Er wordt een gestroomlijnd protocol gepresenteerd voor het opzetten van een model voor de genezing van brandwonden bij muizen met behulp van een digitaal verwarmingsapparaat. De schaakbordachtige experimentele plaatsen die op de huid zijn gemaakt, vergemakkelijken verdere functionele analyse voor de wondgenezingstest.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Schaakbord-achtig brandwondgenezingsmodel van muizen op basis van digitaal verwarmingsapparaat
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ernstige brandwonden behoren tot de meest traumatische en fysiek slopende aandoeningen, die bijna elk orgaansysteem beïnvloeden en resulteren in aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit. Gezien hun complexiteit en de betrokkenheid van meerdere organen, zijn er verschillende diermodellen gemaakt om verschillende facetten van brandwonden na te bootsen. Methoden die worden gebruikt om verbrande oppervlakken te produceren, variëren tussen experimentele diermodellen. Deze studie beschrijft een eenvoudig, kosteneffectief en gebruiksvriendelijk muisbrandmodel voor het creëren van consistente brandwonden over de volledige dikte met behulp van een digitaal verwarmingsapparaat. De punt van dit apparaat werd gedurende 10 s bij 97 °C op het dorsum van muizen aangebracht om een schaakbordachtige brandwond te veroorzaken en de wondgenezing te onderzoeken onder de behandeling van een experimenteel verband. Huidmonsters werden verzameld voor histologische analyse, waaronder hematoxyline en eosine (H&E) kleuring en Masson's kleuring. Wondgenezing werd beoordeeld door middel van analyse van het wondgebied en microscopisch onderzoek van inflammatoire infiltratie, re-epithelisatie en vorming van granulatieweefsel. Het model voor brandwonden bij muizen kan dienen als een fundamenteel hulpmiddel bij het bestuderen van de pathofysiologie van thermische letsels en het evalueren van therapeutische interventies.
Inleiding
Brandwonden worden beschouwd als een van de kritieke verwondingen aan de huid, veroorzaakt door blootstelling aan hitte, elektriciteit, chemische materialen en blootstelling aan straling 1,2. Het kan worden ingedeeld in vier graden, afhankelijk van de diepte van de verwonding, variërend van de opperhuid tot de volledige dikte van de huid, en zelfs de spieren en botten. Kleine brandwonden kunnen leiden tot littekenvorming en het risico op infectie vergroten. Een groot gebied van brandwonden veroorzaakt niet alleen lokale schade, maar stimuleert ook aandoeningen van het hart, de nieren en andere organen of systemen van het lichaam door ernstige en langdurige ontstekingen en immuunreacties, wat leidt tot ernstige systemische gevolgen en hoge morbiditeit3. De meeste overlevenden van brandwonden gaan gepaard met langdurige lichamelijke handicaps, emotionele stress en verminderde kwaliteit van leven 4,5. Daarom is het belangrijk om het pathologische proces van brandwonden en de mechanismen van regeneratie van verbrand weefsel te bestuderen.
Betrokken bij immuunresponsen, weefselregeneratie en systematische homeostase, konden in vitro-onderzoeken het pathologische proces van wondgenezing van brandwonden niet volledig onderzoeken. Daarom zijn er in de afgelopen twee decennia, om mogelijke therapeutische interventies te onderzoeken, verschillende diermodellen voor het genezen van brandwonden ontwikkeld om de verschillende kenmerken van brandwonden te repliceren 6,7. Brandwonden worden meestal geproduceerd op het dorsumoppervlak van varkens, ratten, muizen, konijnen en andere dieren na ontharing. De brandtijd kan 3 s tot 30 s duren om gedeeltelijke tot volledige thermische schade te vormen met een bereik van 5% tot 30% totale lichaamsoppervlakte (TBSA)8. Er zijn momenteel geen gestandaardiseerde modellen van deze methoden in onderzoek naar brandwondendieren vanwege de grote variabiliteit van de gebruikte technieken. De methoden die worden gebruikt om verbrande oppervlakken te produceren, variëren per proefdiermodel, waaronder gasvlam9, brandend ethanolbad10, voorverwarmde enkele metalen plaat/staaf11,12, kokend of heet water13,14. De techniek van het toebrengen van brandwonden en de geproduceerde branddiepte zijn echter vaak inconsistent en slecht beschreven in eerdere studies, wat cruciaal is bij het bepalen van de ernst van de brandwond en de methode van brandwondenbehandeling.
Deze studie heeft tot doel een eenvoudig, kosteneffectief en gebruiksvriendelijk diermodel voor muisbrandwonden te ontwikkelen voor het creëren van consistente brandwonden over de volledige dikte in gesimuleerde klinische scenario's. In dit protocol hebben we een handig digitaal verwarmingsapparaat gebruikt om de diepte van de brandwond te regelen door de temperatuur op de huid aan te passen. De punt van dit apparaat kan in verschillende maten worden geschakeld om thermische brandwonden te veroorzaken met verschillende TBSA-bereiken. Dit maakt het mogelijk om een schaakbordachtige brandwond op de rug van de muis te creëren, waardoor verschillende experimentele en controlebehandelingen binnen hetzelfde dier kunnen worden vergeleken. We hebben het proces van het sluiten van de wond geobserveerd en vastgelegd. Huidmonsters werden geoogst voor histologische evaluatie (hematoxyline en eosine (H&E) kleuring en Masson's trichroom kleuring) in verschillende stadia van wondgenezing. Deze aanpak vermindert het aantal dieren dat in het experiment wordt gebruikt en verlaagt daarom de economische kosten, terwijl het beter verenigbaar is met de dierethiek. Deze studie zal onderzoekers essentiële hulpmiddelen bieden om de ontwikkeling van nieuwe behandelingen voor brandwonden te vergemakkelijken en de pathofysiologische mechanismen van wondgenezing door brandwonden te onthullen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierprocedures in deze studie zijn beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van de West China School of Stomatology, Sichuan University (WCHSIRB-D-2024-499). Vierentwintig acht weken oude C57BL/6-muizen (vrouwtje, lichaamsgewicht 25-30 g) werden gebruikt voor de huidige studie. De details van de gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Apparatuur en muis voorbereiden voor brandwond
- Koop de dieren en huisvest ze bij aankomst 7 dagen in kooien om ze te laten acclimatiseren aan de omgeving.
- Steriliseer het werkgebied door te spuiten en af te vegen met 70% ethanol (v/v). Bedek de operatietafel met steriele chirurgische absorberende pads.
- Stel de temperatuur van het digitale verwarmingsapparaat in op 97 °C. Het verwarmingsapparaat bestaat uit drie delen (afbeelding 1).
OPMERKING: De temperatuur van 50-450 °C kan worden aangepast via de temperatuurregelaar (Figuur 1A). De basis van de standaard wordt gebruikt om de punt te plaatsen (Figuur 1B), die kan worden gedemonteerd (Figuur 1C) om verschillende instrumentformaten te vervangen. Desinfecteer de punt met jodofoor of alcohol. - Verdoof de muis met 5% isofluraan in 100% zuurstof in een inductiekamer gedurende 3 minuten (stroomsnelheid: 4 l/min) totdat de ademhaling is vertraagd. Beoordeel de diepte van de anesthesie met behulp van een teenknijptest.
OPMERKING: Het inademen van isofluraan kan leiden tot slaperigheid en schade toebrengen aan het cardiovasculaire systeem. Het is essentieel om beschermende uitrusting te dragen en deze in een zuurkast in een goed geventileerde ruimte te hanteren. - Zodra de muis diep verdoofd is, brengt u deze over naar een verwarmd kussen in buikligging om de warmte te behouden en onderkoeling te voorkomen tijdens het herstel van de anesthesie. Verminder het isofluraan tot 1. 5% zuurstof voor onderhoud via een neuskegel.
- Breng glijmiddel aan op beide ogen van de muis met een wattenstaafje om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
2. Brandwonden over de volledige dikte veroorzaken
OPMERKING: Het algemene proces van inductie en analyse van brandwonden wordt weergegeven in figuur 2.
- Scheer de huid van de muis met een elektrisch scheerapparaat over een gebied van ongeveer 5 cm lang en 4 cm breed van de nek tot de staart. Ga voorzichtig te werk om te voorkomen dat de huid beschadigd raakt bij het scheren (Figuur 3C).
- Gebruik een applicator met wattenstaafje om ontharingscrème gedurende 3 minuten op de geschoren huid aan te brengen (Figuur 3D).
OPMERKING: Breng de ontharingscrème niet aan op andere delen van de muis om brandwonden te voorkomen, die moeilijk te detecteren kunnen zijn. De crème veroorzaakte huiduitslag bij langer dan 5 minuten gebruik. De precieze duur voor een optimale werkzaamheid verschilt van product tot product en moet worden bepaald door de gebruiker. - Veeg de crème af met een vochtig gaasje totdat crème en haar niet meer worden gedetecteerd. Desinfecteer het operatiegebied met chloorhexidinescrub, gevolgd door driemaal 70% ethanol (v/v). Reinig en droog het gebied met steriel gaas.
- Gebruik een gesteriliseerde pipetpunt van 1 ml met een diameter van 9 mm (Figuur 3A) gedrenkt in gesteriliseerde inkt om de gewenste wondplaatsen nauwkeurig te lokaliseren. De dorsale huid van muizen wordt gekenmerkt door een oneffen topografie. Het definiëren van het wondgebied los van het ruggenmerg van muizen is essentieel om de herhaalbaarheid te garanderen.
- Bedek de huid met een eerder bijgesneden steriel laken en laat het operatiegebied vrij (Figuur 3). Trek hittebestendige handschoenen aan en controleer de temperatuur van het digitale verwarmingsapparaat. Ontsmet voor en na de inductie van het branden de punt van het apparaat met 70% ethanol (v/v).
- Breng de punt van het verwarmingsapparaat aan op het midden van de gelokaliseerde wondplaatsen (97 °C gedurende 10 s) om zes ronde wonden met een diameter van 4 mm te creëren (Afbeelding 3B). Het interval tussen aangrenzende brandwonden is 0,5-1 cm. Bepaal het aantal brandwonden volgens het experimentele ontwerp.
OPMERKING: De verbranding wordt voornamelijk veroorzaakt door warmtegeleiding; Daarom is het niet nodig om druk uit te oefenen op de staaf, d.w.z. deze door de zwaartekracht in contact te houden met de huid tijdens de inductie van brandwonden. Er waren zes brandwonden voor het experimentele ontwerp. Dit is het maximale aantal brandwonden dat kan worden opgebouwd op basis van het apparaat dat we hebben gebruikt en het gebied van de dorsum van de muis. Op deze basis kunnen meerdere replicaten van dezelfde experimentele groep worden bereikt.
3. Verzorging en meting na het branden
- Breng gedurende 5 minuten ijs aan op de brandwond om mogelijke pijn te verminderen voor pijnbestrijding (Figuur 3G).
- Schakel het isofluraan uit en verwijder de neuskegel na de brandwond. Breng de muis over naar een verwarmingskussen totdat de muis normaal beweegt (bijv. niet gehurkt of rillend).
- Plaats elke muis in een herstelkooi om te voorkomen dat ze aan elkaar krabben. Maak sommige voerkorrels zacht door 5-10 druppels drinkwater aan elke korrel toe te voegen en plaats ze op de bodem van de kooi om het voeren te vergemakkelijken.
LET OP: Steriliseren van de kooien door te spuiten en af te vegen met 70% ethanol (vol/vol). Het beddengoed moet regelmatig worden vervangen om de muizen warm te houden en urine op te nemen. - Dien buprenorfine (0,1 mg/kg) tweemaal daags subcutaan toe op een caudale locatie gedurende in totaal 3 dagen, zorg ervoor dat er ten minste 8 uur tussen de injecties zit.
- Reinig alle wonden met een steriel gaasje bevochtigd met zoutoplossing na 24 uur brandwondinductie. Dep de huid af met gaas en breng een kleine hoeveelheid antibacteriële gel (TKH hydrogel) aan met een spuit om de brandwond te bedekken12,14. Herhaal deze procedure daarna op dag 3, 7 en 10.
- Gebruik een ademend, transparant verband om de wonden te bedekken. De grootte van het verband moet ongeveer 1 cm rond de wond bedekken en mag het gebied niet bedekken zonder ontharing.
OPMERKING: Vervang het wondverband minstens eens in de 2 dagen. Langdurig gebruik van het verband zonder vervanging kan leiden tot wondinfectie met pusvorming, wat resulteert in vertraagde wondgenezing. - Meet tijdens de follow-upperiode het gewicht elke 2-3 dagen. Over het algemeen moeten muizen die 15%-20% van hun oorspronkelijke lichaamsgewicht verliezen, worden opgeofferd en uit het experiment worden verwijderd.
4. Wond verzamelen
- Markeer de wond na 0, 3, 7, 10 en 14 dagen met de punt van een steriele pipetpunt van 1 ml en neem deze op met een digitale camera.
- Euthanaseer de muizen door een overdosis anesthesie en cervicale dislocatie (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
OPMERKING: Wees voorzichtig tijdens de cervicale dislocatie om overmatig trekken te voorkomen, wat de rugwonden kan beschadigen. - Isoleer met een schaar de wondplaats en de omliggende huid, inclusief de onderliggende spieren (1 cm x 1 cm). Bereid je voor op ten minste drie monsters voor elke groep.
- Fixeer de huidmonsters gedurende 24 uur in 4% paraformaldehyde (PFA) en bewaar ze bij 4 °C. Het fixatievolume moet 30 keer het weefselvolume15,16 zijn.
OPMERKING: PFA is gevaarlijk. Zorg ervoor dat u in een goed geventileerde ruimte werkt en gebruik de juiste beschermingsmiddelen.
5. Evaluatie van wondgenezing
- Was het wondweefsel twee keer met PBS en verdeel het met filterpapier, dat op het juiste formaat moet worden bijgesneden (Figuur 2H). Door de aanwezigheid van enig slijmvlies in de onderhuidse weefsellaag, hecht het zich aan het oppervlak van het filterpapier zonder beweging of omkrullen van het weefsel.
- Doe het filtreerpapier en het monster in een tissuecassette voor paraffinedehydratatie om relatief gladde weefselmonsters te verkrijgen en sluit het weefsel vervolgens in15,16. Bewaar monsters bij 4 °C.
OPMERKING: Rek het weefsel zoveel mogelijk uit en vermijd vouwen, aangezien deze plooien na fixatie permanent worden.
- Doe het filtreerpapier en het monster in een tissuecassette voor paraffinedehydratatie om relatief gladde weefselmonsters te verkrijgen en sluit het weefsel vervolgens in15,16. Bewaar monsters bij 4 °C.
- Snijd de in paraffine ingebedde monsters in secties van 5 μm dikte en kleurplaten via H&E en Masson's trichroom voor het evalueren van de mate van granulatieweefsel, angiogenesevorming en collageenafzetting, en leveren bewijs om de verschillende stadia en de progressie van de wondgenezing te beoordelen17,18.
- Leg beelden vast van alle monsters met behulp van een microscoop met een 40x objectief.
- Gebruik compatibele software om het gekleurde huidgedeelte te analyseren, inclusief de epidermis, dermis, onderhuids weefsel en spierconditie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In dit protocol werden schaakbordachtige brandwonden gecreëerd met een brandduur van 10 s bij 97 °C door het digitale verwarmingsapparaat (Figuur 1). De punt van het apparaat is gemaakt van puur koper, dat bekend staat om zijn uitstekende warmtegeleiding en snelle verwarmingsmogelijkheden. De handgreep die door de onderzoeker wordt vastgehouden, is gemaakt van polycarbonaat, dat zorgt voor hittebestendigheid en niet-ontvlambaarheid. Vergeleken met de voorver...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Voor brandwondenstudies richten in vitro-modellen zich doorgaans op de remmende effecten van lokale antimicrobiële middelen of antibiotica op bacteriën die verband houden met brandwonden, zoals Staphylococcus aureus en Pseudomonas aeruginosa19, evenals de impact van verschillende biomaterialen (zoals elastine-, zijde- en hydrogelverbanden14,20) op ontstekingscellen na verbranding...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door het Sichuan Science and Technology Program (23ZYZYTS0120), de subsidies van het West China Hospital of Stomatology Sichuan University (RD-03-202011) en het Sichuan Science and Technology Program (2022NSFSC0614). De figuren zijn gemaakt met BioRender. Com.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 mL pipette tip | KIRGEN,USA | KG1333 | Gebruikt om brandwondlocaties te lokaliseren |
| 3 M Tegaderm film | 3M,USA | 1624WCN 6 cm x 7 cm | Voor het afdekken van de wond na brandwondinductie |
| 4% paraformaldehyde(PFA) | Biosharp,China | BL539A | Gebruikt om de huidmonsters te fixeren |
| Buprenorfine | Sigma-Aldrich,USA | PHR8955-50MG | Voor de pijnbestrijding van de muizen |
| C57BL/6 muizen | Chengdu Dashuo experimenteel dierenbedrijf,China | geen | Voor het opzetten van een brandwondmodel |
| Ontharingscrème | Veet,China | — | Voor het verwijderen van de rugharen van de muizen |
| Digitaal verwarmingsapparaat | Shenzhen Kapper Technology Company,China | Nr.936D | Voor het induceren van brandwonden bij muizen |
| Elektrisch scheerapparaat | AUX,China | AUX-A5 | Voor het verwijderen van de rugharen van de muizen |
| Filterpapier | — | — | Gebruikt om de huidmonsters te ontvouwen |
| GraphPad software | — | GraphPad prism 9.5.0 | Voor de analyse van het brandwondgebied |
| Hittebestendige handschoenen | — | — | Gebruikt om de tip van het digitale verwarmingsapparaat vast te houden |
| Hemotoxylin en Eosin kleuringskit | Solarbio,China | G1120 | Voor de histologische analyse van de preparaten |
| ImageJ software | — | ImageJ 1.54f | Voor de analyse van het brandwondgebied |
| Isofluraan | RWD,China | R510-22-10 | Voor de anesthesie van de muizen |
| Masson's Trichrome Kleuringskit | Solarbio,China | G1340 | Voor de histologische analyse van de preparaten |
| Microscoop | Olympus,Japan | VS200 ASW | Gebruikt om de H&E en Masson gekleurde preparaten te scannen |
| Weefselcassette | CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD,China | 31050102W | Voor weefselparaffine dehydratie en paraffine-inbedding |
Referenties
- Mofazzal Jahromi, M. A., et al. Nanomedicine and advanced technologies for burns: Preventing infection and facilitating wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 123, 33-64 (2018).
- Burgess, M., Valdera, F., Varon, D., Kankuri, E., Nuutila, K. The immune and regenerative response to burn injury. Cells. 11 (19), 3073(2022).
- Arbuthnot, M. K., Garcia, A. V. Early resuscitation and management of severe pediatric burns. Sem Pediatr Surg. 28 (1), 73-78 (2019).
- Smolle, C., et al. Recent trends in burn epidemiology worldwide: A systematic review. Burns. 43 (2), 249-257 (2017).
- Jeschke, M. G., et al. Burn injury. Nat Rev Dis Primers. 6, 11(2020).
- Nomellini, V., Gomez, C. R., Gamelli, R. L., Kovacs, E. J. Aging and animal models of systemic insult: Trauma, burn, and sepsis. Shock. 31 (1), 11-20 (2009).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J Biomed Biotechnol. 2011, 969618(2011).
- Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M. G. Animal models in burn research. Cell Mol Life Sci. 71 (17), 3241-3255 (2014).
- Katakura, T., Yoshida, T., Kobayashi, M., Herndon, D. N., Suzuki, F. Immunological control of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infection in an immunodeficient murine model of thermal injuries. Clin Exp Immunol. 142 (3), 419-425 (2005).
- Dai, T., et al. Animal models of external traumatic wound infections. Virulence. 2 (4), 296-315 (2011).
- Tavares Pereira, D. D. S., Lima-Ribeiro, M. H. M., De Pontes-Filho, N. T., Carneiro-Leão, A. M. D. A., Correia, M. T. D. S. Development of animal model for studying deep second-degree thermal burns. J Biomed Biotechnol. 2012, 460841(2012).
- Gong, Y., et al. Exudate absorbing and antimicrobial hydrogel integrated with multifunctional curcumin-loaded magnesium polyphenol network for facilitating burn wound healing. ACS Nano. 17 (22), 22355-22370 (2023).
- Dahiya, P. Burns as a model of sirs. Front Biosci. 14 (13), 4962-4967 (2009).
- Yergoz, F., et al. Heparin mimetic peptide nanofiber gel promotes regeneration of full-thickness burn injury. Biomaterials. 134, 117-127 (2017).
- Rao, G., et al. Rat burn model to study full-thickness cutaneous thermal burn and infection. J Vis Exp. (186), e64345(2022).
- Yampolsky, M., Bachelet, I., Fuchs, Y. Reproducible strategy for excisional skin-wound-healing studies in mice. Nat Protoc. 19 (1), 184-206 (2024).
- Wang, C., et al. Engineering bioactive self-healing antibacterial exosomes hydrogel for promoting chronic diabetic wound healing and complete skin regeneration. Theranostics. 9 (1), 65-76 (2019).
- Papp, A., et al. The progression of burn depth in experimental burns: A histological and methodological study. Burns. 30 (7), 684-690 (2004).
- Barrett, J. P., et al. An in vitro study into the antimicrobial and cytotoxic effect of Acticoat dressings supplemented with chlorhexidine. Burns. 48 (4), 941-951 (2022).
- Lou, P., et al. Injectable self-assembling peptide nanofiber hydrogel as a bioactive 3D platform to promote chronic wound tissue regeneration. Acta Biomater. 135, 100-112 (2021).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Bielefeld, K. A., Amini-Nik, S., Alman, B. A. Cutaneous wound healing: Recruiting developmental pathways for regeneration. Cell Mol Life Sci. 70 (12), 2059-2081 (2013).
- Yildiz, S. C., Demir, C., Ayhanci, A. Examination of the effects of kefir on healing factors in a mice burn model infected with E. coli, S. aureus and P. aeruginosa using qRT-PCR. Burns. 49 (2), 425-431 (2023).
- Wang, Y., et al. Burn injury: Challenges and advances in burn wound healing, infection, pain and scarring. Adv Drug Deliv Rev. 123, 3-17 (2018).
- Chen, Y., et al. Research advances in smart responsive-hydrogel dressings with potential clinical diabetic wound healing properties. Mil Med Res. 10 (1), 37(2023).
- Ito, M., et al. Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis. Nat Med. 11 (12), 1351-1354 (2005).
- Ito, M., et al. Wnt-dependent de novo hair follicle regeneration in adult mouse skin after wounding. Nature. 447 (7142), 316-320 (2007).
- Chen, K., et al. Pullulan-collagen hydrogel wound dressing promotes dermal remodeling and wound healing compared to commercially available collagen dressings. Wound Repair Regen. 30 (3), 397-408 (2022).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
