Het opzetten van een model voor oppervlakkige blaaskanker bij muizen via een intravesicale celtoedieningstechniek

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een unieke methode voor het construeren van een orthotopisch model van oppervlakkige blaaskanker.

Samenvatting

Deze studie presenteert een innovatieve methode voor het opzetten van een orthotopisch tumormodel van de muizenblaas met een hoge efficiëntie en nauwkeurige tumorlokalisatie. Na het verdoven van vrouwelijke C57BL/6J-muizen in rugligging, wordt een intraveneuze naald van 24 G in de blaas ingebracht om de inhoud te evacueren. Een doseernaald van 34 G wordt vervolgens door de katheter ingebracht, vijf keer gedraaid om een focaal letsel aan het slijmvlies van de blaaskoepel te veroorzaken en vervolgens verwijderd. De MB49-celsuspensie wordt aangezogen en aangesloten op een doseernaald van 30 G, die via de katheter in de blaas wordt ingebracht. Tumorcellen worden onder druk submucosaal in de blaas geïnjecteerd. Deze techniek resulteert in minimaal trauma voor de muizen, een hoge tumoropnamesnelheid en een vaste tumorlocatie. Het wordt gekenmerkt door eenvoud en uitstekende reproduceerbaarheid. Dit model biedt een ideaal experimenteel platform voor het ontwikkelen van intravesicale therapieën voor blaaskanker, waardoor de vooruitgang en optimalisatie van behandelingsstrategieën voor deze maligniteit wordt vergemakkelijkt.

Inleiding

Blaaskanker vertegenwoordigt een aanzienlijke wereldwijde gezondheidslast, met opmerkelijke geslachtsspecifieke verschillen in incidentie en prognose. Deze maligniteit wordt gekenmerkt door verschillende moleculaire subtypes, elk geassocieerd met diverse pathogene routes. De moleculaire en pathologische kenmerken verschillen significant tussen niet-spierinvasieve blaaskanker (NMIBC) en spierinvasieve blaaskanker (MIBC)^1,2. NMIBC is goed voor ongeveer 75% van de gevallen, met tumoren van transitionele epitheliale oorsprong die gelokaliseerd blijven zonder metastase of verspreiding. Omgekeerd wordt MIBC gekenmerkt door de infiltratie van kankercellen in de spierlaag van de blaas, vergezeld van een hoog risico op verspreiding, waardoor cystectomie in de klinische praktijk vaak nodig is³.

In preklinisch onderzoek zijn modellen die het oppervlakkige stadium van de ziekte nauwkeurig weergeven essentieel voor het evalueren van medicamenteuze therapieën. Het opstellen van een oppervlakkig blaascarcinoom in situ model is daarom van het grootste belang, dat dient als een cruciaal onderzoeksinstrument voor de ontwikkeling van klinische geneesmiddelen en innovatieve instillatietherapieën.

De ontwikkeling van modellen van orthotope blaaskanker bij muizen heeft van oudsher te maken gehad met uitdagingen. Chemisch geïnduceerde modellen beginnen vaak als oppervlakkige tumoren, maar kunnen evolueren naar invasieve vormen, met variabiliteit die hun bruikbaarheid in grootschalige experimenten beperkt⁴. Traditionele orthotope implantatiemodellen, die gebaseerd zijn op de injectie van tumorcellen door de blaaswand⁵, hebben moeite om oppervlakkige blaaskanker getrouw te reproduceren. Alternatieve methoden, waaronder slijmvliesbeschadiging in combinatie met instillatie van tumorcellen 6,7,8,9,10, zijn geprobeerd, maar worden beperkt door hoge sterftecijfers en lage tumoropnamepercentages, wat een bredere toepassing ervan belemmert.

Deze studie heeft tot doel een nieuwe methode te ontwikkelen voor het construeren van een oppervlakkig blaaskankermodel dat een grotere stabiliteit, lagere mortaliteit en vaste tumorpositionering vertoont in vergelijking met bestaande modellen. Door een preciezere weergave van de ziekte in een vroeg stadium te bereiken, is het huidige model klaar om de rigoureuze evaluatie van preventieve en therapeutische interventies te verbeteren, waardoor de behandeling van blaaskanker wordt bevorderd.

Protocol

Alle protocollen en procedures voor dierproeven zijn goedgekeurd door de Ethische Toetsingscommissie voor Dierproeven van de Tianjin Medical University, Tianjin, China (goedkeuringsnummer SYXK: 2020-0010). Voor dit onderzoek werden zes tot acht weken oude vrouwelijke C57BL/6J-muizen gebruikt. De dieren werden gehuisvest onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden, waaronder een licht-donkercyclus van 12 uur, temperaturen variërend van 21-25 °C, instelbare vochtigheidsniveaus tussen 30%-70% en onbeperkte toegang tot voedsel en water, tenzij anders aangegeven. De details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van de cellen

1. Kweek de muizenblaaskankercellijn MB49 in volledige Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) om een optimale groei te ondersteunen.
2. Houd de celculturen onder standaardomstandigheden bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO₂ . Vernieuw de media elke 2-3 dagen om de gezondheid en levensvatbaarheid van de cellen te garanderen.
3. Oogst de cellen met behulp van een gestandaardiseerde trypsineverteringsprocedure. Piket voorzichtig om de cellen uit de kweekkolf te verwijderen na het aanbrengen van trypsine en het incuberen gedurende een korte periode.
4. Tel de geoogste cellen met behulp van een hemocytometer om de exacte celdichtheid te bepalen. Bereid een eencellige suspensie door de cellen te resuspenseren tot 2 x 10³/μL in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Bewaar deze suspensie op ijs om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden.

2. Voorbereiding van dieren

1. De groep huisvest de muizen (5 muizen per kooi) in individueel geventileerde kooien van polycarbonaat.
2. Laat de muizen 7 dagen acclimatiseren voor aanvang van het onderzoek.

3. Generatie van orthotope tumormodellen bij dieren

1. Dien anesthesie toe aan de muizen via intraperitoneale injectie met een 2,5% oplossing van Avertin (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
2. Wacht tot de muizen een geschikt niveau van anesthesie bereiken voor een operatie, zoals aangegeven door een afname van de ademhalingsfrequentie met een toename in diepte, de afwezigheid van ooglid- en hoornvliesreflexen, verminderde spierspanning en reflexreacties, en geen reactie op een knelling.
3. Plaats de verdoofde muis in rugligging om de procedure te vergemakkelijken.
4. Gebruik een intraveneuze katheter van 24 G waarbij de naaldstilet is verwijderd voor de urethrale katheterisatieprocedure. Breng voldoende glijmiddel aan op de katheter om ongemak te minimaliseren en het inbrengen soepel te vergemakkelijken.
5. Identificeer de urethra, die zich direct achter de vulvaire plooien en vóór de vagina bevindt, terwijl u de muis in rugligging houdt.
   1. Begin de katheterisatie door de urethra in een hoek van 45 graden te benaderen om onder het schaambeen te navigeren. Stel in op een ondiepere hoek om de katheter door de urethra en in de blaas te leiden.
6. Vermijd het uitoefenen van overmatige kracht tegen weerstand, omdat dit kan leiden tot urethrale of blaasperforatie. Bevestig de locatie van de katheter in het blaaslumen door te controleren of er urine in de katheter is.
7. Oefen voorzichtig druk uit op de onderbuik van de muis om de afvoer van urine uit de blaas te vergemakkelijken. Zorg ervoor dat de blaas volledig is geleegd om u voor te bereiden op de volgende stappen van de procedure.
8. Duw de 24 G intraveneuze katheter voorzichtig naar de bovenkant van de blaas. Zorg ervoor dat de punt van de katheter contact maakt met de top van de blaas.
   1. Zodra het contact is bevestigd, laat u de katheter los en laat u deze iets terugtrekken. Houd de katheter in een vaste positie ten opzichte van de muis om stabiliteit te garanderen en losraken te voorkomen.
9. Steek de gewijzigde 34 G-doseernaald langs de 24 G-katheter. Beweeg de naald naar voren totdat deze de bovenkant van de blaas bereikt.
   1. Eenmaal gepositioneerd, draait u de naald zes keer om een gelokaliseerde slijmvliesbeschadiging aan de top van de blaas te creëren. Trek na het voltooien van de rotatie de naald voorzichtig terug langs de katheter.
10. Sluit de doseernaald van 30 G aan op de bovenkant van een spuit van 1 ml. Zorg voor een goede verbinding tussen de naald en de spuit.
    1. Eenmaal aangesloten, zuigt u de vooraf voorbereide 2 x 10³/μL MB49-celsuspensie in de spuit door de zuiger voorzichtig terug te trekken. Controleer of de celsuspensie zonder luchtbellen in de spuit wordt aangezogen.
11. Steek de 30 G-doseernaald langs de 24 G-katheter. Zorg ervoor dat de naald goed is uitgelijnd en vastzit in de katheter.
    1. Eenmaal geplaatst, oefent u druk uit op de zuiger van de spuit van 1 ml om de inhoud te injecteren (voorbereid in stap 1). Houd gedurende 60 s een constante druk op de zuiger om ervoor te zorgen dat de inhoud wordt afgeleverd zonder aanzienlijke volumevermindering.
    2. Trek na 60 s voorzichtig de spuit en de 30 G-doseernaald uit de katheter.

4. Postoperatieve monitoring

1. Plaats de verdoofde muis in rugligging op een verwarmingskussen totdat de oprichtreflex terugkeert.
2. Zorg ervoor dat het dier niet zonder toezicht wordt achtergelaten totdat het weer voldoende bij bewustzijn is.
3. Breng het dier pas terug naar het gezelschap van andere dieren als het volledig hersteld is.

Resultaten

De werkzaamheid van submucosale injecties werd aanvankelijk beoordeeld door toediening van Trypan Blue. Na de injectie werd de verdeling van de kleurstof in de submucosale laag duidelijk gevisualiseerd, wat de nauwkeurige en gecontroleerde afgifte van de geïnjecteerde stoffen bevestigde (Figuur 1).

De ontwikkeling van de tumor werd nauwgezet gevolgd. Ongeveer 14 dagen na implantatie werd een opmerkelijke incidentie van hematurie w...

Discussie

Onderzoek naar blaaskanker is gebaseerd op diermodellen, die onmisbaar zijn voor zowel fundamenteel als toegepast onderzoek. Om de tumorgroeiomgeving beter na te bootsen, bieden orthotope blaastumormodellen een superieure benadering in vergelijking met subcutane tumormodellen¹¹.

Momenteel kunnen orthotope blaaskankermodellen op basis van experimentele doeleinden worden gecategoriseerd in twee hoofdtypen: muizen die gebruik maken van imm...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
34 G dispensing needle	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
30 G dispensing needle	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
Avertin	Sigma-Aldrich LLC	T48402
Trypan blue	Sigma-Aldrich LLC	302643