Hier bieden we een gedetailleerd protocol om live beeldvorming uit te voeren van de asymmetrische deling van germinale stamcellen (GSC's) in de Drosophila ovarium-niche. We gebruiken een transgene lijn die ubiquitair een groen fluorescent eiwit (GFP) tot expressie brengt, een fusie van het spectrosoom-eiwit Par-1.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Uitgebreide live beeldvorming van vrouwelijke Drosophila melanogaster kiembaanstammecellen niches
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Live imaging-methoden maken de analyse van dynamische cellulaire processen in detail en in real-time mogelijk. Het Drosophila-ovarium is een uitstekend model om de dynamiek van een groot aantal ontwikkelingsprocessen, zoals celdeling, stamcelkarakter, differentiatie, migratie, apoptose, autofagie, cellulaire adhesie, enz., in de loop van de tijd te verkennen. Onlangs hebben we een uitgebreide ex vivo-kweek en live imaging van de vrouwelijke Drosophila GSC-niche geïmplementeerd. Met behulp van een Drosophila-lijn die een GFP::Par-1-transgeen bevat als voorbeeld, stelt deze methode de visualisatie van de asymmetrische deling van de GSC's binnen hun niche mogelijk en de beschrijving van de veranderingen in de spectrosomenmorfologie tijdens de celcyclus. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de ex vivo-kweek van Drosophila germaria, waardoor een langdurige visualisatie van de vrouwelijke GSC-niche mogelijk wordt. Belangrijk is dat dit protocol breed toepasbaar is op live imaging GSC's met meerdere fluorescent gelabelde eiwitten van belang die beschikbaar zijn in stockcentra en/of in de Drosophila-onderzoeksgemeenschap.
Inleiding
Live beeldvorming van biologische processen is essentieel om direct experimenteel bewijs te verkrijgen. De combinatie van geavanceerde confocale microscopie en de optimalisatie van methodologieën maakt de exploratie van meerdere biologische gebeurtenissen met hoge precisie mogelijk. Het optimaliseren van stappen in protocollen zoals weefselmanipulatie en dissectie, monstervoorbereiding en -bewaring, en microscopie-acquisitie-instellingen is cruciaal om de betrouwbaarheid en robuustheid van de verkregen resultaten te maximaliseren. Hier presenteren we een protocol om monsters voor langdurige beeldvorming te monitoren, dat speciaal is gericht op Drosophila melanogaster eierstokken. De Drosophila melanogaster eierstok is een uitstekend modelsysteem voor de analyse van een breed scala aan ontwikkelingsprocessen. Onder vele andere bevat dit voortplantingsorgaan van de fruitvlieg Drosophila melanogaster een zeer goed gedefinieerde volwassen stamcelnis. Deze GSC-nis ondersteunt de ontwikkeling van de vrouwelijke gameten tijdens de volwassenheid. De Drosophila eierstokken zijn samengesteld uit ongeveer 18 ovariolen, waarin eicellen worden ontwikkeld in het germinarium. In de punt van elk germinarium worden 2-4 GSC's onderhouden in een somatische cellulaire nis, voornamelijk gevormd door een terminaal filament van 8-10 cellen, een rozet van 5-8 cap-cellen en 2-3 anterieure escortecellen (Figuur 1A). Deze somatische nis voorziet de GSC's van essentiële signalen en fysieke ondersteuning om hun stamcelkarakter te behouden, proliferatie te controleren en differentiatie te voorkomen1,2,3,4,5.
De GSC's delen zich normaal gesproken asymmetrisch om een nieuwe stamcel te genereren die contact houdt met de somatische nis en een dochtercel, de cystoblast (CB), die het directe contact met de somatische cap-cellen verliest en differentieert. GSC's en CB's bevatten een zeer dynamisch en cytoplasmatisch orgaan, het spectrosoom, waarvan de belangrijkste functie de correcte oriëntatie van de mitotische spindel is tijdens mitose6. De CB deelt zich 4 keer met onvolledige cytokinese om 16-cellige cysten te ontwikkelen, waarbij een van de kiemcellen zich specificeert tot de eicel en de andere 15 cellen verpleegcellen worden. Het CB-spectrosoom groeit uit tot een vertakte structuur genaamd het fusoom die de 16-cellige onderling verbonden kiemcellen verbindt. Het spectrosoom is verrijkt met kleine blaasjes en skelet-eiwitten zoals de serine-threonine kinase Par-1 en het membraancomponent Hu-li tai shao (Hts)7. Tijdens de GSC-celcyclus groeit het spectrosoom door de toevoeging van nieuw materiaal en verandert het van vorm, waardoor de identificatie van de G1, S, G2 en M fasen mogelijk is (Figuur 1B)8,9.
We hebben onlangs een ex vivo kweekmethode van het Drosophila germinarium geïmplementeerd die beeldvorming van levende GSC's tot 16 uur mogelijk maakt. Omdat deze cellen gemiddeld eenmaal per 15,5 uur delen8, maakt deze methode het filmen van grote delen van de GSC-celcyclus mogelijk. In combinatie met andere tools heeft onze kweekmethode de beschrijving van spectrosoommorfologie tijdens de GSC-celcyclus en de analyse van de duur van de verschillende celcyclusfasen in vivo mogelijk gemaakt 8 (Figuur 1C). Hier bieden we een gedetailleerd protocol van deze uitgebreide live-imagingmethode aan, ondersteund door een stapsgewijze begeleide video die de methodologie beschrijft (Figuur 2).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Stap 1.4 moet ten minste 2 dagen van tevoren worden uitgevoerd. Stappen 2.1 en 2.2 kunnen 1 dag van tevoren worden gedaan.
1. Pre-experimentele opstelling I
- Bereid 100 µL aliquoten van streptomycine/penicilline antibioticummix (10.000 U/mL penicilline en 10 mg/mL streptomycine) voor en bewaar deze bij -20 °C tot gebruik.
- Bereid 15 mL van de volgende oplossingen met gesteriliseerde zuivere water, bewaar ze bij 4 °C en gebruik ze binnen een maand: Natriumbicarbonaat (NaHCO3) 0,1 M pH 8,0 en 0,1% Tween 20.
- Bereid het volgende kweekmedium en oplossing in een laminaire stromingskast voor om besmetting te voorkomen. Gebruik gesteriliseerde filtertips en buisjes.
- Bereid 2 mL aliquoten van onverdunde foetaal bovien serum (FBS) voor en bewaar deze bij -20 °C tot gebruik onder aseptische omstandigheden.
- Bereid Schneider's Drosophila medium aanvullend met 15% FBS en 0,6% streptomycine/penicilline antibioticummix. Bereid 7 mL aliquoten voor en bewaar deze bij 4 °C. Eén aliquot is genoeg voor twee MatTek platen (zie sectie 2).
- Bereid Ringer's oplossing (128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 35,5 mM Sucrose, 5 mM Hepes in gesteriliseerde zuivere water; pH 6,9). Bereid 1 mL aliquoten voor en bewaar deze bij -20 °C tot gebruik.
- Verzamel 1-2 dagen oude vliegen die constitutief en ubiquitair het Par-1 eiwit gefuseerd met GFP (poly Ubiquitin-mGFP6::par-1 lijn) tot expressie brengen in een nieuwe buis met vliegvoer aangevuld met gistpoeder. Kweek ze 2 dagen bij 25 °C in een incubator voordat je ze ontleedt.
OPMERKING: Deze stap kan worden gedaan met elke fluorescent gelabelde reporter van belang.
2. Coating en voorbereiding van glazen bodemplaat
- Plaats een druppel van 3 µL van een specifiek Cell-Tak hechtmiddel (hierna cell- en weefselhechtmiddel genoemd) in het midden van de dekglas van een 35-mm poly-D-lysine gecoate plaat (glasbodemplaat, zie Tabel van Materialen) zonder handmatig te verspreiden. Gebruik steriele tips.
OPMERKING: Het cell- en weefselhechtmiddel moet bij 4 °C worden bewaard. In het geval van experimenten met twee genetische omstandigheden (typisch, controle- en mutantomstandigheden), plaats twee individuele, goed gescheiden druppels van het hechtmiddel in dezelfde glasbodemplaat. Dit zorgt ervoor dat beide genetische achtergronden onder dezelfde omstandigheden worden afgebeeld. - Voeg onmiddellijk daarna een gelijk volume (3 µL in deze protocolopstelling) van 0,1 M NaHCO3 pH 8,0 voorzichtig toe aan de 3 µL hechtdruppel zoals aanbevolen door de fabrikant en meng door te pipetteren.
- Voor volledige verdamping, incubeer de plaat bij kamertemperatuur (RT) gedurende 20 min en bewaar hem vervolgens bij 4 °C een nacht om de volgende dag te worden gebruikt. Als alternatief, incubeer de voorbereide plaat bij 37 °C gedurende 25 min tot volledige verdamping en ga direct door naar de volgende stap. In beide gevallen, houd de plaat met het deksel. Gebruik steriele tips.
- Laat de voorbereide glasbodemplaat RT bereiken door hem 15-20 min op de werkbank te plaatsen voor gebruik.
- Was de voorbereide plaat 3 keer voorzichtig. Vermijd aanraken en verstoren van de hechtlaag(en). Voeg bij elke wasbeurt 6 µL gesteriliseerde zuivere water toe en verwijder vervolgens het water met een schone tip voor elke van de drie wasbeurten om restanten van de NaHCO3 oplossing te elimineren.
- Laat het water volledig verdampen door de schone en voorbereide plaat bij RT te plaatsen terwijl je dissecteert gedurende 5-10 min met het deksel erop om stofdeeltjes te voorkomen.
3. Drosophila eierstokdissectie en eierstokisolatie en montage
OPMERKING: De eierstokdissectie wordt uitgevoerd in Ringer's oplossing (in plaats van Schneider's medium) zonder FBS om de aanwezigheid van eiwitten die de hechting van het monsterweefsel aan het hechtmiddel kunnen verstoren, te voorkomen.
- Reinig een drie-putjes dissectiedisch, forceps en dissectienaalden met 70% ethanol voordat je begint.
- Voeg een voldoende volume (~200 µL) van Ringer's oplossing toe aan elk van de drie putjes.
- Dissecteer de eierstokken van 5 gist-gevoede vrouwtjes in 200 µL van Ringer's oplossing in de eerste put met behulp van twee paar forceps volgens standaardprocedures10,11. Grijp de Drosophila vrouwtje bij de kruising van de thorax en abdomen met een van de forceps. Trek vervolgens voorzichtig de cuticula bij de achterste buik en trek de buikcuticula totdat de twee eierstokken worden blootgelegd.
- Breng de gedissecteerde eierstokken over naar de tweede put om besmetting met restanten van andere weefsels of puin dat het gevolg is van dissectie te verminderen.
- Verwijder de spierlaag van 15-20 eierstokken met behulp van een stereomicrosco
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met dit uitgebreide protocol voor live-imaging kunnen we de asymmetrische mitose van vrouwelijke GSC's in hun niche registreren zonder schijnbare biologische verstoringen. Hiervoor gebruiken we germaria die overal het GFP::Par-1-eiwit tot expressie brengen, dat onderscheid maakt tussen vijf verschillende spectrosoommorfologieën gedurende de GSC-celcyclus: Rond, Plug, Bar, Fusing en Exclamation point (Figuur 1B,C). In een meer gedetailleerde beschrijving observeerden we dat h...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier presenteren we een protocol om de Drosophila melanogaster GSC-niche gedurende een langere periode, tot 16 uur, te monitoren. De meeste protocollen om biologische processen van Drosophila ex vivo te filmen, zijn gericht op kortere tijdsvensters en er zijn meerdere voorbeelden te vinden voor imaginaire vleugelschijven15,16,17, embryo-gonaden18,19<...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
We danken Acaimo González Reyes en María Olmedo López voor hun nuttige opmerkingen over het manuscript. Dit onderzoek werd ondersteund door PID2021-125480NB-I00 (H. S-G), "Ayudas a la contratación de personal Investigador Doctor" van Junta de Andalucía (J. G-M), "Ayuda a proyectos de investigación precompetitivos" van VI en VII PPIT-Seville University (P. R-R) en "Contrato de Acceso de I+D+i" van VI PPIT-Seville University (P. R-R). We wensen de Company of Biologists Ltd te bedanken voor het vriendelijk verstrekken van rechten om afbeeldingen te delen die zijn aangepast van de originele publicatie (doi:10.1242/DEV.199716).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 9-well glass plate | Corning | 7220-85 | n/a |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | CaCl2·2H2O; Om Ringer's oplossing te bereiden |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cel- en weefselkleefstof gebruikt om cellen of weefselsecties aan te hechten aan vele soorten oppervlakken, inclusief plastic, glas, metaal, FEP-polymeer en biologische materialen. |
| Dumont #5 Forceps | Finescience | 11252-20 | n/a |
| Dumont #55 Forceps | Finescience | 11255-20 | Afmetingen 0,05 mm x 0,02 mm en lengte 11 cm |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | Gekwalificeerd, warmte-geïnactiveerd, E.U.-goedgekeurd, Zuid-Amerikaanse oorsprong |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35GC-1.5-10-C | 35 mm Schaal, Nr. 1.5 Dekglas, 10 mm Glasdiameter, Poly-D-Lysine Gecoat |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | Om Ringer's oplossing te bereiden |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M1028 | MgCl2; Om Ringer's oplossing te bereiden |
| Needle Holder | Roboz | RS-6061 | Lichtgewicht, holle roestvrijstalen handgreep; 4 3/4" Lang. |
| Nikon SMZ18 binoculaire | Nikon | https://www.microscope. healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10.000 U/mL |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911 | KCl; Om Ringer's oplossing te bereiden |
| Schneider's Drosophila Medium | Biowest | L0207 | Celcultuurmedium voor insectencellen |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S8875 | NaHCO3; ≥99,5%, poeder |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9888 | NaCl; Om Ringer's oplossing te bereiden |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | ≥99,5% (GC); Om Ringer's oplossing te bereiden |
| Tungsten Dissection Needle | Roboz | RS-6064 | 0,25 mm, Ultra Fijn, 1 Micron Tip (Pk 10) |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | voor moleculaire biologie, viskeuze vloeistof |
| Yeast powder | Sigma Aldrich | 51475 | n/a |
Referenties
- Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 605-631 (2005).
- Drummond-Barbosa, D. Local and physiological control of germline stem cell lineages in Drosophila melanogaster. Genetics. 213 (1), e234(2019).
- Eliazer, S., Buszczak, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45(2011).
- Rojas-Ríos, P., Guerrero, I., González-Reyes, A. Cytoneme-mediated delivery of Hedgehog regulates the expression of bone morphogenetic proteins to maintain germline stem cells in Drosophila. PLoS Biol. 10 (4), e1001298(2012).
- Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. Concise review: the plasticity of stem cell niches: a general property behind tissue homeostasis and repair. Stem Cells. 32 (4), 852-859 (2014).
- Deng, W., Lin, H. Spectrosomes and fusomes anchor mitotic spindles during asymmetric germ cell divisions and facilitate the formation of a polarized microtubule array for oocyte specification in Drosophila. Dev Biol. 189 (1), 79-94 (1997).
- Huynh, J. R., Shulman, J. M., Benton, R., St Johnston, D. PAR-1 is required for the maintenance of oocyte fate in Drosophila. Development. 128 (7), 1201-1210 (2001).
- Villa-Fombuena, G., Lobo-Pecellín, M., Marín-Menguiano, M., Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. Live imaging of the Drosophila ovarian niche shows spectrosome and centrosome dynamics during asymmetric germline stem cell division. Development (Cambridge). 148 (18), dev199716(2021).
- De Cuevas, M., Spradling, A. C. Morphogenesis of the Drosophila fusome and its implications for oocyte specification. Development. 125 (15), 2781-2789 (1998).
- Wong Li, C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. (1), 52(2006).
- Merkle, J. A. Dissection, fixation, and standard staining of adult Drosophila ovaries. Methods Mol Biol. 2626, 49-68 (2023).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Res. 9, 95(2020).
- Duan, T., Cupp, R., Geyer, P. K. Drosophila female germline stem cells undergo mitosis without nuclear breakdown. Curr Biol. 31 (7), 1602-1610 (2021).
- Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. Live imaging of Drosophila imaginal disc development. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (32), 14217-14222 (2010).
- Dye, N. A. Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs. Methods Mol Biol. 2540, 275-285 (2022).
- Sohr, A., Du, L., Roy, S. Ex vivo Drosophila wing imaginal disc culture and furin inhibitor assay. Bio Protoc. 9 (16), e3336(2019).
- Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche. Dev Biol. 446 (1), 25-34 (2019).
- Gärthner, S. M. K., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment. J Vis Exp. 91, e51868(2014).
- Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling. Dev Cell. 50 (3), 296-310 (2019).
- Jackson, J. A., Imran Alsous, J., Martin, A. C. Live imaging of nurse cell behavior in late stages of Drosophila oogenesis. Methods Mol Biol. 2626, 191-206 (2023).
- Díaz de la Loza, M. C., Díaz-Torres, A., Zurita, F., et al. Laminin levels regulate tissue migration and anterior-posterior polarity during egg morphogenesis in Drosophila. Cell Rep. 20 (1), 121-133 (2017).
- Christophorou, N., Rubin, T., Bonnet, I., Piolot, T., Arnaud, M., Huynh, J. R. Microtubule-driven nuclear rotations promote meiotic chromosome dynamics. Nat Cell Biol. 17 (11), 1388-1398 (2015).
- Bers, D. M. Cardiac excitation-contraction coupling. Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Zielke, N., Korzelius, J., van Straaten, M., et al. Fly-FUCCI: a versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Rep. 7 (2), 588-598 (2014).
- Hinnant, T. D., Alvarez, A. A., Ables, E. T. Temporal remodeling of the cell cycle accompanies differentiation in the Drosophila germline. Dev Biol. 429 (1), 118-131 (2017).
- Hsu, H. J., LaFever, L., Drummond-Barbosa, D. Diet controls normal and tumorous germline stem cells via insulin-dependent and -independent mechanisms in Drosophila. Dev Biol. 313 (2), 700-712 (2008).
- Andersen, D., Horne-Badovinac, S. Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila. Development (Cambridge). 143 (8), 1375-1382 (2016).
- Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Dev Biol. 314 (2), 360-372 (2008).
- Ables, E. T., Drummond-Barbosa, D. Cyclin E controls Drosophila female germline stem cell maintenance independently of its role in proliferation by modulating responsiveness to niche signals. Development (Cambridge). 140, 4267-4276 (2013).
- Lin, H., Spradling, A. C. Germline stem cell division and egg chamber development in transplanted Drosophila germaria. Dev Biol. 159 (1), 140-152 (1993).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
