Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Kwantitatieve, op PCR gebaseerde test om sonische egelsignalering te meten in cellulair model van ciliogenese

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67407

⸱

31 januari 2025

 , 
1CellBio Lab, Institute of Health Sciences, Presidency University

In dit artikel

Samenvatting

De studie demonstreert een kwantitatieve PCR-gebaseerde test voor primaire cilia-gemedieerde Sonic Hedgehog (SHH) signaalroute-activering met behulp van SHH-agonist in een cellulair model van ciliogenese.

Samenvatting

Ciliopathie verwijst naar een verzameling multisystemische en polygene ziekten en aandoeningen bij de mens die ontstaan als gevolg van een afwijking van de structuur of functie van beweeglijke of niet-beweeglijke (primaire) trilharen die op microtubuli gebaseerde celuitsteeksels zijn. Primaire cilia (PC) zijn aanwezig in de meeste menselijke epitheel- en endotheelweefsels en dienen als een hub voor fysiologische signaaltransductie, inclusief Sonic Hedgehog (SHH)-signalering. In verschillende situaties moet de functie van PC worden onderzocht, wat kan worden bereikt door de canonieke SHH-signaleringsroute te meten die bijna uitsluitend door PC wordt gemedieerd. Hier wordt een kwantitatieve PCR (qPCR) gebaseerde techniek ontwikkeld om het transcriptieniveau van SHH-routegenen te meten in slapende hTERT-RPE1 (of RPE1) cellen die meestal PC bevatten. Rust in RPE1-cellen wordt bereikt door serumuithongering gedurende 48 uur, terwijl activering van de SHH-route wordt bevorderd door een specifieke agonist. Deze op celcultuur gebaseerde test is gemakkelijk te volgen en gevoelig. Succesvolle demonstratie van deze test in trilhaar-RPE1-cellen wijst op het enorme potentieel ervan als een in vitro test om de juiste functie van PC te onderzoeken bij genetische of epigenetische verandering van een of meerdere genen, die geassocieerd kunnen zijn met verschillende ciliopathieën.

Inleiding

Een cilium is een op microtubuli gebaseerd en membraanomhuld uitsteeksel van het celoppervlak, dat is geassembleerd op een basaal lichaam1. Bij gewervelde dieren worden twee soorten trilharen waargenomen, namelijk beweeglijke en niet-beweeglijke. Motiele trilharen bevinden zich in gespecialiseerde weefsels en verlenen beweeglijkheid. Niet-beweeglijke primaire cilia (PC) zijn aanwezig in de meeste cellen van gewervelde dieren en vervullen sensorische functies en transduceren kritische signalen van het extracellulaire milieu naar het inwendige van de cellen2. Eenmaal geassembleerd, wordt ciliaire rek geholpen door intraflagellaire transportmachines (IFT), een bidirectioneel transportsysteem dat vracht vervoert die wordt aangedreven door kinesines (anterograde beweging) en dyneïne-II motoreiwitten (retrograde beweging)3,4. Structurele of functionele defecten in beweeglijke of primaire cilia kunnen leiden tot een overvloed aan multisystemische ziekten bij de mens die gezamenlijk bekend staan als ciliopathieën 5,6.

PC dient als de hub voor verschillende ontwikkelingssignaleringsprocessen, zoals Wingless (Wnt), G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCR), receptor-tyrosinekinasen (RTK's), Transforming growth factor β (TGFβ) en Platelet-derived growth factor (PDGF) signalering 7,8. Bij zoogdieren is Sonic Hedgehog (SHH)-signalering een kritieke signalering, die bijna uitsluitend wordt getransduceerd door PC in cellen die PC 9,10,11 bevatten. Afwijkende structuur of functie van PC leidt tot verzwakte signaalroutes die geassocieerd zijn met ziekten zoals aangeboren hartafwijkingen, polycysteuze nierziekte, craniofaciale afwijkingen, retinale dystrofie en enkele zeldzame ziekten zoals het Bardet-Biedl-syndroom (BBS), het Joubert-syndroom (JBTS), het Alström-syndroom, Jeune verstikkende thoracale dysplasie (JATD)12,13,14,15. De meeste hiervan zijn polygene ziekten van epitheel- of endotheelweefsels, die de uitdagingen bij vroege diagnose en behandeling van deze ziekten maken. Bepalen hoe dergelijke mutaties bijdragen aan verzwakte PC-gemedieerde signalering in een celcultuurmodel kan niet alleen inzicht geven in de moleculaire complexiteit van die signaalroute, maar ook de diagnose van verschillende ciliopathieën vergemakkelijken en therapeutische interventies suggereren. Met dit idee wordt een kwantitatieve PCR (qPCR) gebaseerde test ontwikkeld om verandering te bepalen in PC-gemedieerde SHH-signaleringsroute in menselijke telomerase reverse transcriptase (hTERT) onsterfelijke retinale pigmentepitheelcellen (hTERT-RPE1, hier aangeduid als RPE1). RPE1-cellen zijn bijna-diploïde, niet-getransformeerde menselijke cellen die veel worden gebruikt als cellulair model voor ciliogenese, aangezien ongeveer 75%-80% van deze cellen PC assembleren bij serumuithongering (cellen incuberen in serumvrij medium) gedurende 24-48 uur, vergeleken met slechts 15%-18% ciliatie in een asynchroon groeiende cultuur van RPE1-cellen16.

Egelsignalering (HH) wordt bij gewervelde dieren geconserveerd voor de embryonale ontwikkeling17. Bij zoogdieren worden drie verschillende soorten Hedgehog-signalering waargenomen: Sonic (SHH), Indian (IHH) en Desert (DHH), waarvan SHH en IHH overlappende functies vertonen op weefselniveau11. SHH-signalering speelt een sleutelrol tijdens de embryonale ontwikkeling door de patroonvorming van ledematen en de specificatie van het celtype in het zenuwstelsel te reguleren en de homeostase van volwassen weefsel te handhaven 10,11,18. Hoewel SHH-signalering complex is, zijn er steeds meer aanwijzingen dat canonieke SHH-signalering afhankelijk is van PC 7,11,19, die wordt gemedieerd door collectieve functies van Gli-transcriptiefactoren (Gli1, Gli2 en Gli3). Er is gesuggereerd dat HH-signalering en PC samen zijn geëvolueerd, waarbij kritische signaleringscomponenten geconcentreerd zijn in het compacte volume aan het uiteinde van het cilium om effectieve reacties op lage ligandratio's mogelijk te maken11.

Bij afwezigheid van SHH-liganden remt Patched1 (Ptch1), dat gelokaliseerd is op het PC-membraan, de activiteit van Smoothened (Smo) via een slecht begrepen mechanisme dat waarschijnlijk lipidentransport met zich meebrengt, waardoor de route onderdrukt blijft 7,20. De constitutief actieve ciliaire GPR161, een G-gekoppelde eiwitreceptor en een negatieve regulator van het systeem, zorgt ervoor dat de onderdrukking in stand wordt gehouden door hoge niveaus van ciliair cyclisch AMP (cAMP) te behouden dat de activiteit van proteïnekinase A (PKA)21 verhoogt, en door ciliaire lokalisatie van PKA7 te behouden. PKA-activiteit, samen met caseïnekinase 1 (CK1) en glycogeensynthasekinase 3 β (GSK3β), fosforyleert meerdere residuen van Gli-eiwitten, Gli2 en Gli3, in PC. Gli2 en Gli3 kunnen fungeren als zowel activatoren als onderdrukkers van transcriptie van doelgenen. PKA-gemedieerde fosforylering veroorzaakt remming van de activatorfunctie van Gli2, terwijl gefosforyleerd Gli3 wordt gesplitst door proteasen om de repressorvorm Gli3R22 te produceren. Over het algemeen wordt de expressie van SHH-doelwitgenen in dergelijke omstandigheden onderdrukt.

Wanneer SHH-ligand aanwezig is, bindt Ptch1 eraan en verlaat GPR161 PC, en Smo, gefosforyleerd door G-eiwitgekoppelde receptor (GPCR) kinase 2 (GPRK2) en CK1, wordt naar PC getransporteerd, samen met β-arrestine en de microtubuli-motor KIF3A23. In overleg wordt de lokalisatie van Gli2/3, Suppressor of Fused (SUFU) en Kif7 aan de ciliaire punt gepromoot en is gekoppeld aan verminderde Gli2/3-splitsing, waardoor de activatorfunctie van Gli2/324,25 wordt verhoogd. Eenmaal geactiveerd, induceert Gli2/3 de expressie van Gli1, dat alleen kan functioneren als een activator, en versterkt daardoor de respons van de SHH-route22. De binding van SHH aan Ptch1 wordt vergemakkelijkt door CAM-gerelateerd/gedownreguleerd door oncogenen (CDO), broer van CDO (BOC), groeistop-specifiek 1 (GAS1) en lipoproteïne-receptorgerelateerd eiwit 2 met lage dichtheid (LRP2). Omgekeerd kan Hedgehog-interacting protein (HHIP) SHH sekwestreren door er direct mee te interageren en concurreert het ook met Ptch1 door interactie met SHH26. Belangrijk is dat GLI1, HHIP en PTCH1 worden getranscribeerd bij activering van de SHH-route, terwijl de laatste twee deelnemen aan de negatieve regulatie van de SHH-route.

Eerdere studies hebben aangetoond dat de transcriptieniveaus van SHH-doelgenen kunnen worden gemeten om de SHH-route te beoordelen, hoewel deze aanzienlijk kan variëren in verschillende celtypen27,28. Een dergelijke variatie in de respons van de SHH-route kan worden toegeschreven aan verschillende combinaties van PC-gemedieerde SHH-signalering en SHH-signalering die wordt gemedieerd door het celmembraan, waarschijnlijk in afwezigheid van PC. SAG is een Smo-agonist die in deze methode wordt gebruikt om SHH-signaleringsactivering na te bootsen in serum-uitgehongerde RPE1-cellen die voornamelijk trilhaarzuur zijn. De transcriptieniveaus van SHH-doelwitgenen zoals HHIP, GLI1 en PTCH1 en een niet-doelwitgen SMO werden gemeten met behulp van qPCR in controle- en met SAG behandelde cellen en werden vergeleken om de activering van de SHH-route te bepalen. Succesvolle demonstratie van deze op celcultuur gebaseerde gevoelige test om PC-gemedieerde SHH-signalering te meten, suggereert de veelbelovende toepassing ervan in biomedisch onderzoek geassocieerd met de primaire ciliafunctie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Celcultuur

  1. Passage een bijna-confluente T-25-celkweekkolf van RPE1-cellen met een verdunning van 1:5 van de oorspronkelijke cultuur naar een verse T-25-celkweekkolf met 5 ml Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline-streptomycinemix (eindconcentratie - 100 E/ml penicilline G en 100 μg/ml streptomycine). Dit medium wordt het complete medium genoemd. Kweek cellen bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO2.
    OPMERKING: RPE1-cellen zijn niet-getransformeerde cellen die vaak worden gebruikt om de moleculaire regulatie van PC-assemblage en -demontage in celcultuur te bestuderen. Ongeveer 80% van de RPE1-cellen assembleert PC bij uithongering van het serum, dat weer wordt gedemonteerd bij hertoevoeging van serum16.
  2. Bereid de ronde glazen dekglaasjes van 12 mm voor door ze een nacht in een afgedekt glazen bekerglas in 50 ml 1 N HCl in een afgedekte glazen beker te incuberen zonder ze bij 60 °C te schudden in een waterbad of broedmachine.
  3. De volgende dag pipetteer u met een pipet van 25 ml uit de zuuroplossing en gooi deze op de juiste manier weg in een container voor chemisch gevaar. Was de dekglaasjes vervolgens 3x in 100 ml gedestilleerd water door 15 minuten te incuberen met af en toe schudden, gevolgd door pipetteren.
  4. Herhaal de wasstappen met 70% ethanol en 95% ethanol. Droog de dekglaasjes door ze afzonderlijk op een laboratoriumvloeipapier in een bioveiligheidskast te leggen. Eenmaal gedroogd, steriliseren met UV-straling gedurende 60 minuten.

2. Celgroei, serumuithongering en SAG-behandeling

  1. Resuspendeer de cellen in de T-25-kolf in een voorverwarmd volledig medium nadat de cellen zijn losgemaakt door de enzymatische activiteit van de voorverwarmde 0,25% trypsine-EDTA-oplossing. Bepaal de celdichtheid van de suspensie door cellen te tellen met behulp van een hemocytometer.
  2. Bereid twee celkweekschaaltjes van 35 mm voor en plaats er twee steriele dekglaasjes van 12 mm in. Passage 2 x 105 asynchroon groeiende RPE1-cellen in elk schaaltje van 35 mm met dekglaasjes en laat de cellen gedurende 24 uur groeien in 2 ml volledig medium.
  3. Verwijder na 24 uur het medium van de groeiende RPE1-cellen en was de cellen 1x met voorverwarmde 1 ml DPBS-buffer. Voeg aan elk schaaltje 2 ml voorverwarmde DMEM-media toe die 1% penicilline-streptomycine bevatten, maar verstoken van FBS (serumvrij medium) en incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO2.
  4. Vervang het medium na 24 uur door het serumvrije medium dat SAG bevat tot een eindconcentratie van 250 nM of DMSO als controleoplosmiddel en incubeer de cellen nog eens 24 uur. Een cartoondiagram van het celkweekprotocol wordt getoond in figuur 1A.

3. Cel verzameling

  1. Leg de dekglaasjes op een bord met 24 putjes met in elk putje één dekglaasje. Voeg 0,5 ml gekoelde methanol toe aan elk putje en incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij -20 °C om de cellen op de dekglaasjes te bevestigen. Was de dekglaasjes direct daarna 3x met 0,5 ml wasbuffer (1x PBS met 0,5 mM MgCl2 en 0,05% Triton-X 100).
  2. Gooi de media weg en voeg 0,5 ml trizolreagens rechtstreeks toe aan elk gerecht. Laat het gelijkmatig verdelen en 5 minuten bewaren. Pipetteer een paar keer op en neer om een homogeen mengsel te maken en verzamel het in nucleasevrije microcentrifugebuisjes van 1,5 ml.

4. Bereiding van totaal RNA en cDNA

  1. Voeg 0,1 ml chloroform toe aan elke buis met gelyseerde cellen en incubeer gedurende 2-3 minuten. Centrifugeer elk monster gedurende 15 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C. Breng de waterige fase met het RNA over naar verse microcentrifugebuisjes.
  2. Voeg 0,25 ml isopropanol toe aan de waterige fase en incubeer gedurende 10 minuten. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12.000 x g bij 4°C. Het RNA-neerslag vormt een witte gelachtige korrel. Gooi met een micropipet het supernatant weg.
  3. Resuspendeer de RNA-pellet in 0,5 ml vers verdunde 75% ethanol. Draai de monsters kort en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 7500 x g bij 4°C. Gooi het bovenstaande weg met een micropipet.
  4. Laat de RNA-pellet 10 minuten aan de lucht drogen en resureerde in 25 μl nucleasevrij water. Bepaal de concentratie van totaal RNA door de extinctie bij 260 nm te meten met behulp van een microvolumespectrofotometer.
  5. Gebruik 1-3 μg totaal RNA van beide monsters om cDNA's te bereiden volgens de instructies van de fabrikant voor een cDNA-synthesekit. Bewaar cDNA's bij -20 °C.

5. Kwantitatieve PCR

  1. Stel de qPCR-reacties in (in drievoud, tabel 1) met behulp van 1:5 verdunde cDNA's van elk monster met primersets van GLI1, PTCH1, HHIP, SMO en β-ACTIN (als huishoudgen; Tabel 2) genen met een qPCR-mastermix die geschikt DNA-polymerase, dNTP's en buffer bevat, in een geschikte multi-well, fluorescentiegevoelige PCR-plaat.
  2. Bedek de plaat met een geschikte sealer, plaats deze in een geschikt qPCR-instrument en voer een gestandaardiseerd qPCR-programma uit met 40 amplificatiecycli en een smeltcurve-analysestap aan het einde van het programma. Het gestandaardiseerde qPCR-programma met 40 cycli, inclusief een smeltcurve-analyse, wordt schematisch weergegeven in figuur 1B.
  3. Wanneer het qPCR-programma is voltooid, controleert u de smeltcurve van elk amplicon op een enkele piek bij de gewenste temperatuur.
    OPMERKING: Aan het einde van de amplificatiecycli meet de bijbehorende smeltcurve-analyse de smelttemperatuur van het amplicon door de temperatuur van elke put te verhogen van 65°C naar 95°C, met een stap van 0,5°C per stap van 5 s.
  4. Exporteer de amplificatiegegevens naar een spreadsheet en bereken de relatieve expressie (2−ΔΔCT-methode) van elk transcript door te normaliseren ten opzichte van die van het β-ACTINE-gen voor elk monster. Zet de grafiek uit en bereken de statistische significantie van de veranderingen in de relatieve expressie van elk transcript met behulp van een ongepaarde T-toets.

6. Immunokleuring en beeldacquisitie met behulp van fluorescentiemicroscopie

  1. Incubeer de vaste cellen op dekglaasjes in 200 μL blokkeerbuffer (2% BSA en 0,1% TritonX-100 in 1x PBS) gedurende 30 min.
  2. Incubeer de cellen met een mix van primaire antilichamen (meestal een anti-muis tegen geacetyleerd α-tubuline van PC-axoneom en antilichamen tegen konijn tegen respectievelijk ciliair membraan en centriol) verdund in blokkerende buffer (zie Tabel met materialen voor de uiteindelijke verdunning) 's nachts bij 4 °C in een bevochtigde kamer.
    1. Maak een bevochtigde kamer door een natte papieren handdoek in de onderste helft van een lege doos met pipetpunten van 1 ml te leggen. Leg een strook transparante film op het oppervlak van het rek en zoek een druppel (20-25 μL) van de antilichaamoplossing op de film, één voor elk dekglaasje dat moet worden geïncubeerd. Plaats een dekglaasje op de druppels zodat de cellen worden ondergedompeld en sluit het deksel van de tipbox.
  3. Keer de dekglaasjes de volgende dag weer om en doe ze terug in de schaal met 24 putjes. Was de dekglaasjes met de wasbuffer en incubeer ze vervolgens in 150 μL secundair antilichaammengsel met een vooraf gestandaardiseerde verdunning van antilichamen (hier groen-fluorescerende kleurstof-geconjugeerde anti-muis en rood-fluorescerende kleurstof-geconjugeerde anti-konijn verdund in blokkeerbuffer) en nucleaire DNA-kleuringsreagentia gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was de dekglaasjes 3x.
  4. Zoek een druppel (ongeveer 3-5 μl) van de montageoplossing met antifade-reagens op een glazen microscoopglaasje. Plaats een dekglaasje, met de celzijde naar beneden, op de montageoplossing. Veeg overtollige vloeistof af door voorzichtig op een schoon doekje te drukken. Breng transparante nagellak aan langs de rand van het dekglaasje om het op het glaasje af te dichten.
  5. Plaats een dia op de microscoop (zie Materiaaltabel) bevestigd met een gemotoriseerde tafel en een camera die geschikt is voor digitale beeldvorming. Gebruik een 60x Plan Apo-olie-onderdompelingsobjectief (met een numerieke opening van 1,4) om de beelden van serum-uitgehongerde RPE1-cellen bij omgevingstemperatuur te verkrijgen, om PC in cellen te visualiseren, zoals aangegeven door de genoemde antilichamen.
  6. Verkrijg afbeeldingen van de verschillende monsters op afzonderlijke dekglaasjes met een identieke belichtingstijd voor verschillende fluoroforen langs de Z-as met behulp van een softwarepakket voor digitale microscopiebeeldvorming. Tel het aantal PC-bevattende cellen van ten minste 500 cellen om het percentage ciliatie te bepalen in 48 uur serum-uitgehongerde toestand.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De activering van de PC-gemedieerde SHH-signaaltransductieroute is een manier om de juiste functie van PC7 te begrijpen. Hier wordt de relatieve expressie van doelwitgenen van de SHH-route gemeten met behulp van een RT-qPCR-assay bij SAG-gemedieerde activering van de SHH-route in RPE1-cellen die meestal gecilieerd zijn. De directe transcriptie-output van de SHH-route, GLI1 en PTCH1, worden vaak gebruikt om de activiteit van deze route11 te ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het onderzoeken van de functionaliteit van PC is een cruciale stap in de richting van het begrijpen van de dynamiek van ciliatie en ziekten of aandoeningen die verband houden met de disfunctie van PC. Afgezien van het onderzoeken van ciliatie door immunokleuring voor ciliaire markers of met fluorofoor gelabelde ciliaire structurele componenten, wordt de functie van PC gewoonlijk bepaald door de canonieke SHH-routeactivering te testen door de ciliaire translocatie van Smo in weefsels en c...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door Ramalingaswami fellowship to SM door het Department of Biotechnology (DBT), Govt. van India, en onderzoekssubsidie van Science and Engineering Research Board (SERB), Govt. van India naar SM (CRG/2020/004042). Fellowship of PH wordt gesponsord door de University Grant Commission (UGC), Govt. van India. De auteurs danken oprecht Dr. Chandrama Mukherjee en de heer Avik Mukherjee van RNABio Lab of Institute of Health Sciences, Presidency University voor respectievelijk toegang tot het qPCR-instrument en training in het instrument.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DMSO, sterieel gefilterdSigmaD2650
Donkey, anti-Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA21202
Donkey, anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568ThermoFisher ScientificA10042
Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM)Gibco, ThermoFisher Scientific41965039
Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS)Gibco, ThermoFisher Scientific14190144
Fetaal bovien serum (FBS)HimediaRM1112
Fluorescentiemicroscoop uitgerust met 60X objectiefCarl Zeiss Axio observer colibri 5
hTERT-RPE1 cellenATCCCRL-4000
iScript cDNA Synthese KitBio-Rad Laboratories1708891
Muis, monoklonaal anti-acetyleerde tubuline-antilichaamMilipore Sigma-AldrichT7451Eindverdunning 1:1000
Penicilline-Streptomycine, 100XGibco, ThermoFisher Scientific15140122
Kwantitatieve PCR-machine, CFX 96Bio-Rad Laboratories
Konijn, polyklonaal Arl13B antilichaamProteinTech17711-1-APEindverdunning 1:250
Konijn, polyklonaal Cep135 antilichaamProteinTech24428-1-APEindverdunning 1:500
SlowFade gold Antifade moutantThermoFisher ScientificS36940
Smoothened Agonist (SAG) AbmoleM4865Stockoplossing: in DMSO, 5 mM
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725271
TRIzol ReagensInvitrogen15596026
TrypLEGibco, ThermoFisher Scientific12605028

Referenties

  1. Nigg, E. A., Raff, J. W. Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease. Cell. 139 (4), 663-678 (2009).
  2. Halder, P., Khatun, S., Majumder, S. Freeing the brake: Proliferation needs primary cilium to disassemble. J Biosci. 45, 117(2020).
  3. Eguether, T., Cordelieres, F. P., Pazour, G. J. Intraflagellar transport is deeply integrated in hedgehog signaling. Mol Biol Cell. 29 (10), 1178-1189 (2018).
  4. Ishikawa, H., Marshall, W. F. Intraflagellar transport and ciliary dynamics. Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (3), a021998(2017).
  5. Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364 (16), 1533-1543 (2011).
  6. Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (9), 533-547 (2017).
  7. Hilgendorf, K. I., Myers, B. R., Reiter, J. F. Emerging mechanistic understanding of cilia function in cellular signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (7), 555-573 (2024).
  8. Bansal, R., et al. Hedgehog pathway activation alters ciliary signaling in primary hypothalamic cultures. Front Cell Neurosci. 13, 266(2019).
  9. Gigante, E. D., Caspary, T. Signaling in the primary cilium through the lens of the hedgehog pathway. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 9 (6), e377(2020).
  10. Anvarian, Z., Mykytyn, K., Mukhopadhyay, S., Pedersen, L. B., Christensen, S. T. Cellular signalling by primary cilia in development, organ function and disease. Nat Rev Nephrol. 15 (4), 199-219 (2019).
  11. Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian hedgehog signaling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (5), a028175(2017).
  12. Brown, J. M., Witman, G. B. Cilia and diseases. Bioscience. 64 (12), 1126-1137 (2014).
  13. Hanaki, K., et al. Alstrom syndrome: A review focusing on its diverse clinical manifestations and their etiology as a ciliopathy. Yonago Acta Med. 67 (2), 93-99 (2024).
  14. Merrill, A. E., et al. Ciliary abnormalities due to defects in the retrograde transport protein dync2h1 in short-rib polydactyly syndrome. Am J Hum Genet. 84 (4), 542-549 (2009).
  15. Dagoneau, N., et al. Dync2h1 mutations cause asphyxiating thoracic dystrophy and short rib-polydactyly syndrome, type iii. Am J Hum Genet. 84 (5), 706-711 (2009).
  16. Majumder, S., Fisk, H. A. Vdac3 and mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12 (5), 849-858 (2013).
  17. Briscoe, J., Therond, P. P. The mechanisms of hedgehog signalling and its roles in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (7), 416-429 (2013).
  18. Placzek, M., Briscoe, J. Sonic hedgehog in vertebrate neural tube development. Int J Dev Biol. 62 (1-2-3), 225-234 (2018).
  19. Wong, S. Y., et al. Primary cilia can both mediate and suppress hedgehog pathway-dependent tumorigenesis. Nat Med. 15 (9), 1055-1061 (2009).
  20. Deshpande, I., et al. Smoothened stimulation by membrane sterols drives hedgehog pathway activity. Nature. 571 (7764), 284-288 (2019).
  21. Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary g-protein-coupled receptor gpr161 negatively regulates the sonic hedgehog pathway via camp signaling. Cell. 152 (1-2), 210-223 (2013).
  22. Niewiadomski, P., et al. Gli protein activity is controlled by multisite phosphorylation in vertebrate hedgehog signaling. Cell Rep. 6 (1), 168-181 (2014).
  23. Kovacs, J. J., et al. Beta-arrestin-mediated localization of smoothened to the primary cilium. Science. 320 (5884), 1777-1781 (2008).
  24. He, M., et al. The kinesin-4 protein kif7 regulates mammalian hedgehog signalling by organizing the cilium tip compartment. Nat Cell Biol. 16 (7), 663-672 (2014).
  25. Wen, X., et al. Kinetics of hedgehog-dependent full-length gli3 accumulation in primary cilia and subsequent degradation. Mol Cell Biol. 30 (8), 1910-1922 (2010).
  26. Griffiths, S. C., et al. Hedgehog-interacting protein is a multimodal antagonist of hedgehog signalling. Nat Commun. 12 (1), 7171(2021).
  27. Gomez, A. E., Christman, A. K., Van De Weghe, J. C., Finn, M., Doherty, D. Systematic analysis of cilia characteristics and hedgehog signaling in five immortal cell lines. PLoS One. 17 (12), e0266433(2022).
  28. Schmidt, S., et al. Primary cilia and shh signaling impairments in human and mouse models of parkinson's disease. Nat Commun. 13 (1), 4819(2022).
  29. Dutta, A., et al. Increase in primary cilia number and length upon vdac1 depletion contributes to attenuated proliferation of cancer cells. Exp Cell Res. 429 (2), 113671(2023).
  30. De, K., et al. Hyperphosphorylation of cdh1 in glioblastoma cancer stem cells attenuates apc/c(cdh1) activity and pharmacologic inhibition of apc/c(cdh1/cdc20) compromises viability. Mol Cancer Res. 17 (7), 1519-1530 (2019).
  31. Yang, S., Zheng, X. The immunofluorescence-based detection of hedgehog pathway components in primary cilia of cultured cells. Methods Mol Biol. 2374, 89-94 (2022).
  32. Wang, W., et al. The mir-669a-5p/g3bp/hdac6/akap12 axis regulates primary cilia length. Adv Sci (Weinh). 11 (6), e2305068(2024).
  33. Alanazi, A., et al. Identifying the roles of mir-17 in ciliogenesis and cell cycle. Front Cell Dev Biol. 12, 1397931(2024).
  34. Bustin, S. A., et al. The miqe guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time pcr experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Primaire ciliaciliogenese assayRPE1 cellenserumdeprivatiegenexpressieanalyseSmoothened agonistRNA isolatieciliopathie model
Kwantitatieve, op PCR gebaseerde test om sonische egelsignalering te meten in cellulair model van ciliogenese
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.