Hier presenteren we een protocol om de zinkoxide (ZnO) nanodeeltjes te synthetiseren met behulp van het polyisopreenrijke waterige extract verkregen uit de boomschors van Eucommia ulmoides . Het wondgenezingspotentieel van de gesynthetiseerde ZnO-nanodeeltjes op menselijke navelstrengader-endotheelcellen (HUVEC's) werd geëvalueerd met behulp van een krastest, een eenvoudige, kosteneffectieve en efficiënte methode.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Formulering van nanomaterialen op basis van zink met behulp van het Eucommia ulmoides-schorsextract en hun wondgenezingspotentieel
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het waterige extract van de schors van Eucommia ulmoides dient als een rijke bron van bioactieve stoffen met tal van gezondheidsvoordelen. Het protocol hier heeft tot doel de bereiding van zinkoxide (ZnO) nanodeeltjes te onderzoeken met behulp van het Eucommia ulmoides-schorsgemedieerde polyisopreenrijke waterige extract. Ondertussen wordt het voorgestelde protocol geassocieerd met de voorbereiding van wondgenezingsmateriaal door het proces te vergemakkelijken. Bovendien werd het wondgenezingspotentieel van de gesynthetiseerde nanodeeltjes (Eu-ZnO-NP's) geëvalueerd met behulp van een eenvoudige krastest op een monolaag van een endotheelcel van de menselijke navelstrengader (HUVEC). Na 24 uur behandeling met Eu-ZnO-NP's werden de celproliferatie en migratie van HUVEC-cellen beoordeeld. Aan het einde van de studie werden celproliferatie en -migratie waargenomen in gekraste monolaag die werd behandeld met verschillende concentraties Eu-ZnO-NP's, terwijl slechte celmigratie en proliferatiesnelheden werden waargenomen in controlecellen. Van de gekozen concentraties vertoonden 20 μg/ml Eu-ZnO-nanomaterialen een betere celmigratie en een verbeterd wondgenezingspotentieel.
Inleiding
Van geneeskrachtige planten en plantaardige verbindingen is aangetoond dat ze tal van gezondheidsvoordelen vertonen1. De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) meldde dat 80% van de wereldbevolking afhankelijk is van traditionele geneeskrachtige planten voor de eerstelijnsgezondheidszorg. China wordt algemeen erkend en populair vanwege zijn traditionele Chinese geneeskunde (TCM). Van Chinese geneeskrachtige kruiden is gemeld dat ze verschillende ziekten behandelen en worden gebruikt vanwege hun biologische potentieel. Geneeskrachtige planten dienen als reservoirs voor bioactieve stoffen en hebben meerdere therapeutische rollen. Geneeskrachtige planten zijn ook gebruikt om de wonden te behandelen. Er zijn verschillende soorten benaderingen die worden toegepast om chronische wonden te behandelen2. Uit een recent onderzoek is gebleken dat geneeskrachtige planten betrokken zijn bij het wondgenezingsproces door gunstige voorwaarden te bieden voor genezing, vrij van infecties en het versnellen van weefselregeneratie3. Ondertussen kunnen de antibacteriële en schimmelwerende eigenschappen van bioactieve stoffen die aanwezig zijn in geneeskrachtige planten helpen om wonden te genezen en de efficiëntie van wondgenezing te versnellen4.
Nanomaterialen op basis van metaal krijgen steeds meer aandacht vanwege hun biocompatibele en biologisch afbreekbare eigenschappen. Eucommia ulmoides, gewoonlijk de Chinese rubberboom genoemd, is een inheemse soort uit China. De bladeren en schors van de boom worden gebruikt in medicinale praktijken. Het belangrijkste is dat de plantensoort werd gekweekt in de centrale en westelijke provincies van China5. Peng et al.6meldden dat bladeren, schors en meeldraadbloemen eetbaar waren met therapeutisch potentieel. Bovendien dient E. ulmoides als de beste bron van lignanen, fenylpropanoïden, iridoïden, flavonoïden, aminozuren en sporenelementen. Bovendien is de schors gebruikt voor verschillende biomedische toepassingen, zoals het beheersen van de bloeddruk, het verlagen van vet en het bevorderen van antiosteroporose en hypoglykemische activiteit7. Het is dus ongetwijfeld bewezen dat het schorsextract van E. ulmoides een lange geschiedenis heeft in de traditionele Chinese geneeskunde. Eerdere rapporten suggereerden dat natuurlijk polymeer polyisopreen rijk is aan de schors van Eucommia ulmoides8. Op basis van de bovenstaande informatie heeft het huidige werk tot doel nanomaterialen te fabriceren met behulp van Eucommia ulmoides-schorsextracten . De combinatie van zink met schorsextract is een aantrekkelijke keuze voor het bereiden van nanomaterialen. Over het algemeen was het uiteindelijke doel van dit onderzoek het fabriceren van een nieuw hybride nanomateriaal voor wondgenezingstoepassingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Voordat het extract werd bereid, werd het verkregen schorsmateriaal twee keer gewassen met gedeïoniseerd water en op een schaduwrijke plaats gedroogd. De in de schaduw gedroogde schors werd opgeslagen in een luchtdichte verpakking.
1. Preparaat van Eucommia ulmoides-schorsextract
- Hak de schors van de Eucommia ulmoides-boom met een schaar in kleine stukjes.
- Was de gehakte schorsmaterialen twee keer met dubbel gedestilleerd water.
- Droog de stukken schors gedurende 24 uur onder 37 °C in de schaduw.
- Pas de duur van het droogproces aan op basis van de hoeveelheid schors die voor het onderzoek is gebruikt. Zorg ervoor dat de schors volledig droog is voordat u de schors in kleine stukjes snijdt. Vermijd direct zonlicht.
- Breng 20 g schaduwgedroogde schors over in een conische kolf met 220 ml steriel dubbel gedestilleerd water en verwarm gedurende 20 minuten bij 130 °C.
- De kleur van de reactieoplossing verandert in lichtgeel. De kleurveranderingen van de oplossing treden op na 10 minuten. Laat de oplossing nog 10 minuten opwarmen. Pas het volume dubbel gedestilleerd water aan op basis van de monsterhoeveelheid.
- Bewaar het ruwe extract dat polyisopreen bevat bij 4 °C voor verder gebruik. De vorming van een draadachtige structuur duidt op de aanwezigheid van polyisopreen in de extracten.
2. Biosynthese van E. ulmoides schors-gemedieerde ZnO nanodeeltjes
- Voeg 1 M zinknitraatdihydraat Zn (NO3)2 toe aan 50 ml gedeïoniseerd water in een erlenmeyer van 500 ml. Roer continu met behulp van magnetisch roeren (60 RPM). De Zn (NO3)2 heeft 30 minuten nodig om volledig op te lossen.
- Voeg druppelsgewijs 15 ml extract van E. ulmoides-schors toe aan 20 ml 1 M zinknitraatdihydraat (Zn (NO3)2) oplossing.
- Plaats het afgedekte reactiemengsel op een magnetische roerder, zet de roerder aan en draai gedurende 3 uur op (60 RPM).
- Voeg 1 N natriumhydroxide NaOH (3 ml) oplossing druppelsgewijs toe aan het reactiemengsel om de pH op 9 te brengen. Voeg NaOH toe tot het oplossingsmengsel melkachtig wit wordt en de pH niet hoger is dan 9. De oplossing krijgt een melkwitte kleur wanneer ZnO-nanodeeltjes worden gevormd.
- De bereiding van 1 M zinknitraatdihydraat Zn (NO3)2 oplossingsvolume kan variëren afhankelijk van de experimentele behoeften. Zorg ervoor dat je de vers bereide schorsextracten gebruikt. Als de pH hoger is dan 10, resulteert dit in aggregatie van nanodeeltjes.
- Breng de gesynthetiseerde Eu-ZnO-NP's over in een centrifugebuis van 50 ml en centrifugeer deze gedurende 5 minuten bij 100 x g bij 4 °C.
OPMERKING: De onzuiverheden kunnen worden vermeden door onmiddellijk te wassen. - Verzamel de gewassen Eu-ZnO-NP's in een glasplaat en droog ze gedurende 1 uur bij 45-50 °C in een heteluchtoven.
OPMERKING: Als de Eu-ZnO-NP's langer dan 30 minuten worden bewaard, kan dit de fysisch-chemische aard van de nanodeeltjes beïnvloeden
3. Maatbevestiging met TEM
- Bereid 1 mg/ml nanodeeltjes in DDH2O en laad 5 μL Eu-ZnO-NP-monster in het koperrooster en wacht tot het volledig is opgedroogd. Vortex het monster voordat het op het koperen rooster wordt geladen.
- Laad het koperen raster met Eu-ZnO-NP's op de TEM-monsterhouder en verkrijg afbeeldingen met een vergroting van 50x en 100x.
OPMERKING: Roosters moeten tijdens deze stap met een pincet worden opgepakt.
4. Beoordeling van de cytotoxiciteit
- Zaai 1 × 104 HUVEC's in elk putje van een plaat met 96 putjes en plaats deze in een incubator met 5% CO2 37 °C.
- Voeg 10 μl van verschillende concentraties 0, 10, 20, 30, 40 en 50 μg/ml Eu-ZnO-NP's toe aan de 90% confluente cellen en incubeer deze gedurende 24 uur.
- Verwijder na de incubatie het oude medium zonder de cellen te verstoren, voeg 10 μL CCK-8-oplossing toe aan elk putje met 90 μL vers DMEM-medium en incubeer in een incubator met 5% CO2, 37 °C.
- Meet de absorptie van cellen die zijn behandeld met CCK8-oplossing bij 450 nm met behulp van een spectrofotometer.
OPMERKING: De extinctie werd onmiddellijk binnen 15 minuten gemeten om veranderingen in de absorptie te voorkomen.
5. Voorbereiding van HUVEC-cellen voor krastest
- Zaai een geschikte (1 × 105) hoeveelheid HUVEC's in 12 putjes met Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penstreptokokken en incubeer deze in een incubator met 5% CO2 37 °C.
- Voordat u de krastest uitvoert, controleert u de confluentie met behulp van de omgekeerde microscoop.
OPMERKING: Voor het uitvoeren van de krastest worden 6 putplaten of 12 platen gebruikt op basis van de vereisten, en de celdichtheid zal variëren voor verschillende kweekplaten. Het gebruik van 70%-80% confluente cellen is ideaal en wordt aanbevolen voor krastesten. Het volume DMEM-medium kan variëren op basis van de kweekplaten die in het onderzoek zijn gebruikt. Platen met 6 putjes hebben bijvoorbeeld 1-1,5 ml kweekmedium nodig en platen met 12 putjes hebben 0,5-1,0 ml groeimedium nodig.
- Voordat u de krastest uitvoert, controleert u de confluentie met behulp van de omgekeerde microscoop.
- Maak voorzichtig een kras met behulp van een steriele pipetpunt van 200 μl in de representatieve wond met een wondbreedte van 200 μm.
- Zorg ervoor dat de punt die wordt gebruikt om krassen op de celmonolaag te maken, contact maakt met het oppervlak van de cellen.
OPMERKING: Elke keer dat er een kras wordt gemaakt, gebruikt u de steriele punt. - Verwijder het volledige medium en was de HUVEC-monolaag met 1 ml 1x PBS om de losgeraakte cellen te verwijderen.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de losgemaakte monolaagcellen volledig uit de respectievelijke putjes zijn verwijderd. Controleer of er geen schade is opgetreden in het door de wond ontstane gebied. - Om het wondgenezingspotentieel van gesynthetiseerde Eu-ZnO-NP's te evalueren, voegt u concentraties van 0 (controle), 10 en 20 μg/ml Eu-ZnO-nanodeeltjes in combinatie met een compleet medium met 10% FBS toe aan de putjes. Houd de experimentele platen op 37 °C in een 5% CO2 -incubator.
OPMERKING: Verstoor de celmonolaag niet tijdens het toevoegen van het frisse, complete medium. Zorg ervoor dat de monolaagcellen tijdens de incubatie ongestoord blijven. - Maak een microfoto op 0 uur en 24 uur met behulp van een omgekeerde microscoop. Gebruik de annotatietool om de wondsluiting in verschillende tijdsintervallen te meten.
- Bereken het percentage wondsluiting aan de hand van de volgende formule: Wondsluiting (%) = [(celmigratie (in μm) na 0 uur - celmigratie (in μm) na 24 uur)/ celmigratie (in μm) na 0 uur] x 100.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het huidige onderzoek heeft tot doel nanodeeltjes te synthetiseren met behulp van de schors van de Eucommia ulmoides-boom . Het schorsmateriaal werd volledig gedroogd in een schaduwrijke omgeving (Figuur 1). De schorsmaterialen werden gebruikt om het hete water waterige ruwe extract te bereiden door de monsters gedurende 20 minuten op 130 °C te verwarmen. Een kleine verandering in de temperatuur en duur kan de fytoverbindingen verstoren en ze ongesc...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De E. ulmoides schors, zaad en bladeren worden verondersteld tal van gezondheidsvoordelen te vertonen. Onze resultaten hebben aangetoond dat de synthese van EU-ZnO-nanodeeltjes is bereikt met behulp van een eenvoudige en kosteneffectieve aanpak. Het waterige extract werd gebruikt om de nanodeeltjes te synthetiseren. Het verwarmen van het schorsmateriaal bij hoge temperaturen kan degradatie van sommige fytobestanddelen veroorzaken en de extractie-efficiëntie verlagen. De fytobest...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen
Dankbetuigingen
De auteurs willen het Department of Cell Biology, Central South University, Changsha, China, oprecht bedanken voor het ter beschikking stellen van de instrumentatiefaciliteiten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 12 well plate | NEST | 703011 | Gebruikt voor celkweek en test |
| Centrifuge | SCILOGEX | SC1406 | Gebruikt om de nanodeeltjes te scheiden van het colloïdale mengsel |
| Centrifugebuis – 15 mL | BIOFIL | CFT-312150 | Om de gesynthetiseerde oplossing te centrifugeren |
| Centrifugebuis – 5 mL | Biosharp | BS-50-CM-S | Om de nanodeeltjes op te slaan |
| CO2 incubator | Thermo scientific | 3010 | Om de HUVEC-cellen te kweken |
| Gedemineraliseerd water | Millipore | Niet van toepassing | Voor de bereiding van het extract |
| DMEM medium | Cytiva | SH30243.01 | Gebruikt voor celkweekwerk |
| Trechter | Thermo scientific | 42600060 | Om het filterpapier vast te houden tijdens het filteren |
| Glazen bekers | Borosilicaat | 1102-50 | Gebruikt om de waterige extract te bereiden |
| Heteluchtoven | Genetimes | Niet van toepassing | Gebruikt om de nanodeeltjes te drogen en in poedervorm te verzamelen |
| Magneetroerder | KYLIN-BELL | GL-5250-A | Gebruikt voor nanodeeltjessynthese |
| Microscoop | Nikon Eclipse | Ts2 | Gebruikt om microfotografieën te maken |
| Petrischaal | NEST | 753001 | Gebruikt om de nanodeeltjes te verzamelen |
| Pipet 1 mL | Lab Science | YEA17AD0055580 | Om het specifieke volume van oplossing/extract te nemen/toe te voegen |
| Pipet tips 1 mL | SAINING | 3014200-T | Om het specifieke volume van oplossing/extract te nemen/toe te voegen |
| PTFE magnetische roerrepen | LAN RAN | Niet van toepassing | Gebruikt voor het nanomateriaalsyntheseproces |
| Natriumhydroxide | Sigma Alrich | 71690 | Gebruikt om de pH tijdens de synthese aan te passen |
| Roestvrij schaar | Deli | 6034 | Gebruikt om de schorsmaterialen te hakken |
| T25 weefselkweekkolf | NEST | 707001 | Gebruikt om de cellen te onderhouden |
| Weegschaal | Radwag | AS220R2 | Gebruikt om de chemicaliën te wegen |
| Whatman filterpapier nr.1 | Newstar | GB/T1914-2017 | Gebruikt om het extract voor synthese te filteren |
| Zinknitraat | Sigma Alrich | 13778-30-8 | Gebruikt als voorloper voor de synthese van de nanodeeltjes |
Referenties
- Williamson, E. M., Liu, X., Izzo, A. A. Trends in use, pharmacology, and clinical applications of emerging herbal nutraceuticals. Br. J. Pharmacol. 177 (6), 1227-1240 (2020).
- Cedillo-Cortezano, M., Martinez-Cuevas, L. R., López, J. A. M., Barrera López, I. L., Escutia-Perez, S., Petricevich, V. L. Use of medicinal plants in the process of wound healing: a literature review. Pharmaceuticals. 17 (3), 303(2024).
- Budovsky, A., Yarmolinsky, L., Ben-Shabat, S. Effect of medicinal plants on wound healing. Wound Repair Regen. 23 (2), 171-183 (2015).
- Yazarlu, O., et al. Perspective on the application of medicinal plants and natural products in wound healing: A mechanistic review. Pharmacol Res. 174, 105841(2021).
- Zhu, M. Q., Sun, R. C. Eucommia ulmoides Oliver: a potential feedstock for bioactive products. J Agric Food Chem. 66 (22), 5433-5438 (2018).
- Peng, M., Zhou, Y., Liu, B. Biological properties and potential application of extracts and compounds from different medicinal parts (bark, leaf, staminate flower, and seed) of Eucommia ulmoides: A review. Heliyon. 10 (6), e27870(2024).
- Xing, Y. Y., et al. Inhibition of rheumatoid arthritis using bark, leaf, and male flower extracts of Eucommia ulmoides. Evid Based Complement Alternat Med. 2020, 3260278(2020).
- Guo, M., et al. Quantitative detection of natural rubber content in Eucommia ulmoides by portable pyrolysis-membrane inlet mass spectrometry. Molecules. 28 (8), 3330(2023).
- Yusof, H. M., Rahman, N. A., Mohamad, R., Zaidan, U. H., Samsudin, A. A. Biosynthesis of zinc oxide nanoparticles by cell-biomass and supernatant of Lactobacillus plantarum TA4 and its antibacterial and biocompatibility properties. Sci Rep. 10, 19996(2020).
- Gosens, I., et al. Impact of agglomeration state of nano-and submicron sized gold particles on pulmonary inflammation. Part Fibre Toxicol. 7 (1), 37(2010).
- Zare, Y. Study of nanoparticles aggregation/agglomeration in polymer particulate nanocomposites by mechanical properties. Compos A Appl Sci Manuf. 84, 158-164 (2016).
- Kim, M. G., et al. Effects of calcination temperature on the phase composition, photocatalytic degradation, and virucidal activities of TiO2 nanoparticles. ACS Omega. 6 (16), 10668-10678 (2021).
- Aydin Acar, C., Gencer, M. A., Pehlivanoglu, S., Yesilot, S., Donmez, S. Green and eco-friendly biosynthesis of zinc oxide nanoparticles using Calendula officinalis flower extract: Wound healing potential and antioxidant activity. Int Wound J. 21 (1), e14413(2024).
- Sana, S. S., et al. Crotalaria verrucosa leaf extract mediated synthesis of zinc oxide nanoparticles: assessment of antimicrobial and anticancer activity. Molecules. 25 (21), 4896(2020).
- Zhang, H., Liang, Z., Zhang, J., Wang, W. P., Zhang, H., Lu, Q. Zinc oxide nanoparticle synthesized from Euphorbia fischeriana root inhibits the cancer cell growth through modulation of apoptotic signaling pathways in lung cancer cells. Arab J Chem. 13 (7), 6174-6183 (2020).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
