Methodenartikel

Efficiënte genknockdown in de lever via intrasplenische injectie van adeno-geassocieerd virus serotype 8 (AAV8)-afgeleverd klein haarspeld-RNA

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67376

⸱

1 november 2024

 , 
1Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Translational Medical Sciences, College of Medicine, Texas A&M University Health Science Center

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft hoe intrasplentische injectie van AAV8-afgeleverd klein haarspeld-RNA dezelfde gen-knockdown-efficiëntie in de lever bereikt als injectie van de poortader, wat een eenvoudigere procedure vertegenwoordigt met veel lagere perioperatieve en postoperatieve mortaliteit en complicaties.

Samenvatting

De lever is een belangrijk orgaan dat essentiële metabolische functies vervult. Het ontwikkelen van een efficiënte en veilige methode om genexpressie in de lever uit te schakelen, biedt een belangrijk hulpmiddel voor het bepalen van de genfunctie in de pathofysiologie van de lever. In deze studie beschrijven we een methode voor intrasplenische injectie van adeno-geassocieerd virus serotype 8 (AAV8) die is ontworpen om een klein haarspeld-RNA (shRNA) tot expressie te brengen tegen een doelgen van belang, nucleostemine (NS). Intrasplenische injectie van AAV8 die een NS-gericht shRNA (AAV8-shNS1) tot expressie brengt, bereikte dezelfde knockdown-efficiëntie van NS in de lever als injectie van poortader, vergeleken met de injectie van AAV8 die een gecodeerde sequentie shRNA (AAV8-shScr) tot expressie brengt. Bovendien veroorzaakte injectie van het AAV8-shRNA-virus minimale ontstekingsreacties in het leverparenchym. Het belangrijkste was dat dit intrasplenische injectieprotocol technisch niet veeleisend was en minimale bloedingen veroorzaakte op de injectieplaats, wat de belangrijkste oorzaak is van perioperatieve en postoperatieve mortaliteit bij het uitvoeren van poortaderinjectie. Deze studie rapporteert een verbeterde en relatief veilige methode om een efficiënte genknockdown in de lever te bereiken.

Inleiding

De lever is een vitaal orgaan dat voedingsstoffen en chemicaliën metaboliseert, maar wordt ook constant blootgesteld aan cytotoxische en kankerverwekkende beledigingen. Hoewel de volwassen lever in staat is om na een verwonding opnieuw te groeien, wordt het herstellende vermogen ernstig belemmerd opde leeftijd van 1 jaar. Tot op heden is levertransplantatie de enige therapeutische optie voor patiënten met chronische leverziekten in het eindstadium of massale acute leverschade, die op zichzelf al veel uitdagingen met zich meebrengt2. Om de moleculaire pathofysiologie van de lever beter te begrijpen door de functies van interessante genen te ondervragen, zijn genetische manipulaties ontwikkeld voor in vivo toepassing, waaronder RNAi-gemedieerde knockdown en gerichte deletie door een Cre-recombinase in aanwezigheid van loxP-sites3. Cre-expressie cassette en shRNA-constructie kunnen worden afgeleverd door virale vehikels.

Adeno-geassocieerd virus serotype 8 (AAV8) is een robuuste vector voor genafgifte aan selectieve weefseltypen (bijv. lever, skeletspieren, hart, hersenen en pancreas) met hoge efficiëntie en lage ontstekingsreactie 4,5. Om zich op inwendige lichaamsorganen te richten, wordt AAV8 vaak geïntroduceerd door injectie van de staartader, waarbij virale deeltjes eerst door de longen reizen voordat ze de systemische circulatie bereiken. Daarentegen zorgt injectie ervoor dat ze eerst de lever bereiken voordat ze door de longen circuleren, een potentiële bron van sekwestratie en verdunning. Injectie van poortaders is echter technisch uitdagend en wordt vaak gecompliceerd door door operaties veroorzaakte bloedingen en een hoog sterftecijfer. Om een efficiënte genknockdown (KD) in de lever te bereiken en tegelijkertijd het probleem van hoge peri-/postoperatieve mortaliteit te vermijden, hebben we een methode getest voor intrasplenische injectie van AAV8 met een gemanipuleerd shRNA gericht tegen nucleostemine (NS) (AAV8-shNS1) en vergeleken we de KD-efficiëntie met die van door poortader geïnjecteerde AAV8-shNS1.

NS is een met stam-/voorlopercellen verrijkt eiwit dat eerst werd ontdekt in neurale stamcellen en later in verschillende andere soorten stamcellen en kankers 6,7. Het biologische belang van NS wordt aangetoond door het vroege embryonale letale fenotype van kiembaan NS-knockout (NSKO) muizen in vivo 3,8 en door NSKD-geïnduceerde verstoring van zelfvernieuwing in vitro 9,10. Bij volwassen dieren worden hoge niveaus van NS-expressie aangetroffen in de testis en verschillende weefsels die regeneratie ondergaan, waaronder de dedifferentiërende salamander-gepigmenteerde epitheelcellen na lentectomie en spiercellen na amputatie van ledematen11, evenals regenererende zoogdierweefsels, zoals cardiomyocyten van muizen na hartletsel12 en hepatocyten na leverbeschadiging (bijv. CCl4) of chirurgische resectie (bijv. gedeeltelijke hepatectomie)13,14. Bovendien is aangetoond dat NS een belangrijke rol speelt bij de ontwikkeling van borst-, lever- en orale tumoren 15,16,17. Mechanistisch gezien is aangetoond dat NS zelfvernieuwing bevordert door het replicerende genoom te beschermen tegen DNA-schade18,19. Vanwege het vroege embryonale letale fenotype van kiembaan NSKO is echter een experimentele methode nodig om NSKD tijdelijk te introduceren na voltooiing van de weefselontwikkeling om de biologische activiteiten in volwassen organen verder te bepalen.

In dit artikel gebruiken we NS als voorbeeld om het opzetten en testen van een in vivo levergen KD-methode te illustreren die efficiënt is en een lage procedure-geïnduceerde mortaliteit heeft.

Protocol

Alle dierproeven die in dit onderzoek zijn voltooid, zijn beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Texas A&M University Health Science Center in Houston (goedkeuringsnummer: 2021-0264-IBT) en uitgevoerd in overeenstemming met en in overeenstemming met alle relevante regelgevende en institutionele richtlijnen. Vrouwelijke C57BL/6J-muizen (4-5 maanden oud, lichaamsgewicht 23-30 g) werden gebruikt. De details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. AAV8- shRNA-ontwerp en productie

OPMERKING: Raadpleeg Sands et al.4 voor procedurele details.

  1. Ontwerp sense en anti-sense shRNA-oligonucleotiden die zich richten op een lange sequentie van 21 nucleotiden in het coderende gebied van het gen van belang. In dit geval werden muis NS (shNS1) en een vervormde sequentie van 21 nucleotiden als negatieve controle (shScr) gebruikt (Figuur 1A, onderpaneel).
  2. Neem in de haarspeldstructuur een stamlussequentie van TTCAAGAGA op, een 5' stomp uiteinde, een 3' XhoI-compatibel samenhangend uiteinde en een genspecifieke gerichte sense-sequentie van 5'-GAA CTA AAA CAG CAG CAG AAA-3' (shNS1) of een vervormde sequentie van 5'-TCT CGC TTG GGC GAG AGT AAG-3' (shScr).
  3. Fosforylaat en gloei elk paar oligonucleotiden.
  4. Verteer AAV-genoverdrachtsvector, AV5-siRNA-GFP (Figuur 1A, bovenpaneel), met HpaI en XhoI, defosforylaat en gel zuiveren het vectorfragment.
  5. Ligate gegloeide oligonucleotiden in de gel-gezuiverde vector.
  6. Transformeer geligeerde DNA-producten in competente DH5α-bacteriën met subkloonefficiëntie.
  7. Kies enkele klonen op basis van ampicillineresistentie en kweek een bacteriecultuur van 100 ml voor plasmide miniprep. Bevestig de juiste klonen door sequentiebepaling en bereid plasmiden voor met behulp van de in de handel verkrijgbare endotoxinevrije kit (volgens de instructies van de fabrikant).
  8. Verpak AAV8-virussen door de AV5-overdrachtsvector, Rep/Cap-serotype 8 en AdF6-helperplasmiden te transfecteren in 293T-cellen met behulp van iMFectine-transfectiereagens. In totaal werden 40 × 15 cm-schotels getransfecteerd en geoogst/verteerd 3 dagen na de transfectie.
  9. Herstel celgeassocieerde AAV8 door cellyse en precipiteer media-uitgescheiden AAV8 met 40% PEG. Combineer na de vertering AAV8-virussen in het cellysaat en het medium, zuiveren op een discontinue jodixanolgradiënt en concentreren in centrifugatie-eenheden met molecuulgewicht (1.00.000 MW).
  10. Kwantificeer AAV8-titers op basis van absoluut eindpunt qPCR met primers: WPRE-172 (5'- TTTATGAGGAGTTGTGGCCC-3') en WPRE-392 (5'- CAACACCACGGAATTGTCAG-3').

2. Intrasplenische injectie van AAV8 (figuur 1B, 1C) 

  1. Plaats C57BL6/J-muizen in een anesthesiekamer gevuld met 2% isofluraan en zuurstof (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Na bewustzijnsverlies worden de muizen in een rechter laterale liggende positie naar het aseptische operatiegebied overgebracht. Handhaaf de anesthesie door 2% isofluraan met zuurstof die via een neuskegel wordt toegediend.
  2. Steriliseer de incisieplaats met 2% chloorhexidine gevolgd door 80% ethanol. Gebruik een medische schaar van 6,3 inch om een incisie van 15 mm te maken in de linker bovenbuikwand, gevolgd door een incisie van 10 mm in het buikvlies.
  3. Leg de milt voorzichtig bloot met een tang en houd deze op zijn plaats met een nat gaasje dat onder het orgaan wordt geplaatst.
  4. Meng en injecteer AAV8-virussen (50 μl) voorzichtig gedurende een periode van 30 s in de milt met behulp van een naald van 30 G waarvan de punt zich op een diepte van 3 mm onder het oppervlak bevindt (figuur 1B). Bedek de injectieplaats met een wattenstaafje en compres gedurende 1 minuut.
  5. Hecht het buikvlies met een 4-0 resorbeerbare chromische darmhechting.
  6. Sluit de buikwand en huid af met een 4-0 zijden hechtdraad.
  7. Plaats muizen in een schone kooi bovenop een elektrisch warmtekussen en houd ze in de gaten tot ze herstellen.

3. Injectie van AAV8 in de poortader

  1. Verdoof C57BL6/J-muizen door inhalatie van isofluraan (2%) gemengd met zuurstof (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
  2. Voer laparotomie 4,13 uit via een incisie in de middellijn (~1 inch) op de huid en vervolgens in het buikvlies.
  3. Plaats een steriel gaasje gedrenkt in steriele zoutoplossing aan de linkerkant van de muis en gebruik een steriel wattenstaafje om de dikke en dunne darm voorzichtig naar buiten te trekken. Leg de darm op een bevochtigd gaasje en bedek het met een kussentje om contact met de huid of uitdroging te voorkomen.
  4. Injecteer het AAV-virus in de poortader met een steriele naald van 32 G in een volume van 50 μL. Steek de naald 3-5 mm in de poortader in een hoek van minder dan 5 graden. Laat het bloed 5 s langs de naald stromen om terugstroming te voorkomen.
  5. Plaats een steriel wattenstaafje met lichte druk op de injectieplaats totdat de ader volledig is gesloten en er geen bloeding is (ongeveer 5 minuten) om bloedingen te voorkomen.
  6. Plaats de inwendige organen voorzichtig terug in de buikholte.
  7. Sluit de buikwand en de huid met 4-0 zijden hechtdraad.

4. qRT-PCR-analyse

  1. Extraheer RNA's uit 50-100 mg leverweefsel 4,13 met behulp van een in de handel verkrijgbaar RNA-isolatiereagens volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
  2. Synthese van 1st streng cDNA's uit totale RNA's met willekeurige hexameren en M-MLV reverse transcriptase20,21.
  3. Bepaal de ΔC(t)-waarden tussen het doelgen en de referentiegenen met behulp van het real-time PCR-detectiesysteem met één kleur en het supermix SYBR groene reagens volgens eerder gepubliceerde rapporten22,23.
  4. Meet de ΔΔC(t)-waarden van vier biologische replicaten en drie technische herhalingen (n = 12). Stel Tm in op 60 °C voor alle reacties. Bevestig de resultaten met behulp van twee referentiegenen, Rps3 en Rplp0.
  5. Ontwerp de inleidingssequenties als volgt: Ns, 5'-gtc tga tct agt acc aaa gg-3' en 5'-ggg aaa cca atc act cca ac-3'; Rps3, 5'-atg gcg gtg cag att tcc aa-3' en 5'-cat tct gtg tcc tgg tgg c-3'; Rplp0, 5'-ctg aag tgc tcg aca tca ca-3' en 5'-agt ctc cac aga caa tgc ca-3'.

Resultaten

Efficiëntie van gen KD in de lever door intrasplenische vs. poortaderinjectie van AAV8-shRNA
AAV8-virale voorraden werden verdund tot een werkconcentratie van 2E+12 genoomkopieën (gc) per milliliter (gc/ml). Individuele muizen werden geïnjecteerd met 1E+11 gc AAV8-shNS1 of AAV8-shScr (50 μL) via intrasplenische of poortaderinjectie. Twee weken na de injectie werd leverweefsel verzameld voor RNA-isolatie,1-strengs cDNA-synthese en qPCR-analyse. De resultaten toonden aan dat de intrasplenische injectiemethode statistisch gezien dezelfde NSKD-efficiëntie bereikte (20,8% ± 4,4%) als de portale aderinjectiemethode (16,3% ± 3,6%) met Rsp3 en Rplp0 als interne referentie (Figuur 2). Meer in het bijzonder kon de intrasplenische injectieprocedure binnen 15 minuten worden voltooid zonder dat er bijna geen overlijden door de procedure werd veroorzaakt, terwijl de poortaderinjectiemethode normaal gesproken 25-30 minuten vereiste met veel oefening en geassocieerd was met een hoger sterftecijfer (~25%-30% sterftecijfer).

Weefsel ontstekingsreactie
Leverweefsel werd verzameld van muizen die een poortaderinjectie of intrasplenische injectie van AAV8-shScr (Figuur 3A) of AAV8-shNS1 (Figuur 3B) kregen en vergeleken met die van controlemuizen (Figuur 3C). Ontstekingsreacties werden onderzocht door middel van H&E-kleuring4. De resultaten toonden aan dat noch AAV8-shScr noch AAV8-shNS1 opmerkelijke ontstekingsreacties in het leverparenchym opwekten in vergelijking met PBS dat werd geïnjecteerd via de intrasplenische injectie (Spl) of de poortaderinjectie (PV) methode (Figuur 3A-C).

figure-results-1
Figuur 1: Illustraties van het AAV8-shRNA-ontwerp en de intrasplenische injectieprocedure. (A) (Boven) Diagram van het AV5-siRNA-GFP-plasmide dat is ontworpen om adeno-geassocieerd virus serotype 8 (AAV8) te maken voor in vivo knockdown-experimenten. AV5-siRNA-GFP bevat een CMV-promotorgestuurde shRNA-sequentie en EGFP. (Onder) Kleine haarspeld RNAi-constructies die zijn ontworpen voor het richten op 21-nucleotidesequenties op NS van muizen (shNS1) of een vervormde 21-nucleotidesequentie (Scr). (B) Een schematisch workflowdiagram in de intrasplenische AAV8-injectieprocedure. (C) Stapsgewijze weergave van de chirurgische ingreep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Efficiëntie van AAV8-shRNA-gemedieerde knockdown van nucleostemine (NS) in de lever via intrasplenische versus poortaderinjectie. qRT-PCR-assays van NS-expressie in levermonsters geoogst van muizen 2 weken na ontvangst van intrasplenische (Spl) of poortader (PV) injectie van AAV8-shScr of AAV8-shNS1 (1E+11 gc). Grafieken tonen de resultaten met betrekking tot twee interne controles, Rps3 (A) en Rplp0 (B). Balken tonen een gemiddelde ± SEM van vier biologische replicaten, elk met drie technische PCR-herhalingen; *P < 0,01; **p < 0,001; p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Histologie van leverweefsel na intrasplenische injectie of poortaderinjectie van PBS, AAV8-shScr of AAV8-shNS1. H&E-kleuring van leverweefsel 2 weken na intrasplenische injectie (Spl) of poortaderinjectie (PV) van AAV8-shScr (A) of AAV8-shNS1 (B), vergeleken met die van controlemonsters zonder AAV8-injectie (C). Schaal staven: 100 μm. De rechterpanelen tonen vergrote weergaven van de inzetstukken in de linkerpanelen. Schaal staven: 50 μm. In elke groep werden zes tot negen secties van twee verschillende dieren onderzocht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Gen KD door virale afgifte van ofwel een shRNA-expressie construct in een wildtype achtergrond24,25 of Cre recombinase-expressie construct in een floxed achtergrond26 is een krachtige manier om de genfunctie in vivo te ondervragen op een induceerbare, tijdgecontroleerde manier. Een ideale toedieningsmethode voor in vivo gen KO/KD-onderzoeken moet een hoge KO/KD-efficiëntie bereiken in het orgaan van belang, en bovendien moet de procedure zelf technisch eenvoudig zijn met minimale peri-/postoperatieve mortaliteit.

Voor inwendige organen zoals de lever kunnen virale deeltjes worden ingebracht door injectie via de staartader27 of poortader 28,29 of door directe injectie in de milt (intrasplenische injectie)30,31. Poortader en intrasplenische injecties brengen virale deeltjes in de poortcirculatie, die in de lever terechtkomen voordat ze de inferieure vena cava binnendringen en daarna de longcirculatie. Daarentegen omzeilen virale deeltjes die via staartaderinjectie worden geïntroduceerd de portale circulatie en gaan ze in de longcirculatie voordat ze de systemische circulatie bereiken. Voor organen die een portale circulatie ontvangen, zoals de lever, bieden poortaders en intrasplenische injecties het voordeel dat virale deeltjes rechtstreeks aan die organen worden toegediend zonder het risico dat ze door de long worden afgezonderd of in de systemische circulatie worden verdund. Voor organen die geen portale circulatie ontvangen, zoals de hersenen, kan injectie van de staartader gunstiger zijn om geen virale deeltjes aan de lever bloot te stellen voordat ze de longcirculatie bereiken en daarna de systemische circulatie.

In deze studie injecteerden we AAV8-shNS1 in een dosering van 1E+11 gc per dier, wat een betere KD-efficiëntie gaf in vergelijking met 1E+10 gc, maar hetzelfde KD-effect bereikte als 5E+11 gc via intraportale injectie (gegevens niet getoond). Bij de dosering van 1E+11 gc, waarbij de poortaderinjectiemethode en de intrasplenische injectiemethode werden vergeleken, werd geen statistisch verschil gevonden tussen deze methoden in hun NSKD-efficiëntie in de lever, waarbij een KD-efficiëntie van 70%-80% werd bereikt. Het gen KD-effect van met poortader geïnjecteerde AAV8 in de lever kan tot zes weken aanhouden op een constructafhankelijke manier23. Met name proceduregerelateerde complicaties, zoals door operaties veroorzaakte bloedingen en verkleving van het omentum/peritoneum, evenals technische problemen, zijn significant minder en lager voor de intrasplenische injectiemethode in vergelijking met de poortaderinjectiemethode. Als gevolg hiervan wordt de injectie van de poortader één keer uitgevoerd, terwijl de intrasplenische injectie herhaaldelijk kan worden uitgevoerd32. Ten slotte waren er weinig tot geen ontstekingsreacties in het parenchym van levers die ofwel poortaderinjectie ofwel intrasplenische injectie van AAV8-shScr of AAV8-NS1 kregen. De laatste bevinding sluit echter niet de mogelijkheid uit dat extreem hoge titers van AAV nog steeds ontstekingsreacties kunnen veroorzaken die de experimentele bevindingen verwarren. Daarom moet de optimale AAV-dosering empirisch worden bepaald en afgewogen tussen de KD-efficiëntie en de door AAV8 geïnduceerde reactie en kan deze variëren tussen verschillende gerichte genen en/of sequenties. Concluderend tonen deze resultaten aan dat intrasplenische injectie van AAV8-shRNA een zeer efficiënte, relatief veilige en eenvoudige methode is om in vivo gen KD in de lever te bereiken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Individual Investigator Research Award (RP200081) van het Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) voor RYT.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Amicon filter centrifugatie-eenhedenMilliporeSigmaUFC9100Snelle ultrafiltratie
AV5-siRNA-GFP Addgene #124972Plasmid
Competente DH5α bacteriën Invitrogen#18265-017Chemisch competente stam voor klonering 
HpaI New England BiolabsR0105Restrictienezym
iMFectin transfectie reagens GenDepotI7100-101
M-MLV reverse transcriptase PromegaM1708RNA-afhankelijke DNA-polymerase 
MyiQ enkelkleur real-time PCR detectiesysteem Bio-RadBUN9740RADqRT-PCR
Omega endotoxin-vrij kit BioteckD6915-03Plasmid DNA midi prep 
Willekeurige hexamers Invitrogen48190-011
Supermix SYBR green reagens Bio-Rad1708882Real-time PCR toepassingen
T4 DNA LigasePromegaM1801
TRIzol Reagent Life Technologies15596-018Isolatie van hoogwaardige totale RNA
XhoINew England BiolabsR0146Restrictienezym

Referenties

  1. Wang, J., et al. Epigenome-wide analysis of aging effects on liver regeneration. BMC Biol. 21 (1), 30(2023).
  2. Jindal, A., Jagdish, R. K., Kumar, A. Hepatic regeneration in cirrhosis. J Clin Exp Hepatol. 12 (2), 603-616 (2022).
  3. Meng, L., et al. Nucleostemin deletion reveals an essential mechanism that maintains the genomic stability of stem and progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11415-11420 (2013).
  4. Sands, M. S. Aav-mediated liver-directed gene therapy. Methods Mol Biol. 807, 141-157 (2011).
  5. Tenney, R. M., Bell, C. L., Wilson, J. M. AAV8 capsid variable regions at the two-fold symmetry axis contribute to high liver transduction by mediating nuclear entry and capsid uncoating. Virology. 454-455, 227-236 (2014).
  6. Tsai, R. Y., Mckay, R. D. A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells. Genes Dev. 16 (23), 2991-3003 (2002).
  7. Tsai, R. Y., Meng, L. Nucleostemin: A latecomer with new tricks. Int J Biochem Cell Biol. 41 (11), 2122-2124 (2009).
  8. Zhu, Q., Yasumoto, H., Tsai, R. Y. Nucleostemin delays cellular senescence and negatively regulates trf1 protein stability. Mol Cell Biol. 26 (24), 9279-9290 (2006).
  9. Qu, J., Bishop, J. M. Nucleostemin maintains self-renewal of embryonic stem cells and promotes reprogramming of somatic cells to pluripotency. J Cell Biol. 197 (6), 731-745 (2012).
  10. Lin, T., Meng, L., Li, Y., Tsai, R. Y. Tumor-initiating function of nucleostemin-enriched mammary tumor cells. Cancer Res. 70 (22), 9444-9452 (2010).
  11. Maki, N., et al. Rapid accumulation of nucleostemin in nucleolus during newt regeneration. Dev Dyn. 236 (4), 941-950 (2007).
  12. Siddiqi, S., et al. Myocardial induction of nucleostemin in response to postnatal growth and pathological challenge. Circ Res. 103 (1), 89-97 (2008).
  13. Lin, T., Ibrahim, W., Peng, C. -Y., Finegold, M. J., Tsai, R. Y. A novel role of nucleostemin in maintaining the genome integrity of dividing hepatocytes during mouse liver development and regeneration. Hepatology. 58 (6), 2176-2187 (2013).
  14. Shugo, H., et al. Nucleostemin in injury-induced liver regeneration. Stem Cells Dev. 21 (16), 3044-3054 (2012).
  15. Lin, T., et al. Nucleostemin reveals a dichotomous nature of genome maintenance in mammary tumor progression. Oncogene. 38 (20), 3919-3931 (2019).
  16. Wang, J., et al. Nucleostemin modulates outcomes of hepatocellular carcinoma via a tumor adaptive mechanism to genomic stress. Mol Cancer Res. 18 (5), 723-734 (2020).
  17. Crawford, M., Liu, X., Cheng, Y. L., Tsai, R. Y. Nucleostemin upregulation and stat3 activation as early events in oral epithelial dysplasia progression to squamous cell carcinoma. Neoplasia. 23 (12), 1289-1299 (2021).
  18. Lin, T., Meng, L., Wu, L. J., Pederson, T., Tsai, R. Y. Nucleostemin and gnl3l exercise distinct functions in genome protection and ribosome synthesis, respectively. J Cell Sci. 127 (10), 2302-2312 (2014).
  19. Tsai, R. Y. Balancing self-renewal against genome preservation in stem cells: How do they manage to have the cake and eat it too. Cell Mol Life Sci. 73 (9), 1803-1823 (2016).
  20. Meng, L., Hsu, J. K., Tsai, R. Y. Gnl3l depletion destabilizes mdm2 and induces p53-dependent G2/m arrest. Oncogene. 30 (14), 1716-1726 (2011).
  21. Huang, G., Meng, L., Tsai, R. Y. P53 configures the G2/m arrest response of nucleostemin-deficient cells. Cell Death Discov. 1, e15060(2015).
  22. Liu, X., Wang, J., Wu, L. J., Trinh, B., Tsai, R. Y. L. IMPDH inhibition decreases TERT expression and synergizes the cytotoxic effect of chemotherapeutic agents in glioblastoma cells. Int J Mol Sci. 25 (11), 5992(2024).
  23. Liu, X., Wang, J., Li, F., Timchenko, N., Tsai, R. Y. L. Transcriptional control of a stem cell factor nucleostemin in liver regeneration and aging. PLoS One. 19 (9), e0310219(2024).
  24. Mayra, A., et al. Intraperitoneal AAV9-shRNA inhibits target expression in neonatal skeletal and cardiac muscles. Biochem Biophys Res Commun. 405 (2), 204-209 (2011).
  25. Cohen, A., et al. Virus-mediated shRNA knockdown of prodynorphin in the rat nucleus accumbens attenuates depression-like behavior and cocaine locomotor sensitization. PLoS One. 9 (5), e97216(2014).
  26. Jeon, Y., et al. Topbp1 deficiency causes early embryonic lethality and induces cellular senescence in primary cells. J Biol Chem. 286 (7), 5414-5422 (2011).
  27. Smith, T. A., et al. Adenovirus-mediated expression of therapeutic plasma levels of human factor IX in mice. Nat Genet. 5 (4), 397-402 (1993).
  28. Nakai, H., Iwaki, Y., Kay, M. A., Couto, L. B. Isolation of recombinant adeno-associated virus vector-cellular DNA junctions from mouse liver. J Virol. 73 (7), 5438-5447 (1999).
  29. Jung, S. C., et al. Adeno-associated viral vector-mediated gene transfer results in long-term enzymatic and functional correction in multiple organs of Fabry mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2676-2681 (2001).
  30. Hurford, R. K., Dranoff, G., Mulligan, R. C., Tepper, R. I. Gene therapy of metastatic cancer by in vivo retroviral gene targeting. Nat Genet. 10 (4), 430-435 (1995).
  31. Sarkar, R., Xiao, W., Kazazian, H. H. Jr A single adeno-associated virus (AAV)-murine factor viii vector partially corrects the hemophilia a phenotype. J Thromb Haemost. 1 (2), 220-226 (2003).
  32. Czekaj, P., et al. Optimization of methods for intrasplenic administration of human amniotic epithelial cells in order to perform safe and effective cell-based therapy for liver diseases. Stem Cell Rev Rep. 20 (6), 1599-1617 (2024).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

AAV8 toedieninglevergenexpressieinjectie in de poortadernucleostemin knockdownmuizenleverRNA interferentieleverregeneratie
Efficiënte genknockdown in de lever via intrasplenische injectie van adeno-geassocieerd virus serotype 8 (AAV8)-afgeleverd klein haarspeld-RNA
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.