Niet-invasieve kwantificering van skeletspieren bij kleine dieren met behulp van microcomputertomografie

Samenvatting

Dit protocol maakt gebruik van microcomputertomografie om de kosteneffectieve kwantificering van vetvrije massa mogelijk te maken, inclusief skeletspieren en visceraal weefsel, vetweefsel en skeletweefsel bij kleine dieren. Het maakt onderscheid tussen mager en vetweefsel, wat aanzienlijke voordelen biedt voor biomedisch onderzoek, met name bij translationeel onderzoek bij kleine dieren.

Samenvatting

De omvang, massa en samenstelling van de skeletspieren zijn cruciale eigenschappen voor het bestuderen van metabole en spiergerelateerde ziekten, omdat ze een directe invloed hebben op het begrip van ziekteprogressie en behandelingsresultaten. Het kwantificeren van de mager-, vet- en skeletmassa van een levend dier is belangrijk in metabole, fysiologie-, farmacologische en gerowetenschappelijke studies. Het verkrijgen van nauwkeurige metingen van de lichaamssamenstelling, met name van de vetvrije massa, blijft echter een uitdaging vanwege de inherente beperkingen van conventionele beoordelingstechnieken. Micro-computertomografie (micro-CT) is een niet-invasieve radiologische techniek die visualisatie met hoge resolutie van interne structuren in kleine diermodellen mogelijk maakt. Een gestandaardiseerde micro-CT-methode kan translationeel onderzoek aanzienlijk verbeteren met betrouwbaardere en impactvollere resultaten, met name tijdens verouderingsstudies of op verschillende tijdstippen binnen hetzelfde dier. Ondanks het potentieel ervan belemmert het gebrek aan standaardisatie in beeldacquisitie- en analysemethoden de vergelijkbaarheid van de resultaten van verschillende onderzoeken aanzienlijk. Hierin presenteren we een uitgebreid en gedetailleerd goedkoop protocol voor analyse van de magere massa met behulp van micro-CT om deze uitdagingen aan te pakken en consistentie te bevorderen in onderzoek met kleine diermodellen.

Inleiding

Grootte, massa en samenstelling zijn cruciale eigenschappen van skeletspieren voor het bestuderen van spiergerelateerde en metabole ziektemechanismen¹. Sarcopenie, cachexie, atrofie en myopathieën hebben gemeenschappelijke fenotypes: vermindering van de massa, verandering in samenstelling en verminderde spierfunctie 2,3,4,5. Het kwantificeren van de lichaamssamenstelling in een levend dier blijft echter zeer complex en technisch uitdagend⁶.

De primaire methodologieën voor in vivo beeldvorming en analyse van de lichaamssamenstelling zijn dual-energy röntgenabsorptiometrie (DXA), computertomografie (CT) en magnetische resonantiebeeldvorming (MRI). Deze methoden worden voornamelijk gebruikt om ziekten te screenen en te monitoren die leiden tot vermindering van de vetvrije massa 7,8,9,10,11. DXA is de gouden standaard voor de analyse van de lichaamssamenstelling vanwege de lagere kosten. DXA heeft echter een aanzienlijk nadeel ten opzichte van MRI en CT: het onvermogen om spier- en vetweefsel ruimtelijk op te lossen¹.

MRI maakt gebruik van sterke magnetische velden en radiogolven om gedetailleerde beelden van de interne structuren van het lichaam te genereren¹². Een van de belangrijkste voordelen ten opzichte van CT is de superieure contrastresolutie, waardoor een uitstekend onderscheid mogelijk is tussen verschillende typen zacht weefsel ^1,13,14. In tegenstelling tot CT maakt MRI geen gebruik van ioniserende straling, waardoor het veiliger is voor herhaald gebruik^15,16. MRI is echter duurder en minder toegankelijk, met langere scantijden en hogere onderhoudskosten^13,17. MRI-instrumenten die zijn aangepast voor de analyse van kleine dieren zijn dus meestal niet beschikbaar.

Micro-CT is vergelijkbaar met conventionele CT, maar op maat gemaakt voor kleine structuren en biomedisch onderzoek¹⁸. Micro-CT is een geavanceerde, niet-invasieve radiologische beoordelingstechniek die gedetailleerde visualisatie van interne structuren in kleine diermodellen mogelijk maakt. Micro-CT gebruikt röntgenstralen om gedetailleerde beelden te maken van de interne structuren van het lichaam, waarbij wordt vertrouwd op de differentiële verzwakking van röntgenstralen door verschillende weefseltypen. Tijdens een micro-CT-scan ligt de muis op een tafel die langzaam door een cirkelvormig portaal beweegt. In het portaal draait een röntgenbuis rond de muis en zendt röntgenstralen uit vanuit verschillende hoeken. Detectoren aan de andere kant vangen deze röntgenstralen op nadat ze door het lichaam zijn gegaan¹⁸.

De software van de micro-CT-scanner verwerkt de gegevens vanuit deze meerdere hoeken om tweedimensionale dwarsdoorsnedebeelden (plakjes) van het lichaam te reconstrueren. Door middel van reconstructie kunnen deze plakjes worden gecombineerd om de interne anatomie volledig weer te geven¹⁹. De beelden die door micro-CT-scans worden geproduceerd, zijn gebaseerd op de verschillende gradaties van röntgenverzwakking door verschillende weefsels in het lichaam. Deze verzwakking wordt gekwantificeerd met behulp van Hounsfield Units (HU), een schaal die de radiodichtheid^20,21 standaardiseert. De HU-schaal is fundamenteel voor segmentatie, omdat elke structuur een iets andere waarde heeft.

In dit artikel hebben we HU-waarden gebruikt om nauwkeurig onderscheid te maken tussen bot, mager weefsel en vetweefsel¹. Door te verwijzen naar gevestigde HU-reeksen, zorgden we voor een nauwkeurige analyse en vergelijking van de lichaamssamenstelling. Hierin laten we zien hoe u afbeeldingen kunt verkrijgen met behulp van micro-CT en de toepassing ervan bij het visualiseren en kwantificeren van magere, vet- en skeletmassa.

Protocol

Alle methoden zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Rio de Janeiro (IACUC - UFRJ; A16/23-025-20). Er werden scans uitgevoerd op mannelijke C57BL/6-muizen van 6 en 22 maanden.

1. Voorbereiding van dieren

1. Verdoof muizen met 2% isofluraan in een mengsel van zuurstof dat via verdamping wordt afgegeven. Gebruik een precisieverdamper voor zowel inductie als onderhoud met een mengsel van 100% zuurstof met behulp van een precisieverdamper.
2. Plaats het verdoofde dier in rugligging op de micro-CT-scan met behulp van een muisbed. Zet de muis vast met tape om beweging tijdens het scannen te minimaliseren en plaats deze vervolgens in het portaal.
3. Zorg er tijdens het experiment, dat ongeveer 10 minuten duurt, voor dat het dier een masker draagt om het onder het verdovingsvlak te houden terwijl u de onderhoudsdosis krijgt als dat nodig is.

2. Beeldacquisitie en reconstructie

1. Verkrijg micro-CT-scans van het lichaam met behulp van een preklinisch beeldvormingssysteem met hoge resolutie. Leg in totaal 1.024 projecties vast met een belichtingstijd van elk 470 ms , met behulp van een vliegmodusrotatie bij een spanning van 60 kV en een stroom van 480 μA. Stel het systeem in op een vergroting van 1,25, wat resulteert in een gezichtsveld (FOV) van 94,72 mm voor een totale opnametijd van 8,02 min. Leg afbeeldingen vast met een binning van 1 x 1, wat resulteert in een resolutie van 2.368 x 2.240 pixels.
   OPMERKING: De apparatuur die in dit manuscript wordt gebruikt voor micro-CT-beelden vertoont beperkingen bij het verkrijgen van hoofdafbeeldingen vanwege de overlap met het verdovingsmasker. Bovendien wordt niet de hele staartlengte vastgelegd. Daarom hebben we de kop-en-staartanalyse uitgesloten (zie paragraaf 3).
2. Voer een scan uit met dezelfde parameters op een cilindrisch fantoom van acryl (diameter: 2,5 cm, lengte: 11,5 cm) dat voor de helft is gevuld met gedestilleerd water om de HU voor lucht en water te bepalen. Na voltooiing van de acquisities reconstrueert u de afbeeldingen met behulp van de acquisitiesoftware met instellingen die zijn geoptimaliseerd voor ruisonderdrukking en het Filtered Back Projection (FBP)-algoritme. Reconstrueer zowel dier- als fantoombeelden in batches met behulp van een isotrope voxelgrootte van 147 μm en een matrix van 640.
3. Zuig lucht en water HU af uit het fantoom (ruwe gegevens) met behulp van de software waarnaar wordt verwezen. Converteer de afbeeldingen naar DICOM-bestanden en corrigeer de HU-waarden.

3. Beeldanalyse

1. Een bestand uploaden
   OPMERKING: Micro-CT is een techniek die beelden in de tijd en ruimte vastlegt en een beeldreeks genereert. Daarom is het noodzakelijk om de hele map te openen in plaats van een enkele afbeelding.
   1. Zoek in de linkerbovenhoek van de interface het 3D Slicer-menu , gemarkeerd in een grijsblauwe kleur. Klik op Gegevens toevoegen ().
   2. Wanneer een venster met twee opties verschijnt, selecteert u de eerste optie: Kies Directory om toe te voegen.
   3. Navigeer naar de map met de DICOM-afbeeldingenserie voor doeldieren en klik erop. Met deze actie wordt de map in de software geopend, zodat alle afbeeldingen tegelijkertijd kunnen worden bekeken.
   4. Bekijk de beelden die op drie schermen worden weergegeven. Elk scherm vertegenwoordigt een ander anatomisch vlak: coronaal, sagittaal en transversaal, te herkennen aan respectievelijk de kleuren groen, geel en rood.
2. Segmentatie
   1. Zoek de Segmenteditor () op het bovenste tabblad (Modules) en klik erop.
   2. Klik op de groene knop + Toevoegen om segmenten te maken en het HU-bereik te definiëren.
   3. Maak segmenten voor bot, mager weefsel en vetweefsel door 3x op elk segment te klikken.
   4. Dubbelklik op elk segment om het een naam te geven en in te kleuren volgens de gewenste instellingen.
   5. Stel het HU-bereik voor elk segment in met behulp van de functie Drempel, die zich aan de linkerkant van het venster bevindt. Om dit te doen, zoekt u de functie Drempelbereik en voert u de HU-waarden voor elk weefseltype in: Mager weefsel (-29 tot 225 HU); vetweefsel (-190 tot -30 HU); bot (500 tot 5.000 HU). Klik op de knop Toepassen.
      OPMERKING: Raadpleeg aanvullende figuur S1 voor vergelijkingen van HU-waarden.
   6. Herhaal het segmentatieproces voor elk weefseltype.
   7. Klik op 3D weergeven om een 3D-rendering te genereren.
      OPMERKING: De weergave verschijnt in het blauwe kwadrant van het scherm.
3. Het beeld opschonen
   OPMERKING: Na segmentatie en 3D-rendering moeten externe items worden uitgesloten om ervoor te zorgen dat ze niet worden opgenomen in de volumetrische metingen van mager weefsel, vetweefsel en bot. Het verwijderen van deze artefacten is essentieel om een nauwkeurige analyse te garanderen.
   1. Zoek de tool "Schaar" () in het segmentatiemenu .
   2. Kies het anatomische vlak of de 3D-weergave voor een duidelijker beeld van het object dat moet worden verwijderd.
      1. Als u een anatomisch vlak gebruikt, klikt u op de knop Weergave maximaliseren () op de gekleurde balk van het vlak. Gebruik in het anatomische vlakvenster de muisknop om vooruit of achteruit door de CT-scan te navigeren.
         OPMERKING: Elk venster kan afzonderlijk scrollen.
      2. Voor 3D-rendering gebruikt u de linkermuisknop om langs een as te draaien en de rechtermuisknop om in te zoomen.
         OPMERKING: Met de pijltjestoetsen op het toetsenbord kunt u de afbeelding ook draaien.
   3. Selecteer de tool Schaar en markeer de segmentatie rond het ongewenste object en omcirkel het om het uit de afbeelding te verwijderen. De software verwijdert het object automatisch.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de bewerking Erase Inside is geselecteerd. Als de gebruikte apparatuur afbeeldingen genereert voor een niet-biologisch beeld, zoals de kraal, het verdovingsmiddel of chirurgische apparatuur, is het belangrijk om het te verwijderen. Bovendien, als een anatomisch gebied niet volledig wordt verkregen, is het van fundamenteel belang om een anatomische referentie vast te stellen om deze gebieden te verwijderen die niet volledig zijn verkregen om herhaalbaarheid tussen experimenten te garanderen. Ongewenste objecten moeten in elk vlak worden verwijderd.
   4. Klik op het pictogram voor het herstellen van de weergavelay-out () om terug te keren naar het scherm met de vier vensters, ongeacht het geselecteerde venster.
   5. Herhaal het proces voor alle vensters waarin het object moet worden verwijderd.
4. Segmentatie volume
   1. Kwantificeer na de segmentatie de volumes van de segmenten met behulp van de kwantificeringsfunctie in het vervolgkeuzemenu.
      OPMERKING: Alle segmentaties moeten zichtbaar zijn voor deze actie.
   2. Navigeer naar Kwantificering | Segment statistieken. Klik op Toepassen en wacht tot de software een tabel genereert met waarden voor elke segmentatie. De software biedt twee volumewaarden voor elke segmentatie: Labelmap (LM) en Closed Surface (CS).
      OPMERKING: LM-waarde is over het algemeen geschikt voor het berekenen van segmentvolumes, waarbij het aantal voxels wordt gebruikt vermenigvuldigd met het volume van een enkele voxel. CS Value maakt gebruik van een afgevlakt oppervlaktemodel en integreert volume op basis van driehoekige oppervlakte-elementen. CS sluit beter aan op de anatomische contouren en wordt aanbevolen voor nauwkeurige metingen.
   3. Om gegevens van een nieuw dier te uploaden, slaat u de scène op en sluit u deze in het bestandsmenu .
5. Analyse van de samenstelling van het lichaam
   1. Gebruik de volumemetingen die door de software in cm³ worden geleverd om deze volumes om te zetten in weefselmassa en pas de juiste dichtheid toe voor elk weefseltype. Gebruik de volgende weefseldichtheden gespecificeerd door de International Commission on Radiation Units and Measurements²²: 0,95 g/cm³ (vetweefsel), 1,05 g/cm³ (mager weefsel) en 1,92 g/cm³ (skeletweefsel)².
      1. Om de weefselmassa te berekenen, vermenigvuldigt u het volume (cm³) dat uit de software wordt verkregen met de respectieve weefseldichtheid (g/cm³):
         Vetweefselmassa:_{Volumesegmentatie} X 0,95 = Massa_vet
         Magere weefselmassa:_{volumesegmentatie} x 1,05 =_magere massa
         Massa skeletweefsel:_{volumesegmentatie} X 1,92 = massa_skelet
         Totale massa: Massa_vet + Massa_mager + Massa_skelet = Massa_Totaal
6. Meting van botlengte
   OPMERKING: Om weefselmassa te corrigeren aan de botlengte voor bepaalde analyses, is het noodzakelijk om specifieke botlengtes te verkrijgen.
   1. Keer terug naar het menu Segmenteditor . Verberg de segmentaties van vetweefsel en mager weefsel door op het oogpictogram () naast elk segment te klikken.
      OPMERKING: Alleen de segmentatie die overeenkomt met skeletweefsel mag zichtbaar blijven.
   2. Selecteer de optie Markeringen/werkbalk in- en uitschakelen () in de bovenhoek van het hoofdmenu. Dit opent een secundair menu net onder het hoofdmenu. Zoek de knop Nieuwe lijn maken ().
   3. Nadat u op de knop Nieuwe lijn maken hebt geklikt, navigeert u naar de 3D-reconstructie en identificeert u het bot dat moet worden gemeten.
      OPMERKING: De aanbevolen botten zijn het scheenbeen of dijbeen²².
   4. Zodra het bot is geïdentificeerd, klikt u met de linkermuisknop op het ene uiteinde van het bot en opnieuw op het andere uiteinde van het weefsel. Met deze actie kan de software de botgrootte berekenen.
      OPMERKING: Selecteer voor consistente metingen voor elk dier hetzelfde anatomische gebied van het bot. De heupkop wordt bijvoorbeeld gebruikt als het ene uiteinde en de laterale condylus als het andere uiteinde van het dijbeen.
7. Gegevensanalyse en normalisatie
   OPMERKING: De massagegevens kunnen worden verkregen zoals uitgelegd in paragraaf 3.5 en worden gebruikt zoals ze zijn. Als alternatief kunnen de vet-, vet- en botmassa op twee manieren worden genormaliseerd.
   1. Bereken de verhouding tussen de weefselmassa en het gewicht van het dier op de dag dat de beelden worden verkregen.
      Normalisatie naar gewicht: Massa_mager ÷ lichaamsgewicht
   2. Bereken de verhouding tussen massa en botgrootte (bijvoorbeeld dijbeen of scheenbeen).
      Normalisatie naar dijbeen: Massa_mager ÷_{Grootte dijbeen}
      Normalisatie naar scheenbeen: Massa_mager ÷ Grootte_scheenbeen
      OPMERKING: De normalisatieparameters worden gekozen op basis van de experimentele vraag. Als er veranderingen in de botgrootte worden verwacht (bijvoorbeeld: bij het vergelijken van botremodellering), wordt normalisatie naar lichaamsgewicht voorgesteld (item 3.7.1). Bovendien, als er veranderingen in lichaamsgewicht worden verwacht in uw experimentele vraag, is de lange botgrootte de voorgestelde normalisatieparameter (item 3.7.2).

Resultaten

Een goede anatomische positionering van het verdoofde dier op de beeldvormingstafel zorgt voor consistente en reproduceerbare scanresultaten, wat de effectiviteit van gegevensverzameling benadrukt bij het bereiken van betrouwbare resultaten. Een goede sedatie bij dieren tijdens de beeldvorming, inclusief gespecialiseerde gasafgiftesystemen en verdampers, is van fundamenteel belang voor nauwkeurige anatomische beoordelingen (Figuur 1).

Figuur 2 illustreert segmentatie en weergave in verschillende anatomische vlakken, waarbij sequentiële beelden worden weergegeven in de coronale, sagittale en transversale vlakken. Deze afbeeldingen tonen de geleidelijke segmentatie van skelet-, vet- en mager weefsel, culminerend in een grondig gesegmenteerde weergave die alle weefseltypen integreert, een duidelijk onderscheid tussen weefsels benadrukt en regiospecifieke markeringen aantoont op basis van de geïdentificeerde weefseltypen. Ondanks de beperkingen van de apparatuur die het vastleggen van het hele lichaam uitsluiten, biedt de methode gedetailleerde informatie over de weefselverdeling en -samenstelling op verschillende anatomische vlakken.

Figuur 3 toont 3D-weergaven met de nadruk op weefseltypes - bot (blauw), vetweefsel (geel) en mager weefsel (rood) - en biedt een uitgebreide visualisatie van anatomische structuren. Deze visualisatie onderstreept de effectiviteit van het protocol bij het genereren van gedetailleerde 3D-modellen die essentieel zijn voor anatomische studies.

Tabel 1 geeft de genormaliseerde weefselmassa's (vetvrije massa, lichaamsvet en skeletmassa) weer ten opzichte van het gewicht van het dier op de dag van de beeldvorming. De gepresenteerde waarden zijn het resultaat van vermenigvuldiging van het weefselvolume (in cm³) met de overeenkomstige weefseldichtheid, zoals beschreven in stap 3.5.1.1 van de methodologie.

Tabel 2 geeft absolute waarden voor de lichaamssamenstelling, die de massaverdeling en het percentage mager, lichaamsvet en skeletweefsel van elk dier weergeven. Het stelt ons in staat om de totale hoeveelheid van elk weefseltype te beoordelen en hoe het bijdraagt aan de algehele lichaamssamenstelling van elk exemplaar.

Aanvullende tabel S1 toont de tijd die elke analist nodig heeft om de analyse van de lichaamssamenstelling voor elk dier te voltooien en de variabiliteit in de resultaten tussen analisten. Het beoordeelt of er significante variabiliteit is tussen ervaren (analisten 1, 2 en 5) en onervaren operators (analisten 3 en 4) bij het meten van lichaamssamenstellingsstatistieken zoals vetvrije massa, lichaamsvetmassa en skeletmassa.

Figuur 4 toont een vergelijkende analyse van de lichaamssamenstelling tussen volwassen en oudere proefpersonen. Het onthult een vermindering van het percentage vetvrije massa en een verhoogd lichaamsvet, wat overeenkomt met typische verouderingspatronen. Deze bevindingen benadrukken samen de robuustheid en precisie van het beeldvormingsprotocol bij het leveren van kritische anatomische gegevens, wat essentieel is voor het bevorderen van preklinische onderzoeksmethodologieën.

Figuur 1: Preparaat van dieren. (A) Het apparaat dat wordt gebruikt voor sedatie bij dieren tijdens het beeldvormingsproces, zoals gastoevoersystemen en verdampers; (B) het micro-CT-scansysteem. (C) Het verdoofde dier ligt in rugligging op een muizenbed. Een goede positionering is van cruciaal belang om consistente en reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Segmentatie en visualisatie van plakjes in verschillende anatomische vlakken. (A) Coronaal vlak, (B) sagittaal vlak en (C) transversaal vlak. Van links naar rechts tonen de afbeeldingen een niet-gesegmenteerde scan (grijs), botsegmentatie (blauw), segmentatie van lichaamsvet (geel), segmentatie van mager weefsel (rood) en ten slotte volledige segmentatie, inclusief alle segmentaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: 3D-weergaven. Van links naar rechts geven de afbeeldingen de 3D-weergave van het onderwerp weer, waarbij verschillende weefseltypen worden benadrukt: bot in blauw, lichaamsvet in geel, mager weefsel in rood, en de uiteindelijke afbeelding toont een uitgebreid beeld dat bot, vetweefsel en mager weefsel combineert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Vergelijking van de lichaamssamenstelling tussen volwassen en oudere muizen. Het staafdiagram illustreert de percentages van de lichaamssamenstelling van skeletweefsel (volwassene: 10,5 ± 0,5%; ouderen: 9,9 ± 1,0%, p = 0,19), lichaamsvet (volwassene: 17,2 ± 5,7%; ouderen: 27,9 ± 4,4%, p = 0,03) en vetvrije massa (volwassene: 72,3 ± 5,7%; ouderen: 62,3 ± 3,6%, p = 0,03). De gegevens worden weergegeven als GEMIDDELDE ± SD van de dieren (volwassen: n = 3; ouderen: n = 3). Statistieken werden berekend met behulp van een ongepaarde t-toets met een eenstaartige p-waarde (* p < 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

MAGER
Dier-ID	Magere massa (g)	Gewicht (g)	Normalisatie (gewicht)
Ouderen 1	15.1	37.4	0.4
Ouderen 2	14.4	44.4	0.3
Ouderen 3	14.3	37.7	0.4
Volwassene 1	12.3	29.1	0.4
Volwassene 2	16.5	30.4	0.5
Volwassene 3	16.1	31.7	0.5
LICHAAMSVET
Dier-ID	Lichaamsvetmassa (g)	Gewicht (g)	Normalisatie (gewicht)
Ouderen 1	6.4	37.4	0.2
Ouderen 2	8.2	44.4	0.2
Ouderen 3	5.3	37.7	0.1
Volwassene 1	4.4	29.1	0.2
Volwassene 2	2.7	30.4	0.1
Volwassene 3	3.4	31.7	0.1
SKELET
Dier-ID	Skeletmassa (g)	Gewicht (g)	Normalisatie (gewicht)
Ouderen 1	2.3	37.4	0.06
Ouderen 2	2.3	44.4	0.05
Ouderen 3	2.4	37.7	0.06
Volwassene 1	2.0	29.1	0.07
Volwassene 2	2.3	30.4	0.08
Volwassene 3	2.2	31.7	0.07

Tabel 1: Normalisatie van massa's naar dierlijk gewicht op de dag van de beeldvorming. Zoals uitgelegd in paragraaf 3.7, kan de massa van het weefsel worden genormaliseerd aan de hand van het gewicht van het dier op de dag van het onderzoek. Deze normalisatie is toegepast op mager, vet- en botweefsel op basis van het gewicht van het dier.

Lichaamssamenstelling (g)
	Segmentatie Volume x 1.05	Segmentatie Volume x 0,95	Segmentatie Volume x 1.92	Mager + Vet + Skelet
Dier-ID	Magere massa (g)	Lichaamsvetmassa (g)	Skeletmassa (g)	Totale massa (g)
Ouderen 1	15.1	6.4	2.3	23.8
Ouderen 2	14.3	8.2	2.3	24.9
Ouderen 3	14.3	5.3	2.4	22.0
Volwassene 1	12.3	4.4	2.0	18.6
Volwassene 2	16.5	2.7	2.3	21.5
Volwassene 3	16.1	3.4	2.2	21.7
Lichaamssamenstelling (%)
Dier-ID	Vetvrije massa (%)	Lichaamsvetmassa (%)	Skeletmassa (%)	Totale massa (%)
Ouderen 1	63.6	26.8	9.6	100
Ouderen 2	58.1	32.8	9.0	100
Ouderen 3	64.9	24.1	11.0	100
Volwassene 1	65.9	23.5	10.6	100
Volwassene 2	76.8	12.4	10.9	100
Volwassene 3	74.3	15.7	9.9	100

Tabel 2: Lichaamssamenstelling. (A) de lichaamssamenstelling van de dieren in grammen; (B) het percentage van de lichaamssamenstelling.

Aanvullende tabel S1: Lichaamssamenstelling geëvalueerd door verschillende operators. Vetvrije massa, lichaamsvetmassa, skeletmassa en de tijd die nodig was voor analyse (in minuten) werden voor elke evaluatie geregistreerd. Analisten 1, 2 en 5 waren ervaren operators, terwijl analisten 3 en 4 onervaren waren en alleen het protocol volgden dat in het onderzoek werd beschreven. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S1: Dichtheidsbereik van verschillende biologische en niet-biologische materialen. De figuur illustreert de dichtheidsbereiken van verschillende biologische weefsels en niet-biologische stoffen. De waarden werden uit de literatuur gehaald en aangepast om een optimale weefseldifferentiatie te bereiken. Botten vertonen de hoogste dichtheid, gevolgd door mager weefsel, terwijl lichaamsvet een aanzienlijk lagere dichtheid vertoont. Het apparaat werd gekalibreerd met water als referentie bij een dichtheid van 0. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Evaluatie door middel van tomografie is een effectieve en niet-invasieve methode voor het verkrijgen van gedetailleerde informatie over de lichaamssamenstelling. Met name Micro-CT biedt waardevolle uitkomstmaten voor preklinische studies. Op het gebied van botten heeft micro-CT verschillende toepassingen, aangezien het analyseren van de micro-architectuur²³ en botremodellering²⁴ bijzonder interessant zijn. Het beoordelen van de morfologie van de interne biologische structuur is ook relevant in biomedisch onderzoek, aangezien het analyseren van de dichtheid van het vaatstelsel in specifiek weefsel de functie ervan kan beoordelen en conclusies kan trekken over het metabolisme²⁵. Voor endocriene en metabolische studies van de vetmassa levert het gebruik van micro-CT fundamentele informatie op bij levende kleine dieren^26,27. Bovendien kan micro-CT worden toegepast op andere gebieden, zoals zoölogie en plantkunde, waar het wordt gebruikt om de structuren van kleine insecten en planten te evalueren^28,29.

Een belangrijke beperking van micro-CT zijn de hoge kosten en de beperkte toegang tot beeldanalysesoftware. Bovendien is voorafgaande anatomische kennis, vooral van de anatomie van dieren, essentieel voor correcte metingen. Dit manuscript introduceert de 3D-slicersoftware die in staat is om resultaten te produceren die vergelijkbaar zijn met commerciële alternatieven. Dit systeem vermindert ook de vereiste voor uitgebreide anatomische kennis, omdat het semi-automatisch is³⁰.

De beelden die via micro-CT zijn verkregen en door de software zijn geanalyseerd, toonden aan dat de lichaamssamenstelling van muizen een vergelijkbaar traject volgt als dat van mensen tijdens het ouder worden, gekenmerkt door een toename van het totale vetweefsel en een gelijktijdige afname van de vetvrije massa³¹. Deze bevindingen waren duidelijk bij het vergelijken van volwassen muizen (6 maanden) met oudere muizen (22 maanden).

Vanwege de beperkingen van de apparatuur blokkeert het anesthesiemasker de opname van het hoofd. We konden dus niet het hele hoofd vastleggen en nauwkeurig segmenteren. Als gevolg hiervan hebben we een conventie opgesteld om het atlasbot (C1) als anatomisch referentiepunt te gebruiken, waarbij we onze analyse richten op het gebied onder dit punt in de apparatuur die hierin wordt gebruikt. Daarom zijn alle afbeeldingen boven de C1 geselecteerd om te worden verwijderd. De apparatuur haalde niet de volledige staartlengte. Zo werd de staart in alle analyses uit het basale gebied verwijderd. We raden de gebruiker aan om anatomische punten in te stellen voor geselecteerde uitgesloten gebieden om de reproduceerbaarheid tussen experimenten te behouden.

Dit artikel presenteert een methode voor het analyseren van tomografische afbeeldingen met behulp van een toegankelijk en kosteneffectief protocol. De software maakte met succes onderscheid tussen drie weefseltypen: magere massa, vetweefsel en skeletweefsel. Het was echter niet in staat om skeletspieren te onderscheiden van viscerale organen, een veel voorkomende uitdaging bij de analyse van de lichaamssamenstelling van muizen.

Micro-CT mist het vermogen om visceraal weefsel en skeletspiermassa te differentiëren. Ondanks deze beperking tonen onze resultaten de waarde van de software aan voor het bestuderen van ziekten die de lichaamssamenstelling beïnvloeden, met name ziekten die van invloed zijn op skeletspieren, zoals hypertrofie of atrofie. Het kan worden herhaald als een niet-invasieve test, waardoor longitudinale lichaamssamenstelling kan worden gecontroleerd. Deze mogelijkheid helpt bij het evalueren van beschermende behandelingen en het ontwikkelen van protocollen om veel stofwisselingsziekten te modelleren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3DSlicer, version 5.6.2	3D Slicer platform		Een gratis en open-source software voor beeldanalyse en wetenschappelijke visualisatie.
Amide, version 1.0.1	Amide platform		Een gratis en open-source software gebruikt voor het corrigeren van de Hounsfield Unit waarden in de verwerkte DICOM-beelden.
Amira, version 4.1	Thermo Fisher Scientific		Gebaat om lucht en water Hounsfield Unit waarden uit de ruwe gegevens van de fantoom te extraheren en om afbeeldingen om te zetten in DICOM-bestanden.
Isoforine	Cristália		Isofluraan is een niet-brandbaar vloeibaar verdovingsmiddel voor gebruik in algemene inhalatieanesthesie door verdamping.
Triumph XO subsystem	Gamma Medica-Ideas Flex		Geavanceerd beeldvormingssubsysteem ontworpen voor preklinische kleine dier beeldvorming, dat hoog-resolutie CT en PET capaciteiten biedt voor kwantitatieve en kwalitatieve analyse.