Ondanks aanzienlijke inspanningen om chronische wonden te behandelen, is het succes beperkt gebleven. De cellulaire en moleculaire processen die de normale genezing verstoren en bijdragen aan het ontstaan en de ontwikkeling van chronische wonden worden niet goed begrepen. Als gevolg hiervan is het ontwikkelen van effectieve behandelingen voor deze wonden een uitdaging gebleken. Dit komt voornamelijk door het gebrek aan diermodellen die chronische wonden bij mensen nabootsen en omdat experimenten bij mensen met chronische wonden beperkt zijn. Eerder hebben we een muismodel gepubliceerd om chronische wonden te bestuderen die veel kenmerken delen met diabetische chronische wonden bij mensen. Dit model omvat de aanwezigheid van biofilms die op natuurlijke wijze zijn gevormd uit bacteriën die in de huidmicrobiota en het milieu worden aangetroffen zonder dat het nodig is om externe bacteriën in de wonden te introduceren. Daarom kan dit model mogelijk het fundamentele begrip bevorderen van hoe wonden chronisch worden. Hier presenteren we een update van het oorspronkelijke protocol voor het ontwikkelen van dit muismodel. We hebben ons geconcentreerd op het verminderen van de mortaliteit van muizen van ~30% naar ~5%. We beschrijven ook hoe dit model is gebruikt om het ontstaan en de progressie van wondchroniciteit te begrijpen door gebruik te maken van transcriptomische benaderingen van de volgende generatie, waarbij de dynamiek van de bacteriepopulatie tijdens infectie en de ontwikkeling van biofilm wordt opgehelderd en de waarde wordt aangetoond van het testen van de werkzaamheid van behandelingen, inclusief kleine moleculen. Tot nu toe is dit het enige chronische wondmodel dat niet geneest zonder tussenkomst.
Methodenartikel
Protocol om chronische wonden te maken bij diabetische muizen - een update van het gepubliceerde protocol
In dit artikel
Samenvatting
Inleiding
Dit is een update van een bestaand artikel. Klik hier om de originele versie te zien.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
UPDATES:
Dit is een update van het eerder gepresenteerde protocol1
Alle experimenten zijn voltooid in overeenstemming met en in overeenstemming met de federale regelgeving en het beleid en de procedures van de University of California zijn goedgekeurd door de University of California, Riverside IACUC.
1. Dier
Voeg de volgende opmerking toe aan stap 1.1:
OPMERKING: Als homozygote diabetische muizen rechtstreeks bij leveranciers worden gekocht, huisvest de muizen dan in een conventioneel vivarium om kolonisatie van de huid met normale huidflora mogelijk te maken. Zowel mannetjes als vrouwtjes kunnen worden gebruikt.
Voeg de volgende sectie toe na stap 1.3:
1.4.Genotypering uitvoeren
OPMERKING: Voer genotypering uit na het fokken van het dier zoals eerder beschreven tot stap 1.31. Het volgende protocol is gewijzigd ten opzichte van een eerder gepubliceerde procedure2. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen kunnen al na 14-21 dagen bij het spenen worden gegenotypeerd.
1.4.1. Extractie van ruw DNA
1.4.1.1. Verzamel een oorponsbiopsie van de muis en plaats het weefselmonster in een microcentrifugebuisje.
1.4.1.2. Voeg 180 μL 50 mM NaOH toe en zorg ervoor dat het monster wordt ondergedompeld.
1.4.1.3. Incubeer het monster gedurende 10 minuten bij 95 °C, waarbij de buis om de 5 minuten drukloos wordt gemaakt en vortex.
1.4.1.4. Laat het monster minstens 1 minuut afkoelen op ijs.
1.4.1.5. Voeg 20 μl 1 M Tris HCl bij pH 8,0 en vortex toe.
1.4.1.6. Bewaar de monsters tot gebruik bij -20 °C.
1.4.2. Kettingreactie van polymerase
1.4.2.1 Monteer de volgende primermix in een microcentrifugebuis (Tabel met primers).
OPMERKING: De primers versterken het gebied rond de puntmutatie van LepR.
1.4.2.2. Zet 20 μl polymerasekettingreacties op in PCR-buisjes. Voeg 10 μL 2x Taq polymerase master mix toe (die Taq DNA Polymerase, dNTP's, MgCl2 en KCI bevat), 1 μL primer mix (zie Tabel met Primers), 4 μL ruw DNA-extract en 5 μL H2O.
1.4.2.3. Stel de thermocyclische parameters als volgt in: 94 °C gedurende 2 min; 40 cycli van 97 °C gedurende 30 s, 52 °C gedurende 45 s en 72 °C gedurende 45 s; gevolgd door 72 °C gedurende 2 minuten en 10 °C voor oneindige houdbaarheid.
1.4.2.4. Nadat de PCR is voltooid, voegt u 4 μL 6x DNA Loading Dye toe aan de PCR-producten en scheidt u deze op een 2% agarosegel (figuur 1).
OPMERKING: Elke PCR-reactie genereert 3 PCR-producten: 610 bp gewoon product, 406 bp mutant T-allelproduct en 264 bp wild-type G-allel. Het wildtype genotype bestaat uit de producten 610 bp en 264 bp, het heterozygote genotype bestaat uit alle drie de producten en het db/db-genotype bestaat uit de producten 610 bp en 406 bp.
2. Vivarium en veeteelt
Vervang stap 2.1 door de volgende stap en de opmerking:
2.1 Huisvest db/db-muizen in een conventioneel vivarium (geen barrière-/specifieke pathogeenvrije faciliteit) zodat een microflora zich op de huid van db/db-muizen kan vestigen. Om specifiek mensen te modelleren die lijden aan chronische wonden, moeten geen speciale voorzorgsmaatregelen worden genomen om blootstelling aan natuurlijke ziekteverwekkers in de muizenomgeving te voorkomen, aangezien essentiële ziekteverwekkers van het onderzoek verloren kunnen gaan met strengere vivarium-schone omstandigheden.
OPMERKING: Omdat deze muizen erg groot en diabetisch zijn, is het het beste om tot 3 db/db muizen per kooi te huisvesten voordat u ze gebruikt voor chronische wondexperimenten.
3. Vereisten voor de ontwikkeling van chronische wonden
Voeg de volgende stap toe na stap 3.2
3.3. Houd de wond te allen tijde afgedekt met een transparant verband om uitdroging van het wondweefsel te voorkomen.
5. Instellen van reagens
Na 5.2 de volgende opmerking toevoegen
OPMERKING: Gebruik alleen ATZ van het bedrijf dat wordt vermeld in de materiaaltabel. ATZ van andere bedrijven is niet compatibel met dit model en zal de mortaliteit verhogen.
6. Operatie
6.1. Behandeling en anesthesie
OPMERKING: Een bijgewerkt anesthesieregime wordt hieronder beschreven.
6.1.5. In een open systeem wordt 5% isofluraan toegediend met O2 aan de muis toegediend met een stroomsnelheid (2-3,5 l/min) om anesthesie te induceren. Bewaak continu de status van de muis.
OPMERKING: Zodra de muis bewusteloos is of niet meer beweegt, plaatst u deze op een wit chirurgisch kussen en plaatst u het hoofd in een neuskegel die aan de verdamper is bevestigd om continue toediening van isofluraan tijdens de operatie mogelijk te maken.
6.1.6. In een open systeem wordt tijdens de operatie 1% isofluraan toegediend met hetzelfde debiet en wordt de isofluraanstroom aangepast om de diepte van de anesthesie te behouden.
6.3. Verwonding
6.3.5. Stop de toediening van 1% isofluraan aan de muis aan het einde van de procedure.
7. Behandeling en herstel na de operatie
Vervang stap 7.1 in het oorspronkelijke protocol door de volgende stap en let op:
7.1. Nadat het verband met transparante folie direct na de operatie met behulp van een insulinespuit is aangebracht, wordt MSA plaatselijk op de bovenkant van de wond op de rug van de muis aangebracht door met de naald in het verband met de transparante folie te dringen. Gebruik 150 mg/kg MSA in steriele PBS-oplossing binnen 10 minuten na de operatie. Deze concentratie werd bepaald na een uitgebreid literatuuronderzoek, zoals eerder uiteengezet 3,4.
OPMERKING: MSA heeft de neiging om neer te slaan als het niet constant geagiteerd wordt. Zorg ervoor dat MSA volledig is opgelost in de oplossing voordat u het op de wond aanbrengt om de berekende dosis aan de muis toe te dienen.
Vervang stap 7.4 in het oorspronkelijke protocol door de volgende stap:
7.4. Dien de tweede dosis Buprenex 6 uur na de operatie toe. Doseer de muizen vervolgens periodiek volgens de lokale IACUC-regels gedurende de eerste 48 uur.
OPMERKING: Het wordt niet aanbevolen om formuleringen met verlengde afgifte van pijnstillers te gebruiken die subcutaan moeten worden toegediend in dit muismodel. Het lipidegebonden buprenorfine kan worden gesuspendeerd in de middellange-keten vetzuurtriglyceridenolie (MCT). Hoewel het effect van MCT-olie is getest bij zeer jonge db/db-muizen, zijn de effecten van MCT op oudere of geriatrische obese db/db-muizen niet getest 5,6. Gezien het gewicht van de muizen kunnen grote hoeveelheden pijnstillers die subcutaan in de buurt van de wond worden geïnjecteerd, de cellulaire en moleculaire processen van wondgenezing en chronische wondinitiatie en -ontwikkeling aanzienlijk beïnvloeden. Ook zal deze pijnstiller oplossen in het hoge vetgehalte bij deze muizen en daarom mogelijk niet effectief zijn in het doden van de pijn en kan het giftig worden.
8. Gegevensverzameling, omgaan met de muizen na verwonding, overlevingsstrategieën en aanvullende tips
8.1 Gegevensverzameling
Voeg de volgende stappen toe na stap 8.1.3.
8.1.4. Zorg ervoor dat het voor analyse afgenomen weefsel alleen weefsel bevat dat zich op 2 mm afstand van de wondrand bevindt, zowel bij controle- als bij chronische wonden. Wonden kunnen al 1-2 uur na het aanbrengen van MSA via excisie worden verzameld.
8.1.5. Vang overtollig vocht dat zich uit de wond of het wondexsudaat heeft opgehoopt, op met een steriele spuit door het doorzichtige filmverband door te prikken. Bewaren bij -20 °C voor bacterieel onderzoek of -80 °C voor scheikundig en moleculair onderzoek.
8.1.6 Om hele wondweefsels, inclusief biofilm, na 10 dagen te verzamelen, brengt u 4% PFA in PBS aan op de wond, plaatselijk gedurende 10 minuten voordat u met een tang en een schaar wegsnijdt. Voeg bij het verwijderen van het weefsel een extra wondmarge van 5-10 mm toe, zodat het wondweefsel wordt ondersteund met extra normaal weefsel. Ga door met fixeren in 4% PFA in PBS en daaropvolgende wasbeurten en bereid je voor op inbedding.
OPMERKING: Chronische wonden 10 dagen na de operatie kunnen te kwetsbaar worden om te worden verzameld voor histologie.
8.5. Overlevingsstrategieën
8.5.1. Zorg voor extra hydratatieondersteuning: Controleer of muizen lusteloos worden en niet actief eten of drinken omdat de operatie en het genereren van chroniciteit stressvol zijn. Dien warme (35-38 °C) zoutoplossing subcutaan of intraperitoneaal toe in een volume van 0,25 ml per 10 g lichaamsgewicht gedurende de eerste 48-72 uur na de operatie. Hydratatieondersteuning kan tot 2-3 keer per dag nodig zijn, afhankelijk van hoe lusteloos de muizen zijn. Ook kunnen voedselpellets en watergels in het beddengoed worden geplaatst voor gemakkelijke toegang, hoewel vaker kooiwisselingen nodig kunnen zijn.
8.5.2. Zorg voor extra warmteondersteuning: De overleving na de operatie wordt aanzienlijk verlengd als muizen onmiddellijk na de operatie en in het vivarium in kooien worden geplaatst op een pad dat is verwarmd met circulerend water (93 °C). Plaats de kooi 1/2 op en 1/2 van het kussen om het dier weg te laten gaan van de hitte als het te warm wordt en bovenop het kussen te gaan zitten als het koud wordt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1: Genotypering voor het identificeren van heterozygoten om fokkers te creëren. Een voorbeeldgel toont de resultaten van 8 onbekende muizenmonsters. Steekproef 2 en 5 zijn heterozygoot omdat ze 3 banden bevatten (610 bp, 406 bp en 264 bp). Monsters 1, 3, 4, 6, 7 en 8 zijn wildtypes omdat ze slechts 2 banden bevatten (610 bp en 264 bp).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Bevindingen met behulp van dit model van chronische wonden:
Dit model is gebruikt om verschillende onderzoeken uit te voeren in een poging de cel- en moleculaire mechanismen van chronische wondinitiatie en -progressie te begrijpen. Het is aangetoond dat door het remmen van antioxidante enzymen chronische wonden kunnen ontstaan bij de db/db-muizen. De wonden bevatten aanvankelijk een polymicrobiële gemeenschap die na verloop van tijd ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 mm ear punch | Fisherbrand | 13812201 | 2mm gatdiameter |
| 3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) | TCI | A0432 | |
| 70% ethanol | |||
| Acu Punch 7mm skin biopsy punches | Acuderm Inc. | P750 | |
| agarose | |||
| B6.BKS(D)-Leprdb/J | The Jackson Laboratory | 00697 | Homozygotes en heterozygotes beschikbaar |
| Buprenex (buprenorfine HCl) | Henry Stein Animal Health | 059122 | 0.3 mg/ml, Klasse 3 |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Handschoenen | |||
| Haarverwijderingslotion met kalmerende Aloë en Lanolien | Nair | een chemisch ontharingsmiddel | |
| Warmtetherapie (water) Pomp HTP-1500 | Adroit MedicalSystems | ||
| Verwarmingskussen | Conair | Vochtig Droog Verwarmingskussen | |
| Slangadapters | Adroit MedicalSystems | ||
| Insuline spuiten | BD | 329461 | 0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2") |
| Isofluraan | Henry Schein Animal Health | 029405 | NDC 11695-6776-2 |
| Isofluraan verdamper | JA Baulch & Associates | ||
| Kimwipes | |||
| Maxi-Therm Hyper-Hypothermia Blanket | Cincinnati Sub-Zero | Cat No. 247 | 22”x30” Herbruikbare HeavyDuty Pad |
| Mercaptosuccinic acid (MSA) | Aldrich | 88460 | |
| Muisneuskoker | |||
| Zuurstof | Tank moet compatibel zijn met verdampingssysteem | ||
| Fosfaatbufferoplossing (PBS) | autoclave gesteriliseerd | ||
| Scherpe chirurgische schaar | |||
| Kleine plastic containers | |||
| Natriumhydroxide | |||
| Taq 2X Master Mix | New England Biolabs | M0270L | |
| Tegaderm | 3M | Ref: 1624W | Transparante filmpleister (6 cm x 7 cm) |
| Dunne metalen spatel | |||
| Tri-HCl | |||
| Buisjes | |||
| Pincet | |||
| Wahl haartrimmer | Wahl | Lithium Ion Pro |
Referenties
- Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. J Vis Exp. (151), e57656(2019).
- He, J. -F., Tan, T., Zhu, H. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacol Sin. 39 (1), 117-123 (2018).
- Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. J Diabetes Res. 2014 (562625), (2014).
- Kim, J., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nat Protoc Exch. , (2016).
- Martínez-Carrillo, B. E., et al. Changes in metabolic regulation and the microbiota composition after supplementation with different fatty acids in db/db mice. Int J Food Sci. , (2022).
- Zhang, Y., et al. Medium-chain triglyceride activated brown adipose tissue and induced reduction of fat mass in C57BL/6J mice fed high-fat diet. Biomed Environ Sci. 28 (2), 97-104 (2015).
- Basu, P., Kim, J. H., Saeed, S., Martins-Green, M. Using systems biology approaches to identify signalling pathways activated during chronic wound initiation. Wound Repair Regen. 29 (6), 881-898 (2021).
- Basu, P., Martins-Green, M. Signaling pathways associated with chronic wound progression: a systems biology approach. Antioxidants. 11 (8), 1506(2022).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS and skin microbiome are critical for initiation and development of chronic wounds in diabetic mice. Sci Rep. 9 (1), 19318(2019).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS create a microenvironment that significantly decreases the diversity of the microbiota in diabetic chronic wounds and promotes biofilm formation. Front Cell Infect Microbiol. 10 (259), (2020).
- Kim, J. H., et al. Pseudomonas aeruginosa activates quorum sensing, antioxidant enzymes and type VI secretion in response to OS to initiate biofilm formation and wound chronicity. Antioxidants. 13 (6), 655(2024).
- Kim, J. H., et al. Skin microbiota and its role in health and disease with an emphasis on wound healing and chronic wound development. , Elsevier eBooks. 297-311 (2022).
- Kim, J. H., et al. Targeting anaerobic respiration in Pseudomonas aeruginosa with chlorate improves healing of chronic wounds. Adv Wound Care. 13 (2), 53-69 (2024).
- Jabbari, P., et al. Chronic wound initiation: single-cell RNAseq of cutaneous wound tissue during initiation of chronic wound development. Antioxidants. 14 (2), 214(2025).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen