De traditionele Chinese geneeskunde (TCM) vertegenwoordigt een rijke schat aan natuurlijke behandelingsopties en speelt een belangrijke rol bij het aanpakken van uiteenlopende gezondheidsbehoeften wereldwijd. Deze studie presenteert een uitgebreid experimenteel onderzoek naar de extractie, scheiding en fysisch-chemische eigenschappen van rutine, het belangrijkste actieve bestanddeel van Flos sophorae immaturus.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Extractie en karakterisering van de flavonoïde rutine uit de traditionele Chinese geneeskunde Flos sophorae immaturus
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) heeft lange tijd gediend als een rijke opslagplaats van natuurlijke therapeutische oplossingen en speelt een cruciale rol bij het aanpakken van uiteenlopende zorgbehoeften wereldwijd. Van de verschillende kruiden die in TCM worden gebruikt, staat Sophora flavescens bekend om zijn brede scala aan geneeskrachtige eigenschappen. De toepassing ervan gaat eeuwen terug en wordt nog steeds zeer gewaardeerd in de moderne geneeskunde, met name vanwege de therapeutische voordelen bij de behandeling van hart- en vaatziekten. Rutine, een bioactieve flavonoïde verbinding, is wijd verspreid over het plantenrijk, met de hoogste concentratie gevonden in Flos sophorae immaturus. Van rutine is gemeld dat het abnormale capillaire permeabiliteit en kwetsbaarheid vermindert en werkt als een beschermend middel voor cardiovasculaire en cerebrovasculaire vaten. Deze studie presenteert een gedetailleerd experimenteel protocol voor de extractie, scheiding en karakterisering van de fysisch-chemische eigenschappen van rutine afgeleid van Flos sophorae immaturus. Daarnaast wordt het protocol voor de extractie van flavonoïden uit TCM met behulp van de alkali-extractie- en zuurprecipitatiemethode geïntroduceerd en beschreven.
Inleiding
Flos sophorae immaturus (FSI), de gedroogde bloemknop van Sophora japonica L., is al eeuwenlang een hoeksteen van de traditionele Chinese geneeskunde (TCM). De belangrijkste actieve componenten zijn rutine, isoquercitrine, Sophorae Flos en andere flavonoïden en saponinen. Deze bestanddelen zorgen samen voor een verscheidenheid aan farmacologische effecten, zoals het opruimen van warmte en ontgiften, het afkoelen van bloed en hemostase en het verlagen van de bloeddruk. In de klinische praktijk wordt FSI vooral gewaardeerd vanwege zijn vermogen om de capillaire permeabiliteitte beschermen 1, de functie van het cardiovasculaire systeemte behouden 2, bloed te koelen, bloedingen te stoppen en levervuur te reguleren3. De therapeutische eigenschappen worden toegeschreven aan een hoge concentratie rutine (quercetine-3-rutinoside), een bioactieve flavonoïde die tot 20%-30% van het drooggewicht uitmaakt4.
Rutine is een flavonoïde die veel voorkomt in planten. De chemische naam is Que-3-O-rutine (C27H30O16) (Figuur 1). Bij kamertemperatuur verschijnt rutine als een lichtgeel tot geelgroen kristallijn poeder. Het smeltpunt varieert met de kristalvorm en zuiverheid en varieert meestal tussen 125 °C en 195 °C. Rutine vertoont uitgesproken polaire kenmerken: het is enigszins oplosbaar in koud water, zeer goed oplosbaar in polaire organische oplosmiddelen zoals ethanol en methanol, en bijna onoplosbaar in niet-polaire oplosmiddelen zoals ether en chloroform. Bovendien is de oplosbaarheid pH-gevoelig en neemt het aanzienlijk toe onder alkalische omstandigheden als gevolg van de dissociatie van fenolhydroxylgroepen die natrium- of kaliumzouten vormen. Deze fysische eigenschappen zijn nauw verbonden met de polyhydroxyl- en glycosidegroepen in de moleculaire structuur5 en hebben een directe invloed op het extractieproces en de toepassingen in de geneeskunde, de voedingsindustrie en andere industrieën6. Rutine, hoewel alomtegenwoordig in planten, is het meest overvloedig in FSI en vertoont meerdere farmacologische activiteiten, waaronder capillaire stabilisatie7, ontstekingsremmend, antioxidant8, antimicrobieel9 en metabole regulerende effecten10.
Ondanks het klinische potentieel11 vormen de slechte oplosbaarheid en stabiliteit van rutine een uitdaging voor extractie en formulering5. Om deze beperkingen aan te pakken, is de alkali-extractiezuurprecipitatiemethode (AEAP) naar voren gekomen als een effectief alternatief, waarbij gebruik wordt gemaakt van het pH-afhankelijke gedrag van de fenolhydroxylgroepen.
Op basis van de fysische eigenschappen van rutine is de AEAP-methode een gestandaardiseerde techniek geworden voor het isoleren van rutine uit FSI, waarbij gebruik wordt gemaakt van de oplosbaarheid ervan in alkalische oplossingen en de daaropvolgende kristallisatie onder zure omstandigheden12. AEAP maakt gebruik van de pH-schakelbare ionisatie van fenolische hydroxylgroepen om de opbrengst te verbeteren en zeer zuivere rutine-extractie uit FSI te bereiken. Onder alkalische omstandigheden (pH >10) deprotoneren fenolische -OH-groepen om hydrofiele -O-ionen te vormen, waardoor volledige oplosbaarheid uit plantenweefsels mogelijk is en oxidatieve afbraak tot een minimum wordt beperkt. Verzuring tot pH 2-3 keert deze ionisatie om, waardoor de doelfenolen neerslaan met minimale co-precipitatie van polaire onzuiverheden. Als een polyfenol met pH-afhankelijke oplosbaarheid lost rutine gemakkelijk op in alkalische oplossingen (bijv. natriumhydroxide), maar slaat neer onder zure omstandigheden als gevolg van hydroxylgroepprotonering. AEAP biedt een kosteneffectief, schaalbaar en milieuvriendelijk alternatief, in overeenstemming met de principes van groene chemie door giftige oplosmiddelen te vermijden13. Het weerspiegelt een bredere trend in de chemie van natuurlijke producten die de voorkeur geeft aan pH-gestuurde scheidingstechnieken14. Vergelijkbare methoden worden gebruikt om curcumine (uit kurkuma) en berberine (uit Coptis chinensis) te isoleren, waarbij oplosbaarheidsveranderingen bij specifieke pH-waarden worden benut voor selectieve extractie. De AEAP-methode is ideaal voor de productie van rutine met een hoog rendement uit flavonoïderijke bronnen zoals FSI, waarvoor alleen basislaboratoriumapparatuur nodig is (bijv. pH-meters, centrifuges). Voor plantenmatrices met een laag rutinegehalte of complexe storende verbindingen kan in de toekomst een enzymatische hydrolysebehandeling worden overwogen om de extractie-efficiëntie te verbeteren.
Kortom, AEAP vertegenwoordigt een handige benadering voor rutine-extractie, waarbij werkzaamheid, veiligheid en schaalbaarheid in evenwicht worden gebracht. Zijn rol in de modernisering van TCM benadrukt zijn potentieel om traditionele praktijken te overbruggen met hedendaagse farmaceutische normen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Rutine is een flavonoïde die meerdere fenolische hydroxylgroepen bevat en oplosbaar is in hete alkalische oplossingen, gevolgd door verzuring en neerslag. Het kan worden geëxtraheerd met behulp van het alkali-extractiezuurprecipitatieproces. De reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Experimentele voorbereiding
- Verkrijg de volgende materialen: Flos sophorae immaturus (20 g), borax (0,8 g), verschillende bekers, kalkpoeder (1,5 g), geconcentreerd zoutzuur, thermometer en pH-teststrips. Zie Figuur 2 voor een grotere versie van deze afbeelding.
2. Winning van rutine
OPMERKING: Gebruik een borax-waterverhouding van 0,8 g borax op 200 ml water. Gebruik een limoenmelkverhouding van 1,5 g limoenpoeder op 10 ml water. Pas de pH snel en nauwkeurig aan. Vul verloren water aan als dat nodig is.
- Alkali-extractie
OPMERKING: Filtreer met 6 cm rond filtreerpapier.- Voeg 250 ml water en 0,8 g borax toe aan een bekerglas van 500 ml. Verwarm tot het kookt en voeg dan 20 g Flos sophorae immaturus toe. Blijf 2-3 minuten koken.
- Pas na het koken de pH aan op 8-9 met limoenmelk onder roeren. Blijf 20 minuten verwarmen. Filtreer door gaas terwijl het heet is om een geelbruin filtraat te verkrijgen.
- Zure neerslag extractie
- Breng het extract met geconcentreerd zoutzuur op pH 2-3 en laat het bezinken. Een verandering van een heldere geelbruine oplossing naar een troebele, samen met de geleidelijke vorming van oranjegeel vlokkig neerslag op de bodem van de container, duidt op een effectieve scheiding van rutine.
- Na 6 uur te hebben gestaan, onderwerpt u het neerslag aan atmosferische drukzuigfiltratie. Verzamel en droog om ruwe rutine te verkrijgen.
OPMERKING: Snijd de filterfilm volgens de gebruikte Brinell-trechtermaat (diameter 150 mm). - Was het neerslag met water tot het neutraal is tijdens de afzuigfiltratie onder atmosferische druk.
3. Raffinage van rutine
- Na grove weging herkristalliseert rutine met heet water in een oplosbaarheidsverhouding van 1:200. Kook de waterige oplossing 30 minuten en filtreer terwijl deze heet is. Zorg ervoor dat het uiteindelijke volume van de rutineoplossing 210 ml is.
- Filter het residu eruit. Laat het filtraat ongestoord staan, filtreer dan opnieuw en droog onder vacuüm in een oven bij 60-70 °C om geraffineerde rutine te verkrijgen (figuur 3).
OPMERKING: Snijd de filterfilm volgens de gebruikte Brinell-trechtermaat (diameter 150 mm).
4. Fysisch-chemische identificatie van rutine
- Hydrochloride-magnesiumzoutreactie - identificatie van flavonoïde moederkernen
- Los 1-2 ml van het monster op in methanol en voeg 50 mg magnesiumpoeder toe.
- Voeg een paar druppels geconcentreerd zoutzuur toe. Schud voorzichtig. De oplossing moet rood worden (Figuur 4).
- Molisch-reactie - identificatie van suikerverbindingen
- Voeg een 10% ethanoloplossing van α-naftol toe en schud. Kantel de reageerbuis en voeg voorzichtig geconcentreerd zwavelzuur druppelsgewijs langs de binnenwand toe.
- Let op de vorming van een bruine ring op het grensvlak (Figuur 5).
- Vergroening van zirkoniumoxide-citroenzuurreactie
- Voeg 1-2 ml 10% α-naftoloplossing toe aan de ethanoloplossing van het monster. Goed schudden. Voeg langzaam 10 druppels geconcentreerde H2SO4 toe langs de wand van de tube zonder te schudden.
- Voeg 2% citroenzuur methanoloplossing toe. De kleur van de oplossing moet lichter worden (Figuur 6).
- Discriminatie van dunne lagen
- Gebruik zowel de verfijnde rutine als de rutine standaard.
- Gebruik chloroform: methanol: mierenzuur (15: 5: 1) als ontwikkelingsmiddel en 1% ethanoloplossing van AlCl3 als chromogeen middel. Let op fluorescentie onder een UV-lamp bij 365 nm.
5. TLC-onderzoek van rutine
OPMERKING: Een dunne-laagchromatografie (TLC) -methode werd gebruikt om de zuiverheid van rutine te evalueren. Een silicagelplaat werd gebruikt als stationaire fase.
- Spot het geraffineerde rutinemonster en de rutinestandaard (1 mg/ml in methanol) op de plaat. Ontwikkel de plaat in een mobiele fase bestaande uit ethylacetaat:mierenzuur:water (8:1:1, v/v/v).
- Visualiseer de plaat na droging onder UV-licht op 254 nm.
- Bereken de retentiefactor (Rf) van de monsterspot en vergelijk deze met de standaard.
OPMERKING: Een enkele vlek met een identieke Rf-waarde (ongeveer 0,35-0,50 onder deze omstandigheden) duidt op een hoge zuiverheid, terwijl extra vlekken de aanwezigheid van onzuiverheden suggereren.
6. Bepaling van de zuiverheid van rutine door HPLC
OPMERKING: De zuiverheid van rutine werd kwantitatief geanalyseerd door middel van high-performance vloeistofchromatografie (HPLC). De analysecondities waren als volgt: Chromatografische kolom- (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobiele fase-acetonitril (A) en 0,2% azijnzuur waterige oplossing (B). Lineair gradiënt-elutieprogramma: 0-15 min, 20%-30% A; 15-30 min, 30%-60% A. Debiet-1 ml/min. Injectievolume-10 μL. Detectie golflengte-355 nm. Kolom temperatuur-40 °C.
- Weeg nauwkeurig 0,1 g rutinemonsterpoeder af en breng dit over in een centrifugebuis van 10 ml. Voeg 5,0 ml 60% ethanoloplossing toe en schud grondig.
- Stel het waterbad of de kolomoven met constante temperatuur in op 30 °C en ultrasoonapparaat
- Centrifugeer het monster bij 55.900 g × gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik het bovenstaande als testoplossing voor HPLC-analyse.
7. Bepaling van rutine door LC-MS
OPMERKING: De geïsoleerde verbindingen werden geïdentificeerd door middel van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS). LC-omstandigheden kwamen overeen met de HPLC-methode. Massaspectrometrie werd uitgevoerd met behulp van elektrospray-ionisatie (ESI) in negatieve ionenmodus met een capillaire spanning van 3,5 kV. Oplosingstemperatuur-350 °C; Massascanbereik-M/Z 100-1000.
- Weeg 10 mg gezuiverd rutinemonster af en breng dit over in een microcentrifugebuis van 2 ml. Voeg met een pipet 0,6 ml gedeutereerde DMSO toe totdat het monster volledig is opgelost. Bereid rutine standaardoplossingen volgens dezelfde procedure.
- Analyseer de behandelde monsters en standaarden met behulp van protonnucleaire magnetische resonantie (1H NMR) spectroscopie.
- Verwerk de spectrale gegevens met behulp van compatibele software15.
- Vergelijk de spectrale gegevens met literatuur of databasereferenties zoals NIST of PubChem voor verificatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In het fysisch-chemische identificatie-experiment van rutine werd de oplossing rood na toevoeging van magnesiumpoeder en een kleine hoeveelheid geconcentreerd zoutzuur, gevolgd door schudden, wat wijst op de aanwezigheid van een flavonoïde ouderkern. In de Molisch-reactie vormde zich een paarse ring op het grensvlak, wat wijst op een positief resultaat en de aanwezigheid van suikergroepen in de moleculaire structuur. De monsteroplossing werd heldergeel na toevoeging van 2% chlooroxidatie...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De extractie van rutine is voornamelijk gebaseerd op de alkali-extractiezuurprecipitatie (AEAP) methode6, die de voordelen biedt van eenvoudige apparatuurvereisten, bedieningsgemak, hoge efficiëntie en lage kosten. Deze techniek wordt vaak aangevuld met microgolf-geassisteerde extractie (MAE)7 en ultrasone extractie (VAE)8, die het reagensverbruik verminderen, de extractietijd versnellen en de algehele opbrengst verb...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs van dit artikel verklaren hierbij dat zij alle belangenconflicten hebben bekendgemaakt die zich kunnen hebben voorgedaan tijdens het uitvoeren van dit onderzoek en het schrijven van dit artikel. We bevestigen dat we geen financiële, persoonlijke of professionele relaties hebben die onze interpretatie van de resultaten of conclusies die in dit werk worden gepresenteerd, zouden kunnen beïnvloeden. In het bijzonder hebben we geen banden met farmaceutische bedrijven, onderzoeksinstellingen of andere entiteiten die baat zouden kunnen hebben bij de hier gerapporteerde bevindingen. Ten slotte bevestigen we dat onze bevindingen en conclusies uitsluitend gebaseerd zijn op de gegevens en analyses die in dit document worden gepresenteerd en niet worden beïnvloed door externe factoren. We blijven ons inzetten voor de hoogste normen van academische integriteit en ethisch gedrag in al onze onderzoeksactiviteiten.
Dankbetuigingen
We willen onze diepe dankbaarheid betuigen aan het Pharmaceutical Chemistry Laboratory van de Beijing University of Chinese Medicine voor het ter beschikking stellen van het experimentele platform. Hun steun en middelen zijn van onschatbare waarde geweest bij het uitvoeren van ons onderzoek en onze experimenten. We hebben grote waardering voor hun toewijding aan wetenschappelijke excellentie en hun toewijding om de ontwikkeling van jonge onderzoekers te bevorderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1-Naftol | MACKLIN | C16245764 | |
| Azijnzuur | MACKLIN | C12662811 | |
| Acetonitril | MACKLIN | C16129374 | |
| Aluminiumchloride | MACKLIN | C16485922 | |
| Citroenzuur | MACKLIN | C16429480 | |
| DMSO | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20230306 | |
| Ethanol | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20250102 | |
| Ethylacetaat | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20240318 | |
| Flos sophorae immaturus | Beijing Tongrentang | 10092026329782 | |
| Mierenzuur | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20150402 | |
| MestReNova | Mestrelab Research | / | |
| Methanol | innochem | C16365684 | |
| Silicagel 60F254 | STEEMA | 20210222 | |
| Xcalibur | Thermo Fisher Scientific | / | |
| Zirconylchloride octahydraat | MACKLIN | C15350627 |
Referenties
- Drew, A. K., et al. Chinese herbal medicine toxicology database: Monograph on Radix Sophorae Flavescentis, "ku shen". J Toxicol Clin Toxicol. 40 (2), 173-176 (2002).
- Chua, L. S. A review on plant-based rutin extraction methods and its pharmacological activities. J Ethnopharmacol. 150 (3), 805-817 (2013).
- Huang, R., et al. Evaluation of the synergetic effect of Yupingfeng San and Flos Sophorae Immaturus based on free radical scavenging capacity. Biomed Pharmacother. 128, 110265(2020).
- Li, R., Wang, C., Lei, P., Huang, L., Yuan, S. Chemical constituents in Flos sophorae carbonisatus. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 35 (5), 607-609 (2010).
- Ghorbani, A. Mechanisms of antidiabetic effects of flavonoid rutin. Biomed Pharmacother. 96, 305-312 (2017).
- Calabrese, E. J., et al. Rutin, a widely consumed flavonoid, that commonly induces hormetic effects. Food Chem Toxicol. 187, 114626(2024).
- Li, R. R., Yuan, S. T., Li, Z. H., Qin, H. L. Studies on chemical constituents in Flos sophorae carbonisatus. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 30 (16), 1255-1257 (2005).
- Nikfarjam, B. A., Adineh, M., Hajiali, F., Nassiri-Asl, M. Treatment with rutin - a therapeutic strategy for neutrophil-mediated inflammatory and autoimmune diseases: Anti-inflammatory effects of rutin on neutrophils. J Pharmacopuncture. 20 (1), 52-56 (2017).
- Singh, S., et al. Rutin protects t-butyl hydroperoxide-induced oxidative impairment via modulating the Nrf2 and iNOS activity. Phytomedicine. 55, 92-104 (2019).
- Cushnie, T. P., Lamb, A. J. Antimicrobial activity of flavonoids. Int J Antimicrob Agents. 26 (5), 343-356 (2005).
- Budzynska, B., et al. Rutin as neuroprotective agent: From bench to bedside. Curr Med Chem. 26 (27), 5152-5164 (2019).
- Tan, Y. Q., et al. Pharmacological properties of total flavonoids in Scutellaria baicalensis for the treatment of cardiovascular diseases. Phytomedicine. 107, 154458(2022).
- Tobar-Delgado, E., Mejía-España, D., Osorio-Mora, O., Serna-Cock, L. Rutin: Family farming products' extraction sources, industrial applications and current trends in biological activity protection. Molecules. 28 (15), 5864(2023).
- Wang, S., et al. Effect of combined ultrasonic and enzymatic extraction technique on the quality of noni (Morinda citrifolia L.) juice. Ultrason Sonochem. 92, 106231(2023).
- Dos Santos Dantas, T., et al. Phytochemical profile analysis by LC-ESI-MS(n) and LC-HR-ESI-MS and validated HPLC method for quantification of rutin in herbal drug and products from leaves of Croton blanchetianus. Biomed Chromatogr. 37 (9), e5665(2023).
- Santiago, M., Strobel, S. Thin layer chromatography. Methods Enzymol. 533, 303-324 (2013).
- Ravber, M., et al. Hydrothermal degradation of rutin: Identification of degradation products and kinetics study. J Agric Food Chem. 64 (48), 9196-9202 (2016).
- Zhang, Z., et al. Effect of pH regulation on the components and functional properties of proteins isolated from cold-pressed rapeseed meal through alkaline extraction and acid precipitation. Food Chem. 327, 126998(2020).
- Lv, H., et al. Extraction and separation of vitisin D, ampelopsin B and cis-vitisin A from Iris lactea Pall. var. chinensis (Fisch.) Koidz by alkaline extraction-acid precipitation and high-speed counter-current chromatography. J Chromatogr Sci. 54 (5), 744-751 (2016).
- Yang, Y., Chu, X., Li, Y., Meng, H., Qin, L. Alkali-extracted rhamnogalactoarabinan from Chaetomorpha linum: Characterisation and anti-type 2 diabetic effect. Carbohydr Polym. 356, 123388(2025).
- Gao, S., et al. Unveiling polysaccharides of Houttuynia cordata Thunb.: Extraction, purification, structure, bioactivities, and structure-activity relationships. Phytomedicine. 138, 156436(2025).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
