dit te integreren met een cerebraal I/R-model dat wordt gegenereerd door de hechttechniek. Deze methode kan eenvoudig worden uitgevoerd met een consistente bloedingspositie en imiteert effectief de klinische kenmerken van hyperglykemie na een beroerte. Er zijn echter aanzienlijke verschillen in cruciale omstandigheden zoals ischemische tijd en glucoseconcentratie; bovendien zijn de stabiliteit van het model en de incidentie van HT inconsistent in verschillende literatuur.

Onze onderzoeksgroep heeft uitgebreid gebruik gemaakt van de acute hyperglykemie-MCAO-methode om een HT-model op te stellen. Verder hebben we een uitgebreide reeks experimenten uitgevoerd om de relatie tussen ischemische tijd, bloedglucoseconcentratie, HT-incidentie en diersterfte te onderzoeken. Deze experimenten leidden uiteindelijk tot het identificeren van optimale omstandigheden voor het maken van een HT-model na een herseninfarct. Deze studie presenteert een gedetailleerd protocol voor het opstellen van een acuut hyperglykemie-geïnduceerd HT-model met behulp van intraperitoneale injectie van 30% glucose in combinatie met embolische MCAO.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het experimentele protocol werd goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Jianghan University (JHDXLL2024-080) en uitgevoerd in overeenstemming met de ethische richtlijnen voor experimentele dieren die zijn uitgegeven door het Center for Disease Control of China. In dit onderzoek werden volwassen mannelijke C57BL/6J-muizen met een gewicht van 21-26 g gebruikt. De details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Diergroepering en acute hyperglykemie inducerend

  1. Huisvesting van de muizen in het proefdierencentrum van de Jianghan University in een 12-uurs licht/donker-cyclus gecontroleerde omgeving (20-22 °C, 50%-55% luchtvochtigheid) met voedsel en water ad libitum.
  2. Verdeel de muizen willekeurig in vier groepen: Sham + zoutoplossing (n = 12), Sham + glucose (n = 12), MCAO + zoutoplossing (n = 12) en MCAO + glucose (n = 20).

2. Preoperatieve voorbereiding

OPMERKING: Alle experimentele muizen vastten 12 uur voor de operatie.

  1. Systemische analgesie (meloxicam, 5 mg/kg subcutaan) en lokale anesthesie toedienen op de incisieplaats (bupivacaïne, 2 mg/kg subcutaan) peri-operatief.
  2. Steriliseer alle chirurgische instrumenten, wattenstaafjes en chirurgische hechtingen door te autoclaveren bij 121 °C en 15 psi gedurende 30 minuten.
  3. Veeg het operatieplatform en het omliggende werkgebied af met 75% ethanol en zet de verwarmingsschakelaar aan met een temperatuur die is ingesteld op 37 °C.
  4. Verdoof de muis met een mengsel van 3% isofluraan-20% zuurstofgas in de anesthesie-inductiekamer. Evalueer vervolgens de teenknijpreflex om de diepte van de anesthesie te testen.
  5. Beweeg de muis op het operatieplatform in buikligging en steek snel de neus van de muis in de neuskegel. Open de gasstroom naar de neuskegel en sluit de stroom naar de anesthesie-inductiekamer af. Stel het aandeel isofluraan in op 2% en stel de stroom van het gasmengsel in op 0.4 ml/min voor anesthesieonderhoud.
  6. Breng ooggel aan op de ogen van de muis om vocht vast te houden tijdens de operatie.
  7. Scheer het haar van de nek met behulp van de dierentondeuse. Reinig en desinfecteer de huid door afwisselend aan te brengen met jodium en 70% ethanol met een desinfecterend wattenstaafje.
  8. Bedek een steriel gaasje in de nek en snijd een opening om het operatieve gebied bloot te leggen.

3. Baseline meting van de cerebrale bloedstroom

  1. Scheer het haar van de hoofdhuid met behulp van de dierentondeuse. Reinig en desinfecteer de hoofdhuid door afwisselend aan te brengen met jodium en 70% ethanol met een desinfecterende wattenstaaf.
  2. Maak een incisie van 1,0 cm lang in de middellijn in de huid over het frontale gebied om de craniale fontanellen bloot te leggen. Houd de schedel vochtig met normale zoutoplossing.
  3. Bereid het Laser Doppler Flowmetrie (LDF)-instrument voor en houd de LDF-sondepunt loodrecht op het oppervlak van de linker pariëtale schedel (1 mm posterieur en 5 mm lateraal van de bregma); zodra de FLUX stabiel is en noteer de basislijnwaarde.
    OPMERKING: De meeteenheid voor FLUX is Perfusion Units (PU), met een meetbereik van 0-1000 PU. Ideale basislijn CBF op een laserdoppler-flowmetrie is >600 PU. Een aaneengesloten periode van 5 seconden met een fluctuatiebereik van minder dan 10% wordt beschouwd als een geldige FLUX-meting.
  4. Hecht de spier en de huid afzonderlijk met behulp van 5.0 PGA resorbeerbare hechtdraad. Breng diclofenac, natriumgel en mupirocinezalf aan op de wond.

4. MCAO chirurgische ingreep

OPMERKING: MCAO wordt uitgevoerd met behulp van een aangepaste thread-occlusiemethode, zoals eerder beschreven door Chiang et al.13.

  1. Draai de muis voorzichtig in rugligging en dien 15 minuten voor de chirurgische ingreep intraperitoneaal 30% glucose (7,2 ml/kg) of normale zoutoplossing toe aan de muizen.
    OPMERKING: Muizen uit de groepen Sham + glucose en MCAO + glucose kregen intraperitoneale injecties met glucose. Muizen uit de groepen Sham + zoutoplossing en MCAO + zoutoplossing kregen intraperitoneale injecties met normale zoutoplossing.
  2. Scheer het haar van de nek met behulp van de dierentondeuse. Reinig en desinfecteer de huid door afwisselend aan te brengen met jodium en 70% ethanol met een desinfecterend wattenstaafje. Bedek een steriel gaasje in de nek en snijd een opening om het operatieve gebied bloot te leggen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de incisie recht wordt gehouden voor een optimale visualisatie van de halsslagader.
  3. Maak met een scalpel een incisie in de middellijn van 1,5 cm aan de buikzijde van de nek. Trek het onderhuidse weefsel en de oppervlakkige fascia uit elkaar met behulp van een chirurgisch pincet.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de incisie recht wordt gehouden om een optimale visualisatie van de halsslagader te bereiken.
  4. Onder de oppervlakkige fascia bevindt zich de submandibulaire klier en een omgekeerde driehoek gevormd door drie spieren: de sternohyoid, gepositioneerd op de middellijn boven de luchtpijp; de achterste buik van de digastrische spier, herkenbaar aan het glanzend witte peesgedeelte; en tot slot, de sternomastoïde spier.
  5. Voer een stompe dissectie uit in de omgekeerde driehoek om de linker gemeenschappelijke halsslagader (CCA) te identificeren en te scheiden.
  6. Ontleed de nervus vagus naast de CCA en het slijmvliesweefsel rond de bloedvaten met behulp van een oogtang. Maak een beltoon op CCA met behulp van een 5.0 polyglycolzuur (PGA) resorbeerbare hechtdraad, maar houd de hechtdraad ongespannen.
  7. Afzonderlijk naar boven langs de CCA, kan een "Y"-bifurcatie worden waargenomen om de CCA te verdelen in de externe halsslagader (ECA) en de interne halsslagader (ICA).
  8. Scheid de vertakking om de ECA en ICA volledig bloot te leggen. Lus en bind een 5.0 PGA resorbeerbare hechtdraad distaal vanaf de vertakking om de ECA.
    OPMERKING: Zorg voor voldoende afstand tussen de permanente ligatieplaats en de vasculaire bifurcatie om te voorkomen dat de draad losraakt tijdens de rotatie van de ECA.
  9. Klem zowel de CCA als de ICA tijdelijk vast met behulp van twee lichte micro serrafine arteriële slagaderklemmen van 8 mm x 2 mm om de bloedstroom van de CCA naar de ICA te blokkeren.
  10. Rek de hechtdraad op de ECA distaal en CCA uit om het ECA-segment recht te trekken.
  11. Gebruik een microschaar om een kleine incisie te maken tussen de twee hechtdraden op de ECA.
  12. Breng een met siliconen gecoate monofilamenthechting (30 mm lang, 3-4 mm gecoat silicium) in de ECA in. Lus en bind een tweede 5.0 PGA resorbeerbare hechtdraad lichtjes vast op de ECA in de buurt van de bifurcatie om te voorkomen dat de monofilamenthechting terugtrekt.
  13. Snijd de ECA distaal van de permanente ligatie volledig door en verwijder de slagadertangklem van de ICA.
  14. Trek de hechting terug tot aan de vertakking van de CCA, trek vervolgens voorzichtig de ECA-stomp in en draai deze. Pas de inbrengrichting van de hechtdraad aan en breng deze langzaam in, ongeveer 9,0-10,0 mm van de CCA-vertakking in de ICA, om de MCA af te sluiten.
  15. Draai de tweede PGA resorbeerbare hechtdraad rond de ECA vast en verwijder de slagaderklem van de CCA.
  16. Hecht de spier en de huid afzonderlijk met behulp van 5.0 PGA resorbeerbare hechtdraad. Breng diclofenac, natriumgel en mupirocinezalf aan op de wond.
  17. Draai de muis voorzichtig naar de buikligging en herhaal stap 3.4. om de bloedstroom na MCA-occlusie te registreren.
    OPMERKING: Muizen die een vermindering van de bloedstroom vertoonden van minder dan 40% van de basislijnwaarde na MCAO werden uitgesloten van het onderzoek14.
  18. Zet de verwarmingsschakelaar van de herstelkooi aan met de temperatuur ingesteld op 37°C. Plaats de muis in de herstelkooi tijdens de periode na occlusie (60 min).

5. Monofilament verwijdering en reperfusie

  1. Verdoof de muis opnieuw zoals eerder beschreven net voordat de occlusieperiode zou moeten eindigen.
  2. Klem de CCA vast met behulp van een microclip slagaderklem.
  3. Trek het monofilament gedeeltelijk terug van de ICA totdat de met siliconen beklede punt zichtbaar wordt door de ICA.
  4. Plaats nog een microclip-slagaderklem op de ICA boven de met siliconen beklede punt.
  5. Trek het monofilament volledig terug en lig de ECA-stomp stevig vast.
  6. Verwijder de microclip-slagaderklem van respectievelijk ICA en CCA.
  7. Hecht de spier en de huid laag voor laag met behulp van 5.0 PGA resorbeerbare hechtdraad.
  8. Plaats de muis in de herstelkamer en houd alle muizen in de gaten totdat ze volledig wakker zijn. Dien meloxicam (5 mg/kg, subcutaan) toe voor pijnverlichting om de 12 uur gedurende maximaal 24 uur.

6. Bloedglucose meting

OPMERKING: De bloedglucosespiegels werden gemeten op de volgende tijdstippen: (1) net voor de MCAO-operatie (baseline), (2) onmiddellijk na het inbrengen van het monofilament (15 minuten na glucose-injectie), (3) onmiddellijk na het terugtrekken van het monofilament onmiddellijk na het inbrengen van het monofilament (75 minuten na glucose-injectie).

  1. Veeg de staart van de muis af met een alcoholisch watje om de staartader volledig hyperemisch te maken.
  2. Knip de staartpunt 1-2 mm af met een chirurgische schaar.
  3. Knijp voorzichtig langs de wortel van de staart naar het puntje van de staart, zodat het bloed uit de incisie kan stromen.
  4. Plaats de monsterabsorptietank van het testpapier aan de rand van de bloeddruppel.
    OPMERKING: Het bloed wordt door het heveleffect in het testpapier getrokken.
  5. Lees de stand van de bloedglucosemeter af en noteer het resultaat.
    OPMERKING: Sluit de muizen uit bij wie de bloedglucosespiegel na 15 minuten glucose-injectie niet boven de 10 mmol/l was gestegen.
  6. Verwijder overtollig bloed met een watje en oefen druk uit om het bloeden te stoppen.

7. 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) kleuring

  1. Euthanaseer de muis door intraperitoneale injectie van een overdosis pentobarbital (300 mg/kg).
  2. Zodra de muis stopt met ademen, immobiliseert u hem onmiddellijk in rugligging.
  3. Open de thorax met een schaar en knip het middenrif uit om het hart bloot te leggen.
  4. Steek een injectienaald van 23 G in de linkerventrikel van de muis en snijd met een schaar in de oorappendix.
  5. Doseer 15 ml normale zoutoplossing totdat de vloeistof die uit de oorappendix wegloopt helder en transparant lijkt.
  6. Onthoofd de muis en snijd de hoofdhuid open om de schedel volledig bloot te leggen met een schaar. Steek de punt van de schaar 2 mm iets voor de coronale hechting van de schedel om deze open te wrikken.
  7. Gebruik een pincet om het intacte hersenweefsel van de muis te verwijderen.
  8. Plaats het hersenweefsel in een hersenmatrice van knaagdieren en snijd het in coronale plakjes van 2 mm.
  9. Leg de plakjes op een plaat met 24 putjes en incubeer ze gedurende 15 minuten met 2% TTC-oplossing bij 37 °C.
  10. Start de scansoftware en stel de parameterinstellingen in op een resolutie van 1200 dpi en een JPG-formaat voor beeldanalyse.
  11. Knip de weefselsecties met een gebogen tang uit de 24-putjesplaat en rangschik de secties op de glazen scanplaat.
  12. Scan de weefselsecties en exporteer vervolgens de beelden voor meetanalyse.
  13. Meet het infarctgebied door te corrigeren voor weefselzwelling. Trek het niet-infarctgebied van de ipsilaterale zijde af van het gebied van de contralaterale zijde met behulp van ImageJ-software15. Beoordeel de grootte van het infarct als percentage van de contralaterale hemisfeer. Voor meer informatie over de analyse van het infarctgebied, zie Friedländer et al.16.

8. Gross observatie

  1. Herhaal stap 7.1–7.8.
  2. Knip de weefselcoupes met een gebogen tang uit de hersenmatrice en rangschik de secties op de glazen scanplaat.
  3. Scan de coronale secties van de hersenen zoals beschreven in stap 7.10 en 7.12.

9. Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring

  1. Herhaal stap 7.1-7.4. Perfuseer langzaam 15 ml normale zoutoplossing, gevolgd door perfusie van ongeveer 15 ml paraformaldehyde (PFA).
  2. Herhaal stap 7.6–7.7. Fixeer het hersenweefsel met 4% PFA gedurende 24 uur bij kamertemperatuur.
  3. Plaats het gefixeerde hersenweefsel in de geautomatiseerde weefseldroger voor uitdroging, vitrificatie en onderdompeling in was.
  4. Wikkel het weefsel in paraffinewas en snijd het hersenweefsel met microtoom in 5 μm dikke coronale plakjes.
  5. Ontwas het plakje door het drie keer onder te dompelen in xyleen, waarbij elke onderdompeling 8 minuten duurt. Dompel de plak vervolgens geleidelijk onder in ethanoloplossingen in afnemende concentraties (100%, 95%, 90%, 80%, 70%), gevolgd door gedestilleerd water, waarbij elke stap 5 minuten duurt.
  6. Kleur de plak 3 minuten met hematoxylineoplossing. Differentieer het vervolgens door het gedurende 5 s onder te dompelen in 5% zoutzuuralcohol.
  7. Incubeer de plak gedurende 1 minuut met eosineoplossing, dehydrateer en hyaliniseer deze vervolgens met gradiënt-ethanoloplossing (90%, 95%, 100%) en xyleen.
  8. Monteer het gedeelte met neutrale harsen.
  9. Leg de beelden vast van met H&E bevlekte hersenplakjes onder een helder veld met behulp van fluorescentiemicroscopie.

10. Bepaling van Evans Blue (EB) lekage

OPMERKING: Voor details over deze procedure verwijzen wij u naar Wang et al.17.

  1. Injecteer 2% (g/v) Evans Blue (EB) oplossing (2 ml/kg) via de staartader 23 uur na MCAO.
  2. Herhaal stap 7.1-7.7 een uur na de EB-injectie en maak een foto van de hele hersenen.
  3. Plaats de hersenen in een hersenmatrice van knaagdieren en snijd deze coronaal in plakjes van 2 mm. Scan de coronale secties van de hersenen zoals beschreven in stap 7.10-7.12 om EB-lekkage te observeren.
  4. Verdeel de plakjes in rechter- en linkerporties en doe ze elk in een centrifugebuis.
  5. Homogeniseer elk plakje hersenweefsel in 50% trichloorazijnzuur, met een verhouding van 100 mg hersenweefsel tot 0,4 ml trichloorazijnzuur.
  6. Na een nacht bij 4 °C te zijn geïncubeerd, centrifugeert het homogenaat gedurende 30 minuten bij 10.000 x g (bij 4 °C).
  7. Breng de bovenstaande vloeistof over in een andere centrifugebuis en verdun deze viervoudig met ethanol.
  8. Meet de absorptie van de bovenstaande vloeistof bij 620 nm met behulp van een spectrofotometer.
  9. Zet de extinctiewaarden om in de concentratie EB met behulp van een standaardcurve van EB in ethanol (bijv. bij 31,25, 62,5, 125 en 250 ug/ml).
    OPMERKING: Het resultaat wordt weergegeven als een microgram EB per gram hersenweefsel.

11. Bepaling van FITC-Dextran lekkage

  1. Injecteer FITC-Dextran (10 KDa, 6 mg/ml, verdund in 0,01 M PBS; 4 ml/kg) 24 uur na MCAO in de staartader, zodat het 10 minuten in het bloed kan circuleren.
  2. Herhaal stap 7.1-7.7 om perfusie uit te voeren en het intacte hersenweefsel te verwijderen.
  3. Fixeer het hersenweefsel in 4% PFA gedurende 24 uur bij kamertemperatuur in het donker.
  4. Breng het gefixeerde hersenweefsel over in de sucrose-oplossing met gradiëntconcentraties van 10%, 20% en 30% (verdund in 0,01 M PBS) voor uitdroging.
  5. Veranker het hersenweefsel met behulp van een optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) en snijd in 30 μm dikke hersenweefselsecties. Breng de secties over op een microscoopglaasje met behulp van een inoculatielus en zorg ervoor dat ze aan het oppervlak van het objectglaasje hechten.
  6. Monteer de hersenweefselsecties met behulp van een montagemedium dat 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) bevat.
  7. Start de confocale lasermicroscopie en de besturingssoftware.
  8. Bevestig het microscoopglaasje op de objecttafel en lokaliseer het infarctgebied onder het 200x oculair.
  9. Stel de resolutie in op 1024 x 1024 en pas de versterkingswaarde en belichtingstijd aan om een zo helder mogelijk beeld te verkrijgen.
  10. Verkrijg de beelden van het met FITC-Dextran bevlekte gebied van een herseninfarct onder een excitatiegolflengte van 488 nm.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De experimentele procedure van deze studie wordt geïllustreerd in figuur 1. In het kort ondergingen de muizen gedurende 60 minuten door draadocclusie geïnduceerde MCAO, gevolgd door reperfusie. Glucose (30% in normale zoutoplossing, 7,2 ml/kg lichaamsgewicht) werd 15 minuten vóór MCAO intraperitoneaal toegediend. Bloedglucosespiegels werden gemeten bij baseline (vóór glucose-injectie), onmiddellijk na MCAO en op het moment van reperfusie. Na...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het huidige protocol is ontworpen om een betrouwbaar diermodel van hemorragische transformatie na een ischemische beroerte te creëren, dat de schadelijke effecten van vaatrevascularisatie onder hyperglykemische omstandigheden kan repliceren. Van de verschillende risicofactoren voor een ischemische beroerte is de bloedglucosespiegel binnen 24 uur na het begin van een beroerte positief gecorreleerd met de verergering van hersenletsel en verhoogde mortaliteit 3,...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen om bekend te maken.

Dankbetuigingen

Figuur 1 is gemaakt met BioRender software (https://www.biorender.com/). Deze studie werd ondersteund door subsidies van het begeleidingsproject van de Natural Science Foundation van de provincie Hubei (nr. 2022CFC057).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)Sigma-Aldrich108380De kleurstof voor TTC-kleuring
24-well culture plateCorning IncorporatedCLS3527Het vat voor TTC-kleuring
30% glucose injectieKelun PharmaceuticalH42021188Inductie van acute hyperglykemie
4% paraformaldehydeWuhan Servicebio Technology
Co., Ltd.		G1101Weefselfixatie
5.0 Polyglycolzuur absorbeerbare hechtingJinhuan Medical Co., LtdKCR531Uitrusting voor chirurgie
96-well culture plateCorning IncorporatedCLS3596EB-inhoud meting
AnesthesieapparaatMidmark CorporationVMRAnesthesie voor dieren
Antifade-montagemedium met DAPIBeyotime BiotechP0131Montage voor weefselsecties
Automatiseringsweefsel-ontwatering  
machine		Leica BiosystemsTP1020Weefsel ontwateren
Confocale microscopieLeica BiosystemsSTELLARIS 5Beeldverwerving
Diclofenac-natriumgelMaYinglong PharmaceuticalH10950214Analgesie voor dieren
Eosine-kleuringsoplossingServicebio TechnologyG1001De kleurstof voor H&E-kleuring
Evans BlueAladdinE104208EB-kleuring
OoggelGuangzhou PharmaceuticalH44023098Materiaal voor chirurgie
Fitc-dextranSigma-Aldrich60842-46-8BBB-permeabiliteit beoordelen
FluorescentiemicroscoopOlympusBX51Beeldverwerving
Gevroren microtoomLeica BiosystemsCM1900Gebruik voor bevroren secties
GlucometerYuWell580Bloedglucosemeting
Hematoxyline-kleuringsoplossingServicebioG1004De kleurstof voor H&E-kleuring
JodiumLircon20020059Materiaal voor chirurgie
IsofluraanRwd Life ScienceR510-22-10Anesthesie voor dieren
Laser Doppler bloedstroommeterMoor InstrumentsmoorVMSBloedstromingsbewaking
MCAO-nadenRwd Life Science907-00023-01Materiaal voor chirurgie
MeloxicamBoehringer-IngelheimJ20160020Analgesie voor dieren
Microchirurgisch instrumentenkitRwd Life ScienceSP0003-MUitrusting voor chirurgie
MicrotoomThermo Fisher ScientificHM325Weefselsectieproductie
MicrotoombladLeica Biosystems819Weefselsectieproductie
Mupirocine zalfGlaxoSmithKlineH10930064Anti-infectie voor dieren
Neutrale balsemAbsin Bioscienceabs9177Seal voor H&E-kleuring
Paraffine-inbeddingscentrumThermo Fisher ScientificEC 350Paraffineblokjes produceren
Pentobarbital natriumSigma-AldrichP3761Euthanasie voor dieren
Fosfaatgebufferde zoutoplossingBeyotime BiotechC0221ASpoelen voor weefselsectie
ScannerEPSONV330Weefselscannen
ShaverShenzhen Codos Electrical Appliances Co.,Ltd.CP-9200Uitrusting voor chirurgie
SpectrofotometerThermo Fisher Scientific1510-02362EB-inhoud meting
Sucrose-oplossingShanghai Macklin Biochemical57-50-1Dehydratie voor weefsel
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura4583Weefselbeddingsmedium
TrichloroazijnzuurSigma-AldrichT6399EB-inhoud meting

Referenties

  1. Patel, P., Yavagal, D., Khandelwal, P. Hyperacute management of ischemic strokes: JACC focus seminar. J Am Coll Cardiol. 75 (15), 1844-1856 (2020).
  2. Goncalves, A., et al. Thrombolytic tPA-induced hemorrhagic transformation of ischemic stroke is mediated by PKCβ phosphorylation of occludin. Blood. 140 (4), 388-400 (2022).
  3. Adebayo, O. D., Culpan, G. Diagnostic accuracy of computed tomography perfusion in the prediction of hemorrhagic transformation and patient outcome in acute ischaemic stroke: A systematic review and meta-analysis. Eur Stroke J. 5 (1), 4-16 (2020).
  4. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  5. Knight, R. A., et al. Prediction of impending hemorrhagic transformation in ischemic stroke using magnetic resonance imaging in rats. Stroke. 29 (1), 144-151 (1998).
  6. Orset, C., et al. Combination treatment with U0126 and rt-PA prevents adverse effects of the delayed rt-PA treatment after acute ischemic stroke. Sci Rep. 11 (1), 11993(2021).
  7. Kwon, I., et al. Hemorrhagic transformation after large cerebral infarction in rats pretreated with dabigatran or warfarin. Stroke. 48 (10), 2865-2871 (2017).
  8. Mi, D., et al. Correlation of hyperglycemia with mortality after acute ischemic stroke. Ther Adv Neurol Disord. 11, 1756285617731686(2018).
  9. Seners, P., Turc, G., Oppenheim, C., Baron, J. C. Incidence, causes and predictors of neurological deterioration occurring within 24 following acute ischaemic stroke: A systematic review with pathophysiological implications. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 86 (1), 87-94 (2015).
  10. Reshi, R., et al. Hyperglycemia in acute ischemic stroke: Is it time to re-evaluate our understanding. Med Hypotheses. 107, 78-80 (2017).
  11. Graham, M. L., Schuurman, H. J. Validity of animal models of type 1 diabetes, and strategies to enhance their utility in translational research. Eur J Pharmacol. 759, 221-230 (2015).
  12. Rehni, A. K., Liu, A., Perez-Pinzon, M. A., Dave, K. R. Diabetic aggravation of stroke and animal models. Exp Neurol. 292, 63-79 (2017).
  13. Chiang, T., Messing, R. O., Chou, W. H. Mouse model of middle cerebral artery occlusion. J Vis Exp. 48, e2761(2011).
  14. Ma, F., Sun, P., Zhang, X., Hamblin, M. H., Yin, K. J. Endothelium-targeted deletion of the miR-15a/16-1 cluster ameliorates blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke. Sci Signal. 13 (621), eaay5686(2020).
  15. Wanson, R. A., et al. A semiautomated method for measuring brain infarct volume. J Cereb Blood Flow Metab. 10 (2), 290-293 (1990).
  16. Friedländer, F., et al. Reliability of infarct volumetry: Its relevance and the improvement by a software-assisted approach. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (8), 3015-3026 (2017).
  17. Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, 6588(2014).
  18. Wang, C., et al. Association between red blood cell distribution width and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke patients. Cerebrovasc Dis. 48 (3-6), 193-199 (2019).
  19. Zhu, B., et al. Stress hyperglycemia and outcome of non-diabetic patients after acute ischemic stroke. Front Neurol. 10, 1003(2019).
  20. Won, S. J., Tang, X. N., Suh, S. W., Yenari, M. A., Swanson, R. A. Hyperglycemia promotes tissue plasminogen activator-induced hemorrhage by increasing superoxide production. Ann Neurol. 70 (4), 583-590 (2011).
  21. Zhang, F. H., et al. Rosiglitazone attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient focal ischemia in rats. Neuroscience. 250, 651-657 (2013).
  22. Soejima, Y., et al. Hyperbaric oxygen preconditioning attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient MCAO in rats. Med Gas Res. 2 (1), 9(2012).
  23. Chen, C., Ostrowski, R. P., Zhou, C., Tang, J., Zhang, J. H. Suppression of hypoxia-inducible factor-1alpha and its downstream genes reduces acute hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation in a rat model of cerebral ischemia. J Neurosci Res. 88 (9), 2046-2055 (2010).
  24. Lin, Y., et al. Docosahexaenoic acid attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient focal cerebral ischemia in rats. Neuroscience. 301, 471-479 (2015).
  25. MacDougal, E. L., Herman, W. H., Wing, J. J., Morgenstern, L. B., Lisabeth, L. D. Diabetes and ischaemic stroke outcome. Diabet Med. 35 (9), 1249-1257 (2018).
  26. Yang, C., Hawkins, K. E., Doré, S., Candelario-Jalil, E. Neuroinflammatory mechanisms of blood-brain barrier damage in ischemic stroke. Am J Physiol Cell Physiol. 316 (2), C135-C153 (2019).
  27. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Curr Protoc Neurosci. 79, 9.58.1-9.58.15 (2017).
  28. Ahishali, B., Kaya, M. Evaluation of blood-brain barrier integrity using vascular permeability markers: Evans Blue, Sodium Fluorescein, Albumin-Alexa Fluor conjugates, and Horseradish Peroxidase. Methods Mol Biol. 2367, 87-103 (2021).
  29. Kovács, K. B., Bencs, V., Hudák, L., Oláh, L., Csiba, L. Hemorrhagic transformation of ischemic strokes. Int J Mol Sci. 24 (18), 14067(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Erratum


Formal Correction: Erratum: A Mouse Model of Hemorrhagic Transformation Induced by Acute Hyperglycemia Combined with Transient Focal Ischemia
Posted by JoVE Editors on 1/06/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/67371

Meer artikelen verkennen

Hyperglycemie-muismodelocclusie van de arteria cerebri mediabloed-hersenbarrièrecerebraal infarctvolumeEvans Blue-permeabiliteitFITC-dextranlekkagehematoxyline-eosin kleuringlaser-doppler flowmetrie
Een muismodel van hemorragische transformatie geïnduceerd door acute hyperglykemie in combinatie met voorbijgaande focale ischemie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.