Methodenartikel

Levende/dode kleuring voor het kwantificeren van levensvatbare maar niet kweekbare cellen in met Manuka-honing behandelde wondveroorzakende bacteriën

DOI:

10.3791/67398

⸱

25 april 2025

 ,  , 
1Department of Biology, Eastern Washington University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gepresenteerde protocol beschrijft een procedure om levensvatbare maar niet kweekbare cellen (VBNC) te kwantificeren in met Manuka-honing behandelde bacterieculturen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antibioticaresistentie en tolerantie onder bacteriën vormen een aanzienlijke bedreiging voor de wereldwijde gezondheid. Mechanismen die bijdragen aan antibioticaresistentie en -tolerantie zijn onder meer genetische mutaties en verwerving van resistentiegenen en overgang naar respectievelijk Viable But Not Culturable (VBNC) en andere rusttoestanden. Hoewel genetisch identiek aan hun niet-antibioticatolerante tegenhangers, omzeilen VBNC-cellen antibiotica-effecten door metabolisch inactief te blijven. Antibiotica zijn alleen effectief als hun doelprocessen, zoals DNA-replicatie of transcriptie, actief zijn. Omdat omgevingsstressoren, met name antibiotica, bacteriën in rust kunnen brengen, zijn alternatieve antimicrobiële middelen nodig om deze reactie te minimaliseren of te voorkomen. De antimicrobiële Manuka Honing (MH) is effectief tegen veel bacteriën, met een zeldzame ontwikkeling van resistentie. De veelzijdige antimicrobiële mechanismen maken het een waardevol middel voor de behandeling van bacteriële infecties. Dit onderzoek onderzocht de recalcitrantie van MH voor de ontwikkeling van antibioticaresistentie door de hypothese te testen dat MH minder VBNC-cellen induceert dan conventionele antibiotica. Om dit te onderzoeken, werd een protocol ontwikkeld om de wondveroorzakende bacteriën Staphylococcus aureus en Pseudomonas aeruginosa te behandelen met minimale remmende concentraties van MH of de conventionele antibiotica tobramycine of meropenem, die vervolgens het levensvatbare aantal platen gebruikten om metabolisch actieve kweekbare cellen te identificeren en levende/dode kleuring om alle levensvatbare cellen te identificeren. Het aantal VBNC-cellen was gelijk aan het aantal levensvatbare cellen minus het aantal kweekbare cellen. In sommige experimenten was het aantal kweekbare cellen hoger dan het aantal levensvatbare cellen, wat een negatief aantal VBNC-cellen opleverde; het aantal VBNC-cellen werd dus niet direct vergeleken. In plaats daarvan werden voor elke behandeling kweekbare en levensvatbare celaantallen vergeleken. Alleen P. aeruginosa behandeld met tobramycine had significant minder kweekbare cellen dan levensvatbare cellen, wat wijst op een hoger aantal VBNC-cellen. Dit protocol is snel en eenvoudig en kan worden gebruikt om MH-inductie van VBNC-cellen in andere pathogene bacteriën te evalueren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacteriën in de levensvatbare maar niet kweekbare (VBNC) rusttoestand overleven een antibioticabehandeling en veroorzaken terugkerende en soms dodelijke infectieziekten 1,2,3. Meer vertrouwd voor ons is antibioticaresistentie, die optreedt via een erfelijke genetische verandering4. De genetische verandering zorgt voor resistentie tegen een specifiek antibioticum door verschillende mechanismen, waaronder het beperken van de opname van een antibioticum, het verhogen van de uitstroom van het antibioticum, het wijzigen van het antibioticumdoelwit of het inactiveren van het antibioticum4. Bacteriën in rusttoestanden vertonen daarentegen een bredere en niet-erfelijke antibioticatolerantie door hun metabolisme te verminderen 2,3. Antibiotica richten zich op specifieke metabolische processen, waaronder DNA-replicatie en celwandsynthese, en zijn niet effectief tegen metabolisch inactieve VBNC-cellen4. VBNC-cellen bestaan stochastisch in lage aantallen naast hun genetisch identieke antibioticagevoelige broers en zussen in de meeste bacteriepopulaties5. Omgevingsstressoren, waaronder blootstelling aan antibiotica, zorgen er echter voor dat gevoelige bacteriële cellen de antibioticatolerante VBNC-toestand binnengaan 3,6. Behandeling met antibiotica zal antibioticavatbare cellen in de populatie doden, terwijl slapende VBNC-cellen achterblijven. Zoals hun naam al doet vermoeden, zijn VBNC-cellen niet kweekbaar op media die geschikt zijn voor de groei van hun metabolisch actieve broers en zussen. Hun membranen en genetisch materiaal zijn echter onbeschadigd en ze kunnen zich voortplanten 7,8. Wanneer antibiotica worden verwijderd, zijn specifieke stimuli zoals voedingsstoffen, temperatuur of gastheerfactoren nodig om VBNC-cellen uit hun rusttoestand te wekken en de groei te herstellen 3,9. VBNC-cellen zijn gedocumenteerd in veel pathogene bacteriesoorten, waaronder P. aeruginosa en S. aureus, belangrijke etiologische verwekkers van wondinfecties10,11.

Honing wordt al lang gebruikt in medische toepassingen, waaronder wondbehandeling, vanwege zijn antibacteriële eigenschappen12. Manukahoning (MH), afgeleid van bloemen van de Manuka-struik (Leptospermum scoparium), staat bekend om zijn bacteriedodende activiteit met een breed spectrum (besproken in 13,14,15). Het doodt met succes de meeste geteste menselijke infectieveroorzakende bacteriën, waaronder bacteriestammen zoals meticillineresistente Staphylococcus aureus en vancomycine-resistente enterococcus die erfelijke resistentie vertonen tegen traditionele antibiotica16,17. Bovendien is geïnduceerde bacteriële resistentie tegen MH zeldzaam en wordt deze alleen gedetecteerd in aan honing blootgestelde P. aeruginosa biofilms en Escherichia coli gekweekt in toenemende concentraties van een subset van de geteste honing 18,19,20,21. Dit suggereert dat de antimicrobiële mechanismen van MH verschillen van conventionele antibiotica en mogelijk minder of geen VBNC-cellen induceren. Deze hypothese werd getest door te bepalen hoe MH VBNC-populaties beïnvloedt in vergelijking met conventionele antibiotica.

VBNC-cellen moeten worden onderscheiden van hun metabolisch actieve kweekbare broers en zussen en dode cellen. Kweekbare cellen worden geteld met behulp van de levensvatbare plaattellingstechniek, waarbij cellen worden overgebracht naar routinematige kweekmedia en gedurende een periode worden geïncubeerd die voldoende is om voldoende celdelingen te hebben om waarneembare kolonies te vormen. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om VBNC-cellen van dode cellen te onderscheiden op basis van hun intacte membranen en transcriptie op laag niveau. De opname van substraat en fluorescerende kleurstof, gecombineerd met microscopie of flowcytometrie, maakt het mogelijk om cellen direct te tellen door middel van microscopie of flowcytometrie met een kleur die intacte membranen aangeeft22,23. Ademhalingstesten die vereisen dat de elektronentransportketen aanwezig is in een intact celmembraan, zijn ook gebruikt om onderscheid te maken tussen levensvatbare en dode cellen24. Er zijn ook kwantitatieve PCR (qPCR)-methoden ontwikkeld in combinatie met DNA-modificerende kleurstoffen die amplificatie voorkomen; alleen DNA van levensvatbare cellen zal worden geamplificeerd omdat de intacte membranen de kleurstof25 uitsluiten. Hoewel VBNC-cellen slapend zijn, transcriberen ze nog steeds genen op een laag niveau, en dit kan ook worden gebruikt om ze te onderscheiden van dode cellen met behulp van reverse transcriptie PCR26.

In dit werk werd een test ontwikkeld om VBNC-cellen te kwantificeren in twee wondveroorzakende pathogene bacteriën, S. aureus en P. aeruginosa, behandeld met MH. Het beschrijft de behandeling van de bacteriën met MH en conventionele antibiotica en het gebruik van het aantal levensvatbare platen en levende/dode kleuring om kweekbare en levensvatbare cellen te detecteren. Dit eenvoudige en goedkope protocol maakt het mogelijk om het vermogen van MH om antibioticaresistente VBNC-cellen te induceren in veel bacteriële pathogenen te analyseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aangezien P. aeruginosa (ATCC9721) en S. aureus (ATCC29213) zijn geclassificeerd als middelen van bioveiligheidsniveau 2, moeten de ruimtes waar het werk wordt uitgevoerd beperkt toegankelijk zijn en uitgerust zijn met een bioveiligheidskast voor manipulaties die spatten of aerosolen kunnen veroorzaken, zoals agitatie- en centrifugeerculturen. Draag in alle stappen van dit protocol persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder een laboratoriumjas, een veiligheidsbril en handschoenen. Alle reagentia en apparatuur die in de experimenten worden gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Bereiding van steriele bouillon en agarcultuurmedia

  1. Bereid Luria Bertani en Mueller Hinton, NaCl (0,85%), antibiotica en glaswerk.
    1. Bereid de bouillonmedia volgens de instructies van de fabrikant en voeg agarpoeder toe aan 1,5% voor de agarmedia. Voeg 0,85 g NaCl toe aan 100 ml dH20 om 0,85% NaCl te bereiden. Breng autoclaaftape aan op de vaten, plaats ze in een autoclaafveilige container en autoclaveer ze op een vloeistofcyclus die geschikt is voor de gebruikte hoeveelheden.
    2. Wanneer de autoclaafcyclus is voltooid, koelt u de agar af tot ongeveer 60 °C voordat u deze in steriele petrischaaltjes giet.
  2. Bereid 100 μg/ml stockoplossingen van de antibiotica tobramycine en meropenem in dH2O voor verdunning en behandeling van bacteriën. Steriliseer de antibioticavoorraden met behulp van een steriele spuit van 5 ml die is aangesloten op een steriel filter van 0,2 μm.
    1. Bewaar de gesteriliseerde antibioticavoorraden bij -20 °C in meerdere kleine hoeveelheden om verlies van activiteit als gevolg van meerdere vries-dooicycli te voorkomen.

2. Het ophalen van de gearchiveerde stammen Staphylococcus aureus en Pseudomonas aeruginosa van -80 °C (dag 1)

  1. Verzamel de materialen voor het strepen van een klein deel van de bevroren bacteriestammen uit hun diepvriesflesjes van 80 °C tot Luria Bertani (LB) agar. Dit omvat meerdere steriele houten stokjes en een LB-agarplaat met het organisme en de datum erop.
  2. Open de vriezer van -80 °C, verwijder snel de flesjes en sluit de deur van de vriezer. Open elke injectieflacon achtereenvolgens en gebruik een steriele stok om een kleine hoeveelheid bevroren bacteriën op de juiste geëtiketteerde LB-agarplaat te schrapen. Plaats de dop van de injectieflacon terug en plaats deze snel terug in de vriezer van -80 °C.
  3. Incubeer de geënte LB-agarplaten met de agarzijde naar boven gedurende 18-24 uur bij 37 °C onder aërobe (atmosferische) omstandigheden. Sluit de geënte LB-agarplaten na de incubatietijd af met entband en bewaar ze niet langer dan een week bij 4 °C. Inoculeer indien nodig wekelijks verse bacterieculturen uit de bevroren voorraad van -80 °C.

3. Preparaat van S. aureus en P. aeruginosa voor behandeling met Manuka Honing (MH) en het antibioticum (Dag 2)

  1. Verzamel de materialen die nodig zijn voor het starten van een LB-bouilloncultuur van elke stam, inclusief kleine steriele reageerbuisjes, serologische pipetten van 5 ml, steriele LB-bouillon en een inoculatielus. Verzamel ook een handmatige of elektrische pipettor voor gebruik met serologische pipetten, een bunsenbrander en een schudbroedmachine.
  2. Werk naast de vlam van de bunsenbrander en gebruik een serologisch pipet om 2 ml LB-bouillon over te brengen naar twee steriele reageerbuisjes. Steriliseer de inoculatielus in de vlam van de bunsenbrander en breng vervolgens een kwart lus vol bacteriën van de LB-agarplaten over naar de juiste geëtiketteerde reageerbuis met LB-bouillon.
    1. Incubeer de reageerbuis onder aërobe omstandigheden in een schudoven (~250 tpm) bij 37 °C gedurende 18-24 uur.

4. Bereiding van MH en opzetten van MH- en antibioticabehandelingen van S. aureus en P. aeruginosa (T = 0) (dag 3)

  1. Verzamel de materialen die nodig zijn voor het experiment, waaronder Mueller Hinton-bouillon en agarplaten, de LB-bouillonbacterieculturen van dag 2, steriele reageerbuisjes, de antibioticavoorraden op ijs, pipetten (P20, P200 en P1000) en tips, buisjes van 15 ml, serologische pipetten en een pipettor, en microfugebuisjes.
    1. Bereid de 25% en 50% MH voorraadoplossingen vers op de dag dat het experiment wordt opgezet. Weeg op basis van de dichtheid van MH (1,47 g/ml) de juiste hoeveelheid MH af in een steriele tube van 15 ml en voeg de juiste hoeveelheid steriele Mueller Hinton-bouillon toe. Resuspendeer de MH door de buisjes in warm water te plaatsen en ze indien nodig om te keren.
  2. Bereid een verdunning van 1:1000 (ongeveer 106 CFU/ml) van de nachtelijke bacterieculturen in steriele buisjes van 15 ml door 10 μl van de bacteriecultuur toe te voegen aan 10 ml Mueller Hinton-bouillon.
    1. Gebruik de verdunde culturen om drie monsters voor elke bacteriesoort te bereiden: een onbehandeld controlemonster, een met MH behandeld monster (met de minimale remmende concentratie, MIC) en een met antibiotica behandeld monster (tobramycine voor S. aureus of meropenem voor P. aeruginosa, bij het MIC).
    2. Voeg de verdunde bacteriecultuur, MH en het juiste antibioticum toe aan de monsters in de hoeveelheden aangegeven in tabel 1 en tabel 2.
  3. Breng 0,1 ml en 0,5 ml van het onbehandelde monster over in steriele microcentrifugebuisjes voor respectievelijk het levensvatbare kiemgetal (stap 5) en levend/dood kleuring (stap 6) voor de T = 0-monsters.
    1. Incubeer de onbehandelde controle-, MH- en met antibiotica behandelde (tobramycine of meropenem) monsters onder aërobe omstandigheden bij 37 °C in een schudbroedmachine (250 tpm) gedurende 24 uur. Voer de levensvatbare plaattelling (stap 5) en levende/dode kleuring (stap 6) technieken uit op de T= 0 onbehandelde monsters.

5. Bepaling van de kweekbare cellen in monsters met behulp van de levensvatbare plaattellingsmethode (dag 3 - 5)

  1. Verzamel op dag 4, na de 24-uurs incubatie van het monster, 0,1 ml en 0,5 ml van elk monster in microcentrifugebuisjes voor respectievelijk het levensvatbare aantal platen en levend/dood kleuring (stap 6). Dit zijn de T = 24 uurs monsters.
  2. Voer het aantal levensvatbare platen uit op T = 0 en T = 24 uur monsters op de dag dat ze worden verzameld door 10-voudige verdunningen van de vatbare monsters met het aantal platen in LB-bouillon te bereiden om een aftelbaar aantal cellen te verkrijgen (~25-150).
    1. Verdeel 50 μL van elk verdund monster op 1/2 van een LB-agarplaat. Incubeer de LB-agarplaten onder aërobe omstandigheden bij 37 °C gedurende 24 uur.
  3. Verwijder de volgende dag de LB-agarplaten uit de incubator en identificeer de verdunningsplaat met ~25-150 kolonies. Tel het exacte aantal kolonies op de plaat en gebruik de formule van kolonievormende eenheden (CFU) (CFU/mL= # kolonies geteld/ (volume verguld, ml) (gebruikte verdunning)) om het aantal kweekbare cellen per ml te bepalen.
    OPMERKING: Het T = 0-monster wordt op dag 3 geplateerd en op dag 4 geanalyseerd; de T = 24 uur-monsters worden op dag 4 geplateerd en op dag 5 geanalyseerd.

6. Bepaling van de levensvatbare cellen in de monsters met behulp van levende/dode kleuring en fluorescerende microscopie (dag 3 of 4)

  1. Verzamel de materialen die nodig zijn voor levende/dode kleuring, waaronder 0,85% steriele NaCl om een gunstige osmotische omgeving voor cellen te behouden, pipetten (P20, P200 en P1000) en steriele pipetpunten, een levende/dode kleuringskit voor bacteriën en een wegwerphemocytometer. Krijg toegang tot een fluorescerende microscoop met een fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-filterset om de SYTO 9-kleurstof te detecteren, die levende cellen kleurt.
  2. Voeg 0,5 ml 0,85% NaCl toe aan 0,5 ml van elk van de volgende levende/dode monsters: alle onverdunde T = 0 monsters, onverdunde T = 24 uur MH en met antibiotica behandelde monsters, en een verdunning van 1:1000 van het T = 24 uur onbehandelde controlemonster.
    1. Zorg ervoor dat het uiteindelijke aantal levende cellen van alle monsters met twee wordt vermenigvuldigd en dat de verdunde T = 24 uur onbehandelde controle met 1000 wordt vermenigvuldigd. Combineer 1,5 μL SYTO 9 en 1,5 μL propidiumjodide per monster en voeg vervolgens 3 μL van het mengsel toe aan elk monster. Incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij 21 °C in het donker.
  3. Breng 6 μL van elk bevlekt, voorzichtig gemengd monster over naar een wegwerphemocytometer en bekijk het met een fluorescerende microscoop met het FITC-filter en de 40x objectieflens. Maak een foto waarop zowel de rasterlijnen van de hemocytometer als de levende groene cellen te zien zijn.
    1. Tel de groene cellen in zes velden per monster en noteer de afmetingen van het raster zodat het aantal groene cellen per volume kan worden berekend.
      OPMERKING: De veldafmetingen in de huidige experimenten zijn 1,05 mm x 0,6 mm x 0,1 mm, wat overeenkomt met 0,063 mm3 of 6,3 x 10-5 ml. Om het aantal levensvatbare cellen per ml te verkrijgen, deelt u het aantal getelde levende cellen door 6,3 x 10-5 ml en vermenigvuldigt u ze vervolgens met twee (of 2000 als het de T = 24 uur onbehandelde controle is).

7. Bepaling van het aantal levensvatbare maar niet kweekbare cellen (VBNC's)

OPMERKING: Gebruik het aantal kweekbare cellen verkregen uit het aantal levensvatbare platen en het aantal levensvatbare cellen verkregen uit levende/dode kleuring om het aantal VBNC's te bepalen.

  1. Bereken VBNC's/ml door het aantal kweekbare cellen/ml af te trekken van het aantal levensvatbare cellen per ml.
  2. Gebruik een Wilcoxon-gematchte-parentest om de VBNC's/ml of de kweekbare cellen/ml te vergelijken met de levensvatbare cellen/ml voor elke behandeling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Levensvatbare maar niet kweekbare (VBNC) bacteriële levensvormen worden geïnduceerd door stressoren, waaronder antibioticabehandeling, en veroorzaken terugkerende infecties vanwege hun antibioticatolerantie. Omdat MH een breedspectrum antimicrobieel middel is waartegen resistentie zelden is gedetecteerd, werd verondersteld dat MH minder VBNC's induceerde dan conventionele antibiotica. De hier beschreven methode werd gebruikt om VBNC's te kwantificeren die worden gevormd door twee wondver...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier beschreven protocol maakt de detectie van VBNC-celpopulaties mogelijk in wondveroorzakende bacteriën die worden behandeld met minimale remmende concentraties (MIC's) van MH en conventionele antibiotica. Kritieke stappen in het protocol waren onder meer het bereiden van de MH-verdunningen op de dag van het experiment, het voorkomen van monsterverlies tijdens levende/dode kleuring en het correct berekenen van het geanalyseerde volume. Voor deze en andere studies werden de MH MIC's...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door twee beurzen van de Eastern Washington University, de Faculty Research and Creative Works Grant aan A.R.C en de Undergraduate Research & Creative Activities Grant aan L.T.B. Bill en Connie Cross schonken geld aan EWU om de Leica DMIL omgekeerde fluorescerende microscoop met een digitale camera aan te schaffen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Mueller Hinton bouillonFisher BioreagentsB12322
Luria Bertani (LB) bouillon Fisher BioreagentsBP142602
BD Difco AgarFisher ScientificDF0812-07-1
natriumchlorideSigma S3014-500g
meropenemTargetMolT0224
tobramycineSelleck ChemicalsS2514
Staphylococcus aureus ATCCATCC29213
 Pseudomonas aeruginosaATCCATCC9721
schudkweekincubatorEppendorfM13520000
incubatorBenchmark ScientificH2200-H 
Manukaguard Manuka HoningAmazonNA
DMIL omgekeerde fluorescentiemicroscoop Leica Microsystems11521265
Digitale cameraLeica Microsystems12730522
15 mL falconbuisjesGenesee Scientific28-103
serologische pipettenDiagnocineDP-LB0100005, DP-LB010010
Pipet Aid PipettorDrummond Scientific Company4-000-101
BunsenbranderFisher ScientificS48108
Rainin pipettenPipette.comL-20, L-200, L-1000
weegschaalMettler ToledoXS603S
96-well plateFalcon351172
inoculeerlusFisher Scientific13-104-5
isopropanolFisher ScientificBP2618-1
glasverspreiderzelfgemaaktNA
Live dode kleuringskit voor bacteriënInvitrogenL7012
microfugebuisjesBiologix Research CompanySKU 80-1500/P80-1500
tinfolieCostcoNA
Figuur makende softwareGraphPadNAGraphPad Prism werd gebruikt voor het maken van figuren en het uitvoeren van statistische analyses.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spoering, A., Lewis, K. Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials. J Bacteriol. 183 (23), 6746-6751 (2001).
  2. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J Bacteriol. 192 (23), 6191-6199 (2010).
  3. Li, L., Mendis, N., Trigui, H., Oliver, J. D., Faucher, S. P. The importance of the viable but non-culturable state in human bacterial pathogens. F Microbiol. 5, 00258(2014).
  4. Reygaert, W. C. An overview of the antimicrobial resistance mechanisms of bacteria. AIMS Microbiol. 4 (3), 482-450 (2018).
  5. Ayrapetyan, M., Williams, T. C., Baxter, R., Oliver, J. D. Viable but nonculturable and persister cells coexist stochastically and are induced by human serum. Infect Immun. 83 (11), 4194-4203 (2015).
  6. Cabral, D. J., Wurster, J. I., Belenky, P. Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions. PHARH2. 11 (1), 11010014(2018).
  7. Heidelberg, J. F., et al. Effect of aerosolization on culturability and viability of gram-negative bacteria. Appl Environ Microbiol. 63 (9), 3585-3588 (1997).
  8. Cook, K. L., Bolster, C. H. Survival of Campylobacter jejuni and Escherichia coli in groundwater during prolonged starvation at low temperatures. J Appl Microbiol. 103 (3), 573-583 (2007).
  9. Xu, H. S., et al. Survival and viability of nonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in the estuarine and marine environment. Microbl Ecol. 8 (4), 313-323 (1982).
  10. Qi, Z., Huang, Z., Liu, C. Metabolism differences of biofilm and planktonic Pseudomonas aeruginosa in viable but nonculturable state induced by chlorine stress. Sci Total Environ. 821, 153374(2022).
  11. Li, Y., et al. Study on the Viable but Non-culturable (VBNC) state formation of staphylococcus aureus and its control in food system. F Microbiol. 11, 599739(2020).
  12. Oryan, A., Alemzadeh, E., Moshiri, A. Biological properties and therapeutic activities of honey in wound healing: A narrative review and meta-analysis. J Tissue Viability. 25 (2), 98-118 (2016).
  13. Lusby, P. E., Coombes, A. L., Wilkinson, J. M. Bactericidal Activity of different honeys against pathogenic bacteria. Arch Med Res. 36 (5), 464-467 (2005).
  14. Mandal, M. D., Mandal, S. Honey: Its medicinal property and antibacterial activity. Asian Pac J Trop. Biomed. 1 (2), 154-160 (2011).
  15. Carter, D. A., et al. Therapeutic Manuka Honey: No longer so alternative. F Microbiol. 7, 00569(2016).
  16. Cooper, R. A., Molan, P. C., Harding, K. G. The sensitivity to honey of Gram-positive cocci of clinical significance isolated from wounds. J Appl Microbiol. 93 (5), 857-863 (2002).
  17. George Narelle May, C., Keith, F. Antibacterial Honey: In-vitro activity against clinical isolates of MRSA, VRE, and other multiresistant Gram-negative organisms. HMP Global Learning Network. , https://www.hmpgloballearningnetwork.com/site/wounds/article/7751 (2007).
  18. Blair, S. E., Cokcetin, N. N., Harry, E. J., Carter, D. A. The unusual antibacterial activity of medical-grade Leptospermum honey: Antibacterial spectrum, resistance and transcriptome analysis. Eur Soc Clin Microbiol. 28 (10), 1199-1208 (2009).
  19. Cooper, R. A., Jenkins, L., Henriques, A. F. M., Duggan, R. S., Burton, N. F. Absence of bacterial resistance to medical-grade manuka honey. Eur Soc Clin Microbiol. 29 (10), 1237-1241 (2010).
  20. Lu, J., et al. Honey can inhibit and eliminate biofilms produced by Pseudomonas aeruginosa. Sci Rep. 9 (1), 18160(2019).
  21. Bischofberger, A. M., Pfrunder Cardozo, K. R., Baumgartner, M., Hall, A. R. Evolution of honey resistance in experimental populations of bacteria depends on the type of honey and has no major side effects for antibiotic susceptibility. Evol Appl. 14 (5), 1314-1327 (2021).
  22. Cunningham, E., O'Byrne, C., Oliver, J. D. Effect of weak acids on Listeria monocytogenes survival: Evidence for a viable but nonculturable state in response to low pH. Food Control. 20 (12), 1141-1144 (2009).
  23. Kogure, K., Simidu, U., Taga, N. A tentative direct microscopic method for counting living marine bacteria. Can J Microbiol. 25 (3), 415-420 (1979).
  24. Albertini, M. C., et al. Use of multiparameter analysis for Vibrio alginolyticus viable but nonculturable state determination. Cytom J Int Soc Anal Cytol. 69 (4), 260-265 (2006).
  25. Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiol Lett. 291 (2), 137-142 (2009).
  26. Trevors, J. T. Viable but non-culturable (VBNC) bacteria: Gene expression in planktonic and biofilm cells. J Microbiol Methods. 86 (2), 266-273 (2011).
  27. Ankley, L. M., Monteiro, M. P., Camp, K. M., O'Quinn, R., Castillo, A. R. Manuka honey chelates iron and impacts iron regulation in key bacterial pathogens. J App Microbiol. 128 (4), 1015-1024 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Behandeling met manukahoningantibioticaresistentiekweektelmethodeStaphylococcus aureusPseudomonas aeruginosafluorescentiemicroscopiekolonievormende eenheden

Gerelateerde artikelen