Een multi-elektrode array platform voor het modelleren van epilepsie met behulp van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide hersenassemboïden

Summary

Dit protocol heeft tot doel dorsaal-ventrale gefuseerde assembloids stabiel te plaatsen op multi-elektrode-arrays voor het modelleren van epilepsie in vitro.

Abstract

Menselijke hersenorganoïden zijn driedimensionale (3D) structuren die zijn afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) die aspecten van de ontwikkeling van de foetale hersenen recapituleren. De fusie van dorsale met ventrale regionaal gespecificeerde hersenorganoïden in vitro genereert assembloids, die functioneel geïntegreerde microschakelingen hebben met exciterende en remmende neuronen. Vanwege hun structurele complexiteit en diverse populatie neuronen zijn assembloids een nuttig in vitro hulpmiddel geworden voor het bestuderen van afwijkende netwerkactiviteit. Multi-electrode array (MEA)-opnames dienen als een methode voor het vastleggen van elektrische veldpotentialen, pieken en longitudinale netwerkdynamiek van een populatie neuronen zonder de integriteit van het celmembraan in gevaar te brengen. Het hechten van assembloids op de elektroden voor langdurige opnames kan echter een uitdaging zijn vanwege hun grote formaat en beperkte contactoppervlak met de elektroden. Hier demonstreren we een methode om assemblages op MEA-platen te plaatsen voor het registreren van elektrofysiologische activiteit over een periode van 2 maanden. Hoewel het huidige protocol gebruik maakt van menselijke corticale organoïden, kan het in grote lijnen worden aangepast aan organoïden die zijn gedifferentieerd om andere hersengebieden te modelleren. Dit protocol stelt een robuuste, longitudinale, elektrofysiologische test vast voor het bestuderen van de ontwikkeling van een neuronaal netwerk, en dit platform heeft het potentieel om te worden gebruikt bij het screenen van geneesmiddelen voor therapeutische ontwikkeling bij epilepsie.

Introduction

Van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) afgeleide hersenorganoïden zijn ruimtelijk zelfgeorganiseerde 3D-structuren die de weefselarchitectuur en ontwikkelingstrajecten in vivo weerspiegelen. Ze zijn samengesteld uit meerdere celtypen, waaronder voorlopercellen (neuro-epitheelcellen, radiale glia, neuronale voorlopercellen, glia-voorlopercellen), neuronen (corticale-achtige excitatoire neuronen en remmende interneuronen) en gliacellen (astrocyten en oligodendrocyten)^1,2. Assembloids vertegenwoordigen de volgende generatie hersenorganoïden, die in staat zijn om meerdere hersengebieden en/of cellijnen te integreren binnen een 3D-cultuur. Ze bieden een nuttig hulpmiddel voor het modelleren van verbindingen tussen verschillende hersengebieden die lijken op de in vivo tegenhangers, het vastleggen van interacties tussen neuronen en astrocyten om volwassen en complexe neurale netwerken beter na te bootsen, en om de assemblage van neurale circuits te bestuderen. Daarom worden assembloids een veelgebruikt hulpmiddel om kenmerken van epilepsie-pathofysiologie samen te vatten, waarbij functionele maatregelen nodig zijn om afwijkende neurale netwerken te ondervragen die ten grondslag kunnen liggen aan de oorzaak van de ziekte 3,4,5,6.

Om interacties tussen corticale glutamaterge neuronen en GABAergische interneuronen te modelleren, ontwikkelden verschillende groepen afzonderlijke organoïden die lijken op de dorsale en ventrale hersenen en smolten ze vervolgens samen tot een multi-regio assembloid 7,8,9,10. Hier werd een eerder beschreven assembloid-cultuurprotocol met regionaal specifieke neurale subtypes toegepast⁹. Een belangrijke barrière is echter het ontbreken van reproduceerbare functionele tests om de activiteit van neurale netwerken tijdens de neurologische ontwikkeling te volgen. Veel functionele tests van de netwerken in organoïden leveren resultaten op die een hoge variabiliteit vertonen tussen batches van differentiaties en cellijnen. Technieken waarbij organoïden worden gesneden of gedissocieerd, veranderen hun inherente netwerken door de synaptische connectiviteit te verbreken⁸.

Multi-elektrode-arrays (MEA) bieden een grootschalig beeld van netwerkactiviteit in de loop van de tijd met een hoge temporele resolutie om elektrofysiologische eigenschappen van organoïden te karakteriseren zonder de kweekomstandigheden of de integriteit van het celmembraan te verstoren¹¹. Vergeleken met de elektrofysiologie van patchklemmen maakt MEA gegevensverzameling met hoge doorvoer mogelijk op basis van grote populaties neuronen in plaats van afzonderlijke cellen. MEA-platforms variëren in hun elektrodedichtheid en komen tegemoet aan verschillende behoeften in hersenorganoïde-onderzoek¹². De veelgebruikte systemen, zoals weergegeven in dit protocol, registreren van 8 tot 64 elektroden per putje 13,14,15. MEA's met hoge dichtheid met maximaal 26.400 elektroden per put maken een verhoogde ruimtelijke en temporele resolutie mogelijk, kwantificering van de voortplantingssnelheid van het actiepotentiaal en combinatie met optogenetische stimulatie 14,16,17. Daarom dient MEA als een krachtig hulpmiddel voor het modelleren van epilepsie in vitro en een translationeel paradigma voor screening op anti-epileptische medicatie.

Een grote uitdaging is het stabiliseren van de grote assemblageblokken op een hydrofoob metalen oppervlak voor langdurige opnames. Dit protocol schetst een gedetailleerde methodologie voor het plateren van intacte assemblages op MEA-platen voor langdurige longitudinale opname, samen met farmacologische tests. Unieke voordelen van het protocol zijn onder meer een stabiele bevestiging van assembloids aan het elektrodeoppervlak zonder verlies van elektrische activiteit, het gebruik van in de handel verkrijgbare neurofysiologische basale media om de functionele netwerkrijping na het plateren te versnellen, de haalbaarheid om stroomafwaartse functionele tests uit te voeren zoals medicamenteuze behandeling, en brede toepassing op organoïden die zijn gegenereerd met andere regiospecifieke protocollen.

Het doel is om een functionele test met hoge temporele resolutie te bieden om netwerkactiviteit te onderzoeken, ziektespecifieke veranderingen te onderzoeken en geneesmiddelen te testen met therapeutisch potentieel bij epilepsie. Er worden video-instructies gegeven voor de meest uitdagende stappen van dit protocol, waarbij de technieken voor het plateren van assemblages op MEA-platen worden getoond, evenals representatieve opnames uit deze culturen.

Protocol

Alle experimentele procedures die hieronder worden gedemonstreerd, zijn uitgevoerd in overeenstemming met de ethische richtlijnen van de University of Michigan Medical School Institutional Review Board en de Human Pluripotent Stem Cell Research Oversight Committee. De iPSC-lijnen die in dit protocol en de representatieve experimenten worden gebruikt, zijn afgeleid van menselijke voorhuidfibroblasten die uit een commerciële bron zijn verkregen. De details van de cellijnen, reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Afleiding van lotspecifieke hersenorganoïden uit iPSC's

OPMERKING: Dit protocol bevat informatie voor het bereiden van 3 putjes in de microwell-kweekplaat van 5 samenvloeiende (~85%) putjes van een plaat met 6 putjes. Het iPSC-onderhoudsprotocol varieert afhankelijk van de cellijnen.

1. Bereid de afzonderlijke celkweekmedia voor met behulp van de samenstelling die in tabel 1 wordt beschreven. Beschermd tegen licht bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken bewaren.
2. Spoel alle putjes die in de microtitercultuurplaat moeten worden gebruikt eenmaal af met 1 ml DMEM/F-12. Voeg 1 ml/putje mTeSR plus + 50 μM Y-27632 toe en draai de plaat 5 minuten op kamertemperatuur op 2000 x g om luchtbellen uit microwells te verwijderen. Bewaar de plaat in een incubator van 37 °C 5% CO₂ .
3. Reinig gebieden van gedifferentieerde iPSC's met een steriele P10-pipetpunt onder de microscoop in een laminaire flow-schone bank. Was celresten van de monolaag af met 1 ml/putje PBS zonder calcium of magnesium.
4. Dissocieer de monolaag in afzonderlijke cellen door 1 ml/putje voorverwarmd celdissociatiereagens toe te voegen en de plaat gedurende 4-7 minuten in een incubator van 37 °C 5% CO_{2 te} plaatsen (afhankelijk van de kenmerken en samenvloeiing van cellijnen) totdat de meeste cellen opstijgen, met zachte beweging om de 2-3 minuten.
5. Voeg 4 ml DMEM/F-12 toe aan elk putje om het celdissociatiereagens te verdunnen en trituer matig met een serologische pipet van 10 ml. Verzamel de celsuspensie van alle putjes van dezelfde lijn in een conische buis van 50 ml.
6. Centrifugeer gedurende 4 minuten op 200 x g bij kamertemperatuur, zuig het supernatans op met een serologische pipet van 10 ml en resuspendeer de cellen in 2 ml mTeSR plus + 50 μM Y-27632. Verwijder de celsuspensie van 10 μl, meng 1:1 (v/v) met trypanblauw en tel de cellen met een geautomatiseerde celteller.
7. Plaat 3 x 10⁶ levende cellen per putje, 3 putjes per lijn. Voeg indien nodig extra mTeSR plus + 50 μM Y-27632 toe om het totale volume op 2 ml/putje te brengen. Draai de plaat 3 minuten op 100 x g op kamertemperatuur en plaats hem terug in de broedstoofmachine.
   OPMERKING: De microtiter-kweekplaat die hier wordt gebruikt, bevat 300 microwells per putje, dus het plateren van 3 x 10⁶ cellen resulteert in 10.000 cellen/microwell.
8. Voer de volgende dag een mediawissel van half volume uit door voorzichtig 1 ml media te verwijderen en langzaam 1 ml mTeSR plus media (zonder Y-27632) toe te voegen met een P1000-pipetpunt. Houd de punt in de buurt van het mediaoppervlak en zuig zo langzaam mogelijk op, om de aggregatiecellen aan de onderkant niet te verstoren.
9. Controleer een dag na het wisselen van media onder een omgekeerde microscoop en er is een duidelijke omtrek van elk aggregaat te zien. Verwijder de originele media uit elk putje met de P1000-pipetpunten.
10. Spuit matig 0,5 ml neurale inductiemedia (NIM) met dorsomorfine (DM) en SB-4321542 (SB) in elk putje met steriele, gesneden P1000-tips. Spuit de in media gesuspendeerde aggregaten onmiddellijk voorzichtig op en breng ze over in een steriele suspensiecultuurschaal van 10 cm. Herhaal dit totdat alle aggregaten zijn overgebracht. NIET tritureren.
11. Voeg indien nodig extra NIM + SB/DM toe om het totale volume op 10 ml/gerecht te brengen. Zet de schaal op een orbitale schudder in een incubator van 37 °C 5% CO₂ om spontane fusie van aggregaten te voorkomen. Markeer de overdrachtsdatum als Dag 0 van de organoïdecultuur.
12. Volg van dag 1 tot het einde het mediarecept in Tabel 1 en de tijdlijn voor mediaverandering⁹ in Figuur 1. Met name organoïden worden op dag 4 verdeeld in twee suspensiecultuurschalen die worden aangeduid als "dorsaal" en "ventraal".
    OPMERKING: Enkele belangrijke tijdstippen om in gedachten te houden: organoïde-expansie begint op dag 6, wanneer media wordt overgeschakeld naar Neural Differentiation Medium (NDM) met EGF/FGF. Neuronale differentiatie wordt vanaf dag 25 ondersteund door NDM + BDNF/NT3, en organoïden worden vanaf dag 46 zonder groeifactoren in NDM onderhouden.

2. Virale etikettering en genereren van assembloids

OPMERKING: Virale etikettering ^7,9 wordt aanbevolen voor het herkennen van de identiteit van elke regiospecifieke organoïde in een assembloid en het toewijzen van elektrofysiologische activiteit van specifieke elektroden aan assembloid-regio's. Het is optimaal als voor elk MEA-putje slechts één organoïde wordt geplateerd. Dit protocol kan ook van toepassing zijn op single organoid plating.

1. Bereken de hoeveelheden virusvoorraad en verdunningsmedia die moeten worden gebruikt: voor elke organoïde die moet worden geëtiketteerd, is 200 μL media met virus nodig. Dorsale organoïden zijn gelabeld met pAAV1-CAG-tdTomato, meestal in een verdunningsverhouding van 1:1000 (v/v), of ongeveer 2 x 10¹⁰ vg/ml. Voor ventrale organoïden wordt 1:300 (v/v), of 2 x 10¹¹ vg/ml pAAV1-mDLX-GFP-virus gebruikt.
   OPMERKING: Verdunningen moeten worden getitreerd tot het gewenste effect en worden beïnvloed door de virale titer.
2. Verwarm de juiste hoeveelheid media tot 37 °C. Ontdooi virusvoorraad opgeslagen bij -80 °C op ijs. Label voldoende platen met 48 putjes voor alle geëtiketteerde organoïden.
3. Doe een bekerglas met 10% bleekmiddel in de kap. Verdrijf alle materialen die in contact komen met virussen in de beker. Verdun de volledig ontdooide virussen in kweekmedia in aparte conische buisjes van 15 ml, gelabeld als "dorsaal" en "ventraal".
4. Verplaats organoïden van dag 56 van kweekschaaltjes naar borden met 48 putjes. Eén organoïde per putje wordt aanbevolen om spontane fusie in statische cultuur te voorkomen. Verwijder zoveel mogelijk achtergebleven kweekmedia.
5. Voeg respectievelijk 200 μl virus-mediamengsel toe aan elk putje. Zet de borden terug in de incubator van 37 °C 5% CO₂ . Kantel de platen op een steriele, lege plaat om virale deeltjes naar de bodem van de put te concentreren en de transductie-efficiëntie te optimaliseren.
   OPMERKING: Virale deeltjes hebben de neiging om naar de bodem van de conische buis van 15 ml te zinken, dus het is erg belangrijk om de buis regelmatig om te keren om virussen met media te mengen voordat ze aan elk putje worden toegevoegd om een uniforme transductie-efficiëntie voor alle organoïden te garanderen.
6. Voeg de volgende dag (dag 57) een extra 800 μL kweekmedia toe aan elk putje om het totale volume op 1 ml/putje te brengen.
7. Voer drie dagen later (dag 60) een volledige mediaverandering uit op de gelabelde organoïden. Bleekmiddel alle materialen die in contact komen met virale deeltjes.
8. Controleer drie dagen later (dag 63) de fluorescentie-expressie onder een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop. Als het signaal sterk is, begin dan met het genereren van assembloids (zie stap 2.9).
9. Spoel alle geëtiketteerde organoïden twee keer af met 1 ml/putje PBS om kruisbesmetting door resterende virale deeltjes tijdens organoïdefusie te voorkomen. Gebruik een gesneden P1000-pipetpunt om één ventrale organoïde over te brengen naar elke dorsale put (of vice versa) en label de assemblageplaat dienovereenkomstig opnieuw. Kantel de platen zoals in stap 2.5 voor een betere fusie.
10. Voer 3 dagen na de fusieprocedure (dag 66) voorzichtig een mediawissel van half volume uit zonder de assemblages te onderbreken. Het duurt meestal ongeveer een week om stabiele assembloids te vormen (dag 70).

3. Plaatsen van assembloids op voorbehandelde MEA-platen

OPMERKING: Het duurt ten minste 4 dagen om de oppervlaktevoorbereidingsprocedures van MEA-platen te voltooien voordat assemblages worden geplateerd. Om tijd te besparen, kunnen het samensmelten van dorsale en ventrale organoïden (d.w.z. stap 2.9) en MEA-voorbehandeling parallel worden uitgevoerd.

1. Bereid reagentia voor op voorbehandeling en coating van het oppervlak.
   1. Om 1% wasmiddel/enzymoplossing te bereiden, lost u 0,5 g enzym-/wasmiddelpoeder op in 50 ml gedeïoniseerd water. Draai grondig totdat het poeder volledig is opgelost. Steriliseer de oplossing met een steriel vacuümfilter aan de bovenkant van de buis in de bioveiligheidskast voordat u deze aan MEA-putten toevoegt. Maak voor elk gebruik vers.
      OPMERKING: Het wasmiddel/enzym steriliseert het MEA-oppervlak, verwijdert eventuele resterende oliën uit het MEA-productieproces en zorgt ervoor dat het oppervlak hydrofiel genoeg is om interacties met de hydrofiele verbinding polyethyleenimine (PEI)¹⁸ te bevorderen.
   2. Om een 0,07% PEI-oplossing¹⁹ te bereiden, begint u met het maken van een bouillon 7% PEI-oplossing door 1 ml 50% PEI-oplossing te mengen in een conische buis van 15 ml met 6 ml 1x boraatbuffer. Verdun 1 ml 7% PEI-oplossing in 99 ml 1x boraatbuffer om de uiteindelijke werkconcentratie te bereiken. Filtreer voor sterilisatie voor gebruik door een filtereenheid van 0,22 μm in de bioveiligheidskast.
      OPMERKING: PEI, een positief geladen polymeer, wordt gebruikt in het primaire coatingproces om de hechting van een negatief geladen secundaire coating met Basement Membrane Matrix (BMM) en de assembloids²⁰ te vergemakkelijken. Verwijder 1 ml 50% PEI door in de conische buis te gieten in plaats van pipetteren, aangezien de bouillonoplossing erg stroperig is. De benodigde hoeveelheid kan gemakkelijker worden gemeten door deze in een conische buis te wegen, en de 50% PEI-oplossing heeft een dichtheid van 1,08 g/ml. De PEI-oplossing met 7% voorraad kan maximaal een maand worden bewaard in aliquots van 1 ml bij -20 °C. Voer alle volgende stappen uit in de bioveiligheidskast.
2. Rekening houdend met de grootte van elke assembloid, worden MEA-platen met 6 putjes en 64 elektroden per putje gebruikt om één assembloid per putje te bevatten. Bereken het aantal MEA-platen dat nodig is voor de experimenten om ervoor te zorgen dat er voldoende biologische replicaten zijn.
3. Voeg 1 ml 1% detergent/enzymoplossing toe aan elk putje van een steriele MEA-plaat. Zorg ervoor dat u de elektroden niet beschadigt met de pipetpunt. Als u een vacuümaspirator gebruikt voor wasbeurten, zorg er dan voor dat de punt de elektrode-array niet raakt. Incubeer in een incubator van 37 °C gedurende 2 uur.
4. Verwijder het wasmiddel/enzym en was elk putje vijf keer met 1,5 ml steriel gedeïoniseerd water. Aangezien wasmiddel/enzym niet biocompatibel is, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de resterende chemicaliën volledig worden afgewassen.
5. Vul elk putje met 1 ml kweekmedia voor de preconditionering. Zet de platen 2 dagen terug op 37 °C 5% CO₂ incubator. Het blootstellen van het MEA-oppervlak aan celkweekomstandigheden bevordert de celhechting.
6. Verwijder de kweekmedia en bedek de MEA-elektroden in elk putje met 50 μL 0,07% PEI-oplossing voor de primaire coating. Incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur.
7. Zuig de PEI-oplossing volledig op. Was elk putje met 1 ml steriel gedeïoniseerd water. Voer in totaal 3 snelle wasbeurten uit. Droog de borden 15 minuten op kamertemperatuur in de bioveiligheidskast met het deksel eraf.
8. Bedek het elektrodegebied in elk putje met 50 μL 1:20 (v/v) BMM verdund in kweekmedia voor secundaire coating. Zet de MEA-platen een nacht terug in de incubator van 37 °C. Voeg steriel water toe aan de compartimenten rond de putten om te zorgen voor voldoende vochtigheid tijdens het coaten.
9. Aspireer de volgende dag verdunde BMM met een vacuüm en laat een dunne laag op het oppervlak achter. Als er een dikke laag is gevormd, spuit dan het contactgebied van de elektrode krachtig in met kweekmedia met behulp van een P1000-pipetpunt. Was zo vaak als nodig is om eventuele dikke brokken te verwijderen.
   OPMERKING: Resterende dikke BMM kan het contact van de elektrode met de cellen verstoren.
10. Verzamel een assembloid met een breed gesneden P1000-punt en plaats deze op de elektroden in een putje terwijl u zo min mogelijk media overbrengt.
11. In een laminaire stromingskap onder een dissectiescoop duwt u de assembloid voorzichtig met een steriele dissectienaald of P20-tip naar de gewenste locatie, waar zowel dorsale als ventrale organoïden grotendeels kunnen worden bedekt met elektroden. Gebruik een P20-punt om vloeistof rond het assembloid te verwijderen. Herhaal dit voor alle assembloids of een subset, wat binnen een paar minuten kan worden gedaan.
    OPMERKING: Probeer het MEA-oppervlak NIET aan te raken of te krassen met de pipetpunt en/of naald. Probeer NIET in de assembloid te prikken of te scheuren met pipetpunten. Maak het plateren zo snel mogelijk af om te voorkomen dat de organoïde volledig uitdroogt.
12. Incubeer de assembloids bij 37 °C gedurende 10 minuten (zonder media). Breng de platen over van de incubator naar een laminaire stromingskap en breng 2-3 kleine druppels 1:50 BMM verdund in kweekmedia aan op de assembloids onder een dissectiescoop. Incubeer bij 37 °C gedurende nog eens 30 min.
13. Voeg voorzichtig 3 druppels kweekmedia toe in de buurt van de assembloids onder een dissectiescoop. Hierdoor blijven de organoïden gehydrateerd. Incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur.
    OPMERKING: Als de assemblage in volgende stappen beweegt of drijft, moet het plateren opnieuw worden gestart vanaf stap 3.11.
14. Voeg elk uur voorzichtig 20-50 μL celkweekmedia toe aan elk putje onder een dissectiescoop. Dit kan in de loop van een dag worden gedaan. Het doel is om aan het eind van de dag een totaal volume van ten minste 250 μl te bereiken.
15. Controleer de volgende dag of alle assembloids zijn bezinkt en gestabiliseerd onder de dissectiescoop. Voeg 750 μL extra kweekmedia toe om een totaal volume van 1 ml/putje te bereiken. Laat de borden minimaal 2 dagen met rust.
16. Voer zorgvuldig wekelijkse mediaveranderingen uit door 500 μL kweekmedia te verwijderen en 700 μL neurofysiologische basale media toe te voegen. Het extra volume aan toegevoegde media houdt rekening met verdamping en kan worden aangepast afhankelijk van de hoeveelheid verdamping die de gebruikte MEA-plaat heeft. Voeg indien nodig steriel water toe rond de putten om verdamping uit de MEA-putten te minimaliseren.

4. MEA-registratie en gegevensanalyse

1. Begin ongeveer een week na het overschakelen naar neurofysiologische basale media met MEA-registratie (meestal rond dag 78).
2. Wacht tot de opnamekamer de ingestelde temperatuur heeft bereikt (meestal 37 °C). Breng een plaat over naar het apparaat en laat ze ten minste 5 minuten balanceren voordat u opneemt.
3. Live hardware-instellingen
   1. Stel de bemonsteringsfrequentie in, d.w.z. de snelheid waarmee de ruwe spanningsgegevens worden geregistreerd. De standaardinstelling (12,5 kHz) wordt aanbevolen.
   2. Geef de analoge modus op (meestal Neural Spikes, zoals in dit geval) om de hardwarebandbreedte en versterking voor bepaalde toepassingen te configureren. Voor visuele monitoring van activiteit tijdens het opnemen, gebruikt u de modules Spike Detector en Burst Detector .
      OPMERKING: De analoge instellingen zijn van invloed op de manier waarop de onbewerkte voltage gegevens worden geregistreerd en kunnen niet worden gewijzigd nadat de gegevens zijn opgenomen.
   3. (Optioneel) Pas een digitale hardwarefilter toe op de opnamegegevens. Laagdoorlaatfilteropties omvatten een 2 kHz of 3 kHz Kaiser Window. Standaardinstellingen kunnen worden gewijzigd na het selecteren van de analoge instellingen.
   4. Stel in op refereren op mediaan (standaard), wat ten zeerste wordt aanbevolen voor neurale opname, zoals in dit geval. Referencing verbetert de kwaliteit van signalen met een lage amplitude door de ruisinterferentie die vaak voorkomt bij groepen kanalen te verminderen.
      OPMERKING: De bovenstaande parameters kunnen naar behoefte worden aangepast, afhankelijk van de activiteit die in de assembloids wordt waargenomen, maar moeten consistent worden gehouden voor alle opnames in een bepaald experiment.
4. Voeg plaatplattegronden en beschrijvingen toe (indien nodig). Importeer de plaatkaart van de eerdere opname voor dezelfde plaat om consistentie te garanderen en de verwerking van batchgegevens te vergemakkelijken. Zorg ervoor dat de bestanden de juiste naam hebben.
5. Als de signalen er goed uitzien (minimale ruis en artefacten), noteer dan de onbewerkte gegevens. Over het algemeen is 2-5 minuten opname voldoende voor een representatieve steekproef.
6. Registreer één of twee keer per week elektrische activiteit in de lengterichting, gedurende 5-15 minuten, afhankelijk van het experimentele ontwerp. Wacht ten minste 24 uur na elke mediawissel voordat u met de volgende opnameronde begint, aangezien de elektrische activiteit onmiddellijk na elke mediawissel afneemt.
7. (Optioneel) Als elektrische activiteit moet worden gelokaliseerd en onderscheid moet worden gemaakt tussen dorsale en ventrale organoïden, of als de activiteit van elke elektrode afzonderlijk moet worden geanalyseerd, verkrijg dan na elke opname een beeld van elke assembloid onder helder veld en epifluorescentie (Figuur 2B).
8. Pas bij het analyseren van de gegevens een analyseconfiguratie toe, inclusief een piek-/burst-detector en een compiler voor statistieken. Gebruik een adaptieve drempelwaarde die is ingesteld op 5,5-6 standaarddeviaties ten opzichte van de basislijn voor het detecteren van pieken. Identificeer bursts als een activiteit met ≥5 pieken in 100 ms¹³. Definieer netwerkactiviteit wanneer meer dan 25% van het totale aantal actieve elektroden binnen 100 ms wordt afgevuurd met een minimum van 50 pieken per netwerkburst^13,14.
   OPMERKING: Deze parameters worden gemoduleerd afhankelijk van de bakeigenschappen van een specifiek experiment. Om de gevoeligheid voor pieken met een lage amplitude te vergroten, kan de adaptieve drempel voor piekdetectie worden verlaagd. Voor burst-detectie kunnen verschillende methoden worden gebruikt en kunnen de parameters worden aangepast om bursts van spikes te detecteren die aanzienlijk verschillen van de achtergrondactiviteit. De parameters van de netwerkactiviteit kunnen worden gemoduleerd naar een lager percentage elektroden, vooral wanneer assembloids niet het hele veld van elektroden bestrijken. Alle parameters moeten consistent blijven voor de duur van een experiment om longitudinale vergelijkingen mogelijk te maken.
9. Voer de module Statistics Compiler uit voor batchverwerking terwijl u de opgenomen gegevens opnieuw afspeelt. Exporteer geavanceerde metrische gegevens en/of piekuitvoerbestanden voor geavanceerde analyse.
   OPMERKING: Geavanceerde metrische uitvoer bevat .csv bestand met elektrode-, put- en groepsgemiddelden voor gemiddeld afvuren, barsten en synchronie. Spike-uitvoer (.spk-bestand) bevat golfvormsporen voor alle spikes, die kunnen worden geïmporteerd naar andere platforms voor geavanceerde analyse, bijvoorbeeld spikesortering.

5. Farmacologische test op het eindpunt en recycling van platen

OPMERKING: Testen op medicamenteuze behandeling kunnen worden uitgevoerd nadat assembloids volwassen genoeg zijn en de elektrische activiteit piekt. Registratie van de baseline/activiteit vóór de behandeling en de activiteit na de behandeling moet op dezelfde dag worden uitgevoerd.

1. Voeg 1-10 μL geneesmiddeloplossing toe bovenop het assembloid en draai de plaat voorzichtig rond om een uniform mengsel te garanderen. In sommige gevallen wordt een langere incubatietijd in geneesmiddelbevattende media aanbevolen, bijv. synapsgerelateerde geneesmiddelbehandelingsassays met glutamaat/GABA-receptoragonisten/-antagonisten (Figuur 2E) (zie de sectie Resultaten voor details).
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een kleine hoeveelheid geneesmiddeloplossing aan elk putje toe te voegen om een uiteindelijke werkconcentratie te bereiken, aangezien een grote volumeverandering de elektrische activiteit in het algemeen tijdelijk zal verminderen. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de toevoeging van een voertuig waarin de betreffende geneesmiddelen zijn opgelost, geen significante veranderingen in elektrofysiologische parameters veroorzaakt.
2. Voer voldoende PBS-wasbeurten uit (meestal 3) en spoel medicijnen uit na de opname na de behandeling. Voer de volgende dag na het wegspoelen van het medicijn een extra opname uit om te zien of de elektrische activiteit terugkeert naar het basisniveau.
3. Optioneel, krachtig pipetteer media om de assembloids aan het einde van de opnames van de MEA-plaat te scheiden om verdere experimenten uit te voeren, bijv. live beeldvorming, fixatie met 4% paraformaldehyde voor immunokleuring van het hele mont, of lysis voor RNA- of eiwitextractie.
4. Gebruik voor analysedoeleinden ten minste drie technische en biologische replicaten voor elke aandoening. Druk elektrofysiologische gegevens uit als een gemiddelde van n ≥ 3 replicaten.
5. Om de plaat aan het einde van de experimenten te recyclen, zuigt u de resterende media op na het verwijderen van de bijgevoegde assembloids. Eenmaal wassen met steriel PBS. Bedek het metaalgebied volledig met 200 μL/putje 0,25% trypsine-EDTA en plaats de plaat een nacht terug in een incubator van 37 °C.
6. De volgende dag trypsine aspireren, twee keer wassen met 70% steriele ethanol en drie keer met steriel gedeïoniseerd water.
7. Laat de plaat 15 minuten aan de lucht drogen in de bioveiligheidskast met het deksel eraf of totdat deze helemaal droog is. Sluit de schoongemaakte plaat af in een plastic zak en bewaar deze bij kamertemperatuur tot toekomstig gebruik.
   OPMERKING: Een goed gereinigde MEA-plaat kan drie keer worden hergebruikt zonder aanzienlijk verlies van opnamekwaliteit.

Results

Menselijke dorsaal-ventrale assembloids werden geplateerd op een MEA-plaat met 6 putjes (n = 6 per differentiatie, 3 differentiaties), waarbij elk putje 64 elektroden bevatte (Figuur 2A). Negen van de tien assembloids die gepland waren voor longitudinale opname waren in vitro gedurende meer dan 50 dagen stevig aan de elektroden bevestigd (Figuur 2D). 6 van de 8 assembloids die bestemd waren voor farmacologische tests werden met succes afgehandeld tijdens de wash-outfase met netwerkactiviteit die geschikt was voor de ontwikkelingsfase (Figuur 2E). Fasecontrast- en fluorescentiebeelden van één representatief putje worden getoond (Figuur 2B), waarin de AAV-CAG-tdTomaat-gelabelde dorsale en AAV-mDLX-GFP-gelabelde ventrale organoïden gemakkelijk kunnen worden onderscheiden ^7,9.

Activiteit van neuronen op een MEA kan worden geanalyseerd om de algehele cellulaire prikkelbaarheid en netwerkactiviteit te beoordelen, aan de hand van een verscheidenheid aan parameters. Totale vuursnelheden in de cultuur geven informatie over cellulaire en netwerkprikkelbaarheid, terwijl de frequentie van gesynchroniseerde uitbarstingen over meerdere elektroden het bereik van synaptisch actieve netwerken van neuronen aangeeft. Meerdere herhaalde pieken die gedurende een korte periode over ruimtelijk verschillende elektroden optreden (netwerkbreuken) kunnen dienen als een biologische correlatie met aanvalsachtige activiteit, hoewel assembloids op MEA's beperkt blijven in vergelijking met een heel organisme dat bonafide aanvallen kan hebben. Figuur 2C illustreert de netwerkbarstpatronen van assembloids gekweekt in commercieel verkrijgbare neurofysiologische basale media op dag 84 en 91, met een verhoogde barstduur op het latere tijdstip, waarschijnlijk als gevolg van functionele rijping van de neuronen. In dit geval neemt de cellulaire en netwerkactiviteit geleidelijk toe vanaf de dag dat assembloids worden geplateerd, meestal met een piek op dag 92 en bijna vervagend op dag 125 (Figuur 2D). De verhoogde rijping in het latere stadium draagt waarschijnlijk bij aan de langere gesynchroniseerde burst-duur op het latere opnametijdstip.

Bicuculline, een GABA A-receptorantagonist, versterkt de gesynchroniseerde netwerkactiviteit van de assembloids, zoals blijkt uit significant hogere vuursnelheden en (netwerk)burstfrequenties na toevoeging van het geneesmiddel op dag 108 (Figuur 2E). Dit is vergelijkbaar met wat eerder is aangetoond in elektrofysiologische opnames van één cel²¹. Een poweranalyse voor de farmacologische test werd uitgevoerd met behulp van G*Power3 op basis van een effectgrootte van 0,94 en een alfa van 0,05. Een totale steekproef van 15 assembloids met drie groepen van gelijke grootte van n = 5 was nodig om een vermogen van 0,8 te bereiken (Figuur 2E). Er is een voertuigbesturing opgenomen om te controleren of de respons een echte signaalgebeurtenis is en niet slechts een verandering in signaalintensiteit die kan voortvloeien uit de toevoeging van een kleine hoeveelheid media (Figuur 2E).

Figuur 1: Overzicht van het onderzoek. Protocol voor het genereren en uitplateren van dubbel gelabelde assemblages op MEA-tijdlijn van het differentiatieprotocol waarin kritieke stadia en bijbehorende supplementen met kleine moleculen worden beschreven (voor aanvullende informatie over de samenstelling, zie tabel 1 en tabel met materialen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: MEA-registratie van assembloids. (A) Heatmap van de gemiddelde vuuractiviteit van een enkele MEA-plaat (n = 6 putjes) op dag 82, d.w.z. dag 10 na het uitplateren. Alle putjes vertegenwoordigen culturen van dezelfde aandoening en hetzelfde genotype. (B) Representatieve fasecontrast- en confocale beelden van de assembloid, met dorsale assembloid gelabeld met rood en ventrale met groen. Witte pijlpunten duiden op gemigreerde GABAergische interneuronen van de ventrale naar de dorsale zijde. Schaalbalk = 500 μm. (C) Representatieve rasterplots over 120 s registratietijd van een enkele put. Netwerkbursts worden gemarkeerd met een paars vak. Twee afzonderlijke tijdstippen, dag 78 (1 week na het uitplateren, startdag van de opname) en dag 92 (3 weken na het uitplaten, ook wanneer de activiteit piekt), worden gedemonstreerd. (D) Kwantificering van de gemiddelde vuursnelheid, de burstfrequentie en de barstfrequentie van het netwerk van dag 78 tot dag 127 (n = 3 differentiaties, 3 assembloids/differentiatie). Elke curve geeft één individuele assembloid aan, samengesteld uit 3 differentiaties (kleurgecodeerd). De rode curve geeft de gemiddelde waarde aan. (E) Kwantificering van de resultaten van de bicucullinetest (n = 6 assembloids/toestand). Het staafdiagram werd weergegeven als gemiddelde ± SEM. Elke stip vertegenwoordigt één assembloid, samengesteld uit 3 batches differentiatie (kleurgecodeerd). Er werd een niet-parametrische Friedman-test uitgevoerd. **p < 0,01; ns, niet significant. MEA, arrays met meerdere elektroden. Heatmap- en rasterplots worden gegenereerd met behulp van de analytische software Neural Metric Tool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Componenten van media in verschillende differentiatiestadia. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

MEA-gebaseerde methoden voor elektrofysiologische opnames van netwerkactiviteit in iPSC-afgeleide assembloids zijn gebruikt voor in vitro modellering van epilepsie^22,23. Dit voorgestelde platform dat excitatoire en remmende synaptische verbindingen integreert, heeft het potentieel om mechanismen van neuronale hyperexcitabiliteit en de rol van corticale interneuronen in het proces van epileptogenese aan te pakken. Bovendien maakt dit platform de stabilisatie van assembloids en het verzamelen van longitudinale elektrofysiologische gegevens gedurende ongeveer 50 dagen in vitro mogelijk, zelfs in aanwezigheid van farmacologische verstoringen, waardoor een benadering wordt geboden voor het testen van verbindingen met potentiële therapeutische doelen.

Het stabiliseren van volwassen, relatief grote assembloids op een hydrofoob oppervlak gedurende een lange periode in vitro was technisch uitdagend. Om dit obstakel te overwinnen, wordt de strategie van tweemaal coaten toegepast met omgekeerd geladen chemicaliën om de hechting van organoïden aan het elektrodeoppervlak op korte en lange termijn te vergemakkelijken. Dit protocol optimaliseert de eerder gebruikte methode²⁴ door de reagentia voor plaatcoating over te schakelen van poly-L-ornithine (PLO)/laminine naar PEI/BMM, waardoor een solide hechting wordt bereikt met hoge slagingspercentages en een lage toxiciteit. Bovendien heeft dit gestabiliseerde kweeksysteem voor de lange termijn het potentieel om gegevens met een hoge doorvoer op te leveren. Pre-labeling met dubbele virussen kan bijvoorbeeld een aanvulling zijn op het sorteren van spikes door individuele elektroden om activiteit uit verschillende regio's te lokaliseren en te vergelijken. Het voorgestelde platform biedt ook een stabiel hulpmiddel voor het registreren van lokale veldpotentialen, wat zeer relevant is voor de interneuronfunctie zonder de intacte structuur van assembloids te verstoren²⁵. De belangrijkste beperking van dit protocol is dat assemblages na het plateren worden afgevlakt, wat aanleiding geeft tot bezorgdheid over het al dan niet behouden blijven van de oorspronkelijke 3D-structuren. Het kweken van organoïden rond de elektroden met behulp van meer geavanceerde MEA-platforms die een organoïde omhullen met elektroden²⁶ zou de beperking mogelijk kunnen overwinnen.

Een van de belangrijkste obstakels van op MEA gebaseerde methoden voor elektrofysiologische registratie van organoïden is de variabiliteit en reproduceerbaarheid van experimentele bevindingen in differentiatieprotocollen en zelfs batches van differentiatie. Eerdere studies tonen aan dat de netwerkactiviteit van neuronen gemeten door MEA afhankelijk is van de neuronale rijpingsstatus van zowel dorsale als ventrale organoïden²⁷. Opname van assembloids op een later tijdstip met relatief volwassen neuronen en circuits is een manier om de consistentie te verbeteren. Bovendien zal de keuze voor MEA-systemen met meerdere putten die gegevens met een hoge doorvoer genereren, statistische vergelijkingen mogelijk maken in het licht van experimentele variabiliteit. Als de elektrofysiologische activiteit van een cultuur niet overeenkomt met wat op een bepaald tijdstip wordt verwacht, zal het belangrijk en nuttig zijn om de intacte cultuur van het functionele platform te verzamelen voor kwaliteitscontrolemaatregelen, waaronder immunocytochemische en transcriptomische analyse.

Van het grootste belang voor het voorgestelde platform is de functionele integratie van regionaal gespecificeerde excitatoire corticale neuronen aan de dorsale zijde en remmende interneuronen aan de ventrale zijde. Protocollen voor het genereren van hersengebiedspecifieke organoïden die in de literatuur zijn gevonden, verschillen sterk met betrekking tot mediaomstandigheden, de timing van culturen, opbrengst en rijpingsprofielen, naast andere factoren²⁸. Hoewel dit protocol cortex- en ganglionische eminentie-specifiek is in zijn vermogen om exciterende neuronen en GABAergische interneuronen te genereren, kunnen gevestigde differentiatietechnieken worden gebruikt om iPSC-afgeleide neuronen te genereren die andere identiteiten vertonen, zoals motorneuronen²⁹ en Purkinje-cellen³⁰. Het voorgestelde platform heeft dus het potentieel om neurale circuits tussen de hersenschors en het ruggenmerg/cerebellum te modelleren. Na enige optimalisatie met betrekking tot de timing van plating en visualisatie van celtypen met virale labeling, kan deze methode worden vertaald naar andere ziektemodellen dan epilepsie, zoals Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS)¹⁷.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Corning Non TC-treated culture dishes	Corning	08-772-32	Voor suspensiecultuur op de shaker
100 mL Beaker	Fisher Scientific	FB100100
100% Ethanol	Fisher Scientific	BP28184-4L
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Thermo Fisher	21985023	Werkconcentratie 100 μM
48-well cell culture plate	Fisher Scientific	50-202-140
6-well cell culture plate	Fisher Scientific	07-200-83
Aggrewell 800	Fisher Scientific	501974754
Allegra X-14R Refrigerated Centrifuge	Beckman Coulter	BE-AX14R
Allopregnanolone	Cayman	16930	Gesuspendeerd 5mg in DMSO om een 1 mM stockoplossing te krijgen. Verdeel in aliquots en vries bij −80 °C. Verdun bij 1:10.000 voor gebruik. Werkconcentratie 100 nM.
Automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAX2000
Axion CytoView MEA 6-well plates	Axion Biosystems	M384-tMEA-6B
Axion Maestro MEA platform	Axion Biosystems	Maestro	Met temperatuur-milieubeheersing
B-27 supplement (regular, with Vitamin A)	Thermo Fisher	21985023
B-27 supplement (without Vitamin A)	Thermo Fisher	12587010
Basement membrane matrix- Geltrex	Thermo Fisher	A1569601
Bead bath	Fisher Scientific	10-876-001	Isotemp
Benchtop inverted microscope	Olympus	CKX53	Bewaard in een laminare flow clean bench
Bicuculline	Sigma-Aldrich	14340	Werkconcentratie 10 μM
Bleach	CLOROX	67619-26
Borate buffer 20x	Thermo Fisher	28341	Werkconcentratie bij 1x
BrainPhys media	StemCell Technologies	5790
Cell dissociation reagent (StemPro Accutase)	Thermo Fisher	A1110501
Celltron orbital shaker	HT-Infors	I69222
Detergent/enzyme (Terg-A-Zyme)	Sigma-Aldrich	Z273287	Werkconcentratie 1% m/v
DMEM/F12 + HEPES/L-Glutamine	Thermo Fisher	113300
DMSO	Sigma-Aldrich	67685
Dorsomorphin	Sigma-Aldrich	P5499	Los 5mg op in DMSO om een 10 mM stockoplossing te krijgen. Verdeel in aliquots en vries bij −20 °C. Verdun bij 1:2000 voor gebruik. (werkconcentratie 5 μM)
D-PBS zonder calcium of magnesium	Thermo Fisher	14190144
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)	Peprotech	450-10	Los 100 μg op in 1mL PBS tot 100 μg/mL. Verdeel in aliquots en vries bij −20 °C. Verdun bij 1:5000 voor gebruik. (werkconcentratie 20 ng/mL).
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher	35050061
Hemacytometer	Election Microscopy Sciences	63510-20
HEPES	Thermo Fisher	15630080
Heraguard ECO Clean Bench	Thermo Fisher	51029692
Humidity controlled cell culture incubator	Thermo Fisher	370	Ingesteld op 37 °C, 5% CO2
IWP-2	Selleckchem	S7085	Verdeel in aliquots en vries bij −80 °C. Het zal bezinken als het wordt ontdooid bij kamertemperatuur. Bevroren aliquots moeten direct in 37 °C worden geplaatst voor gebruik.
Knockout serum replacement (KOSR)	Thermo Fisher	10828010
mTeSRplus (medium + supplements)	StemCell Technologies	100-0276	cGMP, gestabiliseerd feeder-free medium voor humane iPSC-cellen
N2 supplement	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal A	Thermo Fisher	21103049
Non-essential amino acids (NEAA)	Thermo Fisher	11140050
NT3	Peprotech	450-03	Los 100 μg op in 1mL PBS tot 100 μg/mL. Verdeel in aliquots en vries bij −20 °C. Verdun bij 1:5000 voor gebruik. (werkconcentratie 20 ng/mL).
NuFF Human neonatal foreskin fibroblasts	MTI-GlobalStem	GSC-3002
Parafilm	PARAFILM	P7793
Penicilin/Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
Pipette (P10, P200, P1000)	Eppendorf	EP4926000034	Geautoclaveerde P1000-tips voor organoïdverzameling
Poly (Ethyleneimine) (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	Verdun stock in steriele boraatbuffer. Werkconcentratie 0,07%. Zie details in manuscript.
Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	R&D Systems	236-EG-200	Gesuspendeerd in PBS. Verdeel in aliquots en vries bij -20 °C.
Recombinant Human fibroblast growth factor (FGF)-basic	Peprotech	100-18B	Gesuspendeerd in PBS. Verdeel in aliquots en vries bij -20 °C.
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrifugeer kort voor reconstitutie. Los 100 μg op in 1 mL PBS tot 100 μg/mL. Verdeel in aliquots en vries bij −20 °C. Verdun bij 1:5000 voor gebruik. (werkconcentratie 20 ng/mL).