Dit protocol beschrijft hoe intrasplentische injectie van AAV8-afgeleverd klein haarspeld-RNA dezelfde gen-knockdown-efficiëntie in de lever bereikt als injectie van de poortader, wat een eenvoudigere procedure vertegenwoordigt met veel lagere perioperatieve en postoperatieve mortaliteit en complicaties.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Efficiënte genknockdown in de lever via intrasplenische injectie van adeno-geassocieerd virus serotype 8 (AAV8)-afgeleverd klein haarspeld-RNA
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De lever is een belangrijk orgaan dat essentiële metabolische functies vervult. Het ontwikkelen van een efficiënte en veilige methode om genexpressie in de lever uit te schakelen, biedt een belangrijk hulpmiddel voor het bepalen van de genfunctie in de pathofysiologie van de lever. In deze studie beschrijven we een methode voor intrasplenische injectie van adeno-geassocieerd virus serotype 8 (AAV8) die is ontworpen om een klein haarspeld-RNA (shRNA) tot expressie te brengen tegen een doelgen van belang, nucleostemine (NS). Intrasplenische injectie van AAV8 die een NS-gericht shRNA (AAV8-shNS1) tot expressie brengt, bereikte dezelfde knockdown-efficiëntie van NS in de lever als injectie van poortader, vergeleken met de injectie van AAV8 die een gecodeerde sequentie shRNA (AAV8-shScr) tot expressie brengt. Bovendien veroorzaakte injectie van het AAV8-shRNA-virus minimale ontstekingsreacties in het leverparenchym. Het belangrijkste was dat dit intrasplenische injectieprotocol technisch niet veeleisend was en minimale bloedingen veroorzaakte op de injectieplaats, wat de belangrijkste oorzaak is van perioperatieve en postoperatieve mortaliteit bij het uitvoeren van poortaderinjectie. Deze studie rapporteert een verbeterde en relatief veilige methode om een efficiënte genknockdown in de lever te bereiken.
Inleiding
De lever is een vitaal orgaan dat voedingsstoffen en chemicaliën metaboliseert, maar wordt ook constant blootgesteld aan cytotoxische en kankerverwekkende beledigingen. Hoewel de volwassen lever in staat is om na een verwonding opnieuw te groeien, wordt het herstellende vermogen ernstig belemmerd opde leeftijd van 1 jaar. Tot op heden is levertransplantatie de enige therapeutische optie voor patiënten met chronische leverziekten in het eindstadium of massale acute leverschade, die op zichzelf al veel uitdagingen met zich meebrengt2. Om de moleculaire pathofysiologie van de lever beter te begrijpen door de functies van interessante genen te ondervragen, zijn genetische manipulaties ontwikkeld voor in vivo toepassing, waaronder RNAi-gemedieerde knockdown en gerichte deletie door een Cre-recombinase in aanwezigheid van loxP-sites3. Cre-expressie cassette en shRNA-constructie kunnen worden afgeleverd door virale vehikels.
Adeno-geassocieerd virus serotype 8 (AAV8) is een robuuste vector voor genafgifte aan selectieve weefseltypen (bijv. lever, skeletspieren, hart, hersenen en pancreas) met hoge efficiëntie en lage ontstekingsreactie 4,5. Om zich op inwendige lichaamsorganen te richten, wordt AAV8 vaak geïntroduceerd door injectie van de staartader, waarbij virale deeltjes eerst door de longen reizen voordat ze de systemische circulatie bereiken. Daarentegen zorgt injectie ervoor dat ze eerst de lever bereiken voordat ze door de longen circuleren, een potentiële bron van sekwestratie en verdunning. Injectie van poortaders is echter technisch uitdagend en wordt vaak gecompliceerd door door operaties veroorzaakte bloedingen en een hoog sterftecijfer. Om een efficiënte genknockdown (KD) in de lever te bereiken en tegelijkertijd het probleem van hoge peri-/postoperatieve mortaliteit te vermijden, hebben we een methode getest voor intrasplenische injectie van AAV8 met een gemanipuleerd shRNA gericht tegen nucleostemine (NS) (AAV8-shNS1) en vergeleken we de KD-efficiëntie met die van door poortader geïnjecteerde AAV8-shNS1.
NS is een met stam-/voorlopercellen verrijkt eiwit dat eerst werd ontdekt in neurale stamcellen en later in verschillende andere soorten stamcellen en kankers 6,7. Het biologische belang van NS wordt aangetoond door het vroege embryonale letale fenotype van kiembaan NS-knockout (NSKO) muizen in vivo 3,8 en door NSKD-geïnduceerde verstoring van zelfvernieuwing in vitro 9,10. Bij volwassen dieren worden hoge niveaus van NS-expressie aangetroffen in de testis en verschillende weefsels die regeneratie ondergaan, waaronder de dedifferentiërende salamander-gepigmenteerde epitheelcellen na lentectomie en spiercellen na amputatie van ledematen11, evenals regenererende zoogdierweefsels, zoals cardiomyocyten van muizen na hartletsel12 en hepatocyten na leverbeschadiging (bijv. CCl4) of chirurgische resectie (bijv. gedeeltelijke hepatectomie)13,14. Bovendien is aangetoond dat NS een belangrijke rol speelt bij de ontwikkeling van borst-, lever- en orale tumoren 15,16,17. Mechanistisch gezien is aangetoond dat NS zelfvernieuwing bevordert door het replicerende genoom te beschermen tegen DNA-schade18,19. Vanwege het vroege embryonale letale fenotype van kiembaan NSKO is echter een experimentele methode nodig om NSKD tijdelijk te introduceren na voltooiing van de weefselontwikkeling om de biologische activiteiten in volwassen organen verder te bepalen.
In dit artikel gebruiken we NS als voorbeeld om het opzetten en testen van een in vivo levergen KD-methode te illustreren die efficiënt is en een lage procedure-geïnduceerde mortaliteit heeft.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven die in dit onderzoek zijn voltooid, zijn beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Texas A&M University Health Science Center in Houston (goedkeuringsnummer: 2021-0264-IBT) en uitgevoerd in overeenstemming met en in overeenstemming met alle relevante regelgevende en institutionele richtlijnen. Vrouwelijke C57BL/6J-muizen (4-5 maanden oud, lichaamsgewicht 23-30 g) werden gebruikt. De details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.
1. AAV8- shRNA-ontwerp en productie
OPMERKING: Raadpleeg Sands et al.4 voor procedurele details.
- Ontwerp sense en anti-sense shRNA-oligonucleotiden die zich richten op een lange sequentie van 21 nucleotiden in het coderende gebied van het gen van belang. In dit geval werden muis NS (shNS1) en een vervormde sequentie van 21 nucleotiden als negatieve controle (shScr) gebruikt (Figuur 1A, onderpaneel).
- Neem in de haarspeldstructuur een stamlussequentie van TTCAAGAGA op, een 5' stomp uiteinde, een 3' XhoI-compatibel samenhangend uiteinde en een genspecifieke gerichte sense-sequentie van 5'-GAA CTA AAA CAG CAG CAG AAA-3' (shNS1) of een vervormde sequentie van 5'-TCT CGC TTG GGC GAG AGT AAG-3' (shScr).
- Fosforylaat en gloei elk paar oligonucleotiden.
- Verteer AAV-genoverdrachtsvector, AV5-siRNA-GFP (Figuur 1A, bovenpaneel), met HpaI en XhoI, defosforylaat en gel zuiveren het vectorfragment.
- Ligate gegloeide oligonucleotiden in de gel-gezuiverde vector.
- Transformeer geligeerde DNA-producten in competente DH5α-bacteriën met subkloonefficiëntie.
- Kies enkele klonen op basis van ampicillineresistentie en kweek een bacteriecultuur van 100 ml voor plasmide miniprep. Bevestig de juiste klonen door sequentiebepaling en bereid plasmiden voor met behulp van de in de handel verkrijgbare endotoxinevrije kit (volgens de instructies van de fabrikant).
- Verpak AAV8-virussen door de AV5-overdrachtsvector, Rep/Cap-serotype 8 en AdF6-helperplasmiden te transfecteren in 293T-cellen met behulp van iMFectine-transfectiereagens. In totaal werden 40 × 15 cm-schotels getransfecteerd en geoogst/verteerd 3 dagen na de transfectie.
- Herstel celgeassocieerde AAV8 door cellyse en precipiteer media-uitgescheiden AAV8 met 40% PEG. Combineer na de vertering AAV8-virussen in het cellysaat en het medium, zuiveren op een discontinue jodixanolgradiënt en concentreren in centrifugatie-eenheden met molecuulgewicht (1.00.000 MW).
- Kwantificeer AAV8-titers op basis van absoluut eindpunt qPCR met primers: WPRE-172 (5'- TTTATGAGGAGTTGTGGCCC-3') en WPRE-392 (5'- CAACACCACGGAATTGTCAG-3').
2. Intrasplenische injectie van AAV8 (figuur 1B, 1C)
- Plaats C57BL6/J-muizen in een anesthesiekamer gevuld met 2% isofluraan en zuurstof (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Na bewustzijnsverlies worden de muizen in een rechter laterale liggende positie naar het aseptische operatiegebied overgebracht. Handhaaf de anesthesie door 2% isofluraan met zuurstof die via een neuskegel wordt toegediend.
- Steriliseer de incisieplaats met 2% chloorhexidine gevolgd door 80% ethanol. Gebruik een medische schaar van 6,3 inch om een incisie van 15 mm te maken in de linker bovenbuikwand, gevolgd door een incisie van 10 mm in het buikvlies.
- Leg de milt voorzichtig bloot met een tang en houd deze op zijn plaats met een nat gaasje dat onder het orgaan wordt geplaatst.
- Meng en injecteer AAV8-virussen (50 μl) voorzichtig gedurende een periode van 30 s in de milt met behulp van een naald van 30 G waarvan de punt zich op een diepte van 3 mm onder het oppervlak bevindt (figuur 1B). Bedek de injectieplaats met een wattenstaafje en compres gedurende 1 minuut.
- Hecht het buikvlies met een 4-0 resorbeerbare chromische darmhechting.
- Sluit de buikwand en huid af met een 4-0 zijden hechtdraad.
- Plaats muizen in een schone kooi bovenop een elektrisch warmtekussen en houd ze in de gaten tot ze herstellen.
3. Injectie van AAV8 in de poortader
- Verdoof C57BL6/J-muizen door inhalatie van isofluraan (2%) gemengd met zuurstof (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
- Voer laparotomie 4,13 uit via een incisie in de middellijn (~1 inch) op de huid en vervolgens in het buikvlies.
- Plaats een steriel gaasje gedrenkt in steriele zoutoplossing aan de linkerkant van de muis en gebruik een steriel wattenstaafje om de dikke en dunne darm voorzichtig naar buiten te trekken. Leg de darm op een bevochtigd gaasje en bedek het met een kussentje om contact met de huid of uitdroging te voorkomen.
- Injecteer het AAV-virus in de poortader met een steriele naald van 32 G in een volume van 50 μL. Steek de naald 3-5 mm in de poortader in een hoek van minder dan 5 graden. Laat het bloed 5 s langs de naald stromen om terugstroming te voorkomen.
- Plaats een steriel wattenstaafje met lichte druk op de injectieplaats totdat de ader volledig is gesloten en er geen bloeding is (ongeveer 5 minuten) om bloedingen te voorkomen.
- Plaats de inwendige organen voorzichtig terug in de buikholte.
- Sluit de buikwand en de huid met 4-0 zijden hechtdraad.
4. qRT-PCR-analyse
- Extraheer RNA's uit 50-100 mg leverweefsel 4,13 met behulp van een in de handel verkrijgbaar RNA-isolatiereagens volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
- Synthese van 1st streng cDNA's uit totale RNA's met willekeurige hexameren en M-MLV reverse transcriptase20,21.
- Bepaal de ΔC(t)-waarden tussen het doelgen en de referentiegenen met behulp van het real-time PCR-detectiesysteem met één kleur en het supermix SYBR groene reagens volgens eerder gepubliceerde rapporten22,23.
- Meet de ΔΔC(t)-waarden van vier biologische replicaten en drie technische herhalingen (n = 12). Stel Tm in op 60 °C voor alle reacties. Bevestig de resultaten met behulp van twee referentiegenen, Rps3 en Rplp0.
- Ontwerp de inleidingssequenties als volgt: Ns, 5'-gtc tga tct agt acc aaa gg-3' en 5'-ggg aaa cca atc act cca ac-3'; Rps3, 5'-atg gcg gtg cag att tcc aa-3' en 5'-cat tct gtg tcc tgg tgg c-3'; Rplp0, 5'-ctg aag tgc tcg aca tca ca-3' en 5'-agt ctc cac aga caa tgc ca-3'.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Efficiëntie van gen KD in de lever door intrasplenische vs. poortaderinjectie van AAV8-shRNA
AAV8-virale voorraden werden verdund tot een werkconcentratie van 2E+12 genoomkopieën (gc) per milliliter (gc/ml). Individuele muizen werden geïnjecteerd met 1E+11 gc AAV8-shNS1 of AAV8-shScr (50 μL) via intrasplenische of poortaderinjectie. Twee weken na de injectie werd leverweefsel verzameld voor RNA-isolatie,1-strengs cDNA-synthese en qPCR-anal...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Gen KD door virale afgifte van ofwel een shRNA-expressie construct in een wildtype achtergrond24,25 of Cre recombinase-expressie construct in een floxed achtergrond26 is een krachtige manier om de genfunctie in vivo te ondervragen op een induceerbare, tijdgecontroleerde manier. Een ideale toedieningsmethode voor in vivo gen KO/KD-onderzoeken moet een hoge KO/KD-efficiëntie bereiken in het...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Individual Investigator Research Award (RP200081) van het Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) voor RYT.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Amicon filter centrifugatie-eenheden | MilliporeSigma | UFC9100 | Snelle ultrafiltratie |
| AV5-siRNA-GFP | Addgene | #124972 | Plasmid |
| Competente DH5α bacteriën | Invitrogen | #18265-017 | Chemisch competente stam voor klonering |
| HpaI | New England Biolabs | R0105 | Restrictienezym |
| iMFectin transfectie reagens | GenDepot | I7100-101 | |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | M1708 | RNA-afhankelijke DNA-polymerase |
| MyiQ enkelkleur real-time PCR detectiesysteem | Bio-Rad | BUN9740RAD | qRT-PCR |
| Omega endotoxin-vrij kit | Bioteck | D6915-03 | Plasmid DNA midi prep |
| Willekeurige hexamers | Invitrogen | 48190-011 | |
| Supermix SYBR green reagens | Bio-Rad | 1708882 | Real-time PCR toepassingen |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596-018 | Isolatie van hoogwaardige totale RNA |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | Restrictienezym |
Referenties
- Wang, J., et al. Epigenome-wide analysis of aging effects on liver regeneration. BMC Biol. 21 (1), 30(2023).
- Jindal, A., Jagdish, R. K., Kumar, A. Hepatic regeneration in cirrhosis. J Clin Exp Hepatol. 12 (2), 603-616 (2022).
- Meng, L., et al. Nucleostemin deletion reveals an essential mechanism that maintains the genomic stability of stem and progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11415-11420 (2013).
- Sands, M. S. Aav-mediated liver-directed gene therapy. Methods Mol Biol. 807, 141-157 (2011).
- Tenney, R. M., Bell, C. L., Wilson, J. M. AAV8 capsid variable regions at the two-fold symmetry axis contribute to high liver transduction by mediating nuclear entry and capsid uncoating. Virology. 454-455, 227-236 (2014).
- Tsai, R. Y., Mckay, R. D. A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells. Genes Dev. 16 (23), 2991-3003 (2002).
- Tsai, R. Y., Meng, L. Nucleostemin: A latecomer with new tricks. Int J Biochem Cell Biol. 41 (11), 2122-2124 (2009).
- Zhu, Q., Yasumoto, H., Tsai, R. Y. Nucleostemin delays cellular senescence and negatively regulates trf1 protein stability. Mol Cell Biol. 26 (24), 9279-9290 (2006).
- Qu, J., Bishop, J. M. Nucleostemin maintains self-renewal of embryonic stem cells and promotes reprogramming of somatic cells to pluripotency. J Cell Biol. 197 (6), 731-745 (2012).
- Lin, T., Meng, L., Li, Y., Tsai, R. Y. Tumor-initiating function of nucleostemin-enriched mammary tumor cells. Cancer Res. 70 (22), 9444-9452 (2010).
- Maki, N., et al. Rapid accumulation of nucleostemin in nucleolus during newt regeneration. Dev Dyn. 236 (4), 941-950 (2007).
- Siddiqi, S., et al. Myocardial induction of nucleostemin in response to postnatal growth and pathological challenge. Circ Res. 103 (1), 89-97 (2008).
- Lin, T., Ibrahim, W., Peng, C. -Y., Finegold, M. J., Tsai, R. Y. A novel role of nucleostemin in maintaining the genome integrity of dividing hepatocytes during mouse liver development and regeneration. Hepatology. 58 (6), 2176-2187 (2013).
- Shugo, H., et al. Nucleostemin in injury-induced liver regeneration. Stem Cells Dev. 21 (16), 3044-3054 (2012).
- Lin, T., et al. Nucleostemin reveals a dichotomous nature of genome maintenance in mammary tumor progression. Oncogene. 38 (20), 3919-3931 (2019).
- Wang, J., et al. Nucleostemin modulates outcomes of hepatocellular carcinoma via a tumor adaptive mechanism to genomic stress. Mol Cancer Res. 18 (5), 723-734 (2020).
- Crawford, M., Liu, X., Cheng, Y. L., Tsai, R. Y. Nucleostemin upregulation and stat3 activation as early events in oral epithelial dysplasia progression to squamous cell carcinoma. Neoplasia. 23 (12), 1289-1299 (2021).
- Lin, T., Meng, L., Wu, L. J., Pederson, T., Tsai, R. Y. Nucleostemin and gnl3l exercise distinct functions in genome protection and ribosome synthesis, respectively. J Cell Sci. 127 (10), 2302-2312 (2014).
- Tsai, R. Y. Balancing self-renewal against genome preservation in stem cells: How do they manage to have the cake and eat it too. Cell Mol Life Sci. 73 (9), 1803-1823 (2016).
- Meng, L., Hsu, J. K., Tsai, R. Y. Gnl3l depletion destabilizes mdm2 and induces p53-dependent G2/m arrest. Oncogene. 30 (14), 1716-1726 (2011).
- Huang, G., Meng, L., Tsai, R. Y. P53 configures the G2/m arrest response of nucleostemin-deficient cells. Cell Death Discov. 1, e15060(2015).
- Liu, X., Wang, J., Wu, L. J., Trinh, B., Tsai, R. Y. L. IMPDH inhibition decreases TERT expression and synergizes the cytotoxic effect of chemotherapeutic agents in glioblastoma cells. Int J Mol Sci. 25 (11), 5992(2024).
- Liu, X., Wang, J., Li, F., Timchenko, N., Tsai, R. Y. L. Transcriptional control of a stem cell factor nucleostemin in liver regeneration and aging. PLoS One. 19 (9), e0310219(2024).
- Mayra, A., et al. Intraperitoneal AAV9-shRNA inhibits target expression in neonatal skeletal and cardiac muscles. Biochem Biophys Res Commun. 405 (2), 204-209 (2011).
- Cohen, A., et al. Virus-mediated shRNA knockdown of prodynorphin in the rat nucleus accumbens attenuates depression-like behavior and cocaine locomotor sensitization. PLoS One. 9 (5), e97216(2014).
- Jeon, Y., et al. Topbp1 deficiency causes early embryonic lethality and induces cellular senescence in primary cells. J Biol Chem. 286 (7), 5414-5422 (2011).
- Smith, T. A., et al. Adenovirus-mediated expression of therapeutic plasma levels of human factor IX in mice. Nat Genet. 5 (4), 397-402 (1993).
- Nakai, H., Iwaki, Y., Kay, M. A., Couto, L. B. Isolation of recombinant adeno-associated virus vector-cellular DNA junctions from mouse liver. J Virol. 73 (7), 5438-5447 (1999).
- Jung, S. C., et al. Adeno-associated viral vector-mediated gene transfer results in long-term enzymatic and functional correction in multiple organs of Fabry mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2676-2681 (2001).
- Hurford, R. K., Dranoff, G., Mulligan, R. C., Tepper, R. I. Gene therapy of metastatic cancer by in vivo retroviral gene targeting. Nat Genet. 10 (4), 430-435 (1995).
- Sarkar, R., Xiao, W., Kazazian, H. H. Jr A single adeno-associated virus (AAV)-murine factor viii vector partially corrects the hemophilia a phenotype. J Thromb Haemost. 1 (2), 220-226 (2003).
- Czekaj, P., et al. Optimization of methods for intrasplenic administration of human amniotic epithelial cells in order to perform safe and effective cell-based therapy for liver diseases. Stem Cell Rev Rep. 20 (6), 1599-1617 (2024).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
