Methodenartikel

Onderzoek naar CD4 T-celdifferentiatie bij muizen met behulp van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteïnecomplex-gemedieerde genablatie

1.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67380

⸱

20 juni 2025

 ,  , 
1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH

In dit artikel

Samenvatting

We schetsen een zeer aanpasbare benadering voor het gebruik van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteïne complex-gemedieerde genablatie in muizennaïeve CD4 T-cellen om de genfunctie in CD4 T-celdifferentiatie te onderzoeken.

Samenvatting

De wijdverbreide toegankelijkheid van geclusterde, regelmatig op afstand geplaatste korte palindromische herhaling (CRISPR)-Cas9-technologie heeft gentargeting in primaire cellen tot een routinemethode gemaakt voor het evalueren van de genfunctie in T-cellen. Gezien de kosten en beperkte beschikbaarheid van knock-out (KO) muizenstammen, kan het testen van voorlopige hypothesen met betrekking tot genfunctie in T-cellen onbetaalbaar zijn met behulp van gengerichte diermodellen. Met behulp van in de handel verkrijgbare bronnen, waaronder vooraf ontworpen gids-RNA's (gRNA's), kunnen onderzoekers echter gemakkelijk gengerichte naïeve T-cellen genereren die kunnen worden gebruikt voor T-celactiverings- en differentiatiestudies.

Hier schetsen we een protocol voor het gebruik van nucleofectie-afgeleverde CRISPR-Cas9 ribonucleoproteïne complexen (RNP's) om efficiënt gen KO muizen naïeve CD4 T-cellen te genereren die kunnen worden gebruikt om de genfunctie in CD4 T-celdifferentiatie in vitro te evalueren. Isolatie van naïeve CD4 T-cellen uit secundaire lymfoïde organen van muizen, gevolgd door nucleofectie met Cas9-gRNA-complexen zorgt ervoor dat gen KO wordt geïnitieerd vóór stroomafwaartse T-celactivering, wat een strategisch voordeel biedt ten opzichte van retrovirale gemedieerde gRNA-afgifte, die doorgaans preactivering van T-cellen vereist, waardoor de evaluatie van effecten in naïeve T-cellen wordt voorkomen. Bovendien omzeilt deze op nucleofectie gebaseerde methode mogelijke ontwikkelingsproblemen die verband houden met gen KO-dieren.

Na Cas9-gRNA-afgifte beschrijven we protocollen voor het bestuderen van CD4 T-celdifferentiatie in Th1-, Th2-, Th17- en Treg-lijnen met behulp van in vitro polarisatie. Bovendien kan dit protocol worden aangepast aan het gebruik van gengerichte CD4- of CD8 T-cellen voor tal van downstream-toepassingen, waaronder andere T-celactiveringsstudies in vitro en adoptieve overdrachtsstudies in vivo. Het gebruik van CRISPR-Cas9-methoden heeft ons vermogen om de genfunctie in T-cellen te evalueren gestroomlijnd en maakt de routinematige KO van veel interessante genen mogelijk, waardoor onderzoekers worden bevrijd van beperkingen die verband houden met het bestuderen van gen-KO-dieren.

Inleiding

Het gebruik van geclusterde, regelmatig op afstand geplaatste korte palindromische herhaling (CRISPR)-gebaseerde technologieën heeft ons vermogen om genomische DNA-sequenties te manipuleren getransformeerd, waardoor ons vermogen om de genfunctie in talloze biologische systemen te bestuderen aanzienlijk is verbeterd. Met betrekking tot CD4 T-cellen zijn er methoden ontstaan die gebruik maken van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteïne (RNP)-complexen, waardoor efficiënte genknock-out (KO) in primaire naïeve T-cellen mogelijk is die kunnen worden gebruikt voor in vitro en in vivo studies 1,2,3,4. Identificatie van nieuwe vermeende genen die de differentiatie van CD4 T-cellen reguleren, wordt vaak aangedreven door transcriptomische en epigenomische analyses, waarbij nieuwe doelen worden gegenereerd waarvoor weinig of moeilijk te verkrijgen middelen zijn om te onderzoeken, vooral als het gen meerdere weefsels aantast en mogelijk evaluatie vereist met behulp van voorwaardelijke gengerichte muizen. Gentargeting via retrovirale transductie van gRNA's 5,6 is gebruikt om de genfunctie in T-cellen te evalueren, maar vereist T-celactivering voor retrovirale infectie en kan niet worden gebruikt om genen in naïeve T-cellen te targeten. Nucleofectie-afgeleverde CRISPR-Cas9 in naïeve T-cellen biedt een relatief goedkoop en snel alternatief hulpmiddel om nieuwe interessante genen te valideren en te ondervragen voordat wordt geïnvesteerd in tijdrovende en dure muismodellen.

In ons hier beschreven protocol wordt CRISPR-Cas9-gemedieerde genbewerking uitgevoerd met behulp van recombinant Cas9-eiwit gecomplexeerd met gids-RNA (gRNA)-moleculen die via nucleofectie in naïeve CD4 T-cellen worden afgeleverd. Het gRNA bestaat uit twee verschillende componenten, een transactiverend CRISPR-RNA (tracrRNA) en een CRISPR-RNA (crRNA). Functioneel gezien vergemakkelijken tracrRNA-afgeleide sequenties de associatie van het gRNA met Cas9, terwijl de crRNA-sequenties specificiteit bevatten voor doel-DNA-gebieden van belang. Cas9-gRNA-complexen mediëren gerichte dubbelstrengs DNA (dsDNA) breuken, waarbij gRNA's de sequentiespecificiteit van Cas9-endonuclease-activiteit mediëren 7,8. De Cas9-gemedieerde splitsing van dsDNA leidt tot geninactivatie, door het genereren van indelmutaties na niet-homologe eindverbinding in doelcellen9. In dit protocol raden we aan om meerdere gRNA's te gebruiken die gericht zijn op interessante genen om robuuste KO in naïeve CD4 T-cellen te garanderen.

Helper CD4 T-cellen zijn belangrijke spelers in het immuunsysteem en begeleiden immuunresponsen door de productie van een verscheidenheid aan cytokines die de functie van veel immuunceltypen moduleren. Bij stimulatie via de T-celreceptor (TCR) in aanwezigheid van specifieke cytokines, kunnen naïeve CD4 T-cellen differentiëren in verschillende afstammingslijnen van T-helper (Th) CD4 T-cellen, waaronder Th1, Th2, Th17 en regulerende T-cellen (Treg)10,11,12. Het definiëren van deze verschillende CD4 T-cellijnen is de expressie van specifieke afstammingsdefiniërende transcriptiefactoren (TF's) en cytokines (Figuur 1). CD4 T-celdifferentiatie kan worden gemodelleerd met behulp van in vitro polarisatie 13,14,15, met behulp van naïeve CD4 T-cellen geactiveerd via de TCR in aanwezigheid van afstammingsbevorderende cytokines en blokkerende antilichamen die ongepaste afstammingsadoptie voorkomen.

Het combineren van CRISPR-Cas9-gentargeting in naïeve CD4 T-cellen met in vitro CD4 T-celpolarisatie biedt een robuust systeem om de genfunctie in deze cellen te evalueren (Figuur 2). Gezien de wijdverbreide beschikbaarheid van reagentia om CD4-differentiatie te beoordelen door middel van flowcytometrie, kunnen belangrijke aspecten van CD4 T-celdifferentiatie, waaronder TF-expressie en cytokineproductie, gemakkelijk worden ondervraagd met behulp van de hier beschreven protocollen. De identificatie van nieuwe genen die de CD4 T-celfunctie reguleren, verbetert ons begrip van deze cellen, en CRISPR-Cas9-methoden in combinatie met in vitro polarisatie bieden een robuuste modaliteit voor het beoordelen van de genfunctie voordat we ons committeren aan gen-KO-muismodellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Voor alle procedures die hier worden beschreven, hebben we wildtype (WT) C57/BL6J muizen gebruikt. Muizen werden gehouden en behandeld onder specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden in overeenstemming met de richtlijnen van NIAID (protocol LISB-22E) en de commissies voor dierenverzorging en -gebruik van de NIH (Animal Welfare Assurance #A-4149-01).

1. Overwegingen voordat u begint

  1. GRNA-reagentia selecteren
    OPMERKING: Zie de Tabel met materialen voor het verkrijgen van vooraf ontworpen gRNA-reagentia die gericht zijn op het muizengenoom dat in dit protocol wordt gebruikt.
    1. Zoek het gen van interesse (Tabel met materialen, Gewenste crRNA's) en selecteer de top drie van vooraf ontworpen crRNA's (2 nmol-formaat). Verkrijg bovendien negatief controle-crRNA om parallel te gebruiken (Materiaaltabel).
      OPMERKING: De vorming van functionele gRNA's vereist dubbelzijdig crRNA met tracrRNA; verkrijg een tracrRNA-reagens en volg de stappen in rubriek 3.
    2. Ontwerp op maat gemaakte gerichte gRNA-sequenties.
      OPMERKING: Het ontwerp van op maat gerichte gRNA-sequenties valt buiten het toepassingsgebied van dit protocol, maar kan worden uitgevoerd met behulp van openbaar beschikbare tools zoals CRISPick (Table of Materials).
  2. Buffers, media en apparatuur
    OPMERKING: Tenzij anders vermeld, gebruik koude (4 °C) buffers en reagentia.
    1. Bereid de MACS-buffer, FACS-buffer, 0.5% Triton X-100-buffer, 1x permeabilisatiebuffer, volledige RPMI-media en volledige IMDM-media (materiaaltabel) voor voordat u met de procedure begint en bewaar deze bij 4 °C.
    2. Zorg voor naïeve CD4 T-celisolatie en anti-FITC-microbeadkits (materiaaltabel) voordat u met deze procedure begint.
    3. Alvorens met de nucleofectie te beginnen (sectie 4), verwarm (37 °C) 5 ml volledige IMDM-media voor en bereid minimaal 10 ml volledig IMDM aangevuld met IL-7 bij 5 ng/μl opgewarmd tot 37 °C (materiaaltabel). Pas het volume van voorverwarmde media indien nodig aan om rekening te houden met het toevoegen van 125 μL per monster na nucleofectie. Pas het volume van IL-7-bevattende volledige IMDM indien nodig aan op basis van het aantal cellen dat nucleofectie heeft ondergaan (sectie 4).
    4. Voordat u begint met de isolatie van antigeenpresenterende cellen (APC), moet u het mitomycine-C-reagens bereiden door 4 ml steriel H2O toe te voegen aan de injectieflacon van 2 mg mitomycine C (stockconcentratie van 0,5 mg/ml).
      OPMERKING: Voer alle stappen uit in een weefselkweekkap en gebruik steriele aseptische technieken.

2. Naïeve CD4 T-celisolatie

OPMERKING: Naïeve CD4 T-cellen kunnen worden geïsoleerd met behulp van magnetische isolatie of door celsortering. De zuiverheid verkregen door magnetische isolatie is doorgaans 97% en de levensvatbaarheid van cellen is zeer hoog, terwijl elektronisch sorteren de celzuiverheid kan verbeteren ten koste van de levensvatbaarheid van de cel. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van magnetische isolatie, maar kan aan beide scenario's worden aangepast. Zorg ervoor dat de LS-kolommen op de juiste manier zijn voorbereid (Materiaaltabel).

  1. Isoleer de milt en lymfeklieren (lies-, brachiaal-, axiaal- en cervicaal) van de muizen (WT C57BL/6J-muizen die hier worden gebruikt).
  2. Plaats een zeef van 70 μm in een schaal van 60 mm met 5 ml volledige RPMI (Table of Materials) voor elk verwerkt weefsel. Verwerk de lymfeklieren en milt in verschillende schalen om de opbrengst te verhogen. Maal de tissues voorzichtig door het filter met behulp van een zuiger van een spuit van 3 ml. Spoel het filter met 1-3 ml media en breng de eencellige suspensies over in conische buizen van 15 ml.
  3. Herhaal stap 2.2 voor extra lymfeklieren en miltweefsels, indien nodig.
  4. Centrifugeer de eencellige suspensies bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  5. Bereid je voor om de cellen als volgt te tellen.
    1. Voor miltmonsters, aspireer de supernatant op, suspendeer de celpellet voorzichtig in 1 ml ACK-lysisbuffer, incubeer gedurende 2-5 minuten bij RT, voeg dan 2 ml volledig RPMI toe, draai naar beneden, resuspendeer in 5 ml volledig RPMI en tel de cellen.
    2. Voor lymfekliercellen, aspireer de supernatant op, suspendeer de celpellet in 5 ml vers volledig RPMI en tel de cellen.
  6. Voor invoer in de naïeve CD4-isolatiekit mengt u de splenocyten met lymfekliercellen om het gewenste celaantal voor isolatie te bereiken.
    OPMERKING: Doorgaans levert 1 × 108 lymfeklier- en miltcellen van WT-B6-muizen 2-8 × 106 naïeve CD4 T-cellen op.
  7. Centrifugeer de gepoolde milt- en lymfekliercellen bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C, verwijder de supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in het juiste volume MACS-buffer (materiaaltabel) zoals aangegeven in het protocol van de fabrikant (naïeve CD4 T-celisolatiekit).
  8. Volg nauwkeurig het protocol van de fabrikant om naïeve CD4 T-cellen te isoleren door negatieve selectie (Materiaaltabel) met behulp van naïeve CD4+ T-cel Biotine Antibody Cocktail, Anti-Biotine Microbeads en CD44 Microbeads; gebruik LS-kolommen voor deze isolatie en verzamel de cellen in conische buizen van 15 ml.
  9. Centrifugeer de cellen na isolatie bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C, verwijder het supernatant, suspendeer de celpellet opnieuw in 2 ml volledige RPMI-media en tel de cellen.
  10. Bewaar de cellen bij 4 °C tot ze klaar zijn om met nucleofectie te beginnen.

3. Vorming van Cas9-gRNA-complex

OPMERKING: Bereid negatieve controle en genspecifieke crRNA-voorraden voor. We schetsen het gebruik van één uniek crRNA voor negatieve controlecondities en drie unieke crRNA's voor gentargeting. Het gebruik van drie verschillende crRNA's zorgt tegelijkertijd voor KO van de genen van belang.

  1. Resuspendeer de crRNA's en tracrRNA tot 100 μM voorraadconcentraties met behulp van duplexbuffer (Materiaaltabel). Dit komt neer op 10 μL buffer per 1 nmol RNA.
  2. Combineer individuele crRNA's met tracrRNA in een verhouding van 1:1 in steriele PCR-buisjes en meng door te pipetteren. Verwarm tot 95 °C gedurende 5 minuten in een thermocycler. Laat de complexen vervolgens minimaal 10 minuten afkoelen tot RT op een werkblad.
    OPMERKING: crRNA/tracrRNA-duplexen worden vanaf dit punt gRNA's genoemd. Complexen zijn minimaal 6 maanden stabiel als ze bij -20 °C worden bewaard. We maken doorgaans 6 μL gRNA (3 μL crRNA + 3 μL tracrRNA) per run, wat genoeg materiaal oplevert voor ongeveer vijf monsters (1 μL/monster).
  3. Voor gengerichte gRNA's: Voeg in steriele PCR-buisjes 3 μL gRNA's toe (1 μL elk van drie unieke gRNA's per doelwit), 1 μL Cas9-eiwit en 1 μL Duplex buffer (5 μL totaal per monster). Pineer voorzichtig om te mengen en zorg ervoor dat al het materiaal op de bodem van de buis zit. Incubeer 10 minuten bij RT. Synchroniseer de timing van deze stap met nucleofectie (stappen 4.1-4.2).
  4. Voor gRNA met negatieve controle: Voeg in steriele PCR-buisjes 1 μl gRNA, 1 μl Cas9-eiwit en 3 μl duplexbuffer toe (5 μl in totaal per monster). Pineer voorzichtig om te mengen en zorg ervoor dat al het materiaal op de bodem van de buis zit. Incubeer 10 minuten bij RT. Nogmaals, synchroniseer de timing van deze stap met nucleofectie (stappen 4.1-4.2).
    OPMERKING: Het gebruik van 50 pmol gRNA voor negatieve controle (versus 3 x 50 pmol voor de test) is kosteneffectiever en heeft geen invloed op de resultaten.

4. Nucleofectie - Cas9-gRNA-gemedieerde genablatie

  1. Centrifugeer 1-8 × 106 gezuiverde T-cellen bij 500 × g gedurende 5 min, 4 °C per nucleofectiemonster. Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk supernatans.
  2. Resuspendeer de cellen in 20 μl P3-buffer (16,4 μl P3 + 3,6 μl supplement per monster; Nucleofector Kit, Table of Materials) en breng de suspensie over naar PCR-buisjes die de Cas9-gRNA-complexen bevatten. Meng en breng over naar onafhankelijke putjes van een nucleocuvette met 16 putjes (Nucleofector Kit, Table of Materials). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn gevormd bij het overbrengen van cellen naar de cuvet, omdat dit de efficiëntie van de nucleofectie negatief kan beïnvloeden. Tik met de cuvet tegen een werkblad om ervoor te zorgen dat al het materiaal op de bodem van elk putje ligt en vrij is van luchtbellen.
  3. Voer nucleofectie uit met behulp van het DN100-programma van de nucleofector waarnaar wordt verwezen (Materiaaltabel). Voeg onmiddellijk 125 μL voorverwarmde volledige IMDM-media toe aan de nucleocuvetteputjes en breng de cellen over naar microcentrifugebuisjes van 1,5 ml. Spoel elk putje nog een keer af met 125 μL voorverwarmde media om ervoor te zorgen dat alle cellen worden verzameld.
  4. Centrifugeer de cellen bij 500 × g gedurende 5 min, 4 °C, verwijder alle media en suspendeer opnieuw in 200 μL opgewarmde volledige IMDM-media + 5 ng/ml IL-7 (materiaaltabel).
  5. Breng 200 μL van de cellen over naar de kweekplaat en voeg opgewarmde volledige IMDM-media + 5 ng/ml IL-7 toe om het uiteindelijke gewenste volume te maken volgens de plaatgrootte als volgt: 1-2 × 106 cellen per putje op een plaat met 48 putjes (1 ml media per putje), 2-4 × 106 cellen per putje op een plaat met 24 putjes (1,5 ml media per putje), volume, 4-6 × 106 cellen per putje op een plaat met 12 putjes (2 ml media per putje) en 6-10 × 106 cellen per putje op een plaat met 6 putjes (4 ml media per putje). Kweek de cellen in een incubator bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 3 dagen.
    OPMERKING: Afhankelijk van de omzet van het eiwit en de stroomafwaartse test, optimaliseer deze kweekperiode. We hebben een optimale rustperiode van 3 dagen gevonden, maar dit kan op basis van het doelgen worden aangepast tot tussen 1 en 7 dagen met behulp van deze omstandigheden.
  6. Na de kweek in volledige IMDM-media + 5 ng/ml IL-7, suspendeert u de cellen door te pipetteren en oogst u ze in conische buisjes van 15 ml. Centrifugeer de cellen bij 500 × g gedurende 5 min, 4 °C, verwijder het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in 1 ml volledige RPMI-media.
  7. Tel de cellen om het aantal levende naïeve CD4 T-cellen te bepalen dat overeenkomt met de gRNA-nucleofecte cellen van belang.
    OPMERKING: Verwacht tijdens het nucleofectieproces ~ 50% van de invoercellen te verliezen in de loop van dit protocol en pas het aantal naïeve CD4 T-cellen dienovereenkomstig aan. Op dit punt kunt u ook de efficiëntie van de gentargeting in naïeve CD4 T-cellen testen met behulp van een verscheidenheid aan technieken (flowcytometrie, western blot, qPCR of T7EI-assay).

5. Isolatie van antigeenpresenterende cellen (APC)

OPMERKING: Zorg ervoor dat het mitomycine-reagens is bereid, dat zal worden gebruikt om APC's te behandelen na isolatie (Materiaaltabel). Lees het anti-FITC-microbead-protocol van de fabrikant voordat u begint en zorg ervoor dat de LS-kolommen op de juiste manier zijn voorbereid (materiaaltabel).

  1. Isoleer milten van WT-muizen die zijn aangewezen voor APC-isolatie.
  2. Maak eencellige suspensies zoals hierboven beschreven (2.2, 2.5.1)-lyse erytrocyten met ACK-lysisbuffer, suspendeer de celpellet in 5 ml volledig RPMI (4 °C) en tel de cellen.
    OPMERKING: Verwacht na APC-isolatie ongeveer de helft van het aantal invoercellen te verkrijgen, bijvoorbeeld 1 × de 108 invoersplenocyten levert ~40-50 × 106 APC's op. Bereid het gewenste aantal splenocyten voor op isolatie.
  3. Centrifugeer de cellen bij 500 × g gedurende 5 min, 4 °C en suspendeer de celpellet in 800 μL MACS-buffer (Materiaaltabel).
  4. Voeg 4 μL FITC-geconjugeerde anti-CD4- en anti-CD8-antilichamen (Materiaaltabel) toe aan de splenocyten. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C.
  5. Centrifugeer de cellen bij 500 × g gedurende 5 min, 4 °C en verwijder het supernatant. Volg de instructies van de fabrikant om de cellen opnieuw te suspenderen in het aanbevolen volume MACS-buffer en voeg de juiste hoeveelheid anti-FITC-microbeads toe (Materiaaltabel).
  6. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij 4 °C. Centrifugeer de cellen bij 500 × g gedurende 5 min, 4 °C. Resuspendeer de cellen in 500 μl MACS-buffer en leid de cellen door de voorbereide LS-kolom zoals beschreven in het protocol van de fabrikant, waarbij de cellen worden verzameld in een conische buis van 15 ml.
  7. Centrifugeer de cellen bij 600 × g gedurende 5 min, 4 °C, verwijder de supernatant en suspendeer de cellen opnieuw in 2,7 ml steriel 1x PBS.
    OPMERKING: APC's kunnen slecht pelleteren; Gebruik een verhoogde snelheid voor centrifugeren.
  8. Voeg 300 μL mitomycine C-oplossing toe aan de cellen om een eindconcentratie van 50 μg/ml te maken. Meng goed en incubeer bij 37 °C in een waterbad gedurende 30 minuten of gedurende 45 minuten bij 37 °C, 5% CO2 in een broedmachine.
  9. Na de incubatie centrifugeren de cellen bij 600 × g gedurende 5 min, 4 °C en wassen ze met 10 ml steriel 1x PBS. Gebruik vacuüm om zoveel mogelijk supernatans te verwijderen. Herhaal de wasbeurt 2x.
  10. Centrifugeer de cellen opnieuw bij 600 × g gedurende 5 min, 4 °C, verwijder het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in 5 ml volledige RPMI-media (4 °C). Tel de cellen. Bewaar APC's bij 4 °C totdat ze klaar zijn om CD4 T-celdifferentiatie uit te voeren.

6. CD4 T-cel differentiatie

OPMERKING: Dit protocol is ingesteld op het kweken van cellen in een plaatformaat met 48 putjes-2 × 105 naïeve CD4 + 1 × 106 APC per putje - een verhouding van 1:5. Cellen worden gekweekt in volledige IMDM-media. Hier zullen we voorwaarden scheppen voor de differentiatie van Th1-, Th2-, Th17- en Treg CD4 T-cellen; Afhankelijk van de focus van de gebruiker kunnen echter individuele afstammingsvoorwaarden worden gekozen.

  1. Bepaal het aantal cellen in een plaat met 48 putjes die moet worden gebruikt en bereken het aantal cellen dat nodig is voor elk celtype.
    OPMERKING: Voor 10 putten zijn bijvoorbeeld 2 × 106 naïeve CD4 en 10 × 106 APC's nodig om de verhouding van 1:5 te behouden. Als het aantal cellen het toelaat, bereken dan voldoende cellen voor één extra putje om rekening te houden met eventuele pipetteerfouten bij het plateren.
  2. Meng het gewenste aantal naïeve CD4 en APC's bij 1:5, centrifugeer de cellen bij 600 × g gedurende 5 min, 4 °C, verwijder de supernatant en suspendeer de celpellet in 500 μL volledige IMDM-media per putje (bijv. cellen die overeenkomen met 10 putjes in 5 ml media).
  3. Plaat 500 μL stappen van cellen in putjes van een plaat met 48 putjes, zorg ervoor dat elk putje 2 × 105 naïeve CD4 + 1 × 106 APC's bevat.
  4. Bereid voor de gewenste CD4 T-celdifferentiatiecondities 2x cytokine + antilichaammengsels in volledige IMDM zoals beschreven in tabel 1. Voeg 500 μL van het 2x mengsel toe aan de eerder geplateerde 500 μL stappen van cellen om de uiteindelijke concentraties van reagentia 1x te maken.
    OPMERKING: Deze voorbeelden zijn gebaseerd op het maken van 2,5 ml 2x preparaten, genoeg voor vijf putjes voor elke toestand. Nogmaals, als de hoeveelheden reagens het toelaten, maak dan een extra stap van 2x mengen om rekening te houden met de pipetteerfout.
  5. Voeg 500 μL 2x cytokine + antilichaammedia toe aan 500 μL CD4/APC-cellenbevattende putjes om een uiteindelijke concentratie van reagentia van 1x te maken.
  6. Plaats de plaat met 48 putjes in een broedmachine bij 37 °C met 5% CO2 . Kweek de cellen gedurende 72 uur om de CD4-polarisatie te voltooien.
    OPMERKING: Onderzoek de plaat na de kweekperiode om een robuuste groei te garanderen. De media moeten na incubatie een oranje kleur hebben, waarbij gele media duiden op mogelijke celovergroei.

7. Beoordeling van de impact van genablatie op CD4 T-celdifferentiatie

OPMERKING: Bereid voor alle kleuringsstappen een mastermix van antilichamen voor die in de juiste verdunning aan de vereiste kleuringsbuffer worden toegevoegd. Per monster wordt een volume van 50 μL van de antilichaam/buffercocktail gebruikt. Pas specifieke antilichamen aan die worden gebruikt op basis van het experiment. Gebruikers moeten antilichaampanels kiezen die relevant zijn voor hun specifieke experimenten; Hier geven we een sjabloon waarmee we dit kunnen benaderen in de context van de genen waarop we ons hier richten.

  1. Verwijder na CD4-differentiatie voorzichtig 600 μl van het supernatant en suspendeer vervolgens de cellen in elk putje opnieuw door te pipetteren.
  2. Verwijder 200 μL van de cellen uit elk putje en voeg ze toe aan een gelabelde plaat met 96 putjes voor transcriptiefactorkleuring. Pellet de monsters door gedurende 5 minuten bij 500 × g bij 4 °C te centrifugeren, veeg het bovenstaande weg en ga verder met het kleuren van het oppervlak (stap 7.5).
  3. Voor cytokineanalyse restimuleer je de resterende 200 μL cellen met PMA (50 ng/ml), Ionomycine (500 ng/ml) en Golgi Stop (1/2.000 verdunning) in volledige IMDM. Voeg 200 μL van het 2x restimulatiemengsel toe aan elk putje en incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 4 uur.
    OPMERKING: Er moet nog 200 μL in de plaat met 48 putjes zitten; daarom zal het toevoegen van 200 μL van de 2x mix van PMA (2x, 100 ng/ml), Ionomycine (2x, 1 μg/ml) en Golgi Stop (2x, 1/1.000) een uiteindelijke concentratie van 1x creëren (Materiaaltabel).
  4. Begin in de tussentijd met het kleuren van de transcriptiefactor. Voer oppervlakteantigeenkleuring uit door de cellen opnieuw te suspenderen in 50 μL FACS-buffer die de gewenste fluorchroomgeconjugeerde antilichamen per monster bevat (Tabel 2). Incubeer in het donker bij 4 °C gedurende 30 min.
  5. Voeg 150 μL FACS-buffer toe aan elk putje om de kleuringsbuffer af te wassen. Centrifugeer de plaat 5 minuten bij 500 × g bij 4 °C. Veeg de supernatant uit. Herhaal dit voor in totaal twee wasbeurten.
  6. Fixeer de cellen met 100 μL Foxp3-fixatieoplossing (Materiaaltabel) in het donker bij RT gedurende 25 minuten.
  7. Voeg na 25 minuten 100 μL FACS-buffer toe aan elk putje om het fixatief af te wassen. Centrifugeer de plaat 5 minuten bij 500 × g bij 4 °C en veeg het bovenstaande weg. Herhaal dit voor in totaal twee wasbeurten.
  8. Voer intracellulaire kleuring uit door de cellen gedurende minimaal 1 uur bij 4 °C in het donker opnieuw te suspenderen in 50 μL 1x Foxp3-permeabilisatiebuffer die direct geconjugeerde transcriptiefactorspecifieke antilichamen bevat (Tabel 2) (Tabel 2).
  9. Nadat de intracellulaire kleuring is voltooid, voegt u 100 μL FACS-buffer toe aan elk putje. Centrifugeer de plaat 5 minuten bij 500 × g bij 4 °C en veeg het bovenstaande weg. Herhaal dit voor in totaal twee wasbeurten. Resuspendeer de cellen in een eindvolume van 200 ml voor flowcytometrie.
  10. Na PMA/ionomycine/Golgi Stop-restimulatie worden de cellen geresuspendeerd door te pipetteren en wordt 400 μl van elk cytokinemonster overgebracht naar microcentrifugebuisjes van 1,5 ml. Pellet de monsters bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Resuspendeer de celmonsters in 100 μL FACS-buffer en breng ze over naar een plaat met 96 putjes voor oppervlaktekleuring. Pellet de monsters opnieuw door 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C te draaien, veeg de supernatant eraf.
  11. Bereid een cocktail van oppervlaktekleuring met FACS-buffer met fluorescerende antilichamen gericht tegen oppervlakte-antigenen (tabel 2). Resuspendeer de cellen in 50 μL kleuringsbuffer per monster en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker.
  12. Voeg 150 μL FACS-buffer toe aan elk putje om de kleuringsbuffer af te wassen. Centrifugeer de plaat 5 minuten bij 500 × g bij 4 °C. Veeg de supernatant uit. Herhaal dit voor in totaal twee wasbeurten.
  13. Fixeer de cellen in 100 μL 4% PFA (Table of Materials) in het donker bij RT gedurende 25 min.
  14. Voeg 100 μL FACS-buffer toe aan elk putje om het fixeermiddel af te wassen. Centrifugeer de plaat 5 minuten bij 500 × g bij 4 °C. Veeg de supernatant uit. Herhaal dit voor in totaal twee wasbeurten.
  15. Voer intracellulaire cytokinekleuring uit door de cellen gedurende minimaal 1 uur bij 4 °C in het donker opnieuw te suspenderen in 50 μL anti-cytokine-antilichaam dat 0,5% Triton X-100-kleuringsbuffer per monster bevat (Tabel 2).
  16. Nadat de intracellulaire kleuring is voltooid, voegt u 100 μL FACS-buffer toe aan elk putje. Centrifugeer de plaat 5 minuten bij 500 × g bij 4 °C en veeg het bovenstaande weg. Herhaal dit voor in totaal twee wasbeurten. Resuspendeer de cellen in een eindvolume van 200 ml voor flowcytometrie.
  17. Analyseer de transcriptiefactor en cytokine-gekleurde monsters door middel van flowcytometrie.
    OPMERKING: Verwachte flowcytometrieprofielen van de omlijnde kleuringspanelen worden weergegeven in het gedeelte met representatieve resultaten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om te valideren dat een zuivere populatie van naïeve CD4 T-cellen werd verkregen met behulp van ons protocol (sectie 2), gebruikten we flowcytometrie om deze cellen voor en na magnetische isolatie te identificeren. Met behulp van onze aanpak verkregen we een zeer zuivere populatie van levende CD4+TCRb+CD25-CD44-CD62L+ naïeve CD4 T-cellen na isolatie (Figuur 3A). Om te bevestigen dat Cas9...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het integreren van protocollen voor het afleveren van CRISPR-Cas9-complexen in naïeve CD4 T-cellen met methoden voor het bestuderen van CD4 T-celdifferentiatie biedt een robuust hulpmiddel om nieuwe genen te onderzoeken die de biologie van CD4 T-cellen reguleren. Hier bieden we een uitgebreide gids voor het gebruik van in de handel verkrijgbare Cas9- en gRNA-reagentia die eenvoudig zijn om mee te werken. Nucleofectie-gemedieerde afgifte van Cas9-gRNA-complexen in naïeve CD4 T-cellen zorg...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door het Intramural Research Program van NIAID, NIH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 M EDTA, pH = 8.0IPM Scientific11005-016
16% Paraformaldehyde, PFAElectron Microscopy Sciences15710Verdunnen met PBS om 4% PFA fixeeroplossing te maken
1x eBioscience Buffer (1x Permeabiliseringsbuffer)Thermo Fisher Scientific00-5523-00Gebruik permeabiliseringsbuffer uit kit om 1x oplossing te maken
1x PBS, pH = 7.4Quality Biological114-058-101
2-mercaptoethanol (1000x)Gibco21985-023
4D Nucleofector Core UnitLonzaAAF-1003B
4D Nucleofector X UnitLonzaAAF-1003X
60 mm schaalFalcon353002
70 µm nylon gaas zeefFisherbrand22363548
ACK Lysing BufferGibcoA10492-01
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X KitLonzaV4XP-3032Deze kit bevat: P3 Primary Cell Solution, Supplement 1, en 16-well nucleocuvette strips
anti-FITC microbeadsMiltenyi Biotec130-048-701Volg Miltenyi Anti-FITC Microbeads Protocol
anti-muis CD28 (37.51)bioXcellBE0015-1zie Tabel 1 voor stockconcentratie
anti-muis CD3e (145-2C11)bioXcellBE0001-1zie Tabel 1 voor stockconcentratie
anti-muis IFNγ (XMG1.2)bioXcellBE0055zie Tabel 1 voor stockconcentratie
anti-muis IL-12p40 (C17.8)bioXcellBE0051zie Tabel 1 voor stockconcentratie
anti-muis IL-4 (11B11)bioXcellBE0045zie Tabel 1 voor stockconcentratie
BioLite 48-well MutlidishThermo Fisher Scientific130187
Bovine Serum Albumine, BSASigma Life ScienceA3059
Cas9 enzymIDT1081059Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 (10mg/mL) - bevat nucleair lokalisatiesequentie
Complete IMDM + IL-7 MediaComplete IMDM met 5 ng/mL IL-7
Complete IMDM MediaIMDM+GlutMAX, 10% FBS, 1% L-Glutamine, 1% Pen/Strep, 0.1% BME
Complete RPMI MediaRPMI-1640, 10% FBS, 1% L-Glutamine, 1% Pen/Strep, 0.1% BME
CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
Gewensen crRNAs IDTGebruikte vooraf ontworpen van IDT website: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_PREDESIGN  
eBioscience FOXP3/Transcriptie Factor Staining Buffer SetThermo Fisher Scientific00-5523-00De kit bevat drie reagentia: Fixatie/Permeabiliseringsconcentraat (4x), Fixatie/Permeabiliseringsdiluent en Permeabiliseringsbuffer (10x)
FACS Buffer1x PBS, 1% FBS, 1 mM EDTA
Fetaal bovien serum (FBS)VWR Seradigm Life Science97068-085Voor gebruik verwarmen (verwarmen tot 56°C gedurende 45 minuten)
FITC anti-muis CD4 (RM4-5)Biolegend1005101/200 verdunning (0.5 mg/mL stockconcentratie)
FITC anti-muis CD8α (53-6.7)Biolegend1007061/200 verdunning (0.5 mg/mL stockconcentratie)
Golgi StopBD Biosciences51-2092KZ1/2000 verdunning
IMDM (1x) + GlutMAX-1 MediaGibco31980-030
Ionomycin calciumzout van Streptomyces conglobatus (1 mg/mL)Sigma Aldrich10634Aanbevolen eindconcentratie van 500 ng/mL
L-Glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
LS kolommenMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Buffer1x PBS, 0.5% BSA, 1 mM EDTA, filter gesteriliseerd
Mitomycin C (0.5 mg/mL)Millipore SigmaM4287-2MG 
Mouse Naïve CD4 T Cell Isolation KitMiltenyi Biotec130-104-453Volg Miltenyi Naïve CD4 T Cell Isolation Protocol. Deze kit bevat Naïve CD4+ T Cell Biotin Antilichaam Cocktail, Anti-Biotin Microbeads en CD44 Microbeads
Negatieve controle crRNAIDT1072544alternatief voor het ontwerpen van eigen negatieve controle
Nuclease Vrije Duplex BufferIDT1072570
PCR buis stripsUSA Scientific1402-2700
Penicilline StreptomycineGibco15140-023
Phorbol 12-myristaat 13-acetaat, PMA (100 µg/mL)Sigma AldrichP8139Aanbevolen eindconcentratie van 50 ng/mL
ProSeries High Performance 15mL CentrifugebuizenAlkali ScientificPS560015 mL conische buizen
recombinant humaan (h) IL-2Peprotech200-02zie Tabel 1 voor stockconcentratie
recombinant humaan TGF-b1 (HEK293 afgeleid)Peprotech100-21zie Tabel 1 voor stockconcentratie
recombinant muis IL-12p70

Referenties

  1. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. J Exp Med. 215 (3), 985-997 (2018).
  2. Nussing, S., et al. Efficient CRISPR/Cas9 gene editing in uncultured naive mouse T cells for in vivo studies. J Immunol. 204 (8), 2308-2315 (2020).
  3. Albanese, M., et al. efficient and activation-neutral gene editing of polyclonal primary human resting CD4+ T cells allows complex functional analyses. Nat Methods. 19 (1), 81-89 (2022).
  4. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein transfection for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Curr Protoc Immunol. 124 (1), e69(2019).
  5. Huang, B., Johansen, K. H., Schwartzberg, P. L. Efficient CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis in primary murine T lymphocytes. Curr Protoc Immunol. 124 (1), e62(2019).
  6. Huang, B., et al. In vivo CRISPR screens reveal a HIF-1α-mTOR network regulates T follicular helper versus Th1 cells. Nat Commun. 13 (1), 805(2022).
  7. Asmamaw, M., Zawdie, B. Mechanism and applications of CRISPR/Cas-9-mediated genome editing. Biologics. 15, 353-361 (2021).
  8. Li, T., et al. CRISPR/Cas9 therapeutics: progress and prospects. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 36(2023).
  9. Yang, H., et al. Methods favoring homology-directed repair choice in response to CRISPR/Cas9-induced double-strand breaks. Int J Mol Sci. 21 (18), (2020).
  10. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annu Rev Immunol. 28, 445-489 (2010).
  11. Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., Xia, B. CD4+ T cells: differentiation and functions. Clin Dev Immunol. 2012, 925135(2012).
  12. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  13. Rumble, J., Segal, B. M. In vitro polarization of T-helper cells. Methods Mol Biol. 1193, 105-113 (2014).
  14. Yang, W., Chen, X., Hu, H. CD4(+) T-cell differentiation in vitro. Methods Mol Biol. 2111, 91-99 (2020).
  15. Wang, W., Ai, X. Primary culture of immature, naive mouse CD4+ T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100756(2021).
  16. Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
  17. Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
  18. Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
  19. Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
  20. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
  21. Wan, Y. Y., Flavell, R. A. Regulatory T-cell functions are subverted and converted owing to attenuated Foxp3 expression. Nature. 445 (7129), 766-770 (2007).
  22. Williams, L. M., Rudensky, A. Y. Maintenance of the Foxp3-dependent developmental program in mature regulatory T cells requires continued expression of Foxp3. Nat Immunol. 8 (3), 277-284 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CRISPR Cas9 genablatieT celactivatieisolatie van na eve T cellennucleofectie afleveringgen knockoutmuizenin vitro polarisatieTh1 Th2 Th17 Tregadoptieve transferstudies
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen