Methodenartikel

Driedimensionale beeldvorming van aortaweefsels bij atherosclerose

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67400

⸱

25 oktober 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Vascular Surgery, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Institute for Cardiovascular Prevention (IPEK), Ludwig-Maximilians-University, 3Institute of Precision Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich Heart Alliance

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we geoptimaliseerde weefselopruimingsprotocollen om de muizenaorta in drie dimensies (3D) in beeld te brengen. We schetsen state-of-the-art procedures voor immunokleuring, optische klaring en beeldvorming met de bedoeling om de anatomische nabijheid van het perifere zenuwstelsel met atherosclerotische plaques en de adventitia bij atherosclerose te definiëren.

Samenvatting

Recent onderzoek heeft het begrip van atherosclerose als een transmurale chronische ontstekingsziekte bevorderd waarbij alle drie de lagen van de arteriële wand betrokken zijn, inclusief de intima-plaque, de media en de adventitia, die de buitenste bindweefsellaag van slagaders vormt. Onze recente studies hebben gesuggereerd dat de adventitia door het perifere zenuwstelsel wordt gebruikt als een kanaal om alle weefselcellen te bereiken. We ontdekten ook dat het perifere zenuwstelsel, dat wil zeggen het sensorische en sympathische zenuwstelsel, grote remodelleringsprocessen ondergaat waarbij de neogenese van axonnetwerken naast atherosclerotische plaques betrokken is. In deze context houdt het begrijpen van de structuur van het neurale netwerk en de interacties met vasculaire componenten van zieke slagaders belangrijke beloften in voor een beter begrip van de pathogenese van hart- en vaatziekten. Om deze doelstellingen te bereiken, zijn methoden nodig om de subcellulaire architectuur van de intacte gezonde en zieke slagaders samen met hun omliggende perivasculaire compartimenten te visualiseren. Weefselopruiming maakt intacte diepe weefselbeeldvorming mogelijk van grotere weefselcompartimenten die anders ontoegankelijk zijn. Het maakt volumetrische beeldvorming van intacte slagaders mogelijk door de integratie van labeling, clearing, geavanceerde microscopische beeldvorming en beeldverwerkingstools. Hier beschrijven we twee verschillende maar complementaire benaderingen voor het opruimen van passief weefsel, namelijk op water gebaseerde 2, 2-thiodiethanol (TDE) klaring en op oplosmiddel gebaseerde immunolabeling-enabled driedimensionale beeldvorming van solvent-geklaarde orgaan (iDISCO) klaring om geïsoleerde aortasegmenten of hele aorta in-situ in de hele muis in beeld te brengen.

Inleiding

Histologische technieken bieden een basiskennis van biologische monsters door de doorsnede van weefsels/organen. De afbakening van complexe anatomische cel/cel en weefsel/weefsel-interacties in drie dimensies (3D) was echter - tot voor kort - moeilijk te bereiken. Deze onvervulde behoefte was vooral duidelijk in de context van het cardiovasculaire systeem in gezonde en zieke omstandigheden. Het afbeelden van intacte weefsels was in het verleden een uitdaging vanwege lichtabsorptie en lichtverstrooiing, waardoor ze intrinsiek ondoorzichtig zijn. Weefselopruiming maakt het intacte biologische monster transparant door deze beperkingen te minimaliseren. Recente ontwikkelingen in weefselopruimingstechnieken maken 3D-beeldvorming met hoge resolutie van niet-doorsneden transparante weefsels mogelijk om een aanzienlijk inzicht te geven in de cellulaire en structurele microarchitectuur van hele organen met micrometerresolutie, waardoor de definitie van anatomische connectiviteitsnetwerken mogelijk wordt.

Atherosclerose omvat drie lagen van de arteriële wand, waaronder de binnenste intimalaag, de middelste medialaag en de buitenste bindweefsellaag, die adventitia wordt genoemd. Atherosclerotische plaques in de binnenste laag van slagaders zijn al tientallen jaren een conventioneel doelwit van onderzoek 1,2. De adventitia-laag bevat echter bloedvaten, lymfevaten en zenuwvezels van het perifere zenuwstelsel. Bovendien is de adventitia verbonden met het perivasculaire vetweefsel en neuronale weefselcomponenten, waaronder perifere zenuwen en perivasculaire ganglia 3,4. Van perifere zenuwen is bekend dat ze de adventitia gebruiken als kanalen om verre doelweefsels en, inderdaad, cellen te bereiken5. Onze recente studies hebben de vooruitgang bevorderd in het begrijpen van de meerlagige interacties van de belangrijkste biologische systemen, waaronder het immuunsysteem, het zenuwstelsel en het cardiovasculaire systeem. We hebben deze interacties neuro-immuun-cardiovasculaire-interfaces 6,7 genoemd. Tijdens atherogenese ondergaan arteriële wandcomponenten een robuuste herstructurering en hermodellering. Grenzend aan de progressie van atherosclerotische plaque in de intima, vormen zich bijvoorbeeld immuuncelaggregaten en vindt neuronale axonneogenese plaats in de aorta-adventitia van muizen 6,8,9. Naarmate atherosclerose vordert, ontwikkelen immuuncelaggregaten zich tot goed gestructureerde tertiaire lymfoïde organen (ATLO's) van de slagader met verschillende T-cel-, B-cel- en plasmacelgebieden10. Om deze veranderingen in 3D af te bakenen, was beeldvorming met hoge resolutie van het intacte weefsel echter een uitdaging vanwege onvoldoende membraanpermeabilisatie en inherente lichtverstrooiing11. Weefselopruimingsbenaderingen hebben de belangrijkste beperkingen van conventionele histologiebenaderingen overwonnen 11,12,13,14,15 met verbeterde penetratie van antilichamen om diep in intacte weefsels of organen te reiken door de brekingsindex (RI) uniform aan te passen, wat leidt tot beelden met een resolutie op micrometerschaal met een hogere beelddiepte in voxels. RI's van monsters kunnen worden gekoppeld aan glycerol (RI 1.46) of immersieolie (RI 1.52), waardoor lichtverstrooiing en sferische aberraties aanzienlijk worden verminderd, waardoor een hoge resolutie mogelijk is. Recente ontwikkelingen in de technieken voor het opruimen van het hele orgaan of het hele lichaam, zoals respectievelijk 2,2-thiodiethanol (TDE) en immunolabeling op basis van 3D-beeldvorming van met oplosmiddel geklaarde organen (iDISCO), samen met volumetrische beeldvormingstechnieken (waaronder confocale, multifoton- en light-sheet microscopiebeeldvorming) hebben reconstructies van de microanatomie van de vasculaire architectuur mogelijk gemaakt door hun connectiviteitsatlaste construeren 11,16. Het visualiseren van deze cellulaire en structurele verbindingen in 3D kan nieuwe inzichten opleveren om tot nu toe onbeantwoorde biologische vragen te beantwoorden.

Protocol

Het huidige onderzoek is uitgevoerd volgens de richtlijnen van de lokale en nationale commissie voor gebruik en verzorging van dieren. Hyperlipidemische mannelijke Apoe-/- muizen met een C57BL/6J-achtergrond die werden gehandhaafd op een standaard knaagdiervoer dat spontaan atherosclerose ontwikkelt tijdens het ouder worden, werden gebruikt in de huidige studie.

1. Beeldvorming van de hele berg van geïsoleerde aorta en TDE-klaring

  1. Weefsel preparatie
    1. Bereid de verdoving voor op 150 mg/kg ketamine en 30 mg/kg xylazine (zie materiaaltabel) per muis. Verdoof muizen diep door middel van intraperitoneale injectie en bevestig dit door het uitblijven van een reactie op de diepe pijntest.
      OPMERKING: De concentratie en het injectievolume zijn als volgt: Ketamine 100 mg/ml; Xylazine 20 mg/ml; Injectievolume: 50:50 bijvolume, mengsel van ketamine en xylazine in een dosis van 3 μl/g.
    2. Plaats de muis op een schuimrubberen plaat bedekt met chirurgisch papier en bevestig armen en benen in rugligging met tapes. Desinfecteer de borstkas met 75% ethanol (zie materiaaltabel) en neem bloed af via de linkerventrikel met een wegwerpspuit van 1 ml om het bloed te verwijderen voor een betere perfusie.
      OPMERKING: Cardiale bloedafname via thoracotomie kan ook worden gebruikt.
    3. Maak een incisie in de middellijn op de borst om het hart bloot te leggen en een kleine incisie in het rechter atrium om transcardiale perfusie mogelijk te maken. Verdrink de muis via de linkerventrikel met 10 ml 5 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA; zie Materiaaltabel) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 minuten, gevolgd door 20 ml PBS gedurende 5-10 minuten totdat het bloed is weggespoeld. Tenslotte 20 minuten perfuseren met 10 ml 4% paraformaldehyde (PFA).
      OPMERKING: Alle procedures kunnen worden uitgevoerd met een peristaltische perfusiepomp met een druk van 100-125 mm Hg bij kamertemperatuur (RT). De perfusienaald wordt in het muizenhart ingebracht via hetzelfde gat als de bloedextractie.
    4. Verwijder inwendige organen, waaronder de milt, lever, longen en gastro-intestinale en voortplantingsorganen, met behulp van chirurgische instrumenten. Houd het hart, de aorta en de nieren intact in situ.
      OPMERKING: Chirurgische instrumenten die worden gebruikt voor dissectie en verwijdering van organen zijn dissectiescharen, fijne irisscharen, veerscharen, stompe tangen, gebogen tangen en gebogen fijne tangen.
    5. Stel de hele aorta van de aorta ascendens tot de darmbeenvertakking bloot onder de ontledende stereomicroscoop (vergroting van 30-40x). Verwijder voorzichtig de thymus en het vetweefsel zonder de aorta te beschadigen.
      OPMERKING: Pas op dat u de aorta niet doorsnijdt. Voor Apoe-/- muizen, behoud het minimale omgeven perivasculaire vetweefsel van de aorta voor een verbonden structuur.
    6. Oogst de hele aorta in een petrischaaltje gevuld met PBS. Verdeel de aorta in verschillende segmenten en splits de hele aorta in de lengterichting met behulp van een iris- of veerschaar om het intimale oppervlak bloot te leggen volgens de volgorde en richting aangegeven in figuur 1A voor TDE-klaring.
    7. Speld de aorta van het gezicht in een Y-vorm op de platte zwarte wasplaat, zoals aangegeven in figuur 1A. Breng het een nacht na in 4% PFA bij 4 °C.
      OPMERKING: Speld de aorta vast op de wasplaat voordat u deze fixeert om vouwen en krullen in de volgende stappen te voorkomen.
    8. Maak de aorta los en breng deze over naar PBS. Was de aorta grondig gedurende 5 minuten gedurende 5 keer.
      OPMERKING: Breng de aorta over in verschillende buisjes gevuld met PBS, telkens om te wassen.
  2. Antilichaamkleuring voor aorta in het gezicht
    OPMERKING: Alle incubatiestappen worden uitgevoerd in 2 ml safe-lock buizen met zachte rotatie of schudden bij RT.
    1. Breng de gefixeerde aorta gedurende 2 uur over in een blokkerende oplossing voor blokkering en permeabilisatie.
      OPMERKING: Blokkeeroplossing varieert op basis van de primaire en secundaire antilichamen. Bijvoorbeeld, blokkerende oplossing: 0,5 mg/ml CD16/32 (1:100), 10% normaal ezelserum, 2% Triton X-100 in PBS (zie materiaaltabel)
    2. Incubeer de aorta met primaire antilichamen in de bovenstaande blokkeringsoplossing (stap 1.2.1), bijvoorbeeld CD3e (verdunning 1:100), NF200 (verdunning 1:200) en B220 (verdunning 1:200) gedurende 24 uur (zie materiaaltabel). Was de aorta in PBS gedurende 5 minuten gedurende 5 keer.
    3. Incubeer de aorta met secundaire antilichamen in 10% normaal ezelserum (verdunning 1:300) en 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI; 1 mg/ml) voor nucleaire kleuring 's nachts (zie tabel met materialen). Was de aorta 5 keer 5 minuten in PBS en bewaar de aorta in PBS bij 4 °C tot de weefselopruimingsprocedure.
      OPMERKING: Breng de aorta over in verschillende buisjes gevuld met PBS, telkens om te wassen. Dek de buizen af met aluminiumfolie om ze in het donker te houden voor stap 1.2.3.
  3. TDE weefsel opruimen
    OPMERKING: Alle incubatiestappen worden uitgevoerd in 2 ml safe-lock buizen, voorzichtig roterend bij RT en in het donker afgedekt met aluminiumfolie. TDE (zie Materiaaltabel) werkoplossingen zijn zeer doorlaatbaar en moeten zorgvuldig worden behandeld in een zuurkast. Verzamel en gooi afval weg volgens de lokale regelgeving.
    1. Breng de gekleurde aorta over in 20% TDE-werkoplossingen en incubeer gedurende 1 uur.
    2. Breng de aorta over in 47% TDE-werkoplossingen en incubeer gedurende 12 uur. Breng de aorta over in 60% TDE-werkoplossingen en incubeer gedurende 24-36 uur totdat de monsters in zichtbaar licht transparant worden om overeen te komen met de RI.
    3. Bewaar de aorta in 60% TDE bij RT in het donker tot beeldvorming.
      OPMERKING: Ververs de werkoplossingen elke 30 minuten voor de korte incubatieperiode (bijvample, stap 1.3.1) en elke 4 uur voor de lange incubatieperiode (bijvample, stap 1.3.2). De incubatietijd voor elke stap kan worden aangepast, afhankelijk van de weefselgrootte, om een betere antilichaampenetratie of transparantie bij het opruimen te krijgen. Voor Apoe-/- aorta van muizen omgeven met vetweefsel moet de incubatietijd op de juiste manier worden verlengd.
  4. Beeldvorming van de TDE-klaringsaorta met behulp van confocale laserscanmicroscoop (CLSM)
    1. Gebruik in de handel verkrijgbare dubbelzijdige, kleverige rechthoekige beeldafstandsputjes met een dikte van 0,2 mm (zie materiaaltabel). Plak de put op een schoon glasplaatje en breng de vrijgemaakte aorta over. Zorg ervoor dat de aorta-adventitia van het gezicht naar het dekglaasje wijst.
      OPMERKING: Tik de aorta van het gezicht voorzichtig plat met de abluminale kant van de aorta van het gezicht aan de bovenkant met behulp van een schuine tang. Stapel indien nodig meerdere beeldvormende afstandsputten op elkaar om overeen te komen met de weefselgrootte.
    2. Monteer de aorta met druppels 60% TDE-oplossing. Bevestig voorzichtig een dekglaasje aan de put en vermijd luchtbellen tussen het monster en het dekglaasje.
      OPMERKING: Verwijder de luchtbellen voorzichtig met een naald voor het dekglaasje. Gebruik niet te veel montagevloeistof, omdat het monster kan rondzweven.
    3. Gebruik een omgekeerd CLSM-instrument (zie materiaaltabel) uitgerust met een 20x onderdompelingsobjectief (multi) (NA: 0,75).
      OPMERKING: CLSM maakt volumetrische beeldvorming mogelijk tot 70 μm diep met een hogere resolutie, wat nodig is voor de analyse van de zenuwdiameter en de interactie tussen zenuw en immuuncel in de aorta-adventitia.
    4. Selecteer het 20x/0,75 onderdompelingsobjectief (olie). Stem de hybride diodedetectoren af op basis van de gekleurde kleurstoffen. Pas de weergave-instellingen aan en selecteer de XY-indeling van 1024 x 1024 pixels voor beeldvorming.
      OPMERKING: Een objectieflens met olie-onderdompeling vangt signalen beter op dan water.
    5. Druppel de onderdompelingsolie (met glycerol) gelijkmatig langs de aorta op het dekglaasje. Beweeg het 63x objectief grof in de richting van het monster totdat het de dompelolie/dekglaasje raakt.
    6. Beweeg het 63x objectief fijn onder de microscoop om het interessegebied te lokaliseren. Verkrijg Z-stack vanaf de adventitia-kant van de aorta van het gezicht met een stapgrootte van 2-4 μm tot een diepte van 60 μm voor 3D-beeldvorming.
    7. Geef het bestand een naam met voorbeelddetails, scan de details en sla de gegevens op.
  5. Beeldvorming van TDE-klaring van de aorta met behulp van een multifotonmicroscoop
    1. Volg stap 1.4.1-1.4.2 om de aorta van het gezicht op de objectglaasje te monteren.
    2. Gebruik een rechtopstaande multifotonmicroscoop (zie Materiaaltabel) uitgerust met een 20-voudig objectief (onderdompeling in water, NA: 1,00, werkafstand = 2 mm), waardoor volumetrische beeldvorming tot 1,5 mm diep mogelijk is.
    3. Verkrijg Z-stacks vanaf de abluminale zijde bij 10-15 μm stapgrootte tot 700 μm diepte. Geef het bestand een naam en sla de gegevens op zoals in stap 1.4.7.

2. Immunokleuring van het hele lichaam en opruiming van iDISCO-weefsel

  1. Weefsel preparatie
    1. Volg de stappen 1.1.1-1.1.3 hierboven voor anesthesie, het fixeren van de muis en perfusie.
    2. Verwijder de huid en inwendige organen, waaronder de milt, lever, longen en gastro-intestinale en voortplantingsorganen, met behulp van chirurgische instrumenten. Houd het hart, de aorta en de nieren intact in situ.
    3. Ontleed het lichaamsdeel boven het middenrifniveau en fixeer het onderste lichaamsdeel met 4% PFA gedurende 1-2 dagen (s) bij 4 °C.
      OPMERKING: Voer de fixatie, wasbeurten en incubaties uit in tubes van 50 ml op een zacht draaiende schudder. Ververs de oplossing 2-3 keer in nieuwe buisjes.
    4. Was het monster 3 keer grondig gedurende 10 minuten bij RT.
      OPMERKING: Breng de aorta over in verschillende buisjes die telkens met PBS zijn gevuld.
    5. Incubeer het monster gedurende 48 uur in 20% heldere, onbelemmerde cocktails voor hersen/lichaamsbeeldvorming en computationele analyse (CUBIC) oplossing voor ontkleuring.
      OPMERKING: Los voor 20% CUBICS-oplossing 25 g ureum op in 15 ml Triton X-100 en 28 ml Quadrol en voeg PBS toe aan het uiteindelijke volume van 100 ml. Bereid het in de afzuigkap, want de ingrediënten zijn stimulerend (zie Tabel met materialen).
    6. Was het monster vijf keer grondig gedurende 1 uur in PBS bij RT.
  2. Antilichaam kleuring
    OPMERKING: Alle incubatiestappen worden uitgevoerd in 50 ml safe-lock buizen met zachte rotatie of schudden bij 4 °C.
    1. Incubeer het monster een nacht in PBS-gelatine-Triton X-100-serum (PGST) -oplossing voor permeabilisatie en blokkering.
      OPMERKING: Blokkeeroplossing varieert op basis van de antilichamen. Bijvoorbeeld, blokkerende oplossing: PBS-gelatine-Triton X-100-serum (PGST, zie materiaaltabel) oplossing: 0,2% varkenshuidgelatine, 0,5% Triton X-100 en 5% geitenserum in PBS.
    2. Incubeer het monster met primaire antilichamen in een PGST-oplossing, bijvoorbeeld NF200 (verdunning 1:200, zie materiaaltabel) bij 4 °C en schud voorzichtig gedurende 10-12 dagen. Was het monster vervolgens grondig in PGST gedurende 1 uur 5 keer bij RT.
    3. Incubeer het monster met secundaire antilichaamoplossing (verdunning 1:300) en DAPI (1 mg/ml) in PGST bij 4 °C gedurende 7 dagen.
    4. Was het monster grondig in PGST gedurende 1 uur 5 keer bij RT. Breng het monster over naar PBS en bewaar de aorta in PBS bij 4 °C voor verdere stappen.
      NOTITIE: Dek de buizen af met aluminiumfolie om ze donker te houden voor de stappen 2.2.3-2.2.4.
  3. Gemodificeerde iDISCO weefselopruiming
    NOTITIE: Tijdens het opruimen moeten de buizen worden afgedekt met aluminiumfolie om te voorkomen dat het signaal verbleekt/afschrikt als gevolg van directe blootstelling aan natuurlijk/kunstlicht. Alle organische reagentia die worden gebruikt bij het opruimen van DISCO's zijn schadelijk en alle reinigingsstappen moeten in een zuurkast worden uitgevoerd. Draag een laboratoriumjas, handschoenen en een masker bij het omgaan met de reagentia om inademing en contact met huid en ogen te voorkomen. Verzamel het opruimafval en gooi het in de daarvoor bestemde afvalcontainers in de motorkap.
    1. Breng de gekleurde monsters van stap 2.2.4 over naar een reeks verhoogde concentraties tetrahydrofuraan (THF, zie Materiaaltabel) werkoplossingen voor dehydratatie, d.w.z. 50%, 70%, 90% en 100% (twee keer 100%). Incubeer gedurende 12 uur per concentratie.
      OPMERKING: Verdun het THF-reagens (99%-100%) in gedestilleerd water voor werkoplossingen van verschillende concentraties in de kap. Ververs werkende oplossingen elke 6 uur.
    2. Breng het monster gedurende 3 uur over naar absolute dichloormethaan (DCM, zie materiaaltabel) oplossing voor verwijdering van lipiden.
    3. Breng het monster over in een RI-overeenkomende benzylalcohol-benzylbenzoaat (BABB) werkoplossing (zie materiaaltabel). Incubeer gedurende 3-6 uur totdat het weefsel doorschijnend is en grotendeels transparant in zichtbaar licht.
      OPMERKING: Om BABB-werkoplossing te bereiden, mengt u 1 deel benzylalcohol en 2 delen benzylbenzoaat (1:2) in een glazen fles. Schud het voorzichtig gedurende 5 minuten in de kap.
  4. Beeldvorming van iDISCO-opruiming van weefsel met behulp van een light-sheet microscoop
    OPMERKING: Beeld het gewiste monster af zodra een optimale transparantie is bereikt. Een light-sheet microscoop, zoals een ultramicroscoop-II (zie Materiaaltabel), wordt gebruikt voor beeldvorming. Vul het beeldvormingsreservoir met de uiteindelijke klaringsoplossing, de BABB-oplossing. Zorg ervoor dat u geen BABB op het instrument morst om schade aan het instrument te voorkomen.
    1. Gebruik een 1x luchtobjectief voor beelden met een lage vergroting die de gehele breedte van het hele monster beslaan. Breng het monster voorzichtig uit de klaringsoplossing over op een papieren doek en droog het kort af.
      OPMERKING: Gebruik een stompe tang om te voorkomen dat u in het monster knijpt.
    2. Selecteer een monsterhouder van de juiste maat op basis van de monster-/weefselgrootte en bevestig de achterkant van het monster met superlijm aan de monsterhouder.
      NOTITIE: Wacht 1-2 minuten totdat het monster stevig is bevestigd aan de monsterhouder.
    3. Vul het beeldvormingsreservoir van de light-sheet microscoop met BABB-oplossing en plaats het monster er voorzichtig in. Pas de monsterhouder aan om ervoor te zorgen dat het monster loodrecht op de lichtplaat staat en goed wordt verlicht.
    4. Verlaag het objectief om scherp te stellen op het monster en pas de weergave-instellingen aan tijdens het scherpstellen om het monster goed te bekijken. Selecteer de juiste lichtplaat(en) in de microscoopsoftware en pas de breedte aan om het hele gezichtsveld gelijkmatig te verlichten.
      NOTITIE: In een ultramicroscoopsysteem met laserverlichting aan beide zijden begint u met het uitlijnen en focussen van de laser aan één kant. Zodra beide zijden zijn ingesteld, activeert u beide zijlasers om een samengevoegd scanbeeld van beide belichtingen te observeren.
    5. Selecteer een verrood kanaal (680 nm) om NF200-gekleurde neuronale structuren in beeld te brengen en een autofluorescentiekanaal (488 nm) om ongekleurde aorta en bindweefsels in beeld te brengen. Pas het laservermogen aan afhankelijk van de intensiteit van het fluorescerende signaal voor een optimale signaal-ruisverhouding, de belichtingstijd en de breedte van de lichtplaat(en).
    6. Selecteer de x-y-z scanmodus. Stel de z-stack-scan in met een z-stap van 2-8 μm en selecteer 25%-60% overlap langs de longitudinale y-as van de tegelscans (16 bit) die ventrale en dorsale oppervlakken van de monsters bedekken om het volledige monstervolume (tot 6-8 mm diep) in beeld te brengen.
    7. Geef de scan een naam met gedetailleerde informatie, waaronder de datum van de scan, de naam van het monster, het gebruikte antilichaam, het objectief, de zoomfactor, de z-stappen en de gebruikte lasers. Sla de gegevens op.
    8. Schakel over naar een hogere vergroting (2x of 4x) via de inzoomfunctie om specifieke lichaamsgebieden in beeld te brengen.
    9. Volg de stappen 2.4.4-2.4.7 hierboven voor beeldvorming en sla de gegevens op.

3. Beeldverwerking en analyses

OPMERKING: Voor de verwerking is een krachtig verwerkingswerkstation nodig. Zorg voor een back-up van de gegevens onmiddellijk na de verwerking vanwege het hoge volume aan beeldvorming (5-100 GB per afbeelding).

  1. Beeldverwerking van CLSM- en multifotonbeelden
    1. Laad de Z-stack tegelafbeeldingen van CLSM- en multifotonmicroscopen naar het beeldverwerkingswerkstation dat is uitgerust met Las X, Imaris (beeldanalysesoftware) of Fiji-software voor 3D- en tweedimensionale (2D) visualisatie, segmentatie en kwantificering.
    2. Om de volumediepte van een cel of structuur een kleurcode te geven, gebruikt u software voor het herstellen van afbeeldingen (zie Materiaaltabel) om het onbewerkte beeld te deconvolueren en een projectie met maximale intensiteit van de gedeconvolueerde gegevens te genereren met behulp van tijdelijke kleurcodering in Las X of Fiji.
  2. Beeldverwerking van light-sheet afbeeldingen
    1. Laad de Z-stack betegelde TIFF-afbeeldingsserie naar Fiji-software. Naai afbeeldingen met de stitching-plug-in van Fiji en sla samengevoegde afbeeldingen op in TIFF-formaat.
      OPMERKING: Comprimeer indien nodig de samengevoegde afbeeldingen in LZW-formaat om een snelle verwerking met verschillende software mogelijk te maken.
    2. Laad de samengevoegde afbeeldingen in de 3D-visualisatiesoftware (zie Materiaaltabel) voor beeldsegmentatie. Traceer handmatig de neuronale en vasculaire structuren in de x-yz-as. Voor het handmatig traceren van kleine zenuwvezels selecteert u handmatig de NF200+ -signalen pixel voor pixel in elk z-vlak langs het hele pad van de zenuwvezel tussen de aorta en de ganglia.
    3. Laad voorbewerkte afbeeldingen in beeldanalysesoftware (zie Materiaaltabel) voor het genereren van video's, 2D- en 3D-visualisatie van de afbeeldingen.
    4. Gebruik autofluorescentie om de aorta en bindweefsels, inclusief lymfeklieren en spieren, te segmenteren in de beeldanalysesoftware. Pas afzonderlijke pseudokleuren toe in de beeldanalysesoftware om verschillende aortasegmenten zoals aortawand en tandplak te visualiseren.
    5. Gebruik de contrastbeperkte adaptieve histogram-egalisatie (CLAHE)-functie in Fiji-software om het lokale contrast op de achtergrond van de verwerkte afbeeldingen te verbeteren.

Resultaten

Om de microanatomie van de intacte gezonde en zieke aorta aan te tonen en om de fysieke verbindingen tussen het immuunsysteem, het zenuwstelsel en het cardiovasculaire systeem in muismodellen van atherosclerose te onthullen, gebruikten we twee complementaire benaderingen voor het opruimen van weefsel: TDE-klaring van de geïsoleerde aorta en iDISCO-klaring van de hele muis (Figuur 1). Na immunokleuring van de hele berg werd de enface aorta geklaard met een reeks TDE-werkoplossingen. De RI wordt afgestemd op 1,4-1,5, afhankelijk van de TDE-concentratie van de laatste stap, om een optimale transparantie van het aortaweefsel te bereiken zonder het volume te veranderen (Figuur 1A). In tegenstelling tot TDE-klaring, omvat het iDISCO-clearingprotocol ontkleurings- en permeabilisatiestappen vóór immunokleuring van de hele berg, gevolgd door delipidatie en dehydratatie met behulp van verschillende chemische oplosmiddelen, en de RI-matching op 1,56 (Figuur 1B). De iDISCO-clearing maakt visualisatie mogelijk van groot weefsel en zelfs het hele muizenlichaam als gevolg van de krimp van het weefsel.

Confocale en multifoton 3D-beeldvorming van de TDE-geclearde hele berg en gezichtsaorta maakt de visualisatie van structuren mogelijk, waaronder intimale plaques, adventitia cellulariteit en adventitia neuronale projecties onder andere structuren, terwijl light-sheet beeldvorming van iDISCO geclearde muis de visualisatie en de reconstructie van arteriële boom mogelijk maakt, samen met perivasculair vetweefsel, nierlymfeklieren en de bijbehorende neurale componenten, waaronder zenuwen en ganglia (Figuur 1C). Confocale beeldvorming van TDE-geclearde atherosclerotische aorta detecteerde bijvoorbeeld meerdere CD3e-gekleurde T-cellen in plaque en uitgebreide neogenese van NF200-gekleurde zenuwvezels met verschillende diameters in ATLO's, terwijl multifotonbeeldvorming van TDE de hele berg zieke abdominale aorta van oude Apoe-/- muizen territorialiteit vertoonde van NF200-expressie axonen die ontkiemen in B220-negatieve T-celgebieden binnen ATLO's (Figuur 2A). Omgekeerd visualiseerde light-sheet beeldvorming van iDISCO de hele buik van de muis de ruimtelijke relatie tussen de aorta en de aangrenzende sympathische ganglia. 3D-beeldsegmentatie en tracering van individuele axonen van de ganglia tot het aortaoppervlak onthulden robuuste neuronale herstructurering, inclusief nieuw gevormde NF200 gekleurde axonen in de aorta adventitia grenzend aan atherosclerotische plaque (Figuur 2B).

figure-results-1
Figuur 1: Workflow van het onderzoek. (A) TDE-klaring op waterbasis van de aorta van de voorkant . (B) iDISCO-clearing op basis van oplosmiddelen van de hele muis. (C). 3D volumetrische beeldvorming en beeldverwerking van optisch geklaarde geïsoleerde aorta of hele muizenmonsters. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Sun et al.17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Voorbeeld van 3D-beelden van TDE- en iDISCO-geklaarde weefsels. (A) 3D-beeldvorming van TDE-geklaarde en gezichtsaorta . Bovenste paneel: Confocale beelden toonden CD3e+ T-cellen (rood, pijl) in intimale plaque en NF200+ zenuwaxonen (groen) in atherosclerotische aorta adventitia (ATLO); Onderste paneel: Multifotonbeelden toonden NF200+ zenuwaxonen (groen, pijlpunten), B220+ B-cellen (rood, open driehoek), collageen-afgeleide tweede harmonische generatie (SHG, wit) in ATLO's van 78 weken oude mannelijke Apoe-/- muizen. Sytox (blauw) en DAPI (blauw) toonden de kernen. (B) 3D gereconstrueerde en gesegmenteerde beelden van iDISCO maakte de hele buik van de muis vrij. Light-sheet 3D-reconstructie, segmentatie en tracering van NF200+ zenuwen en axonen (pijlen, groen) en hun ruimtelijke relatie met sympathische ganglia (pijlpunten) van de intacte abdominale aorta. Open driehoek duidde op een nieuw gevormd axon grenzend aan atherosclerotische plaques. Autofluorescentie (auto) werd gebruikt om de aorta en het bindweefsel in beeld te brengen, inclusief plaque (cyaan) en nierlymfeklier (RLN, blauw). CG, coeliakie ganglia, SycG, sympathische keten ganglia. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Mohanta et al.6 en Sun et al.17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Atherosclerose kan worden gezien als een transmurale ontstekingsziekte van slagaders waarbij alle drie de lagen van de arteriële wand betrokken zijn. Bovendien zijn de slagaders omgeven door de perivasculaire vet- en neuronale weefsels. Tijdens de progressie van atherosclerose ondergaat elk van deze weefsels aanzienlijke cellulaire en structurele veranderingen, wat methoden vereist om subcellulaire optische toegang te krijgen tot de intacte weefsels rond gezonde en zieke slagaders. Deze methoden worden hier aangereikt om de interacties tussen cellen en cellen en weefsels beter te begrijpen en om het begrip van de pathogenese van hart- en vaatziekten te vergroten. Weefselopruiming en daaropvolgende 3D-microscopische beeldvorming maken beeldvorming mogelijk van grootschalige, tot nu toe ontoegankelijke intacte weefselcompartimenten, waardoor gedetailleerde reconstructies van slagaders worden onthuld. Hier introduceren we protocollen voor TDE- en iDISCO-technieken voor het opruimen van weefsel, waarbij we de nadruk leggen op hun effectiviteit en eenvoud bij het bereiken van bijna volledige weefseltransparantie, efficiënte beeldvorming met confocale/multifoton- of light-sheet-microscopie en tegelijkertijd het behoud van structurele integriteit.

TDE-klaring maakt gebruik van een in water oplosbaar reagens om weefseltransparantie te bereiken door de RI aan te passen, waardoor fluorescentiesignalen in het weefsel effectief worden behouden. Het vertegenwoordigt een efficiënte methode voor het opruimen van weefsel voor kleinere bloedvaten, dat wil zeggen een weefselvolume van micrometer tot millimeter zonder weefselkrimp. Het vereist echter een langere verwerkingstijd voor grotere weefsels, dat wil zeggen weefselvolumes van millimeter- tot centimetergrootte. Belangrijk is dat de procedure kan worden aangepast aan de behoefte van de gebruiker door de concentratie van de reagentia en de incubatietijd aan te passen. Aan de andere kant gebruikt iDISCO een reeks organische oplosmiddelen om lipiden en water te verwijderen, wat leidt tot een betere weefseltransparantie voor grotere weefsels, hele organen of de hele muis of grotere menselijke weefsels. Het biedt de unieke voordelen van korte verwerkingstijden en geschiktheid voor grote weefselvolumes. Het leidt echter tot krimp van de geklaarde monsters, het doven van de fluorescentiesignalen en het verwijderen van lipiden, wat een belangrijke beperking is voor lipidenrijke atherosclerotische weefsels. Bovendien kan light-sheet-microscopie, in tegenstelling tot confocale of multifotonmicroscopie, geen subcellulaire details op micrometerniveau visualiseren en neuronale projecties met een kleine diameter visualiseren, zoals enkele axonen en hun verbindingen met andere vasculaire cellen.

Vasculaire innervatie speelt een belangrijke rol bij de ontwikkeling van atherosclerose 6,7,18. Onderzoek naar de verdeling van perifere zenuwen langs de arteriële boom en hun veranderingen zal helpen om de ziekteprogressie te begrijpen. Vanwege zijn efficiënte verwerkingsvermogen wordt iDISCO vaak gebruikt voor beeldvorming van het hele vasculaire netwerk in atherosclerosemodellen bij ratten en muizen 12,19,20,21, waardoor driedimensionale beelden met een hoge resolutie worden verkregen. TDE daarentegen is geschikt voor studies die het behoud van fluorescerende labels vereisen, zoals het observeren van specifieke neuronale markers, waardoor de fijne structuur en veranderingen in vasculaire innervatie nauwkeurig worden onthuld6. Beide protocollen voor weefselopruiming zijn vereist, aangezien TDE-klaring geen krimp met zich meebrengt en lipiden in beeld kan brengen, terwijl iDISCO leidt tot weefselkrimp als gevolg van uitdroging en delipidatie. Bovendien kan het aangepaste iDISCO-protocol worden gebruikt voor het opruimen van weefsel van menselijk cardiovasculair weefsel22,23. Beide opruimtechnieken bieden complementaire voordelen voor het bestuderen van arteriële remodellering bij atherosclerose. Door de sterke punten van beide methoden te combineren, kan een uitgebreider en diepgaander begrip van de pathologische mechanismen van atherosclerose worden bereikt.

Openbaarmakingen

SKM, CJY en AJRH zijn medeoprichters van Easemedcontrol R &D GmbH en Co. KG.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door de Duitse Onderzoeksstichting (DFG) SFB1123/Z1, het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek (DZHK) DZHK 81X2600282 en een subsidie van de Corona Foundation (S199/10087/2022) aan SKM; en ERA-CVD (PLAQUEFIGHT) 01KL1808 en een overheidssubsidie aan AJRH bij Easemedcontrol R &D GmbH en Co. KG.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2,2’-thiodiethanol (TDE)Sigma 166782Clearing reagent
AmiraThermo Fisher Scientific3D visualisatiesoftware; Beeldverwerkingssoftware gebruikt voor handmatige segmentatie en tracering in 3D-beelden
Benzyl alcoholSigma W213713Clearing reagent
Benzyl benzoateSigmaB6630Clearing reagent
CD16/32eBioscience14-0161-82Blocking solution
Confocal laser scanning microscope Leica MicrosystemsTCS- SP8 3XBeeldvormingsapparaat voor multidimensionale hoge-resolutie beeldvorming van intacte biologische weefsels of secties met hoge specificiteit bij subcellulaire resolutie.
DAPIInvitrogenD3571Nucleï marker
Dichloromethane (DCM)Sigma 270997Clearing reagent
Dissecting pan-black wax Thermo Scientific S17432Aorta dissectie en fixatie 
Dissection stereomicroscopeLeica Microsystems Stemi 2000Muis orgaan dissectie
Ethanol SigmaE7023Deflectie 
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Roth 8040.1Perfusie buffer 
Fiji (ImageJ, NIH)Open source beeldverwerkingssoftware voor 2D en 3D beelden
Goat anti-Hamster IgG, Cy3Dianova 127-165-099Secundaire antilichaam
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 680Thermo Fisher Scientific / InvitrogenA-21109Secundaire antilichaam 
Goat anti-Rat IgG, Cy5Dianova712-175-150Secundaire antilichaam
Hamster Anti-CD3e BD Bioscience145-2C11 Pan-T cel marker
Huygens ProfessionalScientific Volume Imaging, The NetherlandsVersion 19.10Beeldherstelsoftware; Beeldverwerkingssoftware voornamelijk gebruikt voor deconvolutie van 2D en 3D beelden
Image processing workstationMIFCOM MIFCOM X5Beeldverwerkingswerkstation uitgerust met alle beeldverwerkingssoftware inclusief Leica application suite X, Fiji en Imaris voor nabewerking van beelden verkregen door confocale, multifoton en lichtbladmicroscopen
ImarisBitplaneVersion 8.4Beeldanalysesoftware; Beeldverwerkingssoftware gebruikt voor geautomatiseerde segmentatie van 3D-beelden
Incubator en rotator Marshall Scientific Innova 4230Incubatie- en rotatieapparaat tijdens weefsel
clearing 
iSpacerSunjin LabIS4020Rechthoekige put als monsterhouder
KetamineLivistoAnesthetisch middel
Leica Application Suite X (LAS-X) Leica MicrosystemsVersion 3.5Beeldverwerkingssoftware voor de beelden verkregen met Leica microscoop
Light microscopeLeica MicrosystemsDM LBBeeldvormingsapparaat voor helderveld beeldvorming
Light sheet  microscopeLaVision BioTechUltramicroscope IIBeeldvormingstechniek voor snelle, hoge-resolutie beeldvorming van grote biologische exemplaren of volledige muis met lage lichtblootstelling door snel verwerven van beelden van dunne optische secties.
Multiphoton microscopyLeica MicrosystemsTCS-SP5II MP Beeldvormingsmodus voor multidimensionale, hoge-resolutie beeldvorming van intacte en levensvatbare biologische weefsels op subcellulair en moleculair niveau gedurende langere periodes, diep in het monster en met minimale invasie.
Normal goat serum SigmaG9023Blocking solution
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P-6148 Fixatie 
Phosphate-buffered saline (PBS)Sigma P4417-100TAB Wasbuffer
Porcine skin gelatinSigma G1890Incubatie buffer
QuadrolSigma122262CUBIC clearing reagent
Rabbit Anti-NF200SigmaN4142Pan-neuronale marker
Rat Anti-B220 BD BioscienceRA3-6B2Pan-B cel marker
SucroseSigma 90M003524V Uitdroging 
SytoxThermo Fisher ScientificS11380Nucleï marker
TetrahydrofuranSigma 401757Clearing reagent 
Triton X-100Roth 3051.1Penetratievermogen
UreaSigma U5128CUBIC clearing reagent
Xylene Fisher Chemical x/0250/17 Anesthetisch middel 

Referenties

  1. Libby, P. The changing landscape of atherosclerosis. Nature. 592 (7855), 524-533 (2021).
  2. Mohanta, S., Yin, C., Weber, C., Hu, D., Habenicht, A. J. Aorta atherosclerosis lesion analysis in hyperlipidemic mice. Bio Protoc. 6 (11), e1833(2016).
  3. Yin, C., Mohanta, S. K., Srikakulapu, P., Weber, C., Habenicht, A. J. Artery tertiary lymphoid organs: Powerhouses of atherosclerosis immunity. Front Immunol. 7, 387(2016).
  4. Mohanta, S. K., et al. Artery tertiary lymphoid organs contribute to innate and adaptive immune responses in advanced mouse atherosclerosis. Circ Res. 114 (11), 1772-1787 (2014).
  5. Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436 (7048), 193-200 (2005).
  6. Mohanta, S. K., et al. Neuroimmune cardiovascular interfaces control atherosclerosis. Nature. 605 (7908), 152-159 (2022).
  7. Mohanta, S. K., et al. Cardiovascular brain circuits. Circ Res. 132 (11), 1546-1565 (2023).
  8. Hu, D., Yin, C., Luo, S., Habenicht, A. J. R., Mohanta, S. K. Vascular smooth muscle cells contribute to atherosclerosis immunity. Front Immunol. 10, 1101(2019).
  9. Newland, S. A., et al. Type-2 innate lymphoid cells control the development of atherosclerosis in mice. Nat Commun. 8, 15781(2017).
  10. Grabner, R., et al. Lymphotoxin beta receptor signaling promotes tertiary lymphoid organogenesis in the aorta adventitia of aged Apoe-/- mice. J Exp Med. 206 (1), 233-248 (2009).
  11. Mai, H., et al. Whole-body cellular mapping in mouse using standard igg antibodies. Nat Biotechnol. 42 (4), 617-627 (2024).
  12. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for disco tissue clearing. Mol Syst Biol. 17 (3), e9807(2021).
  13. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  14. Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. J Anat. 238 (2), 489-507 (2021).
  15. Adolfs, Y., Raj, D. D. A., Brignani, S., Pasterkamp, R. J. Protocol for tissue clearing and 3d analysis of dopamine neurons in the developing mouse midbrain. STAR Protoc. 2 (3), 100669(2021).
  16. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  17. Sun, T., et al. Tissue clearing approaches in atherosclerosis. Methods Mol Biol. 2419, 747-763 (2022).
  18. Chistiakov, D. A., Ashwell, K. W., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Innervation of the arterial wall and its modification in atherosclerosis. Auton Neurosci. 193, 7-11 (2015).
  19. Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Mol Metab. 14, 71-81 (2018).
  20. Kirst, C., et al. Mapping the fine-scale organization and plasticity of the brain vasculature. Cell. 180 (4), 780-795.e25 (2020).
  21. Todorov, M. I., et al. Machine learning analysis of whole mouse brain vasculature. Nat Methods. 17 (4), 442-449 (2020).
  22. Bhatia, H. S., et al. Spatial proteomics in three-dimensional intact specimens. Cell. 185 (26), 5040-5058.e19 (2022).
  23. Mai, H., et al. Scalable tissue labeling and clearing of intact human organs. Nat Protoc. 17 (10), 2188-2215 (2022).

Herprints en machtigingen

Tags

Beeldvorming van aortawefselprogressie van atheroscleroseweefselklaringconfocale microscopiemulti foton beeldvormingimmunolabelingremodellering van de adventitiavisualisatie van neurale netwerkenbeeldsegmentatie
Driedimensionale beeldvorming van aortaweefsels bij atherosclerose
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.