Karakterisering van biologische absorptiespectra die zich uitstrekken van het zichtbare tot het kortegolf-infrarood

Samenvatting

Biologische monsters hebben duidelijke optische kenmerken in het kortegolf-infrarood (SWIR) in vergelijking met het zichtbare (VIS) en nabij-infrarood (NIR) golflengtebereik. Het registreren van zuivere SWIR-absorptiespectra is echter een uitdaging en wordt zelden uitgevoerd voor biologische moleculen. Dit artikel presenteert een methode om de VIS-SWIR-absorptiespectra van biologische absorbers te karakteriseren.

Samenvatting

Voor niet-invasieve fysiologische monitoring op basis van licht kunnen optimale golflengten van individuele weefselcomponenten worden geïdentificeerd met behulp van absorptiespectroscopie. Vanwege het gebrek aan gevoeligheid van hardware bij langere golflengten, is absorptiespectroscopie echter meestal toegepast voor golflengten in het zichtbare (VIS) en nabij-infrarood (NIR) bereik van 400 tot 1.000 nm. Hardwareverbeteringen in het kortegolf-infrarood (SWIR) -bereik hebben onderzoekers in staat gesteld om golflengten te onderzoeken in het bereik van ~ 1.000 nm tot 3.000 nm, waarin de karakteristieke absorptiepieken voor lipide, eiwit en water vallen. Deze moleculen zijn moeilijk te visualiseren in de VIS-NIR en kunnen labelvrije bronnen van biologisch contrast bieden. Bovendien is een lagere SWIR-absorptie waargenomen voor melanine, de primaire chromofoor die verantwoordelijk is voor huidpigmentatie. In vivo optische apparaten zoals klinisch standaard pulsoximeters blijken een verminderde nauwkeurigheid te hebben bij mensen met een donker gepigmenteerde huid, mogelijk vanwege de sterkere melanine-absorptie in het VIS-bereik. Fouten in verband met huidpigmentatie kunnen dus worden verminderd door apparaten te gebruiken die in de SWIR werken. Het ontwerp van optische instrumenten wordt vergemakkelijkt door het begrip van de absorptie-eigenschappen van kernweefselcomponenten van het VIS- tot het SWIR-bereik. Dit artikel beschrijft protocollen en instrumentatie voor het verkrijgen van VIS-SWIR-absorptiespectra van gewone weefselabsorbers: zuurstofrijk hemoglobine, zuurstofarm hemoglobine, melanine, water en lipide.

Inleiding

De meeste biologische absorbers zijn optisch gekarakteriseerd in het zichtbare (VIS, ~400-700 nm) en nabij-infrarood (NIR, ~700-1.000 nm) spectrale bereiken, maar niet in het kortegolf-infrarood (SWIR, ~1.000-3.000 nm)1,2,3,4 (Figuur 1). Dit ondanks het feit dat de SWIR een diepere lichtpenetratie biedt dankzij een lagere weefselverstrooiing en verminderde absorptie van melanine, evenals extra labelvrij biologisch contrast voor water, lipiden en eiwitten ^1,5,6. Het gebrek aan absorptiespectra die de VIS-SWIR overspannen, heeft een leemte in de kennis gecreëerd die de ontwikkeling van biomedische optische apparaten die profiteren van deze SWIR-voordelen verhindert. Hoewel er in het verleden verschillende pogingen zijn gedaan om de spectra te karakteriseren, ontbreken hoogwaardige VIS-SWIR-absorptiespectra van zuivere componenten zonder significante oplosmiddelartefacten ^1,7,8. In de SWIR zijn bijvoorbeeld in water oplosbare stoffen zoals hemoglobine gekarakteriseerd, waarbij water als oplosmiddel wordt gebruikt en de absorptie van zuiver water wordt afgetrokken van de resulterende spectra⁹. De nauwkeurigheid van deze aanpak is echter onduidelijk, omdat water een dominante absorbeerder is in deze regio.

Werken in de SWIR heeft als bijkomend voordeel dat het vertekening veroorzaakt door sterke melanineabsorptie in het VIS bij gebruik van in vivo optische diagnostiek vermindert of mogelijk verwijdert. Talrijke onderzoeken hebben aangetoond dat pulsoximeters de oxygenatie bij zwarte patiënten overschatten, en als zodanig hebben zwarte patiënten meer kans op gevaarlijk lage zuurstofniveaus die pulsoximeters niet hebben gedetecteerd¹⁰. Deze huidpigmentatiebias heeft geresulteerd in een vertraagde en ontoereikende medische behandeling van veel zwarte hypoxische patiënten^11,12 en heeft geleid tot een oproep tot actie in de optica- en technische gemeenschappen om de nauwkeurigheid van optische apparaten voor alle huidtinten te verbeteren¹³. De overstap van de hoge melanine-absorberende VIS-golflengten naar de NIR en SWIR is een opwindende technische innovatie die raciale ongelijkheden in kritisch belangrijke biomedische optische technologieën zou kunnen verminderen.

Het registreren van absorptiespectra van biomoleculen is essentieel voor het begrijpen van de optische eigenschappen van weefselmonsters die worden gebruikt in een verscheidenheid aan technische en biomedische toepassingen¹⁴. Absorptiespectroscopie meet molecuulspecifieke lichtabsorptie als functie van de golflengte. De gouden standaardmethode voor het verkrijgen van absorptiemetingen in oplossing is om gecollimeerd, monochromatisch licht door een opgelost monster te sturen en het doorgelaten licht op te nemen met een detector die aan de andere kant van het monster van de lichtbron is geplaatst. De absorptie (A) van het monster wordt dan gedefinieerd door Eq. (1).

A = log₁₀(I₀/I) (1)

Waarbij I_o de intensiteit van het invallende licht op het monster is, en I de intensiteit van het licht dat door het monster wordt doorgelaten en dat de detector raakt. I_o wordt verkregen door het meten van een referentie, die meestal het oplosmiddel is van de opgeloste stof van belang, met behulp van dezelfde acquisitie-instellingen als I. Absorptiespectroscopie biedt kwantitatieve absorptie-eigenschappen en wordt beheerst door de wet van Beer-Lambert (Eq. 2), die niet van toepassing is op monsters met optische verstrooiing. Deze vergelijking stelt dat optische absorptie wordt bepaald door de molaire absorptiecoëfficiënt van een monster (ε, eenheden L·^mol-1·^cm-1) bij golflengte λ vermenigvuldigd met de molaire concentratie (C, eenheden mol∙^L-1) en de weglengte (L, eenheden cm), die wordt gedefinieerd als de afstand die door het monster is afgelegd¹⁵:

A(λ) = ε(λ)*L*C (2)

Belangrijk is dat de molaire absorptiecoëfficiënt uniek is voor elke biologische absorber en aangeeft hoe sterk een monster licht absorbeert bij een bepaalde golflengte¹⁶.

Bij het uitvoeren van absorptiespectroscopiemetingen van het VIS tot de SWIR zijn aanpassingen aan hardware, monstervoorbereiding en spectrale nabewerking vereist die verder gaan dan de standaard VIS-NIR-spectra:

Hardware
VIS-NIR-metingen maken doorgaans gebruik van een siliciumdetector of fotomultiplicatorbuizen (PMT) met fotokathodes die gevoelig zijn voor UV-VIS-fotonen, terwijl SWIR-absorptie een fotodetector vereist die gevoelig is voor SWIR-fotonen, zoals een Indium Gallium Arsenide (InGaAs) detector¹⁷. VIS-, NIR- en SWIR-systemen vereisen doorgaans ook golflengtespecifieke dispersie-elementen, zoals optische roosters, voor lichtdispersie in deze optische bereiken. Bovendien vereist SWIR-absorptie glas- of kwartscuvetten, die een hogere transmissie hebben dan plastic cuvetten in de SWIR, waardoor ze geschikter zijn voor VIS-SWIR-spectra. Er moet een lichtbron of lichtbronnen worden gekozen met een brede en relatief uniforme emissie die de VIS-SWIR bestrijkt, zoals een wolfraamhalogeenlamp (gebruikt in dit protocol). Het aanpassen van het invallende lichtvermogen, de belichtingstijd of de duur gedurende welke de fotodetector aan licht wordt blootgesteld, kan helpen bij het optimaliseren van absorptiemetingen.

Voorbereiding van het monster
De concentratie van het monster of de padlengte van de cuvet zal de hoeveelheid absorptie die optreedt zoals hierboven beschreven in Eq (2) lineair veranderen, en kan dus worden gewijzigd om een hoge signaal-ruisverhouding te bereiken (SNR, hierin berekend als de verhouding van de piekamplitude gedeeld door de standaarddeviatie van een gedetrended gebied van het spectrum, meestal SNR > 30 wordt als hoge kwaliteit beschouwd) metingen in verschillende delen van het spectrum met relatief hoge of lage Extinctie. Om SWIR-metingen in een waterige oplossing te optimaliseren, kan deuteriumoxide (D₂O), ook wel zwaar water of gedeutereerd water genoemd, worden gebruikt in plaats van water (H₂O), omdat het aanzienlijk lagere absorptiepieken in de SWIR¹ heeft. Dit maakt de karakterisering van de opgeloste stof mogelijk zonder interferentie van de dominante waterabsorptie in de SWIR.

Spectrale nabewerking
Nabewerking is vereist omdat VIS-SWIR-spectra twee detectoren vereisen, één voor de zichtbare-NIR (meestal silicium of UV-VIS-gevoelige PMT) en één voor de SWIR (meestal InGaAs), en de spectra moeten aan elkaar worden gehecht om een volledig VIS-SWIR-spectrum te bereiken. Wanneer spectra de VIS-SWIR overspannen, kan de absorptie aanzienlijk variëren, afhankelijk van het golflengtegebied, en het kan nodig zijn om het monster in sommige gebieden te verdunnen of de padlengte te verkleinen om verzadiging te voorkomen. Spectra moeten lineair worden geschaald om rekening te houden met veranderingen in de monsterconcentratie of padlengte en vervolgens worden samengevoegd om een enkel spectrum te creëren dat twee golflengtegebieden omvat.

De volgende protocollen zullen de voorbereiding en spectroscopische meting van de VIS naar de SWIR van vijf voorbeelden biologische absorbers beschrijven: water (omvat ~60% van het lichaamsgewicht), melanine (primaire absorber voor huidpigmentatie), maïsolie (gebruikt als analoog voor menselijke lipiden omdat het een lage variabiliteit heeft tussen batches, nauwe chemische samenstelling met menselijke en dierlijke lipiden, en minimale verstrooiing), en zuurstofrijk en zuurstofarm hemoglobine (de primaire absorbeerders in het bloed).

Protocol

1. Voorbereiding van de monsters

1. Voorbereiding van het watermonster
   1. Om het monster voor te bereiden, vult u een schone container met ultrapuur water en filtreert u deze met behulp van een spuitfilter van 0,22 μm. Zorg ervoor dat de uitvoer van de spuit naar een schone glas- of kwartscuvet wordt geleid om absorptiespectroscopiemetingen van het monster uit te voeren.
   2. Om de referentie voor te bereiden, vult u een schone container met gedeutereerd water en filtreert u deze met behulp van een spuitfilter van 0,22 μm. Zorg ervoor dat de uitvoer van de spuit naar een identieke schone glas- of kwartscuvet wordt geleid als de monstercuvet om als referentie te dienen.
      OPMERKING: De filterstap minimaliseert optische verstrooiing van het monster door kleine deeltjes in het water uit te filteren, die een sterke bijdrage leveren in het zichtbare gebied.
2. Bereiding van melaninemonster
   1. Bereid een oplossing van 1,7 mg/ml melanine voor door melanine in poedervorm toe te voegen aan een centrifugebuis gevuld met 3,5 ml dimethylsulfoxide (DMSO). Om te beginnen moeten de metingen beginnen bij de golflengten met de laagste verwachte absorptie, waar de hoogste concentratie melanine vereist is. Begin melaninemetingen met ongeveer 1,7 mg/ml voor de SWIR en verdun het later met DMSO tot een 10x verdunning (ongeveer 0,17 mg/ml) voor de VIS/NIR-regio's.
   2. Sonificeer de buis gedurende 10 minuten om ervoor te zorgen dat de melanine in poedervorm oplost in de DMSO en breng de oplossing over in een schone glas- of kwartscuvet voor spectroscopiemetingen.
   3. Blijf binnen het lineaire absorptiebereik van de spectrometer en zorg voor hoge SNR-metingen door de concentratie en/of weglengte te wijzigen (bijv. door over te schakelen van een korte weglengte (1 of 2 mm) naar een komaatcuvet van 10 mm). De absorptie van melanine heeft een breed bereik, van VIS tot SWIR. Gebruik voor het VIS de laagste concentratie en/of padlengtecuvet van melanine vanwege de hoge molaire extinctiecoëfficiënt; gebruik voor de SWIR de hoogste concentratie melanine en/of padlengtecuvet om een kwalitatief schone spectroscopiemeting te verkrijgen.
3. Voorbereiding van maïsoliemonster
   1. Voeg maïsolie toe aan een schone glas- of kwartscuvet voor spectroscopiemetingen.
   2. Gebruik open lucht als referentie. Er wordt geen cuvet of oplossing als referentie gebruikt.
4. Bereiding van zuurstofrijk hemoglobinemonster met volledig gehepariniseerd menselijk bloed
   OPMERKING: Volledig gehepariniseerd menselijk bloed werd gekocht en ingezameld in door de FDA erkende inzamelcentra in de Verenigde Staten.
   1. Om hemoglobine uit de rode bloedcellen (RBC's) te isoleren en zoveel mogelijk water uit het bloed te verwijderen, pipetteert u eerst 1.800 μL volledig gehepariniseerd menselijk bloed in microcentrifugebuisjes en centrifugeert u bij 9,6 × g gedurende 10 minuten.
      OPMERKING: Ongeveer 4-6 microcentrifugebuisjes worden aanbevolen
   2. Verwijder na het centrifugeren de buisjes uit de microcentrifuge, verwijder vervolgens het bovenstaande (zal ongeveer 850 μl zijn) uit het gecentrifugeerde bloedmonster en gooi het weg zonder de pellet te verstoren (figuur 2). Het bovenstaande bestaat uit de vloeistof (voornamelijk plasma en bloedplaatjes) boven de rode bloedcelkorrel. Zoek naar de rode bloedcelpellet op de bodem van de microcentrifugebuis.
   3. Reconstitueer elke pellet met dezelfde hoeveelheid gedeutereerd water als de hoeveelheid bovengronds die is weggegooid. Centrifugeer opnieuw bij 9,6 × g gedurende 10 min.
   4. Verwijder de buisjes uit de centrifuge en gooi het bovenstaande weg zonder de pellet te verstoren.
   5. Reconstitueer de pellet met dezelfde hoeveelheid gedeutereerd water als de hoeveelheid supernatans die is weggegooid. Centrifugeer opnieuw bij 9,6 × g gedurende 10 min.
   6. Verwijder de buisjes uit de centrifuge, verwijder vervolgens het bovenstaande met een pipet en gooi het weg.
   7. Lyseren van rode bloedcellen (RBC's): Reconstitueer de RBC-pellets met een groot volume (4,5 ml) gedeutereerd water, wat een hypotone burst zal veroorzaken. Als de pellet aan de buis blijft plakken, spoel deze dan af met een deel van de gemeten 4,5 ml gedeutereerd water om deze los te maken.
      OPMERKING: Het volume van het bovenstaande neemt toe na elke centrifugatiestap. Dit volume van supernatans kan variëren van 800 μL tot 1.600 μL. Het volume gedeutereerd water voor lysing kan veranderen afhankelijk van de gewenste monsterconcentratie, maar moet hoog genoeg zijn om een hypotone barsting te veroorzaken.
   8. Verwijder de gelyseerde bloedoplossing uit de buis met een naald en spuit; Verwijder vervolgens voorzichtig de naald van de stompe punt en gooi deze weg in een container voor biologisch gevaarlijke scherpe voorwerpen. Sluit de spuit aan op een spuitfilter van 0,22 μm en duw de inhoud van de spuit door het filter in een wegcuvet van 3,5 ml met een weglengte van 3,5 ml.
      OPMERKING: De filterstap minimaliseert optische verstrooiing van het monster door de cellulaire organellen en membranen in de oplossing uit te filteren. Als het monster sterk geconcentreerd is en het spuitfilter moeilijk te duwen is, gebruik dan meerdere spuitfilters.
   9. Zet de cuvet met een luchtdichte stop vast over de cuvet om te voorkomen dat waterdamp uit de lucht het monster vervuilt. Parafilm de buitenkant van de stop om besmetting verder te voorkomen en een luchtdichte afsluiting te garanderen.
      OPMERKING: Voor metingen van 600 nm tot 1.600 nm zal ongeveer 1.200-1.600 μL pellet opgelost in 4,5 ml gedeutereerd water kwalitatief schone metingen geven.
      OPMERKING: Voor spectrale gebieden met een hoge verwachte absorptie (400 nm tot 600 nm) moeten monsters worden verdund met gedeutereerd water om niet-verzadigde absorptiewaarden te verkrijgen en ervoor te zorgen dat de absorptiewaarden binnen het lineaire bereik van de detector liggen. Bovendien moeten de monsters en de referentie in cuvetten met een korte weglengte (1 of 2 mm) worden geplaatst. Voor de hierin getoonde spectra werden monsters 10x verdund voor 400-500 nm en 5x voor 500-600 nm en gemeten in cuvetten met een weglengte van 2 mm.
      De kortere weglengte (1 of 2 mm) zorgt voor minder lichtabsorptie in sterk absorberende golflengten, waardoor sommige fotonen doorgeven aan de detector en binnen het lineaire detectiebereik blijven.
   10. Zorg voor een schone cuvet met dezelfde padlengte en hetzelfde volume als de monstercuvet met de gefilterde bloedoplossing en vul deze met gedeutereerd water voor basislijn- en referentiemetingen. Als u de weglengtes van de cuvetten voor verschillende spectrale bereiken wijzigt, noteer dan een nieuw referentiespectrum voor elke koosweglengte.
5. Bereiding van zuurstofarm hemoglobinemonster met volledig gehepariniseerd menselijk bloed
   1. Volg stap 1.4.1-1.4.8.
   2. Voeg natriumdithioniet toe aan de bloedoplossing in de cuvet en roer voorzichtig. Zet de cuvet met een luchtdichte stop vast over de cuvet om te voorkomen dat waterdamp uit de lucht het monster vervuilt. Parafilm de buitenkant van de stop om besmetting verder te voorkomen en een luchtdichte afsluiting te garanderen. Kantel de cuvet voorzichtig heen en weer om ervoor te zorgen dat het natriumdithioniet oplost in de oplossing; De bloedoplossing verandert van een rode kleur naar een donkerdere paarsrode kleur.
      OPMERKING: Om hemoglobine volledig te deoxygeneren, is de massa natriumdithioniet die nodig is ongeveer 0,007 g per ml bloedoplossing. Volgens Briley-Sӕbø en Bjørnerud is ten minste 2,5 mg natriumdithioniet/g bloed nodig om volbloed volledig te deoxygeneren¹⁸. Deze concentratie bleek echter onvoldoende te zijn in de studies hier. Een concentratie van ongeveer 3,4 mg/g volbloed bleek de bloedoplossing volledig zuurstofvrij te maken zonder de introductie van optische verstrooiing. Voor metingen van 400 tot 600 nm moet de bloedoplossing worden verdund met gedeutereerd water. Bereken de vereiste massa van natriumdithioniet op basis van het gebruikte volume bod-oplossing en niet op het volume na verdunning. Voor metingen van 600 nm tot 1.600 nm zal ongeveer 1.200-1.600 μL pellet opgelost in 4,5 ml gedeutereerd water hoge SNR-metingen geven.
      Een cuvet met een kortere padlengte (1 of 2 mm) zorgt voor minder lichtabsorptie in sterk absorberende golflengten, waardoor sommige fotonen doorgeven aan de detector en binnen het lineaire detectiebereik blijven.
   3. Vul een andere cuvet met een gelijke baanlengte als de cuvet met gefilterde bloedoplossing met gedeutereerd water voor basislijn- en referentiemetingen. Als u de weglengtes van de cuvetten voor verschillende spectrale bereiken wijzigt, noteer dan een nieuw referentiespectrum voor elke koosweglengte.

2. Verkrijgen van hoogwaardige absorptiemetingen

1. Bereid monsters en referentie voor zoals beschreven in sectie 1 en plaats ze in glazen of kwartscuvetten voor VIS NIR-SWIR-metingen. Zet de spectrometer aan lamp en detectoren en laat het systeem minimaal 5-20 minuten opwarmen, afhankelijk van het spectrometersysteem en de lichtbron.
   OPMERKING: Vijf minuten zorgde voor voldoende koeling van de detector en stabiliteit van de lampoutput voor de hierin verzamelde spectra, maar dit moet voor elk systeem worden gekarakteriseerd voordat de absorptiemetingen worden vastgelegd.
   Houd het monster en de referentie bij de hand tijdens deze verzamelperiode. Zorg ervoor dat de deksels van de cuvetten goed vastzitten. Houd de meetruimte zo donker mogelijk om vervorming van de absorptiemetingen door omgevingslicht te voorkomen.
2. Herhaal de volgende stappen voor verschillende delen van het spectrum vanwege de grote variatie in absorptie in de VIS-SWIR.
   1. Als u een configuratie met dubbele bundel gebruikt (twee afzonderlijke detectoren voor monster en referentie), zorg er dan voor dat het systeem op de basislijn staat. Verkrijg de basislijn door identieke referentiemonsters met het oplosmiddel voor elke detector te plaatsen en verzamel een absorptiemeting met behulp van de exacte acquisitieparameters die moeten worden gebruikt voor het verzamelen van het monsterabsorptiespectrum. Hoewel de detectoren theoretisch nul absorptie zouden moeten vertonen, is dit meestal niet perfect. Trek het resulterende absorptiespectrum af van alle monsterabsorptiespectra die met dezelfde instellingen worden verkregen.
      OPMERKING: De basislijn moet worden herhaald telkens wanneer de acquisitie-instellingen voor gegevensverzameling worden gewijzigd.
   2. Plaats het monster in de spectrometer en kies de detector die relevant is voor het te meten gebied (VIS-NIR = silicium of UV-VIS PMT, SWIR = InGaAs) en bekijk de absorptie in Live Mode, waarin de meting continu wordt bijgewerkt als meetparameters worden afgestemd.
   3. Begin met de standaard spectrometerparameters en pas het vermogen van het invallende licht en de belichtingstijd aan totdat een kwalitatief schoon absorptiespectrum zonder verzadiging is verkregen.
      1. Als het afstemmen van de parameters niet resulteert in kwalitatief zuivere spectra, wijzig dan parameters zoals invallend lichtvermogen, belichtingstijd, padlengte en monsterconcentratie. Probeer eerst het vermogen en de belichtingstijd aan te passen. Als het afstemmen van deze parameters niet leidt tot een hoog SNR-spectrum, wijzigt u de monsterconcentratie of de weglengte van het monster en de referentie.
         OPMERKING: De standaardparameters die werden gebruikt bij het verzamelen van de hierin getoonde spectra waren invallend lichtvermogen van 15 nW bij 400 nm en 20 nW bij 1.000 nm, belichtingstijd van 30 ms, kuvettenpadlengte van 10 mm en monsterspecifieke concentraties: 100% water, melanine 1,7 mg/ml, 100% maïsolie, zuurstofrijk hemoglobine (15,9 g/dl), en zuurstofarm hemoglobine (15,9 g/dl).
      2. Als u de SNR wilt verhogen, verhoogt u het gemiddelde aantal gelezen gegevens per gegevenspunt. Hoe hoger het gemiddelde aantal gelezen gegevens, hoe langer de tijd per meting.
      3. Om de spectrale resolutie te verhogen, verkleint u de stapgrootte (nm) van de meting tot de resolutielimiet van de spectrometer. Hierdoor wordt de tijd per meting langer. Verminder bovendien de vermogensbandbreedte^{van het} invallende licht tot 1/10e van de volledige breedte van de smalste piek bij de helft van maximaal¹⁹.
      4. Zodra de meetinstellingen voor het monster zijn geoptimaliseerd, documenteert u de instellingen voor elk verkregen spectrum.
      5. Om een spectrum te verkrijgen, gebruikt u de geoptimaliseerde instellingen om alleen de referentie te meten. Vervang vervolgens de referentiecuvet door de voorbeeldcuvet en voer nog een meting uit. Zorg ervoor dat u zowel de referentie- als de voorbeeldmetingen afzonderlijk opslaat.
         OPMERKING: Het is absoluut noodzakelijk dat de referentiemeting niet verzadigd raakt. Als dit het geval is, verminder dan het invallende lichtvermogen en/of de belichtingstijd totdat er geen verzadiging meer is. Houd alle systeemparameters hetzelfde tussen de referentie- en monstermetingen; Als de ene moet worden gewijzigd, moet de andere ook worden herhaald om overeen te komen.
      6. Bereken voor elke gepaarde set referentie- en monstermetingen de extinctie A (Eq 1) door de referentiemeting te behandelen_{als I o} en de monstermeting als I.
      7. Om verschillende gebieden aan elkaar te naaien die verschillen in monsterconcentratie of padlengte vereisten, past u een vermenigvuldigingsfactor toe op een van de spectrale gebieden. Bijvoorbeeld, voor een eerste gebied dat 1/10 van de concentratie en identieke padlengte had als een tweede gebied, vermenigvuldigt u het eerste spectrale gebied met 10 om de twee regio's op de juiste manier samen te schalen.
         OPMERKING: De vermenigvuldigingsfactor moet het verschil in concentratie en/of padlengte tussen de regio's zijn.
      8. Nadat de spectra zijn gecorrigeerd voor verschillen in padlengte of concentratie, kiest u een overlappende golflengte in de twee spectrale gebieden om de twee gebieden aan elkaar te hechten.
      9. Kort de twee spectra af om te eindigen op de overlappende golflengte; Kies één spectrum om de spectrale overgangswaarde op te nemen. Verbind de twee afgekapte spectra om een enkel resulterend spectrum met een breder golflengtebereik te creëren.

Resultaten

Gegevens zijn beschikbaar via de WUSTL Digital Research Materials Repository (DRMR) doi: https://doi.org/10.7936/6RXS-108249

Spectrale karakterisering van water
Water, een van de meest voorkomende biologische absorbers, heeft karakteristieke, sterk absorberende pieken in de NIR en SWIR. Deze karakteristieke pieken zijn zo sterk dat bij het meten van de absorptie van water het vaak verdund moet worden met gedeutereerd water om verzadiging te voorkomen. Het verschil in absorptie tussen water en gedeutereerd water wordt weergegeven in figuur 3, waarbij de toename van meer dan een orde van grootte in waterabsorptie ten opzichte van gedeutereerd water wordt benadrukt. Een sterke waterabsorptie in de SWIR maakt het ook moeilijk om de absorptiespectra te verkrijgen van andere biologische absorbers die water in het monster bevatten of die water als oplosmiddel en referentie gebruiken. Als oplossing voor dit probleem kan gedeutereerd water worden gebruikt in plaats van water. Gedeutereerd water werkt op dezelfde manier als water, terwijl het een veel zwakkere SWIR-absorber is, waardoor het een ideale vervanging is voor water in SWIR-spectroscopiemetingen.

Om het absorptiespectrum van water te meten, werd water als monster gebruikt en gedeutereerd water als referentie. Om verzadiging in de SWIR te voorkomen, werd het monster verdund met gedeutereerd water in de SWIR-regio. Het resulterende waterabsorptiespectrum vertoont een lage absorptie in het VIS, die toeneemt bij langere golflengten. Karakteristieke absorptiepieken zijn te zien bij ongeveer 750 nm, 970 nm, 1.200 nm en 1.450 nm (Figuur 4). Het resulterende waterspectrum heeft een SNR van 3536,6 en werd vergeleken met het waterabsorptiespectrum²⁰ van Hale and Querry, met een vergelijkbare absorptiecurve van ~500 nm tot 1.600 nm. Van 400 tot 500 nm verschillen de absorptiecurven echter, waarbij Hale en Querry een hogere absorptiewaarde laten zien bij lagere golflengten. Dit verschil kan te wijten zijn aan resterende kleine deeltjes in het water die een hogere verstrooiing zullen hebben bij kortere golflengten in vergelijking met langere golflengten³ en kunnen de aannames van geen verstrooiing in op de wet van Beer-Lambert gebaseerde absorptiemetingen ongeldig maken.

Spectrale karakterisering van melanine
Melanine, de primaire optische absorber van de huid, werd spectraal gekarakteriseerd met melanine in poedervorm als monster en DMSO als oplosmiddel en referentie. Het resulterende spectrum heeft een SNR van 172 en werd vergeleken met eumelaninegegevens van Sarna et ^al.21,22 en Crippa et ^al.23 (Figuur 5). Eumelanine is het primaire pigment dat verantwoordelijk is voor de kleur van de huid en biedt daarom de meest nauwkeurige gegevens over de invloed van melanine op optische apparaten. Het spectrum dat is verzameld met behulp van het hierin beschreven protocol vertoont een hoge correlatie met deze literatuurwaarden.

Spectrale karakterisering van maïsolie
Om het absorptiespectrum van een lipide te onderzoeken, werd gekozen voor maïsolie vanwege de minimale optische verstrooiing in vergelijking met andere lipiden en de bekende gelijkenis in chemische samenstelling met dierlijke vetten¹. Om het absorptiespectrum van maïsolie te nemen, werd maïsolie gebruikt als monster met lucht als referentie. Zoals te zien is in figuur 6, bevat het maïsoliespectrum karakteristieke pieken bij ongeveer 930 nm, 1.210 nm en 1.410 nm. Het resulterende maïsoliespectrum heeft een SNR van 10363.1 en werd bedekt met het maïsoliespectrum¹ van Cao et al., wat een sterke correlatie vertoont.

Spectrale karakterisering van zuurstofrijk en zuurstofarm hemoglobine
Hoewel de karakterisering van de absorptie van zuurstofrijk en zuurstofarm hemoglobine een van de belangrijkste prestaties in de biomedische optica is, blijven hun absorptiespectra van het VIS tot de SWIR slecht begrepen. Een van de meest uitdagende aspecten bij het bepalen van het absorptiespectrum van zuurstofrijk en zuurstofarm hemoglobine in de SWIR is het verwijderen van het water in het bloed, dat de relatief kleine hemoglobineabsorptie overweldigt. Om de absorptie van hemoglobine en water te ontwarren, werd hemoglobine eerst geïsoleerd uit menselijk volbloed met behulp van centrifugatie en werd het bovenstaande verwijderd en vervangen door gedeutereerd water. Gedeutereerd water werd ook gebruikt als referentie en oplosmiddel waarin hemoglobine werd gereconstitueerd om hypotone barsting te veroorzaken. Zoals te zien is in figuur 3, heeft gedeutereerd water een veel lagere optische absorptie dan water, waardoor het een ideaal oplosmiddel en referentie is voor SWIR-absorptiemetingen. Het resulterende zuurstofrijke hemoglobinespectrum strekt zich uit van het VIS tot de SWIR met een SNR van 23118.7 en kwam zeer nauw overeen met het door Prahl gepubliceerde geoxygeneerde hemoglobinespectrum⁴  (Figuur 7). In het VIS vertoont het geoxygeneerde hemoglobinespectrum een hoge absorptie met karakteristieke absorptiepieken bij ongeveer 415 nm en een doubletpiek van ongeveer 540 tot 575 nm. In de NIR vertoont het zuurstofrijke hemoglobinespectrum een karakteristieke piek die een breder scala aan golflengten beslaat, ongeveer 800 nm tot 1.100 nm. In de SWIR is de absorptie van hemoglobine laag. Van ongeveer 1.400 nm tot 1.600 nm vertoont het hemoglobinespectrum echter een hogere absorptie met pieken, waarschijnlijk als gevolg van water in hemoglobine dat tijdens het centrifugatieproces niet volledig kon worden verwijderd.

Voor zuurstofarm hemoglobine werd natriumdithioniet toegevoegd aan de hemoglobineoplossing om dissociatie van dizuurstof van zuurstofrijk hemoglobine te introduceren en het monster om te zetten in zuurstofarm hemoglobine. Het resulterende spectrum heeft een SNR van 9813.9 en werd vergeleken met het zuurstofarme hemoglobinespectrum van Prahl en vertoont een zeer sterke correlatie tussen 400 nm en 1.000 nm⁴  (Figuur 8). Het resulterende zuurstofarme hemoglobinespectrum vertoont karakteristieke absorptiepieken bij ongeveer 430 nm, 560 nm en 760 nm. Hierna neemt de absorptie van zuurstofarm hemoglobine af, maar bevat kleinere absorptiepieken rond 1.200 nm en van 1.400 nm tot 1.600 nm. De extinctie tussen 1.400 en 1.600 nm is waarschijnlijk te wijten aan water dat tijdens het centrifugatieproces niet volledig uit het hemoglobinemonster is verwijderd.

Vergelijking van biologische absorbers uit het VIS-SWIR
De volledige VIS-SWIR-spectra van alle biologische absorbers die in dit protocol worden gekarakteriseerd, worden weergegeven in figuur 9, geschaald op basis van hun biologische concentratie in weefsel², die de duidelijke spectrale verschillen tussen biologische absorbers benadrukt. Melanine, zuurstofrijk hemoglobine en zuurstofarm hemoglobine hebben bijvoorbeeld een sterke, karakteristieke absorptie in het VIS die over het algemeen afneemt met de golflengte, terwijl water en lipide karakteristieke pieken vertonen in de NIR en SWIR. In biologisch weefsel zorgt de combinatie van afname van melanine en hemoglobine en afname van optische verstrooiing voor een grotere optische penetratiediepte in de NIR en SWIR. Bovendien maakt de verminderde melanineabsorptie van de NIR en SWIR optisch onderzoek van zuurstofrijk en zuurstofarm hemoglobine, lipide en water mogelijk met minimale effecten als gevolg van huidpigmentatie.

Figuur 1: Eerder gepubliceerde spectra van gangbare biologische absorbers van UV naar SWIR. De geoxygeneerde en zuurstofarme hemoglobinespectra werden uitgezet met behulp van gegevens van Prahl⁴. Het melaninespectrum werd uitgezet met behulp van gegevens van Sarna²¹ en Crippa²³. Het lipidenspectrum werd uitgezet met behulp van gegevens van van Veen²⁴. Het waterspectrum werd uitgezet met behulp van gegevens van Hale en Querry²⁰. Afkorting: SWIR = kortegolf infrarood. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Foto van het bovenstaande en de rode bloedcelpellet van gecentrifugeerd volbloed. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Vergelijking van het absorptiespectrum van water en gedeutereerd water verzameld met identieke acquisitie-instellingen in log (links) en lineaire (rechts) absorptieschaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Vergelijking van het waterabsorptiespectrum verkregen met behulp van de hierin beschreven methoden versus Hale en Querry²⁰. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Vergelijking van het melanine-absorptiespectrum verkregen met behulp van de hierin beschreven methoden versus Sarna et ^al.21,22 en Crippa et ^al.23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Vergelijking van het absorptiespectrum van maïsolie verkregen met behulp van de hierin beschreven methoden versus Cao et ^al.1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Vergelijking van het absorptiespectrum van geoxygeneerd hemoglobine verkregen met behulp van de hierin beschreven methoden versus Prahl⁴. Spectrale kenmerken van 1.400 tot 1.600 nm worden waarschijnlijk toegeschreven aan restwater in het monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Vergelijking van het zuurstofarme hemoglobine-absorptiespectrum verkregen met behulp van de hierin beschreven methoden versus Prahl⁴. Spectrale kenmerken van 1.400 tot 1.600 nm worden waarschijnlijk toegeschreven aan restwater in het monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: VIS-SWIR-spectra van gangbare biologische absorbers. Afkorting: VIS-SWIR = zichtbaar-kortegolf infrarood. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De protocollen die in dit artikel worden beschreven, kunnen worden gebruikt om VIS-SWIR-absorptiespectra van biologische absorbers en contrastmiddelen te verkrijgen. Hierin laten we specifieke stappen zien om spectra van water, melanine, maïsolie, zuurstofrijk hemoglobine en zuurstofarm hemoglobine te verkrijgen van 400 nm tot 1.600 nm. De volgende bespreking behandelt kritische stappen, tips voor meetoptimalisatie, beperkingen van de methode en toepassingen van dit protocol binnen de biogeneeskunde.

Hoewel alle protocolstappen belangrijk zijn, moeten een paar cruciale stappen worden gevolgd om met dit protocol nauwkeurige spectra te verkrijgen. Ten eerste moet het monster niet-verstrooiend zijn; Bij het verkrijgen van zuurstofrijk en zuurstofarm hemoglobine uit bloed moeten bijvoorbeeld de verdelers in het monster worden uitgefilterd (hier werd een spuitfilter van 0,22 μm gebruikt). Bij het bereiden van zuurstofarm hemoglobine mag de toegevoegde hoeveelheid natriumdithioniet niet groter zijn dan het opgegeven gewicht, omdat het monster troebel wordt bij hogere gewichtspercentages en de vereisten van de wet van Beer-Lambert ongeldig maakt.

Ten tweede moet gedeutereerd water worden gebruikt als monsteroplosmiddel en referentie voor in water oplosbare opgeloste stoffen zoals hemoglobine. In de SWIR is de wateropname sterk en kan andere absorbers maskeren. Ten derde moeten metingen worden verkregen binnen het lineaire bereik van de detector, gedefinieerd als het gebied waarin een verandering in fotonen die de detector bereiken resulteert in een lineaire verandering in het detectorsignaal. Als er minimale absorptie optreedt, kan de detector een absorptie van nul registreren, zelfs als er sprake is van absorptie. Dit gebeurt wanneer het monster te verdund is, de belichtingstijd te kort is en/of de koosweg van de cuvet te kort is, maar kan worden verholpen door een verhoging van de monsterconcentratie, de koetweglengte en/of de belichtingstijd. Evenzo, als er een hoge absorptie optreedt, kan de detector geen fotonen registreren en een vlakke lijn opleveren die "verzadiging" wordt genoemd en die niet gevoelig is voor veranderingen in absorptie. Dit gebeurt wanneer het monster te geconcentreerd is, de belichtingstijd te kort is en/of de weglengte te lang is, maar kan worden vastgelegd door de monsterconcentratie te verhogen, de belichtingstijd te verlengen en/of de koosweg te verkleinen.

Ten vierde moeten de gebruikte detectoren lineair zijn. Als het niet zeker is of de detector een lineaire respons vertoont op het aantal fotonen dat de detector bereikt, kunnen verschillende verdunningen van een monster worden gemeten met dezelfde acquisitie-instellingen om te controleren of hun extinctiewaarden de verwachte lineaire trend tussen extinctie en concentratie laten zien. Als alternatief kan een enkel monster worden gemeten en de belichtingstijd worden verlengd om te testen of er een lineaire toename van de detectorintensiteit is. Beide tests zouden een lineaire relatie moeten opleveren als de gebruiker binnen de lineaire grenzen werkt (zie het derde kritieke punt hierboven).

Ten vijfde, om binnen het lineaire bereik van de detector te blijven voor het gehele VIS-SWIR-spectrale bereik, moeten de monsterconcentratie, de belichtingstijd van de detector en/of de routelengte van de cuvetten worden gewijzigd voor verschillende spectrale gebieden met een significant hogere of lagere absorptie ten opzichte van het beginspectrale gebied.

Ten zesde moeten spectra die zijn verkregen met behulp van verschillende monsterconcentraties of padlengten voor verschillende spectrale gebieden aan elkaar worden gehecht door lineaire schaling van één gebied op basis van bekende veranderingen in concentratie of padlengte. Na het schalen moeten de spectra aan elkaar worden gehecht op een overlappende golflengte tussen de twee regio's. Als een meting metingen van verschillende detectoren omvat, moeten er overlappende absorptiespectra zijn die de gewenste overgangsgolflengte van de detector bevatten (800 nm wordt vaak gebruikt bij het samenvoegen van UV-VIS- en SWIR-gebieden). Elk spectrum wordt afgekapt op de overgangsgolflengte van de detector en één spectrum wordt gekozen om de oorspronkelijke overgangsabsorptiewaarde van de detector op te nemen. Vervolgens worden de twee afgekapte spectra aaneengeschakeld om een enkel langwerpig spectrum te creëren.

Aanvullende tips voor het verkrijgen van absorptiespectra van hoge kwaliteit zijn onder meer het gebruik van een eerder gepubliceerd spectrum van het monster van belang, zelfs als het niet het volledige te meten spectrale bereik bestrijkt, om de metingen te begeleiden. Als u vooraf het golflengtebereik met de laagste absorptie kent, kunnen metingen in dit gebied met het monster met de hoogste concentratie worden gestart en van daaruit worden aangepast en verdund. Het kan helpen bepalen hoeveel afzonderlijke regio's moeten worden gemeten op basis van de omvang van de verwachte absorptieveranderingen. Het kan ook het vertrouwen geven dat het verwachte spectrum is verkregen als het overeenkomt met gepubliceerde spectra, of als het niet overeenkomt met gepubliceerde spectra, kan de monstervoorbereidingsmethode opnieuw worden onderzocht, samen met problemen die het spectrum zouden kunnen vervormen.

Absorptiespectra kunnen nabewerking vereisen. Een digitaal voortschrijdend gemiddeldefilter kan bijvoorbeeld worden gebruikt om absorptiemetingen af te vlakken en punten met bekende fouten kunnen worden verwijderd met een datasetreparatie waarbij de foutieve punten worden verwijderd en interpolatie wordt uitgevoerd tussen niet-foutieve punten.

Beperkingen van deze methode zijn onder meer onnauwkeurigheid voor monsters met optische verstrooiing, zoals volbloed. Om hemoglobine nauwkeurig te meten, wordt het bloedmonster gelyseerd en vervolgens gefilterd met een spuit om de meeste andere resterende cellulaire componenten die optische verstrooiing veroorzaken, te verwijderen. Evenzo wordt deze methode niet in vivo gebruikt vanwege weefselverstrooiing. Hoewel op de wet van Beer-Lambert gebaseerde absorptiemetingen vervelend en soms moeilijk uit te voeren kunnen zijn, is het de gouden standaardmethode voor pure optische absorptiemetingen. Bovendien maken sommige oplosmiddelen het bijzonder uitdagend om een zuiver absorptiespectrum van bepaalde opgeloste stoffen te verkrijgen. Het natuurlijke oplosmiddel van zuurstofrijk en zuurstofarm hemoglobine is bijvoorbeeld water, maar de absorptie van water is sterk in de SWIR en domineert de opname van zuurstofrijk hemoglobine. Daarom proberen we water uit het bloed te verwijderen via herhaalde centrifugatie, verwijdering van het supernatant en reconstitutie met gedeutereerd water dat een zwakkere SWIR-absorptie heeft. De resulterende zuurstofrijke en zuurstofarme hemoglobinespectra van volledig gehepariniseerd menselijk bloed worden vermoed kleine restabsorptie te bevatten als gevolg van waterabsorptie van ongeveer 1.300 nm tot 1.600 nm, zoals te zien is in figuur 3. Hoewel het waarschijnlijk geen perfecte ontwarring is van water van zuurstofrijk en zuurstofarm hemoglobine, zien we een nauwe afstemming met veel geciteerde gepubliceerde zuurstofrijke en zuurstofarme hemoglobinespectra van 400 nm tot 1,000 nm en breiden we het spectrum uit met enkele honderden nanometers ^2,3.

De hierin beschreven protocollen zullen onderzoekers helpen de absorptiespectrabibliotheken uit te breiden met VIS-SWIR-spectra van een groot aantal biologische componenten en contrastmiddelen. Deze kennis kan worden gebruikt om het begrip van basisbiologie en -fysiologie te verbeteren door middel van niet-invasieve biomedische beeldvorming en detectie op diepere golflengten dan de meeste systemen momenteel werken. De toevoeging van SWIR-golflengten verbreedt het type weefselcomponenten dat niet-invasief kan worden gecontroleerd en zou de ontwikkeling van nieuwe monitoring en diagnostiek kunnen informeren. Bovendien moeten apparaten die in de NIR en SWIR werken, helpen bij het minimaliseren van huidpigmentatiebias die is gemeld voor optische apparaten die werken in de VIS- en NIR-reeksen en is het een veelbelovende strategie voor het creëren van rechtvaardige medische hulpmiddelen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.22 µm diameter syringe Filters	Sigma-Aldrich	SLGPM33RS
1000 µL Pipette	Millipore Sigma	EP3124000121
200 µL Pipette	Millipore Sigma	EP3124000083
Conical Tubes	Avantor VWR	21008-089
Corn Oil	Happy Belly	n/a	48 Fl Oz
Deuterium Oxide	Cambridge Isotope Laboratories	DLM-4-100
Deuterium Oxide	Sigma-Aldrich	7789-20-0
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D5879-1L
Disposable 1 mL Syringe	BH Supplies	BH1LL
Disposable Needle	Atshuhut/Amazon	66941
Freezer (-80 °C)	Fisher Scientific	IUE386FARK
Glass Beakers	Millipore Sigma	CLS1000PACK
Glass or Quartz Cuvettes	Sigma-Aldrich	Z802875-1EA	700 µL volume
Glass or Quartz Cuvettes	Thorlabs	CV10Q35EP	3500 mL volume
Heparinized Human Blood	Lampire	7203710
Microcentrifuge Tubes	Costar	3213
Microcentrifuge--accuSpin Micro 17	Fisher Scientific	13-100-675
MilliQ Water	Millipore Sigma	ZMQSP0D01
OSRAM FCS 64640 150 W 24 V HLX Halogen Light Bulb	Amazon	B0001221DG
Parafilm	Millipore Sigma	HS234526B
Pipette Tips	Eppendorf	22492055
Powdered Synthetic Melanin	Sigma-Aldrich	8049-97-6
Scale	Sartorius	UX-11976-09
Sodium Dithionite	Sigma-Aldrich	1065070500
Sonicator	Fisher Scientific	CPX1800
Spatula	Aozita	000 00 0 1 2 3
UV/VIS/SWIR Spectrophotometer	On Line Instrument Systems	Olis Cary 14
Weigh Boats	Amazon	B07M5RMNPF