Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Primair syndroom van Sjögren geassocieerd met longadenocarcinoom: onderzoek naar de mogelijke gemeenschappelijke pathogene mechanismen en experimentele verificatie

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67421

⸱

20 september 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 2Oncology Department, Wangjing Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, 3The Second Department of Healthcare, China-Japan Friendship Hospital, 4Rheumatology Department, Shangqiu Hospital of Traditional Chinese Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft de operationele procedures en voorzorgsmaatregelen om de mogelijke gemeenschappelijke pathogene mechanismen die primair syndroom van Sjögren en longadenocarcinoom met elkaar verbinden, te onderzoeken door middel van bio-informaticaanalyse en experimentele verificatie.

Samenvatting

Deze studie had tot doel de mogelijke gemeenschappelijke pathogene mechanismen te onderzoeken die het primaire syndroom van Sjögren (pSS) en longadenocarcinoom (LUAD) met elkaar verbinden door middel van bio-informaticaanalyse en experimentele verificatie. De relevante genen geassocieerd met pSS en LUAD werden opgehaald uit de Gene Expression Omnibus (GEO) database en de Genecard-database. Vervolgens werden differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) geassocieerd met pSS en LUAD gescreend als pSS-LUAD-DEG's. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) en Gene Ontology (GO) verrijkingsanalyses werden uitgevoerd om de significante biologische functies van pSS-LUAD-DEG's op te helderen. Kerndoelen werden geïdentificeerd door het eiwit-eiwitinteractie (PPI)-netwerk te construeren, waarbij de diagnostische nauwkeurigheid van het hub-gen verder werd beoordeeld door middel van Receiver Operating Characteristics (ROC)-curveanalyses. In deze studie dienden NOD/Ltj-muizen als pSS-diermodellen en werden ze gestimuleerd met fijnstof 2.5 (PM2.5) om een ontstekingsreactie op te wekken. Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR), enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) en western blotting werden gebruikt voor relevante verificatie van moleculair-biologische experimenten. De resultaten die zijn onthuld door KEGG- en GO-verrijkingsanalyses geven aan dat ontsteking een cruciale rol speelt bij het koppelen van pSS en LUAD. IL6, CCNA2, JAK2, IL1B, ASPM, CCNB2, NUSAP1 en CEP55 werden bepaald als de belangrijkste doelen van pSS-LUAD. BALB/c-muizen en NOD/Ltj-muizen vertoonden verbeterde expressie van inflammatoire cytokines IL-6 en IL-1β in longweefsel na 21 dagen stimulatie met PM2.5, waardoor de JAK2/STAT3-signaleringsroute werd geactiveerd en de expressie van tumor-geassocieerde genen CCNA2, CCNB2 en CEP55 werd opgereguleerd, waarbij NOD/Ltj-muizen meer uitgesproken veranderingen vertoonden dan BALB/c-muizen. Dit protocol toont aan dat carcinogenese geïnduceerd door de pulmonale inflammatoire micro-omgeving een belangrijke reden kan zijn voor de hoge incidentie van LUAD bij pSS-patiënten. Bovendien kunnen blokkeringsgerelateerde mechanismen het optreden van LUAD bij pSS-patiënten helpen voorkomen.

Inleiding

Primair syndroom van Sjögren (pSS) is een auto-immuunziekte die wordt gekenmerkt door lymfatische infiltratie van de exocriene klieren en leidt tot de klinische symptomen van droge ogen (xeroftalmie) en droge mond (xerostomie)1,2. pSS gaat meestal ook gepaard met extraglandulaire manifestaties van betrokkenheid, waaronder hyperglobulinemie3, interstitiële longziekte4, renale tubulaire acidose5, neurologische schade6, en trombocytopenie7, die de voornaamste ongunstige prognostische factoren vormen. In de afgelopen jaren heeft een reeks onderzoeken aangetoond dat pSS over het algemeen gepaard gaat met een verhoogde prevalentie van kanker, waaronder hematologische maligniteiten en solide tumoren 8,9,10. Longkanker is een van de meest voorkomende vormen van pSS-gerelateerde kanker, met name longadenocarcinoom (LUAD)11.

Gezamenlijk suggereerde verder onderzoek dat pSS met LUAD een onderliggende gemeenschappelijke pathogenese kan hebben. Volgens onze huidige kennis zijn er nog geen speciale studies die de gemeenschappelijke mechanismen tussen de twee ziekten verklaren. Onlangs biedt bio-informatica-analyse ons een potentiële mogelijkheid om mogelijk gedeelde ziektemechanismen tussen soorten te onthullen 12,13,14. Om de onderliggende mechanismen verder bloot te leggen, wordt bioinformatica-analyse gebruikt voor de analyse van gemeenschappelijke doelen en signaalroutes tussen pSS en LUAD, en worden vervolgens diermodellen opgesteld voor experimentele verificatie. Het onthullen van deze mechanismen kan helpen bij het verkrijgen van een wetenschappelijke basis voor klinische preventie van LUAD bij pSS-patiënten.

Deze studie gebruikte de GEO- en Genecard-databases om de relevante genen te achterhalen die geassocieerd zijn met pSS en LUAD. Daarna werden DEG's geassocieerd met pSS en LUAD gescreend als pSS-LUAD-DEG's. We hebben KEGG- en GO-verrijkingsanalyses uitgevoerd om de significante biologische functies van pSS-LUAD-DEG's op te helderen. De constructie van het PPI-netwerk werd gebruikt om kerndoelen te identificeren, en we hebben de diagnostische nauwkeurigheid van het hub-gen verder beoordeeld door middel van ROC-curve-analyses. We gebruikten NOD/Ltj-muizen als pSS-diermodellen die werden gestimuleerd met fijnstof 2.5 (PM2.5) om een ontstekingsreactie op te wekken. QPCR, ELISA en western blotting werden uitgevoerd om het onderzoek experimenteel te verifiëren. Over het algemeen geven de resultaten hier aan dat carcinogenese geïnduceerd door de pulmonale inflammatoire micro-omgeving een kritieke reden kan zijn voor de hoge incidentie van LUAD bij pSS-patiënten. Het suggereert ook dat het optreden van LUAD bij pSS-patiënten kan worden voorkomen door blokkeringsgerelateerde mechanismen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De proefdieren werden gehuisvest in de dierenfaciliteit van het China-Japan Friendship Hospital, waar de huisvestingsomstandigheden voldeden aan de diervoedingsomgeving in overeenstemming met China's nationale standaard, Laboratory Animal-Requirements of Environment and Housing Facilities (GB14925-2010). Alle procedures en experimenten voor dierenverzorging voldeden aan de ARRIVE-richtlijnen en waren gebaseerd op de 3V-principes (vermindering, vervanging, verfijning), in overeenstemming met de richtlijnen van de National Animal Welfare Law of China. BALB/c-muizen werden gekocht van SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd., en NOD/Ltj-muizen werden gekocht van Huafukang (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.

1. Bio-informatica analyse

  1. Voorbereiding van datasets
    1. Open de Gene Expression Omnibus (GEO)-database (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)15 en gebruik het primaire syndroom van Sjögren en longadenocarcinoom als trefwoorden om genexpressieprofielen te doorzoeken. Klik vervolgens op de resultaten in de GEO DataSets Database en selecteer Homo sapiens in Top Organisms. Selecteer en download de dataset van interesse samen met de bijbehorende platforminformatie.
    2. Open de Genecard-database (https://www.genecards.org/)16 en gebruik hetsyndroom van Sjögren en longadenocarcinoom als trefwoorden om de genen pSS en LUAD te verkrijgen. Download de spreadsheets van de ziektegenen.
  2. Identificatie van gedeelde DEG's tussen pSS en LUAD
    1. Download en open de R-software (https://cran.r-project.org/)17. Installeer het GEOquery R-pakket, het stringr R-pakket, het ggplot2 R-pakket, het reshape2 R-pakket en het limma R-pakket in R-software.
    2. Identificeer en visualiseer differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) in verschillende GEO-datasets (GSE84844, GSE51092, GSE32863 en GSE75037) met behulp van R-software, vergelijk en analyseer vervolgens genexpressie tussen deze datasets. Beschouw de genen met een aangepaste P-waarde < 0,05 en vouwverandering (FC) > 1,2 of < 0,83 als DEG's.
    3. Selecteer genen met een expressieniveau groter dan of gelijk aan 20 gerelateerd aan pSS en LUAD uit de Genecard-database.
    4. Voeg de DEG's die zijn gekoppeld aan pSS en de DEG's die zijn gekoppeld aan LUAD samen uit zowel de GEO-database als de Genecard-database.
    5. Installeer en laad het VennDiagram-pakket in R om de DEG's te verkrijgen en te visualiseren die zijn gekoppeld aan pSS en LUAD (pSS-LUAD-DEG's).
  3. Kyoto Encyclopedie van Genen en Genomen (KEGG) routeverrijkingsanalyse
    1. Voer Metascape (https://metascape.org/)18 in. Klik op Bestand selecteren en upload het bestand in .xlsx formaat van pSS-LUAD-DEG's. Selecteer H. sapiens in Invoer als soort. Selecteer op dezelfde manier H. sapiens in Analyse als soort.
    2. Klik op Aangepaste analyse. Klik op Verrijking en selecteer KEGG-traject. Klik op Verrijkingsanalyse en klik vervolgens op Analyserapportpagina wanneer de verrijkingsanalyse is voltooid.
    3. Klik op Alles in één zipbestand om het resultaat te downloaden. Open het bestand _ FINAL_GO.csv in de map Enrichment_GO downloaden om het resultaat te bekijken.
    4. Gebruik het ggplot2-pakket om het KEGG-visualisatieprogramma in R uit te voeren.
  4. Gene Ontology (GO) verrijking analyse
    1. Installeer en laad clusterProfiler en enrichplot pakket in R.
    2. Importeer de tekstlijst van pSS-LUAD-DEG's in R.
    3. Voer de pakketten clusterProfiler en enrichplot uit voor GO-verrijkingsanalyse en resultaatvisualisatie. Definieer statistische significantie in de analyse op een aangepaste P-waarde < 0,05.
  5. Constructie van eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerk- en moduleanalyse
    1. Voer de database Retrieval of Interacting Genes (STRING) in (http://string-db.org/)19. Klik op Bladeren en upload het bestand met pSS-LUAD-DEG's. Selecteer Homo sapiens in Organismen en klik vervolgens op Zoeken.
    2. Klik op Doorgaan. Zodra de resultaten beschikbaar zijn, klikt u op Instellingen. Selecteer onder Basisinstellingen > Minimaal vereiste interactiescore de optie Hoge betrouwbaarheid (0,700). Schakel Losgekoppelde knooppunten in het netwerk verbergen in Geavanceerde instellingen in en klik vervolgens op Bijwerken.
    3. Klik op Exports in de titelbalk om de tekst van de PPI-relatie in TSV-formaat te downloaden.
    4. Download en schakel de Cytoscape 3.7.1-software in (https://cytoscape.org/)20. Klik op Bestand > Importeren > netwerk uit bestand om het TSV-indelingsbestand te importeren voor het maken van het PPI-netwerk.
    5. Gebruik de Network Analyzer-tool om de topologische parameters in het netwerk te analyseren. Optimaliseer de grootte en kleur van knooppunten via de stijlbalk in het linker configuratiescherm.
    6. Selecteer op de menubalk Extra > Netwerk analyseren. Klik in het deelvenster Tabel op Graad om componenten in aflopende volgorde op graad te sorteren. Neem de top 20 genen met hogere graden als hub-genen.
    7. Installeer en laad de igraph- en ggplot2-pakketten in R om hub-genen op graad te visualiseren.
  6. Identificatie en validatie van hub-genen
    1. Installeer en laad het pROC-pakket in R.
    2. Importeer de tekstlijst van hub-genen in R.
    3. Plot de ROC-curven (ROC) van hubgenen en bereken het gebied onder de ROC-curve (AUC)-waarden.
      NOTITIE: Raadpleeg aanvullend coderingsbestand 1 voor de R-code voor het filteren van DEG's.

2. Experimentele verificatie

NOTITIE: Raadpleeg de Materiaaltabel voor details over de materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.

  1. Voorbereiding van dieren
    1. Voer 12 negen weken oude vrouwelijke BALB/c-muizen en 12 negen weken oude vrouwelijke NOD/Ltj-muizen adaptief gedurende 1 week.
    2. Gebruik een tabel met willekeurige getallen om 12 negen weken oude vrouwelijke BALB/c-muizen gelijkmatig toe te wijzen aan de lege controlegroep en de PM2.5-groep. Verdeel op dezelfde manier 12 negen weken oude vrouwelijke NOD/Ltj-muizen gelijkmatig in de pSS-groep en de pSS-PM2.5-groep.
  2. Bereiding van de zwevende deeltjes 2.5 (PM2.5) suspensie
    OPMERKING: PM2.5 kan het optreden en de ontwikkeling van ontstekingsgerelateerde LUAD induceren in muismodel21. BALB/c-muizen en NOD/Ltj-muizen werden door PM2.5 geïnduceerd om ontstekingsgerelateerde veranderingen te ontwikkelen. Volgens de methode beschreven door Piao et al.22 werd de concentratie van de PM2.5-suspensie bereid op 1 mg/ml.
    1. Weeg de PM2.5-kwartsvezelmembranen, snijd ze in stukken van 2 cm × 2 cm en dompel ze onder in een bekerglas met de juiste hoeveelheid gedeïoniseerd water.
    2. Sluit het bekerglas af en sonificeer het glas in een waterbadsonicator bij 37 °C gedurende telkens 30 minuten. Herhaal dit proces 3 keer totdat de deeltjes volledig zijn opgelost.
    3. Filtreer de vloeistof in het bekerglas door 16 lagen steriel medisch gaasje en knijp het resterende vocht uit het gaasje.
    4. Leg het filtraat op een platte schaal en vries het in ijsblokjes in een vriezer van -20 °C. Gebruik vervolgens een vriesdrooginstrument (-52 °C, 0,1 mbar, 48 uur) om de ijsblokken filtraat te drogen en de poedervormige deeltjes op te vangen.
    5. Los de poedervormige deeltjes grondig op in zoutoplossing om een PM2.5-suspensie te bereiden met een concentratie van 1 mg/ml. Giet de PM2.5-suspensie in een glazen fles, plaats deze in een hogedruksterilisator en pas hoge druk en temperatuur toe (15 minuten bij 121 °C, 15 psi) voor sterilisatie.
    6. Voer ultrasone agitatie uit (200 W, 10 s agitatie, 10 s rust, gedurende 3 cycli). Bewaar het na de behandeling in een koelkast van 4 °C voor later gebruik.
  3. Oprichting van het PM2.5-muismodel
    OPMERKING: De PM2.5-groep en de pSS-PM2.5-groep kregen gedurende 28 dagen eenmaal per 3 dagen PM2.5-suspensie via een tracheuminfuus toegediend, waarbij elke dosis 0,1 ml was. De blanco controlegroep en de pSS-groep kregen gedurende 28 dagen eenmaal per 3 dagen fysiologische zoutoplossing toegediend via een trachea-infuus, waarbij elke dosis 0,1 ml was.
    1. Injecteer een mengsel van ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) in de muis. Bevestig het chirurgische vlak van anesthesie door te controleren of er niet reageert op een beknelde teen en zorg voor volledige spierontspanning. Bewaak continu de reflexen, ademhaling en algehele respons om ervoor te zorgen dat tijdens de procedure voldoende anesthesie wordt gehandhaafd totdat alle stappen zijn voltooid.
    2. Plaats de muis op het knaaptoestel voor kleine dieren met de buik naar boven, het hoofd omhoog en de staart in een hoek van 45° naar beneden. Gebruik fijne draad om de bovenste snijtanden van de muis te lussen, trek ze omhoog en bevestig de draad op een schroef op de dierhouder, zodat de mondholte van de muis volledig zichtbaar is.
    3. Open de koude lichtlamp en schijn het licht op de huid van de nek van de muis. Gebruik een tang om de tong van de muis naar buiten te trekken, waardoor de glottis volledig bloot komt te liggen. Observeer in de mondholte van de muis een terugkerende lichtvlek bij het openen en sluiten, die de positie van de luchtwegopening van de muis aangeeft.
    4. Steek de 18 G veneuze verblijfsnaald in de luchtpijp van de muis, trek de naaldkern eruit, plaats de katoenen draad aan het buitenste uiteinde van de veneuze verblijfsnaald en bevestig het succes bij het observeren van de katoenen draad die beweegt met de borstbewegingen van de muis.
    5. Zuig eerst 0.2 ml lucht aan met een spuit van 1 ml, zuig vervolgens 0.1 ml PM2.5-suspensie aan, gevolgd door het aanzuigen van nog eens 0.2 ml lucht. Injecteer het mengsel door de 18 G veneuze verblijfsnaald in de luchtpijp.
    6. Trek de 18 G veneuze verblijfsnaald naar buiten. Zet de dierhouder rechtop en draai hem 30 keer met de klok mee en tegen de klok in om de PM2.5-suspensie gelijkmatig in de longen van de muis te verdelen. Strek vervolgens de nek van de muis recht en leg hem op zijn zij om verstikking te voorkomen.
  4. Verzameling van specimens
    OPMERKING: Verzamel monsters op de 29edag van het experiment voor daaropvolgende moleculair-biologische analyses.
    1. Controleer de aansluiting van het euthanasiesysteem en schakel de controller in. Open de kraan van de kooldioxide (CO2) cilinder.
      OPMERKING: Vul de euthanasiekamer niet voor voordat u de dieren erin plaatst.
    2. Plaats de muizen in de kamer en laat CO2 trekken met 30%-70% van het kamervolume per minuut. Stel de muizen gedurende 5 minuten bloot aan CO2 en zorg ervoor dat ze onbeweeglijk zijn, niet ademen en verwijde pupillen hebben. Draai de CO2 -cilinderklep dicht en observeer nog 5 minuten om de dood te bevestigen.
    3. Plaats de geëuthanaseerde muis in rugligging op een schoon snijbord. Leg de luchtpijp, het hart en de longen bloot.
    4. Gebruik een schaar en een tang om de huid en spieren te verwijderen die de ventrale, thoracale en nekgebieden bedekken. Gebruik een schaar en een tang om incisies te maken langs de randen van de ribben aan beide zijden van de borstholte om de borstholte met het hart en de longen bloot te leggen. Snijd vervolgens het sleutelbeen door om een opening te creëren die breed genoeg is om de linker- en rechterlongkwabben grondig te onderzoeken.
    5. Snijd de nekspieren weg die zich uitstrekken van het borstbeen en de ribben tot aan de kaak. Steek een schaar onder de voorste rand van de ribben en maak aan beide zijden incisies om het benige gedeelte dat de luchtpijp bedekt te verwijderen.
    6. Pak de luchtpijp bij de kaak vast met een tang en maak een volledige transversale incisie met behulp van een schaar die boven de tang wordt geplaatst.
    7. Trek de luchtpijp voorzichtig omhoog met een tang en knip de ventrale weefselverbindingen met een schaar door totdat het volledige thoracale weefsel uit het lichaam is verwijderd.
    8. Leg de longen plat op de werkbank. Spoel de resten van het longweefseloppervlak af met zoutoplossing, dep droog met filtreerpapier, aliquot in cryobuisjes en bewaar bij -80 °C.
  5. Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR)
    1. Vermaal het longweefsel tot poeder met behulp van een vijzel met vloeibare stikstof.
    2. Weeg 20 mg gemalen weefsel af met behulp van een precisiebalans, combineer het met 750 μL Buffer RL in een centrifugebuis, meng grondig met behulp van een vortexmixer en laat het 3 minuten op kamertemperatuur (RT) staan. Centrifugeer het vervolgens op 14.000 x g gedurende 5 minuten bij RT en verzamel het supernatant.
    3. Plaats de minikolom van het genomische DNA (gDNA)-filter in een verzamelbuis van 2 ml. Breng het bovenstaande over naar de minikolom van het gDNA-filter en centrifugeer op 14.000 x g gedurende 2 minuten bij RT.
    4. Gooi de minikolom van het gDNA-filter weg. Voeg een gelijk volume van 70% ethanol toe aan het filtraat en meng door 5 keer op en neer te pipetteren.
    5. Plaats de RNA-minikolom in een verzamelbuisje van 2 ml. Breng 750 μL van het mengsel over naar de RNA-minikolom en centrifugeer op 12.000 x g gedurende 1 minuut bij RT.
    6. Gooi het filtraat weg en plaats de RNA-minikolom terug in de verzamelbuis van 2 ml. Voeg 500 μL Buffer RW1 toe aan de RNA-minikolom en centrifugeer op 12.000 x g gedurende 1 minuut bij RT.
    7. Gooi het filtraat weg en plaats de RNA-minikolom terug in de verzamelbuis van 2 ml. Voeg 500 μL Buffer RW2 toe aan de RNA-minikolom. Centrifugeer op 12.000 x g gedurende 1 minuut bij RT. Herhaal deze stap nog een keer.
    8. Gooi het filtraat weg en plaats de RNA-minikolom terug in de verzamelbuis van 2 ml. Centrifugeren bij 12.000 x g gedurende 2 minuten bij RT.
    9. Breng de RNA-minikolom over naar een centrifugebuis van 1,5 ml, voeg 100 μL RNase-vrij water toe aan het midden van het kolommembraan en incubeer gedurende 2 minuten bij RT. Centrifugeer vervolgens bij 12.000 x g gedurende 1 minuut bij RT. Gooi de RNA-minikolom weg en bewaar de RNA-oplossing bij -80 °C.
    10. Neem 2 μL van de RNA-oplossing en meet deze met behulp van de NanoDrop-spectrofotometer volgens de handleiding van de apparatuur om de concentratie en kwaliteit te bepalen.
      OPMERKING: De studie selecteerde verhoudingen van 260/280 en 260/230 voor RNA-kwaliteitscontrole.
    11. Bereid de RNA-oplossing voor door achtereenvolgens de volgende componenten toe te voegen aan een microcentrifugebuisje: 1 μg totaal RNA, 4 μl MgCl2 (25 mM), 2 μl reverse transcriptie 10x buffer, 2 μl dNTP-mengsel (10 mM), 0,5 μl recombinante ribonucleaseremmer, 15 eenheden reverse transcriptase, 0,5 μg oligo(dT)15 primer, en voeg nucleasevrij water toe aan 20 μL. Meng de inhoud voorzichtig om alle vloeistof op de bodem van de buis op te vangen.
      OPMERKING: Cocktailoplossingen moeten worden voorbereid om een consistentere cDNA-synthese en RNA-kwantificering te garanderen.
    12. Reverse transcribeer de 20 μL RNA-oplossing in cDNA door deze gedurende 15 minuten bij 42 °C te incuberen, gedurende 5 minuten bij 95 °C te denatureren en vervolgens af te koelen tot 4 °C, gevolgd door opslag bij -20 °C.
    13. Combineer en meng grondig 6,4 μL gedestilleerd water, 10 μL SYBR Green real-time PCR-mastermix, 2 μL van de verkregen cDNA-oplossing, 0,8 μL voorwaartse primer (10 μM) en 0,8 μL omgekeerde primer (10 μM) (Tabel 1) om het reactiesysteem voor te bereiden.
    14. Voer de reactie uit op het PCR-instrument om de cyclusdrempelwaarden (CT) voor de doelgenen en referentiegenen te verkrijgen.
      1. Stel de initiële denaturatie aan het begin van elke PCR-cyclus in op 95 °C gedurende 60 s.
      2. Voer tijdens de PCR-cycli denaturatie uit bij 95 °C gedurende 15 s, gloeien bij 60 °C gedurende 15 s en rekken bij 72 °C gedurende 45 s, waarbij gegevens worden verzameld tijdens de verlengstap. Voer in totaal 40 PCR-cycli uit.
      3. Na het voltooien van de PCR-cycli voert u automatisch een smeltcurve-analyse uit met behulp van het PCR-instrument.
        OPMERKING: Als de smeltcurve een dubbele piek of onregelmatige piekvorm vertoont, geeft dit aan dat er mogelijk een probleem is met het experiment.
    15. Bepaal de relatieve expressieniveaus van elk doelgen met behulp van de 2-ΔΔCT-methode, gevolgd door verdere statistische analyse. Gebruik de volgende lijst met formules voor de 2-ΔΔCT-methode:
      ΔCT (test) = CT (doelwit, test) - CT (ref, test)
      ΔCT (kalibrator) = CT (doel, kalibrator) - CT (ref, kalibrator)
      ΔΔCT = ΔCT (test) -ΔCT (kalibrator)
      2-ΔΔCT = Vouwverandering in genexpressie

Naam van het genVolgorde (5′ tot 3′)
Muis CCNA2 vooruitCCCAGAAGTAGCAGAGTTTGTG
Muis CCNA2 achteruitTTGTCCCGTGACTGTGTAGAG
ASPM vooruit muisCTTATTCAGGCTATGTGGAGGA
Muis ASPM omgekeerdCCAGGCTTGAATCTTGCAG
Muis CCNB2 vooruitTTGAAATTTGAGTTGGGTCGAC
Muis CCNB2 achteruitCTGTTCAACATCAACCTCCC
Muis NUSAP1 vooruitCTCCCTCAAGTACAGTGACC
Muis NUSAP1 omgekeerdTTTAACAACTTGGTTGCCCTC
Muis CEP55 vooruitCCGCCAGAATATGCAGCATCAAC
Muis CEP55 achteruitAGTGGGAATGGCTGCTCTGTGA

Tabel 1: Priemsequenties voor kwantitatieve real-time PCR.

  1. Enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA)
    OPMERKING: Volgens de instructies van de ELISA-kit, breng de ELISA-kit in evenwicht met RT, bereid een wasbuffer voor en verdun de standaard. Verdun 90 μl geconcentreerd gebiotinyleerd antilichaam met 8910 μl verdunningsbuffer van gebiotinyleerde antilichamen om vooraf een werkoplossing voor gebiotinyleerd antilichaam (1:100) te bereiden. Verdun op dezelfde manier 90 μL geconcentreerd enzymconjugaat met 8910 μL enzymconjugaatverdunningsbuffer om vooraf een enzymgeconjugeerde werkoplossing (1:100) te bereiden.
    1. Vermaal het longweefsel tot poeder met behulp van een vijzel met vloeibare stikstof.
    2. Weeg 50 mg longweefsel af met behulp van een precisiebalans, combineer het met 1 ml PBS in een maalbuis en maal het grondig op ijs.
    3. Centrifugeer het mengsel gedurende 5 minuten bij 4 °C, 3000 x g , en verzamel het bovenstaande als monster.
    4. Plaats 100 μL monster/standaard van verschillende concentraties in de respectievelijke putjes van de ELISA-plaat, bedek de reactieputjes met zelfklevende afdichtingsfolie en incubeer in een incubator van 37 °C gedurende 90 min.
    5. Gebruik een geautomatiseerde platenwasser om de ELISA-plaat 4 keer te wassen, waarbij u telkens 350 μL wasbuffer injecteert met een interval van 30 s tussen injectie en aspiratie.
    6. Voeg 100 μL gebiotinyleerde antilichaamwerkoplossing per putje toe, dicht de putjes af met zelfklevende afdichtfolie en incubeer gedurende 60 minuten in een incubator van 37 °C. Was de ELISA-plaat daarna 4 keer volgens de eerder beschreven procedure.
    7. Voeg 100 μL enzymgeconjugeerde werkoplossing per putje toe, dicht de putjes af met zelfklevende afdichtfolie en incubeer 30 minuten in een incubator van 37 °C. Was de ELISA-plaat daarna 4 keer volgens de eerder beschreven procedure.
    8. Voeg 100 μL chromogeen middel per putje toe, bescherm tegen licht en incubeer in een incubator van 37 °C gedurende 10-20 minuten. Voeg vervolgens 100 μL stopoplossing per putje toe, meng grondig en meet onmiddellijk de optische dichtheid bij 450 nm (OD450) waarden.
      OPMERKING: Een 8-kanaals pipet wordt gebruikt om de gebiotinyleerde antilichaamwerkoplossing, enzymgeconjugeerde werkoplossing en stopoplossing toe te voegen, waardoor de toevoeging snel kan worden voltooid en mogelijke fouten kunnen worden voorkomen.
    9. Genereer een standaardcurve met behulp van CurveExpert-software (http:// curveexpert.webhop.net/) om de concentratie van de doelstoffen in elk monsterputje te berekenen.
  2. Western blotting
    1. Bereid de oplossing voor radio-immunoprecipitatietest (RIPA) voor door RIPA-lysisbuffer, fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF) en fosfataseremmer te mengen in een verhouding van 100:1:1 en plaats deze op ijs.
    2. Vermaal het longweefsel tot poeder met behulp van een vijzel met vloeibare stikstof.
    3. Weeg 20 mg longweefsel nauwkeurig af met behulp van een precisieweegschaal en voeg dit toe aan 250 μl van de RIPA gemengde oplossing.
    4. Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten op ijs, centrifugeer het vervolgens gedurende 15 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C en verzamel het bovenstaande als monster.
    5. Bereid de BCA-werkoplossing voor door reagens A en reagens B uit de BCA-kit in een verhouding van 50:1 te mengen.
      1. Verdun de standaard om verdunde standaardoplossingen te bereiden met concentraties van 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 en 0,5 mg/ml. Voeg 20 μl van elke standaardoplossing toe en bemonster in afzonderlijke putjes van een plaat met 96 putjes en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
      2. Meet de extinctie bij 490 nm met behulp van de microplaatlezer. Pas de standaardcurve aan met behulp van de concentraties en extincties van de standaardoplossingen en bereken de monsterconcentratie23. Breng de monsterconcentraties op hetzelfde niveau met behulp van de RIPA gemengde oplossing.
    6. Meng het eiwitsupernatans met 5x laadbuffer in een verhouding van 4:1 in een centrifugebuis. Kook 5 minuten in een metalen bad, centrifugeer het vervolgens 15 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C en vang het bovenstaande op.
    7. Voer eiwitscheiding uit met behulp van natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en breng de eiwitten elektrisch over op een polyvinylideenfluoride (PVDF)-membraan. Blokkeer het PVDF-membraan met 5% magere melk bij RT gedurende 1 uur.
    8. Incubeer het PVDF-membraan met primair antilichaam (verdund 1:1000) bij 4 °C gedurende 12 uur, gevolgd door driemaal wassen met TBST gedurende 10 minuten elk, en incubeer vervolgens met secundair antilichaam (verdund 1:5000) bij RT gedurende 2 uur.
    9. Detecteer de doelbanden met behulp van een volautomatisch elektrochemiluminescentie-immunoassaysysteem en voer kwantitatieve analyses uit met behulp van de ingebouwde software.
  3. Statistische analyse
    1. Gebruik de juiste software voor statistische analyse.
    2. Presenteer experimentele gegevens als gemiddelde ± standaarddeviatie.
    3. Bepaal de significantie met behulp van eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA).
    4. Beschouw P < 0,05 als statistisch significant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In totaal werden 3290 DEG's geïdentificeerd van de 23348 genen in GSE84884 (pSS), waaronder 2659 opgereguleerde genen en 631 neerwaarts gereguleerde genen (Figuur 1A). Voor GSE51092 (pSS) werden in totaal 3290 DEG's geïdentificeerd van de 11409 genen, waaronder 667 opgereguleerde genen en 587 neerwaarts gereguleerde genen (Figuur 1B). De GeneCards-database verkreeg 102 ovariële pSS-gerelateerde DEG's en de correlatiescore van sc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hoewel pSS wordt beschouwd als een ziekte die voornamelijk wordt gekenmerkt door de invasie van exocriene klieren, kan de schade aan extra-klieren niet worden genegeerd24. De longen vertegenwoordigen een doelorgaan voor pSS, en betrokkenheid van de longen is een veel voorkomende extraglandulaire manifestatie van pSS, meestal met lymfocytaire infiltratie van het bronchiale slijmvlies en het pulmonale interstitium25. Onderzoek wijst uit dat t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door National High Level Hospital Clinical Research Funding (2023-NHLHCRF-BQ-01) en het Youth Project van China-Japan Friendship Hospital (nr. 2020-1-QN-8).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3-Color Prestained Protein MarkerEpizymeWJ103Western Blot
Antibody Dilution BufferEpizymePS119Western Blot
BCA Protein Quantification KitEpizymeZJ101Western Blot
Cytoscape 3.7.1 softwareNational Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health (NIH)Versie 3.7.1.Open-source software voor biologische netwerkanalyse en visualisatie
ECL Luminous FluidEpizymeSQ203Western Blot
Electrophoresis BufferEpizymePS105SWestern Blot
GraphPad Prism 10.0GraphPadVersie 10.0Data-analyse
HRP-conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014)abclonalAS014Western Blot
JAK2 AntibodyCell Signaling Technology3230TWestern Blot
Mouse IL-1β ELISA KitBeijing 4A Biotech Co., LtdCME0015ELISA
Mouse IL-6 ELISA KitBeijing 4A Biotech Co., LtdCME0006ELISA
Phosphatase Inhibitor Cocktail (100×)EpizymeGRF102Western Blot
Phospho-JAK2 (Tyr1007/1008) AntibodyCell Signaling Technology3776SWestern Blot
Phospho-STAT3 (Tyr705) AntibodyCell Signaling Technology9145SWestern Blot
Protease Inhibitor Cocktail (100×)EpizymeGRF101Western Blot
Protein Free Rapid Blocking Buffer (5×)EpizymePS108Western Blot
PVDF membraneMilliporeIPVH00010Western Blot
R softwareR Foundation for Statistical ComputingNiet van toepassingStatistisch analysesoftware en programmeertaal gebruikt voor data-analyse, visualisatie en machine learning-toepassingen
Radio Immunoprecipitation AssayEpizymePC101Western Blot
Reverse Transcription SystemPromegaA3500PCR
SDS-PAGEEpizymeLK303Western Blot
SDS-PAGE Protein Loading Buffer (5×)EpizymeLT103Western Blot
STAT3 AntibodyCell Signaling Technology9139SWestern Blot
SYBR Green Realtime PCR Master MixTOYOBOQPK-201PCR
TBST (10×)EpizymePS103Western Blot
Western Blot Transfer Buffer (10×)EpizymePS109Western Blot
β-Actin AntibodyabclonalAC026Western Blot

Referenties

  1. Thorlacius, G. E., Bjork, A., Wahren-Herlenius, M. Genetics and epigenetics of primary sjogren syndrome: Implications for future therapies. Nat Rev Rheumatol. 19 (5), 288-306 (2023).
  2. Bjordal, O., Norheim, K. B., Rodahl, E., Jonsson, R., Omdal, R. Primary Sjogren's syndrome and the eye. Surv Ophthalmol. 65 (2), 119-132 (2020).
  3. Zhong, H., et al. Hyperglobulinemia predicts increased risk of mortality in primary Sjogren's syndrome: Based on a Chinese multicentre registry. Mod Rheumatol. 34 (1), 137-143 (2023).
  4. Lin, W., et al. Interstitial lung disease in primary Sjogren's syndrome. BMC Pulm Med. 22 (1), 73(2022).
  5. Aiyegbusi, O., et al. Renal disease in primary Sjogren's syndrome. Rheumatol Ther. 8 (1), 63-80 (2021).
  6. Liampas, A., et al. Primary sjogren syndrome-related peripheral neuropathy: A systematic review and meta-analysis. Eur J Neurol. 30 (1), 255-265 (2023).
  7. Wu, J., et al. Clinical and laboratory features of primary Sjogren's syndrome complicated with mild to severe thrombocytopenia. Ann Transl Med. 10 (6), 300(2022).
  8. Zhong, H., et al. Primary Sjogren's syndrome is associated with increased risk of malignancies besides lymphoma: A systematic review and meta-analysis. Autoimmun Rev. 21 (5), 103084(2022).
  9. Goulabchand, R., et al. Cancer incidence in primary Sjogren's syndrome: Data from the French hospitalization database. Autoimmun Rev. 20 (12), 102987(2021).
  10. Witkowski Durand Viel, P., et al. Chronological interplay, clinical features, and treatments among patients with cancer and primary Sjogren's syndrome. Cancer Immunol Immunother. 72 (12), 4309-4322 (2023).
  11. Xu, Y., et al. The prevalence and clinical characteristics of primary Sjogren's syndrome patients with lung cancer: An analysis of ten cases in China and literature review. Thorac Cancer. 6 (4), 475-479 (2015).
  12. Shi, L., Du, X., Li, J., Zhang, G. Bioinformatics and systems biology approach to identify the pathogenetic link between psoriasis and cardiovascular disease. Clin Cosmet Investig Dermatol. 16, 2283-2295 (2023).
  13. Xu, R., Ma, L. L., Cui, S., Chen, L., Xu, H. Bioinformatics and systems biology approach to identify the pathogenetic link between heart failure and sarcopenia. Arq Bras Cardiol. 120 (10), e20220874(2023).
  14. Lv, Y., et al. Bioinformatics and systems biology approach to identify the pathogenetic link of long COVID and myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome. Front Immunol. 13, 952987(2022).
  15. Barrett, T., et al. Ncbi geo: Archive for functional genomics data sets--update. Nucleic Acids Res. 41 (database issue), D991-D995 (2013).
  16. Stelzer, G., et al. The GeneCards suite: From gene data mining to disease genome sequence analyses. Curr Protoc Bioinformatics. 54, 1.30.1-1.30.33 (2016).
  17. Liu, S., et al. Three differential expression analysis methods for RNA sequencing: limma, EdgeR, DESeq2. J Vis Exp. 175, e62528(2021).
  18. Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nat Commun. 10 (1), 1523(2019).
  19. Szklarczyk, D., et al. The string database in 2023: Protein-protein association networks and functional enrichment analyses for any sequenced genome of interest. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D638-D646 (2023).
  20. Shannon, P., et al. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  21. Hill, W., et al. Lung adenocarcinoma promotion by air pollutants. Nature. 616 (7955), 159-167 (2023).
  22. Piao, C. H., et al. PM2.5 exposure regulates th1/th2/th17 cytokine production through NF-κβ signaling in combined allergic rhinitis and asthma syndrome. Int Immunopharmacol. 119, 110254(2023).
  23. Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume protein concentration determination using the nanodrop 2000c spectrophotometer. J Vis Exp. 33, e1610(2009).
  24. Luo, J., et al. Distinct clinical phenotypes of primary Sjogren's syndrome differ by onset age: A retrospective study of 742 cases and review of the literature. Clin Exp Rheumatol. 40 (12), 2373-2380 (2022).
  25. Luppi, F., et al. Lung complications of Sjogren syndrome. Eur Respir Rev. 29 (157), (2020).
  26. Berardicurti, O., et al. Interstitial lung disease and pulmonary damage in primary Sjogren's syndrome: A systematic review and meta-analysis. J Clin Med. 12 (7), 2586(2023).
  27. Roca, F., et al. Interstitial lung disease in primary Sjogren's syndrome. Autoimmun Rev. 16 (1), 48-54 (2017).
  28. Fisher, D. A., et al. Diagnosis and treatment of lung cancer in the setting of interstitial lung disease. Radiol Clin North Am. 60 (6), 993-1002 (2022).
  29. Okudela, K., et al. Implications of thyroid transcription factor-1 gene methylation in carcinogenesis of interstitial pneumonia-related non-terminal respiratory unit lung adenocarcinoma. Int J Clin Exp Pathol. 15 (3), 120-130 (2022).
  30. Sekine, A., et al. Disease activity of lung cancer at the time of acute exacerbation of interstitial lung disease during cytotoxic chemotherapy. Thorac Cancer. 13 (17), 2443-2449 (2022).
  31. Glaviano, A., et al. PI3K/AKT/mTOR signaling transduction pathway and targeted therapies in cancer. Mol Cancer. 22 (1), 138(2023).
  32. Ediriweera, M. K., Tennekoon, K. H., Samarakoon, S. R. Role of the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in ovarian cancer: Biological and therapeutic significance. Semin Cancer Biol. 59, 147-160 (2019).
  33. Hoxhaj, G., Manning, B. D. The PI3K-AKT network at the interface of oncogenic signalling and cancer metabolism. Nat Rev Cancer. 20 (2), 74-88 (2020).
  34. Liu, R., et al. PI3K/AKT pathway as a key link modulates the multidrug resistance of cancers. Cell Death Dis. 11 (9), 797(2020).
  35. Manogaran, P., Beeraka, N. M., Paulraj, R. S., Sathiyachandran, P., Thammaiappa, M. Impediment of cancer by dietary plant-derived alkaloids through oxidative stress: Implications of PI3K/AKT pathway in apoptosis, autophagy, and ferroptosis. Curr Top Med Chem. 23 (10), 860-877 (2023).
  36. Acosta-Martinez, M., Cabail, M. Z. The PI3K/AKT pathway in meta-inflammation. Int J Mol Sci. 23 (23), 15330(2022).
  37. Chen, G. Y., et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 5233462(2021).
  38. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of Rhizoma Drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κβ and PI3K/AKT pathways. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 6634837(2021).
  39. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of Rhizoma Drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Des Devel Ther. 16, 1743-1766 (2022).
  40. Yao, C., Narumiya, S. Prostaglandin-cytokine crosstalk in chronic inflammation. Br J Pharmacol. 176 (3), 337-354 (2019).
  41. Liu, P., et al. NOD-like receptor signaling in inflammation-associated cancers: From functions to targeted therapies. Phytomedicine. 64, 152925(2019).
  42. Damasceno, L. E. A., et al. PKM2 promotes Th17 cell differentiation and autoimmune inflammation by fine-tuning stat3 activation. J Exp Med. 217 (10), e20190613(2020).
  43. Banerjee, S., Biehl, A., Gadina, M., Hasni, S., Schwartz, D. M. JAK-STAT signaling as a target for inflammatory and autoimmune diseases: Current and future prospects. Drugs. 77 (5), 521-546 (2017).
  44. Jiramongkol, Y., Lam, E. W. FOXO transcription factor family in cancer and metastasis. Cancer Metastasis Rev. 39 (3), 681-709 (2020).
  45. Tong, X., et al. Targeting cell death pathways for cancer therapy: Recent developments in necroptosis, pyroptosis, ferroptosis, and cuproptosis research. J Hematol Oncol. 15 (1), 174(2022).
  46. Ou, H. L., et al. Cellular senescence in cancer: From mechanisms to detection. Mol Oncol. 15 (10), 2634-2671 (2021).
  47. Felten, R., et al. Interleukin 6 receptor inhibition in primary Sjogren syndrome: A multicentre double-blind randomised placebo-controlled trial. Ann Rheum Dis. 80 (3), 329-338 (2021).
  48. Bardsen, K., et al. Interleukin-1-related activity and hypocretin-1 in cerebrospinal fluid contribute to fatigue in primary Sjogren's syndrome. J Neuroinflammation. 16 (1), 102(2019).
  49. Barrera, M. J., et al. Tofacitinib counteracts il-6 overexpression induced by deficient autophagy: Implications in Sjogren's syndrome. Rheumatology (Oxford). 60 (4), 1951-1962 (2021).
  50. Liu, H., Zhou, Q., Xu, X., Du, Y., Wu, J. ASPM and TROAP gene expression as potential malignant tumor markers. Ann Transl Med. 10 (10), 586(2022).
  51. Qian, X., et al. CCNB2 overexpression is a poor prognostic biomarker in Chinese NSCLC patients. Biomed Pharmacother. 74, 222-227 (2015).
  52. Mo, M. L., et al. Use of serum circulating CCNB2 in cancer surveillance. Int J Biol Markers. 25 (4), 236-242 (2010).
  53. Li, L., et al. NuSAP is degraded by APC/C-Cdh1 and its overexpression results in mitotic arrest dependent of its microtubules' affinity. Cell Signal. 19 (10), 2046-2055 (2007).
  54. Fabbro, M., et al. Cdk1/Erk2- and Plk1-dependent phosphorylation of a centrosome protein, cep55, is required for its recruitment to midbody and cytokinesis. Dev Cell. 9 (4), 477-488 (2005).
  55. Jeffery, J., Sinha, D., Srihari, S., Kalimutho, M., Khanna, K. K. Beyond cytokinesis: The emerging roles of CEP55 in tumorigenesis. Oncogene. 35 (6), 683-690 (2016).
  56. Feng, Z., et al. Overexpression of abnormal spindle-like microcephaly-associated (ASPM) increases tumor aggressiveness and predicts poor outcome in patients with lung adenocarcinoma. Transl Cancer Res. 10 (2), 983-997 (2021).
  57. Zheng, H., et al. Comprehensive pan-cancer analysis reveals NuSAP1 is a novel predictive biomarker for prognosis and immunotherapy response. Int J Biol Sci. 19 (14), 4689-4708 (2023).
  58. Verstappen, G. M., Pringle, S., Bootsma, H., Kroese, F. G. M. Epithelial-immune cell interplay in primary sjogren syndrome salivary gland pathogenesis. Nat Rev Rheumatol. 17 (6), 333-348 (2021).
  59. El Rayes, T., et al. Lung inflammation promotes metastasis through neutrophil protease-mediated degradation of Tsp-1. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (52), 16000-16005 (2015).
  60. Zhao, L., et al. PM2.5 and serum metabolome and insulin resistance, potential mediation by the gut microbiome: A population-based panel study of older adults in china. Environ Health Perspect. 130 (2), 27007(2022).
  61. Li, J., et al. PM2.5 exposure perturbs lung microbiome and its metabolic profile in mice. Sci Total Environ. 721, 137432(2020).
  62. Liao, J. H., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of artemisinin in treating primary sjogren's syndrome. BMC Immunol. 25 (1), 16(2024).
  63. Hu, Q., et al. JAK/STAT pathway: Extracellular signals, diseases, immunity, and therapeutic regimens. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1110765(2023).
  64. Xue, C., et al. Evolving cognition of the JAK-STAT signaling pathway: Autoimmune disorders and cancer. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 204(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Differentieel tot expressie gekomen genenKEGG-verrijkingGO-verrijkingproteïne-proteïne-interactieJAK2-STAT3-signaleringsrouteinflammatoire cytokinendiermodel
Primair syndroom van Sjögren geassocieerd met longadenocarcinoom: onderzoek naar de mogelijke gemeenschappelijke pathogene mechanismen en experimentele verificatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.