Eencellige calciumbeeldvorming voor het bestuderen van de activering van calciumionkanalen

Samenvatting

Dit artikel presenteert een methode voor real-time, kwantitatieve monitoring van calciumionconcentraties (Ca²⁺) in cellen met behulp van eencellige Ca²⁺ beeldvorming met de Fura-2/AM-kleurstof. Deze techniek maakt het mogelijk om de kleurstof efficiënt te laden en de Ca²⁺ -niveaus nauwkeurig te berekenen door middel van fluorescentie-intensiteitsverhoudingen, waardoor het een eenvoudige en snelle aanpak is voor onderzoekstoepassingen.

Samenvatting

Enkelvoudige Ca²⁺ beeldvorming is essentieel voor de studie van Ca²⁺ kanalen die worden geactiveerd door verschillende stimulaties zoals temperatuur, spanning, natuurlijke verbinding en chemicaliën et al. Het is voornamelijk gebaseerd op microscopische beeldvormingstechnologie en de verwante Ca²⁺ -indicator Fura-2/AM (AM is de afkorting voor acetoxymethylester). In de cellen wordt Fura-2/AM door esterasen gehydrolyseerd tot Fura-2, dat omkeerbaar kan binden met vrij cytoplasmatisch Ca²⁺. De maximale excitatiegolflengte verschuift van 380 nm naar 340 nm (indien verzadigd met Ca²⁺) bij binding. De uitgezonden fluorescentie-intensiteit is kwantitatief gerelateerd aan de concentratie van gebonden Ca²⁺. Door de 340/380-verhouding te meten, kan de Ca²⁺ -concentratie in het cytoplasma worden bepaald, waardoor fouten worden geëlimineerd die worden veroorzaakt door variaties in de laadefficiëntie van de fluorescerende sonde tussen verschillende monsters. Deze technologie maakt realtime, kwantitatieve en gelijktijdige monitoring van Ca²⁺ -veranderingen in meerdere cellen mogelijk. De resultaten worden opgeslagen in ". XLSX"-formaat voor latere analyse, dat snel is en intuïtieve veranderingscurves genereert, waardoor de detectie-efficiëntie aanzienlijk wordt verbeterd. Vanuit verschillende experimentele perspectieven beschrijft dit artikel het gebruik van deze technologie om Ca²⁺ -signalen te detecteren in cellen met endogene of tot overexpressie gebrachte kanaaleiwitten. Ondertussen werden ook verschillende methoden voor het activeren van cellen getoond en vergeleken. Het doel is om lezers een beter inzicht te geven in het gebruik en de toepassingen van single cell Ca²⁺ -beeldvorming.

Inleiding

Ca²⁺ speelt een cruciale rol bij cellulaire signaaltransductie en reguleert verschillende cellulaire functies zoals spiercontractie¹, zenuwgeleiding², secretie³ en genexpressie⁴, waardoor meerdere fysiologische processen worden beïnvloed. Abnormale Ca²⁺ -concentraties kunnen leiden tot ziekten zoals aritmieën⁵, stollingsstoornissen⁶ en hormonale onevenwichtigheden⁷. Daarom is het bestuderen van de mechanismen van intracellulaire Ca²⁺ concentratieveranderingen van het grootste belang.

Verschillende ionkanalen zijn betrokken bij de regulatie van de Ca²⁺ -concentratie in cellen, waaronder sterk Ca²⁺-selectieve calciumafgifte-geactiveerde calciumkanalen (CRAC)⁸ en niet-selectieve kationkanalen van de TRP-familie⁹. Deze ionenkanalen kunnen worden geactiveerd door stimuli zoals temperatuur¹⁰, verbindingen en actieve ingrediënten die worden aangetroffen in de traditionele Chinese geneeskunde¹¹ en spelen een cruciale rol in verschillende Ca²⁺-gerelateerde fysiologische processen.

Effectieve monitoring van intracellulaire Ca²⁺ -concentratieveranderingen is essentieel voor het bestuderen van Ca²⁺-gerelateerde ionkanalen, met name op het gebied van de traditionele Chinese geneeskunde, waar calciumsignaleringsregulatie een centrale rol speelt in veel therapeutische benaderingen. Momenteel kunnen de primaire methoden voor het meten van intracellulaire Ca²⁺ worden onderverdeeld in twee typen: elektrische en optische metingen. De elektrische meetbenadering maakt gebruik van de patch-clamp-techniek om veranderingen in het celmembraanpotentiaal als gevolg van Ca²⁺ -influx¹² te beoordelen.

Bij optische metingen binden fluorescente sondes specifiek aan Ca²⁺, waardoor onderzoekers veranderingen in cellulaire fluorescentie-intensiteit kunnen volgen. Veelgebruikte optische methoden zijn onder meer technieken op basis van fluorescerende eiwitten en technieken op basis van fluorescerende kleurstoffen. In op fluorescerende eiwitten gebaseerde methoden kunnen onderzoekers Ca²⁺-gevoelige fluorescerende eiwitten zoals Cameleon¹³ en GCaMP¹⁴ in cellen tot overexpressie brengen en fluorescentiesignaalveranderingen volgen met behulp van fluorescentiemicroscopie of flowcytometrie om verschuivingen in cytoplasmatische Ca²⁺ -concentraties waar te nemen. Bovendien kunnen onderzoekers deze eiwitten bij muizen tot overexpressie brengen en twee-fotonfluorescentiemicroscopie gebruiken voor real-time in vivo of weefselniveaumonitoring van intracellulaire Ca²⁺ -concentraties, wat zorgt voor een hoge resolutie en diepe weefselpenetratie¹⁰.

Voor methoden op basis van fluorescerende kleurstoffen worden vaak Ca²⁺ -sondes gebruikt, waaronder Fluo-3/AM, Fluo-4/AM en Fura-2/AM¹⁰. Onderzoekers incuberen cellen in een oplossing die deze fluorescerende sondes bevat, die het celmembraan kruisen en worden gesplitst door intracellulaire esterasen om actieve verbindingen te vormen (bijv. Fluo-3, Fluo-4 en Fura-2) die in de cel blijven. Deze sondes vertonen minimale fluorescentie in hun vrije ligandvorm, maar zenden sterke fluorescentie uit wanneer ze gebonden zijn aan intracellulair Ca²⁺, wat wijst op veranderingen in cytoplasmatische Ca²⁺ -concentraties. Vergeleken met andere fluorescerende eiwitten en kleurstoffen, is Fura-2 doorgaans geëxciteerd bij golflengten van 340 nm en 380 nm. Wanneer gebonden aan intracellulair vrij Ca²⁺, ondergaat Fura-2 een absorptieverschuiving, waardoor de excitatiegolflengtepiek wordt verplaatst van 380 nm naar 340 nm, terwijl de emissiepiek in de buurt van 510 nm ongewijzigd blijft. Er is een kwantitatief verband tussen fluorescentie-intensiteit en gebonden Ca²⁺ -concentratie, waardoor de intracellulaire^{Ca 2+} -concentratie kan worden berekend door de fluorescentie-intensiteitsverhouding bij deze twee excitatiegolflengten te meten. Verhoudingsmetingen verminderen de effecten van fotobleken, lekkage van fluorescerende sondes, ongelijkmatige belasting en verschillen in celdikte, wat betrouwbaardere en reproduceerbare resultaten oplevert (Figuur 1).

Eencellige Ca²⁺ beeldvormingssystemen maken voornamelijk gebruik van microscopietechnieken en de Ca²⁺ indicator Fura-2/AM om intracellulaire Ca²⁺ concentraties te detecteren. Deze systemen bestaan uit een fluorescentiemicroscoop, een Ca²⁺ beeldvormende lichtbron en fluorescentiebeeldvormingssoftware, waarmee realtime, kwantitatieve monitoring van Ca²⁺ -veranderingen in het cytoplasma van meerdere cellen tegelijk mogelijk is (tot 50 cellen per gezichtsveld). De resultaten worden opgeslagen in ".xlsx"-formaat voor latere analyse. Het systeem biedt een hoge analysesnelheid (ongeveer 1 minuut voor het analyseren van een groep cellen binnen één gezichtsveld) en genereert intuïtieve veranderingscurves, waardoor de detectie-efficiëntie aanzienlijk wordt verbeterd. Single-cell^{Ca 2+} beeldvorming is een essentiële technische benadering voor het bestuderen van Ca²⁺-gerelateerde kanalen en heeft een aanzienlijke waarde in ionkanaalgerelateerd biomedisch onderzoek. De toepassing ervan in de eencellige calciumbeeldvormingstechnologie zal naar verwachting het onderzoek naar de mechanismen die ten grondslag liggen aan de traditionele Chinese geneeskunde aanzienlijk bevorderen.

Protocol

De experimentele methoden werden goedgekeurd door en volgden de IACUC-richtlijnen van Tsinghua University en Beijing University of Chinese Medicine. Dit protocol introduceert eencellige Ca²⁺ beeldvormingsmethoden voor verschillende celtypen, waaronder primaire keratinocyten geïsoleerd uit de huid van verschillende pasgeboren muizen (binnen drie dagen na de geboorte, met geslachtsgerandomiseerde nestgenoten, C57BL/6-muizen). Details van de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van de cellen

NOTITIE: Primaire cellen, cellijnen met endogene doelwitgenen of cellen die zijn getransfecteerd met tot overexpressie gebrachte plasmiden zijn allemaal geschikt voor eencellige Ca²⁺ -beeldvorming. De plasmiden die in deze studie werden gebruikt, werden verkregen uit het laboratorium van professor Xiao Bailong aan de Tsinghua University. Deze plasmiden werden geconstrueerd door sequenties van GFP fluorescerend eiwit op te nemen met humaan STIM1, DsRed fluorescerend eiwit met humaan Orai1, mRuby fluorescerend eiwit met konijn TRPV1, evenals het rode fluorescerende eiwit mCherry in faagplasmidevectoren¹⁰.

1. Bereid steriele glazen objectglaasjes met een diameter van 8 mm voor op een plaat met 24 putjes. Voeg 500 μL poly-D-lysine (PDL) buffer (50 μg/ml in DPBS) toe aan elk putje.
2. Incubeer de objectglaasjes gedurende 1 uur bij 37 °C om ze te coaten en gooi de coatingoplossing vervolgens met een pipet weg.
3. Was de dia's een keer met DPBS en leg ze opzij voor later gebruik.
4. Kweek primaire cellen en cellijnen afzonderlijk volgens hun specifieke kweekmethoden¹⁰.
5. Zaadcellen op de voorbereide plaat met 24 putjes met een dichtheid van ongeveer 1,5 x 10⁵ cellen per putje. Gebruik de cellen voor Ca²⁺ beeldvorming zodra ze zich op het dekglaasje hebben gehecht.
6. Voor cellen die plasmiden tot overexpressie brengen, transfecteer^10,15 het doelplasmide (1 μg/put) gebruikend Lipofectamine 2000 (of Lipofectamine 3000) transfectiereagens bij een verhouding van 1:1, en incubeer in een incubator van de celcultuur ongeveer 24 h.
   NOTITIE: Een langere incubatietijd kan nodig zijn voor eiwitten die tot expressie komen met een grotere expressie.

2. Bereiding van Fura-2/AM werkoplossing

1. Voeg 50 μl dimethylsulfoxide (DMSO) toe aan een tube met 50 μg Fura-2/AM-poeder en meng goed om een 1 μg/μl bouillonoplossing van Fura-2/AM te bereiden.
2. Meng de Fura-2/AM stockoplossing en Pluronic F-127 in de buffer van Hank met 1.3 mM Ca²⁺.
   NOTITIE: De uiteindelijke concentratie van Fura-2/AM en Pluronic F-127 in de werkoplossing is 2,5 μg/ml. De buffer van de Hank wordt voorbereid door 10 mM HEPES toe te voegen aan 1x HBSS-buffer.
3. Gebruik aluminiumfolie om de Fura-2/AM werkoplossing tegen licht te beschermen.

3. Celvoorbehandeling voor eencellige Ca²⁺ beeldvorming

1. Breng de glasplaatjes met cellen over op een nieuwe plaat met 24 putjes met Hank's buffer om te wassen.
2. Gooi de buffer weg met behulp van een pipet en voeg 500 μL Fura-2/AM werkbuffer toe aan elk putje.
3. Incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker om de sonde te kunnen laden.
4. Verwijder de Fura-2/AM werkbuffer en was de cellen drie keer met Hank's buffer om overtollige Fura-2/AM te verwijderen. De cellen zijn nu klaar voor gebruik.

4. Starten van het Ca²⁺ beeldvormingssysteem

OPMERKING: In dit onderzoek wordt een fluorescentiemicroscoop gebruikt voor Ca²⁺ beeldvorming.

1. Start de volgende componenten in volgorde: DG4-licht (xenonlamp), camera, witlichtbron, microscooptrapcontroller, microscoop, computer en fluorescentiebeeldvormingssoftware.
   NOTITIE: Als u de activering van ionenkanalen door temperatuur detecteert, schakelt u ook de volgende componenten in: perfusiesysteem, verwarmingssysteem, temperatuurregelaar en verwarmings-/koelapparaat met vloeistofcirculatie.

5. Cellulaire Ca²⁺ responsprocedure

1. Open de fluorescentiebeeldvormingssoftware (zie Materiaaltabel).
   1. Kies Protocol en selecteer vervolgens Bestand, gevolgd door Protocol laden. Selecteer het protocol en klik op OK.
   2. Configureer het experiment (in de menulijst).
   3. Selecteer Nieuw experiment.
2. Monteer de perfusiekamer op de microscoop.
   NOTITIE: Laat het objectief altijd volledig zakken bij het monteren of verwijderen van kamers met behulp van de ruwe focusknop om schade aan het objectief te voorkomen.
3. Verwijder de met Fura-2/AM behandelde celglaasjes en plaats ze in de kamer met de buffer van Hank.
4. Start het perfusiesysteem.
5. Selecteer het 20x DIC-objectief en pas de scherpstelling aan onder wit licht.
6. Klik op Cfg Exp op de taakbalk.
   1. Selecteer de gewenste fluorstoffen voor beeldvorming.
   2. Bepaal de acquisitiefrequentie en weergave-instellingen op het scherm (Verkrijgen: controleer op 340, 380, GFP; Acquisitie-interval: 1 s; Opslaginterval: 1 s).
7. Focus
   1. Klik in het configuratiescherm van het experiment op de knop Focus .
   2. Pas de acquisitietijd aan (meestal 100 ms) en verhoog indien nodig, en 'bewaar voor deze golf'.
      NOTITIE: Gebruik voor UV-licht versterking in plaats van belichtingstijd.
   3. Kies de gewenste golflengte om scherp te stellen (bijv. 380) en klik op Begin met scherpstellen.
   4. Schakel de weergave van de verrekijker naar de computer.
   5. Zorg ervoor dat er een vage groenachtige kleur zichtbaar is door de verrekijker.
   6. Stel scherp op de cellen, gebruik eerst ruwe scherpstelling om het objectief dichtbij te krijgen en vervolgens fijne scherpstelling.
      NOTITIE: De microscoop piept als hij te dicht bij het podium komt. Als dit gebeurt, laat je het objectief zakken, lijn je de plaat opnieuw uit op het podium en stel je opnieuw scherp. Minimaliseer de tijd die wordt besteed aan scherpstellen om door laser veroorzaakte celbeschadiging te verminderen.
   7. Controleer de fluorescentie-intensiteit van de cellen tijdens het scherpstellen.
   8. Pas de fluorescentie-intensiteit van de cellen aan door de belichtingstijd en -versterking aan te passen.
      NOTITIE: De belichtingstijd en versterking voor 340 en 380 moeten consistent zijn.
   9. Zodra een goede scherpstelling is bereikt, drukt u op de knop op de microscoop om de weergave naar de computer te schakelen.
   10. Stel indien nodig opnieuw scherp om het scherpste beeld op de computer te krijgen en klik vervolgens op Stoppen met scherpstellen.
8. Alternatieve procedure voor het vinden van GFP-positieve cellen
   1. Gebruik eerst de 340/380-procedure om een goede focus op de cellen te krijgen.
   2. Selecteer FITC en klik vervolgens op Start Focusing.
   3. Gebruik de stagecontroller om GFP-positieve cellen te vinden.
   4. Schakel de weergave over naar de computer en klik vervolgens op Stoppen met scherpstellen.
9. Regio selectie
   1. Klik op de knop Regio in de menubalk.
   2. Selecteer het gewenste verlichtingstype (340/380/FITC/TRITC). FITC- en TRITC-filters worden geselecteerd voor respectievelijk GFP en mCherry/DsRed/mRuby voor cellen die de beoogde plasmiden tot overexpressie brengen; selecteer anders Fura-2.
      NOTITIE: Vermijd het selecteren van cellen die in slechte staat of dood zijn, zoals cellen die duidelijk afgerond zijn of overbelichte fluorescerende eiwitten hebben.
   3. Klik op Afbeeldingen verkrijgen en vervolgens op OK.
   4. Er verschijnt een nieuw venster; Selecteer cellen door op het ovale gereedschap te klikken en vervolgens op de cel te klikken.
   5. Selecteer de gewenste cellen onder de fluorescentie die door het doeleiwit wordt gedragen (FITC of TRITC). Selecteer de controlecellen die het doeleiwit niet tot expressie brengen onder de 380 nm-conditie.
   6. Maak een regio ongedaan door met de rechtermuisknop op de cirkel te klikken en vervolgens Regio verwijderen te selecteren.
   7. Selecteer een achtergrondvoorbeeld als de laatste regio en noteer het ID-nummer.
   8. Klik op Opslaan en vervolgens op Gereed.
10. Achtergrond aftrekken
    1. Klik op de menuknop Referenties.
    2. Geef het nummer van de achtergrondregio aan.
       NOTITIE: Als de achtergrond de laatst geselecteerde regio was, wordt bij het invoeren van een zeer hoog nummer automatisch overgeschakeld naar de laatst gekozen regio.
    3. Vink het vakje Verwijzingen aftrekken aan en klik vervolgens op OK.
11. Loggegevens
    1. Klik op de knop Gegevens loggen in het configuratiescherm van het experiment.
       NOTITIE: Afbeeldingen worden alleen opgeslagen als er een wens is om het experiment later opnieuw af te spelen; Normaal gesproken is het voldoende om het gegevensvakje aan te vinken.
    2. Zorg ervoor dat er een prompt verschijnt waarin wordt gevraagd naar het gewenste gegevensbestandstype; Selecteren. XLSX-formaat wordt aanbevolen.
    3. Er wordt een werkblad van het type ".xlsx" geopend. Door het werkblad te minimaliseren, voorkomt u dat het schermruimte in beslag neemt.
12. Data-acquisitie
    1. Stel in het gedeelte Time Lapse van het configuratiescherm het gegevensverzamelingsinterval in op 1 s.
       NOTITIE: Dit kan worden aangepast aan de werkelijke behoeften.
    2. Klik op Zero Clock en Acquire op het configuratiescherm van het experiment om het experiment te starten. Basislijnen zijn zichtbaar in een grafiek die elk van de geselecteerde celgebieden aangeeft.
    3. Voer een reeks behandelingen uit op de cellen volgens de experimentele vereisten.
    4. Om de temperatuurrespons van de cellen te observeren, verwarmt u de buffer in het perfusiesysteem met behulp van een temperatuurregelaar tot een geschikte temperatuur.
    5. Om de effecten van geneesmiddelen op cellen te observeren, perfuseert of voegt u handmatig een geneesmiddelbevattende buffer toe en registreert u de celveranderingen.
    6. Nadat de gegevensverzameling is voltooid, klikt u op Pauze.
       NOTITIE: De gegevensverzameling kan worden gepauzeerd en de klok kan op elk moment tijdens het experiment worden gereset.
    7. Sla de gegevens op en analyseer ze.
13. Klik op Bestand en experiment sluiten om het experiment te beëindigen en selecteer Nee in het dialoogvenster om het protocol op te slaan.
14. Open een nieuw experiment door in het menu op Nieuw te klikken en herhaal het proces.
15. Afsluiten
    1. Sluit de software en breng de gegevens over van de computer.
    2. Draai de opstartprocedure in omgekeerde volgorde.
    3. Registreer de uren op het aanmeldingsformulier en ruim eventuele rommel op.
16. Gegevensanalyse
    1. Geef de intracellulaire Ca²⁺ -concentratie weer met de Fura-2 340/380-verhouding of converteer naar de overeenkomstige Ca²⁺ -concentratie.

Resultaten

Detectie van temperatuurrespons
Primaire keratinocyt
Primaire keratinocyten werden geïsoleerd uit pasgeboren muizen en bereid volgens vastgestelde protocollen¹⁰. Deze cellen werden gezaaid in platen met 24 putjes met glazen dia's. Na het laden van de Fura-2-sonde werd de focus onder de microscoop aangepast op een golflengte van 380 nm om een duidelijke visualisatie van de celmorfologie te krijgen, zoals geïllustreerd in

Discussie

De toepassing van eencellige Ca²⁺ beeldvormingssystemen is uitgebreid en maakt de studie mogelijk van Ca²⁺ signalen in verschillende celtypen, waaronder keratinocyten, stamcellen¹⁶, levercellen, hartcellen¹⁷, podocyten¹⁸, immuuncellen en cellijnen met overexpressie van doeleiwitten^10,19. Deze techniek meet veranderingen en absolute waard...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Camera	Nikon
Capsaicine	Sigma	211275
CL-100 temperatuurregelaar	Warner Instruments
Cyclopiazonic Zuur (CPA)	Sigma	C1530
DG-4 licht	Sutter Instrument Company
Dimethyl sulfaat (DMSO)	Amresco	231
DPBS	Thermofisher	14190144
Fluorescentiebeeldvormingssoftware (MetaFluor, Betaalde software)	Molecular Devices
Fluorescentiemicroscoop	Nikon
Fura-2/AM	Invitrogen	F1201
HBSS-buffer	Gibco	14175103
HEPES	Sigma	H3375
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
Pluronic F-127	Beyotime	ST501
poly-D-lysine	Beyotime	ST508
SC-20 vloeistofcirculatie verwarming/koelapparaat	Harvard Apparatus
Witte lichtbron	Nikon