Actieve immunisatie voor het induceren van auto-immuun spierspecifieke kinase (MuSK) myasthenia gravis bij muizen

Samenvatting

Dit artikel presenteert een uitgebreid protocol voor een experimenteel muismodel van auto-immuun spierspecifieke kinase (MuSK) myasthenia gravis, gericht op het onderzoeken van de pathofysiologie en mogelijke therapeutische strategieën voor de ziekte.

Samenvatting

Myasthenia gravis (MG) is een auto-immuunziekte die de neuromusculaire overgang aantast. Terwijl de meeste MG-patiënten auto-antilichamen produceren tegen de acetylcholinereceptor (AChR), vertoont een subgroep van patiënten auto-antilichamen gericht op het spierspecifieke kinase (MuSK). MuSK MG wordt gekenmerkt door ernstige spierzwakte, therapieresistente klinische manifestaties en myasthenische crises, waardoor vaak mechanische beademing nodig is. Bijgevolg hebben patiënten vaak langdurig gebruik van immunosuppressiva nodig, die gepaard gaan met bijwerkingen op de lange termijn. Gezien de ernst en zeldzaamheid van MuSK-MG is de ontwikkeling van een experimenteel diermodel cruciaal voor het bevorderen van nieuwe behandelingsmodaliteiten en een beter begrip van de onderliggende pathofysiologische mechanismen. Experimentele auto-immuun myasthenia gravis (EAMG) dient als een diermodel voor MuSK-MG en bootst effectief maar gedeeltelijk de klinische en immunologische kenmerken van menselijke MG na. De inductie van auto-immuun diermodellen kan worden bereikt door actieve of passieve immunisatie. In het hierin gepresenteerde experimentele protocol werd actieve immunisatie toegepast door subcutaan het gezuiverde extracellulaire domein van humaan MuSK geëmulgeerd in volledig Freund's adjuvans met door hitte gedode Mycobacterium tuberculosis toe te dienen. Immunisatie werd uitgevoerd op vier locaties, gevolgd door een boosterinjectie van MuSK op de 28e dag. Dit adjuvans met M. tuberculosis maakt activering van het immuunsysteem mogelijk door middel van TLR4 en versterkte fagocytose van het toegediende antigeen. Dit artikel beschrijft uitgebreid de ontwikkeling en karakterisering van MuSK-EAMG van begin tot einde.

Inleiding

Myasthenia gravis (MG) is een auto-immuunziekte die zich ontwikkelt via T-celafhankelijke, antilichaam-gemedieerde mechanismen. Het wordt voornamelijk veroorzaakt door antilichamen tegen nicotine-acetylcholinereceptoren (AChR) op het postsynaptische membraan van de neuromusculaire overgang (NMJ) bij 80%-85% van de patiënten, en door antilichamen tegen spierspecifiek kinase (MuSK) bij ongeveer 5% van de patiënten, evenals andere NMJ-eiwitten. MG is een prototype geworden voor auto-immuunziekten en een model voor het begrijpen van postsynaptische functie¹. Diermodellen van auto-immuunziekten kunnen worden onderverdeeld in twee hoofdcategorieën: (1) spontane modellen, waarin dieren van nature een auto-immuunziekte ontwikkelen, en (2) geïnduceerde modellen, waarbij de auto-immuunziekte kunstmatig wordt nagebootst en gerepliceerd. Studies naar myasthenia gravis (MG) hebben aangetoond dat zowel actieve als passieve immunisatie de ziekte kan induceren, wat aanzienlijk bijdraagt aan het begrip van antilichaam-gemedieerde aandoeningen².

Passieve overdracht is een zeer effectieve methode voor het evalueren van de acute effecten van auto-antilichaam-gemedieerde ziekten en wordt veel gebruikt om van de patiënt afgeleide antilichamen in MG te bestuderen. Deze benadering is nuttig geweest bij het verbreden van het begrip van de immunologische factoren die ten grondslag liggen aan de ziekte. Passieve transferstudies hebben bijvoorbeeld de pathogene impact van anti-MuSK IgG4 op de reductie van AChR-clusters³ aangetoond. Er zijn echter enkele beperkingen aan het passieve overdrachtsmodel, zoals de functionele verschillen tussen IgG en immuunsysteem bij mensen en knaagdieren en de ontoereikendheid van het passieve overdrachtsmodel om de initiële activeringsmechanismen van de anti-MuSK-auto-immuniteit in lymfoïde weefsels na te bootsen.

Aan de andere kant is een mogelijke beperking van de immunisatiestudies de immunogenetische variabiliteit tussen verschillende muizenstammen⁴. Terwijl C57BL/6 (B6)-muizen bijvoorbeeld vatbaar zijn voor actieve immunisatie met AChR, zijn AKR/J-muizen resistent. Daarom is het bij het maken van een EAMG-diermodel van cruciaal belang om de diersoort, de immunisatiemethode en de inhoud van het protocol correct te selecteren om de ziekte nauwkeurig weer te geven⁵.

Bovendien resulteert het gebruik van het doelantigeen als geheel eiwit vaak in hoge antilichaamtiters. Niet alle antilichamen kunnen echter kruisreageren met het muizenantigeen of ziekteverwekkende epitopen produceren. Daarom weerspiegelen actieve immunisatiemodellen niet altijd nauwkeurig de menselijke pathologie. Desalniettemin, wanneer ze met succes een geschikt klinisch en fysiologisch fenotype creëren, bieden deze modellen een langetermijnplatform voor het testen van experimentele therapieën.

Klinische studies wijzen op uiteenlopende ziektemechanismen en therapeutische vereisten voor MuSK-MG, wat de noodzaak benadrukt van verdere identificatie van de specifieke pathogene kenmerken van dit MG-subtype ^4,5,6. Eerdere actieve immunisatie-gebaseerde MuSK EAMG-onderzoeken toonden een overheersende betrokkenheid aan van Th2-type immuniteit en anti-muis IgG1 bij MuSK-auto-immuniteit en identificeerden een aantal mogelijke behandelingsmodaliteiten (bijv. teriflunomide, mesenchymale stamcel, FCRLB shRNA) voor humaan MuSK MG ^7,8,9. Dit toonde het belang aan van het MuSK EAMG-model bij het testen van nieuwe therapeutische doelen en het onderzoeken van de pathofysiologie van MuSK MG.

In dit artikel zijn de procedures voor het induceren van het diermodel, het monitoren van ziekteprogressie en validatie van EAMG-inductie beschreven. De klinische evaluatie omvatte het monitoren van gewicht, houding, grijpkracht en klinische scores door een waarnemer. Muizen werden 28 dagen na de tweede immunisatie geëuthanaseerd en verschillende weefsels, waaronder bloed, achterste ledematen, milt en oksel- en lieslymfeklieren, werden verzameld om de vaststelling van de ziekte te bevestigen. Anti-MuSK-antilichamen werden gekwantificeerd in sera met behulp van de ELISA-methode. Bovendien werd immunofluorescerende kleuring uitgevoerd op spierweefsels om afzettingen bij de neuromusculaire overgang te visualiseren. Om de klinische en immuunresponsen in muisgroepen met verschillende MuSK EAMG-gevoeligheid aan te tonen en te vergelijken, vertoonden muizen die werden behandeld met KCNS3 shRNA een pro-inflammatoire werking (niet gepubliceerd) en FCRLB shRNA vertoonde een ontstekingsremmende werking⁹, zoals vastgesteld in eerdere studies.

Protocol

Het protocol werd goedgekeurd door de Lokale Ethische Commissie voor Dierproeven van de Universiteit van Istanbul (HADYEK) met het beslissingsnummer 2020/29. In onze eerdere studies ^7,8,9 werd het EAMG-model geïnduceerd bij 8-10 weken oude BALB/c- of B6-muizen via actieve immunisatie met het MuSK-eiwit. Dit artikel presenteert voorbeeldgegevens verkregen uit verschillende experimenten met MuSK-geïmmuniseerde BALB/C-muizen (4-8 muizen per groep). De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Productie en bereiding van humaan MuSK voor immunisatie

1. Kloon de humane MuSK extracellulaire domein aminozuren 24-495 (NCBI Reference Sequence: NP_005583.1) in de pPIC9 vector.
2. Secrete expressie in het gist Pichia pastoris (stam GS115) systeem.
3. Induceer expressie door de toevoeging van methanol (2,5% v/v) aan het groeimedium.
4. Voeg een C-terminal 6xHIS-tag toe voor zuiveringsdoeleinden.
5. Breng het eiwit tot expressie als een uitgescheiden geglycosyleerd eiwit en zuiver het onder inheemse omstandigheden. Dialyseer het kweekmedium tegen 50 mM fosfaatbuffer pH 8,0, 300 mM NaCl.
6. Ga verder met nikkel-ion-affiniteitschromatografie met behulp van Ni²⁺/nitrilotriacetaat-agarose (Ni-NTA). Bewaar het gezuiverde eiwit na toevoeging van 10% glycerol bij -80 °C, waar het ten minste twee jaar stabiel is¹⁰.
   OPMERKING: De expressieniveaus, geschat na Ni-NTA-zuivering, zijn ongeveer 0,4 mg/L cultuur. Er werden geen andere eiwitonzuiverheden gedetecteerd in de monsters die door SDS-PAGE werden geanalyseerd.
7. Controleer vóór immunisatie de zuiverheid van het geïsoleerde extracellulaire domein van het MuSK-eiwit door middel van gelelektroforese (aanvullende figuur 1).
8. Bereid de MuSK voor elke muis voor op een concentratie van 45 μg/100 μL PBS.
9. Homogeniseer (emulgeren) de MuSK in een verhouding van 1:1 met PBS (100 μL) en Complete Freund's Adjuvans (CFA-100 μL) met Mycobacterium tuberculosis H37Ra (10 mg/10 ml) (totaal volume van de emulsie is 200 μL per muis).

2. Anesthesie en immunisatieprocedure

1. Vóór immunisatie, verdun de propofol in PBS (verhouding 1:5).
2. Intraperitoneaal toedienen in een dosis van 50 mg/kg per muis.
   OPMERKING: Isofluraan kan ook worden gebruikt voor anesthesie via inhalatie (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). De initiële concentratie is doorgaans vastgesteld op 3%-5% met een zuurstofdebiet van 1-2 l/min, terwijl de onderhoudsconcentratie meestal 1%-3% is met een zuurstofdebiet van 0,5-1 l/min.
3. Eerste immunisatie: Injecteer in totaal 45 μg/200 μL bereide MuSK in CFA subcutaan in de schouders en de binnenkant van de achterpoten (ongeveer 11,25 μg/50 μL voor elk deel).
4. Tweede immunisatie: Injecteer in totaal 45 μg/200 μL bereide MuSK in CFA subcutaan in de schouders en heupen (ongeveer 11,25 μg/50 μL voor elk deel).
   OPMERKING: Dien de injecties tweemaal toe met een interval van 28 dagen om het model vast te stellen. Intramusculaire toediening gaat gepaard met spierpijn, wat de beoordeling van klinische zwakte kan verstoren. Aangezien EAMG een spierziekte is, kan het gebruik van intramusculaire injectie pijngerelateerde niet-myasthenische zwakte veroorzaken en zo als een verstorende factor werken. Een controlegroep die is geïmmuniseerd met alleen CFA (zonder MuSK) wordt aanbevolen.

3. Klinische scoren

1. Train de muizen door ze voorzichtig 40 keer over het bovenste rooster van een kooi te slepen terwijl ze proberen het rooster vast te pakken om vermoeidheid op te wekken, omdat de symptomen van myasthenia gravis bij muizen meer uitgesproken worden na inspanning en vermoeidheid.
2. Observeer de muizen na het sporten zorgvuldig op veranderingen in activiteit, gewicht en spierkracht. Wijs op basis van deze observaties de juiste scores toe om de evaluatiecriteria te sturen.
   LET OP: Score 0: Muizen blijven actief en blijven hun omgeving verkennen; Score 1: Een gebogen houding wordt waargenomen na het sporten, maar muizen keren terug naar normale activiteit en gezelligheid. De vachtverzorging wordt over het algemeen gehandhaafd. Score 2: Een gebogen houding is al zichtbaar vóór de inspanning en wordt meer uitgesproken na de inspanning. Er wordt een afname van zelfverzorging en activiteit opgemerkt. Score 3: Voor en na het sporten wordt een dramatische gebogen houding waargenomen. Er is een significante afname van beweging, gezelligheid en spierkracht, vergezeld van een gewichtsverlies van 1-2 gram om de 2-3 dagen. Uitdroging treedt op, waardoor het voor muizen moeilijk wordt om bij water en voedsel te komen. Uitdroging wordt geïdentificeerd door de huid die niet snel terugkeert na te zijn geknepen en veranderingen in de ontlasting. Muizen met pijn worden gekenmerkt door loensen en een gebogen houding. Muizen die tekenen van hevige pijn vertonen en meer dan 20% gewichtsverlies worden opgeofferd. Score 4: De muis wordt dood aangetroffen in de kooi. De overleden muis moet onmiddellijk worden verwijderd en de kooi moet worden vervangen⁵.
3. Controleer de muizen dagelijks, aangezien de symptomen ongeveer 10 dagen na de tweede immunisatie snel vorderden. Voer de eerste 28 dagen wekelijks klinische scores en metingen uit en daarna twee keer per week.
4. Voer gewichtsmeting uit.
   OPMERKING: Gewichtsmeting biedt een cruciale parameter voor het volgen van ziekteprogressie. Vanwege de hoge stofwisseling van muizen kan het lichaamsgewicht aanzienlijk variëren. Het is belangrijk om voor alle metingen dezelfde schaal te gebruiken en deze metingen op hetzelfde tijdstip van de dag uit te voeren voor consistentie.
5. Voer spierkrachtmeting uit. Gebruik een horizontale dynamometer met een rasterdraad om de spierkracht te meten.
   1. Train de muizen voor klinische scoren door ze voorzichtig 40 keer over de kooi te slepen om vermoeidheid op te wekken.
   2. Plaats elke muis onmiddellijk op het rooster van de rollenbank en trek voorzichtig aan de staart, waarbij u ervoor zorgt dat alle poten het rooster stevig vastpakken. Overweeg alleen metingen waarbij de muizen het rooster met alle vier de poten vastpakken.
      OPMERKING: Probeer tijdens elke meting een gelijke hoeveelheid kracht uit te oefenen, en het wordt aanbevolen dat dezelfde onderzoeker alle metingen uitvoert om de betrouwbaarheid te behouden en de variabiliteit te verminderen. Aangezien vermoeidheid het kenmerk is van MG-zwakte, moet een reeks grijpkrachttests worden uitgevoerd zonder de grijpkracht te meten. Daarna werden zeven metingen uitgevoerd voor elke muis en werden de maximum- en minimumwaarden weggegooid. Het gemiddelde van de overige vijf metingen wordt berekend om betrouwbare resultaten te garanderen.

4. Voorbereiding van weefselmonsters

OPMERKING: Offer de muizen 28 dagen na de tweede immunisatie volgens institutioneel goedgekeurde protocollen. Het verzamelen van bloed, spieren, milt en lymfeklieren van de geofferde muizen zal nuttig zijn voor verder onderzoek.

1. Harten bloedafname
   OPMERKING: Om hartbloed af te nemen, verdooft u de muizen met een geschikt verdovingsmiddel (bijv. propofol) dat is goedgekeurd door de ethische commissie. Hartpunctie vereist anesthesie en is een terminale procedure, wat betekent dat dieren onmiddellijk daarna moeten worden geëuthanaseerd.
   1. Nadat u de rat diep hebt verdoofd, legt u deze op zijn rug, opent u de buik en zoekt u het hart, ongeveer 1 cm boven de onderste rib en iets naar rechts.
   2. Gebruik een naald van 25-35 G om voorzichtig bloed af te zogen uit de linker hartkamer in een hoek van 45 graden zonder de spuit te bewegen om complicaties te voorkomen¹¹.
   3. Breng de bloedmonsters over naar droge buisjes voor serumscheiding en/of naar EDTA-buisjes voor RNA-isolatie - indien gepland.
   4. Scheid het serum door centrifugeren en bewaar de serummonsters bij -20 °C totdat het wordt gebruikt.
2. Behoud en voorbereiding van spiermonsters
   1. Verzamel de voorste tibialis-spier 11,12,13. Spoel af met ijskoud PBS.
   2. Plaats monsters in cryobuizen, dompel ze onmiddellijk onder in met vloeibare stikstof gekoeld isopentaan bij -20 °C en bewaar ze in een vriezer van -80 °C.
      OPMERKING: Monsters moeten worden ingevroren voor nauwkeurigere resultaten in experimenten.
   3. Plaats de tissues verticaal op een sectiehouder; Een kurk kan worden gebruikt. Veranker de monsters voor immunofluorescentiekleuring in OCT (Optimal Cutting Temperature compound).
   4. Laat het weefsel drijven op met vloeibare stikstof gekoeld isopentaan. Bewaar in een vriezer van -80 °C tot ze worden gesneden met een cryostaat.

5. Evaluatie van neuromusculaire juncties via immunofluorescentielabeling

1. Cryostaat secties en fixatie
   1. Snijd de ingevroren weefsels die in OCT zijn ingebed bij -24 °C in stukken tot een dikte van 7 μm met behulp van een cryostaat.
   2. Fixeer de secties in aceton gekoeld tot -20 °C. Was met PBS gedurende 5 min.
   3. Opnieuw wassen PBS met 0,4% Triton X (PBS-T) gedurende 10 minuten.
      OPMERKING: Een permeabilisatiestap kan worden uitgevoerd om de conformatie van moleculen die door fixatie worden aangetast te corrigeren, wat zorgt voor een nauwkeurigere binding. Permeabilisatie omvatte behandeling met PBS met 1% FBS gedurende 10 minuten en PBS-T gedurende nog eens 10 minuten.
   4. Blokkeer de secties met PBS-T met 10% FBS gedurende 30 minuten om niet-specifieke binding te voorkomen.
2. Immunofluorescentie kleuring
   OPMERKING: Voor kleuring kunnen de volgende antilichamen worden gebruikt: C3, IgG, acetylcholinereceptormarker α-bungarotoxine.
   1. Verdun de geselecteerde antilichamen in PBS-T met 1% FBS.
   2. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 2,5 uur.
   3. Was de secties met PBS-T met 1% FBS.
   4. Tegenvlekken met DAPI.
   5. Bewaar de coupes tot onderzoek onder een fluorescentiemicroscoop in een donkere en vochtige omgeving bij 4 °C.
   6. Beeldvorming en analyse uitvoeren.
      OPMERKING: Bungarotoxine (BTX)-positieve neuromusculaire juncties in elke sectie moeten worden geteld met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Leg foto's vast met een vergroting van 20x. Voor analyse werden BTX- en C3- of IgG-positieve neuromusculaire juncties handmatig onder de microscoop geteld. Voor de analyse moet het percentage dubbel-positieve juncties ten opzichte van het totale aantal BTX-gelabelde juncties in seriële secties worden gebruikt.

6. Westerse vlek

1. Eiwitisolatie en kwantificering
   1. Gebruik spiermonsters die snel bevroren zijn.
   2. Bereid lysisbuffer voor met protease en fosfataseremmers.
   3. Voeg 0,5 mm zirkoniumoxidekorrels toe, gelijk aan het monstergewicht en 2x het volume van de lysisbuffer.
   4. Homogeniseer monsters met behulp van een homogenisator.
   5. Centrifugeer het lysaat bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
   6. Verzamel het bovenstaande dat het eiwitlysaat bevat.
   7. Gebruik een BCA-testkit of Bradford-reagens om de eiwitconcentratie te kwantificeren.
   8. Bereid eiwitmonsters voor tot de gewenste concentratie met lysisbuffer. 25 μg eiwit per putje is efficiënt voor het aantonen van AChR.
2. SDS-PAGE gel elektroforese
   1. Meng eiwitmonsters met 4x Laemmli buffer.
   2. Verwarm de monsters gedurende 5 minuten op 95 °C om te denatureren.
   3. Laad gelijke hoeveelheden eiwit en een eiwitladder in putjes van een SDS-PAGE-gel.
   4. Laat de gel 30 minuten op 200 V draaien (de tijd kan variëren tussen de verschillende voedingen).
3. Eiwit overdracht
   1. Voor semi-droge overdracht met nitrocellulosemembraan moet elk onderdeel worden bevochtigd met een koudeoverdrachtsbuffer.
   2. Zet de transfersandwich op: spons, filtreerpapier, gel, membraan, filtreerpapier, spons.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de lagen aanwezig zijn. Het overdrachtsprogramma moet worden geselecteerd volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
4. Blokkering en incubatie van antilichamen
   1. Blokkeer het membraan in 5% magere melkpoeder of BSA in TBST gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met zacht schommelen.
   2. Incubeermembraan met primair antilichaam (anti-AChR) verdund in 2,5% blokkerende buffer 's nachts bij 4 °C met zacht schommelen.
   3. Was het membraan 3 keer gedurende 10 minuten in TBST.
   4. Incubeermembraan met HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (IgG HRP) verdund in 2,5% blokkerende buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
   5. Was het membraan 3 keer gedurende 10 minuten in TBST.
5. Detectie en beeldvorming
   1. Breng ECL-substraat aan op het membraan volgens de instructies van de fabrikant.
   2. Leg het chemiluminescente signaal vast met behulp van een beeldvormingssysteem.
   3. Analyseer banden met behulp van beeldvormingssoftware.
      OPMERKING: Bewaar eiwitten en reagentia altijd op ijs om afbraak te voorkomen. Zorg voor een gelijkmatige belasting door een huishoudelijk eiwit (bijv. bèta-actine, alfa-tubuline of GAPDH) als controle uit te voeren. Optimaliseer antilichaamconcentraties en incubatietijden voor de beste resultaten. Het is cruciaal om aan te tonen dat AChR-eiwit minder tot expressie komt in MuSK-geïmmuniseerde muizen.

7. Zelfgemaakte Anti-MuSK IgG ELISA

1. Bereid MuSK-antigeen voor in een concentratie van 0,5 μg per putje in 100 μL carbonaatbicarbonaatbuffer (Plate Coating).
2. Doseer 100 μl van de antigeenoplossing in elk putje van een immunoassayplaat.
3. Incubeer de plaat een nacht bij 4 °C.
4. Was de plaat met PBS met 0,5% Tween 20 (wasoplossing).
5. Incubeer de plaat met PBS met 5% FBS (blokkeringsoplossing) gedurende 90 minuten bij 4 °C om niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren (blokkering).
6. Aangezien optimalisatiestudies hoge niveaus van MuSK-IgG aantoonden, verdun de serummonsters 1/50.000 in blokkeeroplossing.
7. Voeg zonder wassen na het blokkeren de verdunde serummonsters toe aan de putjes.
8. Incubeer de plaat gedurende 90 minuten bij 37 °C.
9. Was de plaat drie keer met de wasoplossing.
10. Verdun HRP-geconjugeerd anti-muis IgG secundair antilichaam (ab97023) 1/5000 in blokkeeroplossing.
11. Voeg 100 μL van het verdunde secundaire antilichaam toe aan elk putje.
12. Incubeer de plaat gedurende 90 minuten bij 37 °C.
13. Was de plaat drie keer met de wasoplossing.
14. Voeg 100 μL TMB-substraat toe aan elk putje en observeer de kleurverandering.
15. Stop de reactie op een geschikt moment met 2 M H₂SO_4.
16. Meet de optische dichtheid bij 450 nm met behulp van een spectrofotometer.
17. Voer alle monsters in duplicaten en op dezelfde plaat uit voor consistentie.
    OPMERKING: Voor de analyse moeten optische dichtheidswaarden worden gebruikt, aangezien er geen standaardmonsterverdunningen beschikbaar waren. Er mag geen kleurverandering optreden in de negatieve controleputjes (blanco). Er wordt een snelle kleurverandering verwacht, dus de stopoplossing moet in de buurt worden gehouden om de reactie in de putjes onmiddellijk te stoppen.

Resultaten

Bij het evalueren en valideren van het MuSK Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis (EAMG)-model zijn verschillende belangrijke parameters en experimentele resultaten van cruciaal belang om de succesvolle inductie en karakterisering van het ziektemodel aan te tonen. Hieronder staan de representatieve resultaten die de totstandkoming van het MuSK EAMG-model bevestigen.

Klinische scoren
Muizen worden gecontroleerd en gescoord op klinische s...

Discussie

Muriene MuSK-EAMG bootst humaan MuSK-MG na, zowel in zijn klinische als immunopathogene aspecten in termen van spierzwakte, gewichtsverlies als gevolg van bulbaire spierzwakte, circulerende anti-MuSK-antilichamen en verminderde spier-AChR. Wat betreft mijlpalen en de verwachte tijdlijn voor dit MuSK-EAMG-model, zouden klinische tekenen van spierzwakte binnen de eerste week na de tweede immunisatie moeten verschijnen. Ongeveer 5% van de muizen kan na de eerste immunisatie tekenen van ziek...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
125I-α-bungarotoxin	Invitrogen	BTX T1175
2-Methylbutaan	Sigma-Aldrich	M32631
40 μm Cell Strainer	NEST	258369
96 well Maxisorp plate	Sigma-Aldrich	M9410
Adjuvant Incomplete	Becton Dickinson & Co.	263910
Anti-AChR alfa1	Alomone	ANC-001
Anti-muis IgG HRP	Abcam	ab97023
Bullet Blender Storm	Next Advance		Weefsel homogenisator
C3	Novus	NB200-540G
Carbonaat-Bicarbonaat Buffer	Merck	C3041
Cryostat	Leica	CM1860
Dynamometer Imada DST-50N	Muromachi	MK380Si
Fluorescentiemicroscoop	Leica	DM4M
Glazen spuit met luer lock	ISOLAB	094.92.005
IgG	Abcam	ab96871
Microplate Photometer, Multiskan FC	Thermo Scientific	51119000
Muis Chirurgisch Kit	Kent Scientific Corparation	INSMOUSEKIT
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	Becton Dickinson & Co.	231141
OCT Compound	Agar Scientific	AGR1180
Spuiten, 1 mL	Becton Dickinson & Co.	309625
Spuiten, 2 mL	B. Braun	7389
Universele dierendtrainer	Merck	Z756911-1EA
WesternBright Sirius-Western blotting detectiekit	Advansta	K-12043-D10	ECL