Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gebruik van optische pincetten voor het genereren van hybride sferoïden

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67422

⸱

30 mei 2025

 ,  , 
1Department of Clinical and Experimental Pathology, Institute of General and Experimental Pathology, Wrocław Medical University, 2Department of Optics and Photonics, Faculty of Fundamental Problems of Technology, Wrocław University of Science and Technology

In dit artikel

Samenvatting

In dit artikel stellen we een protocol voor voor de productie van hybride sferoïden met behulp van een optisch pincet. Deze methode maakt een nauwkeurige controle van de vroege stadia van het sferoïde-vormingsproces mogelijk, wat met andere methoden onbereikbaar is.

Samenvatting

Tweedimensionale (2D) celcultuur is nog steeds een van de meest gebruikte modellen in preklinisch kankeronderzoek. De driedimensionale (3D) in-vitromodellen lijken de in vivo-omgeving echter nauwkeuriger te beoordelen, inclusief een relevantere architecturale morfologie, micro-omgeving en reacties op medicijnen.

Optische vangst maakt gebruik van een of meer gefocusseerde laserstralen om op niet-invasieve wijze de positie, beweging, interactie en dynamiek van structuren op nano- en microschaal te manipuleren. Optische pincetten (OT) hebben tal van toepassingen gevonden in de celbiologie; Hun potentieel in kankeronderzoek wordt echter nog steeds ondergewaardeerd. In dit artikel bevelen we een niet-invasief protocol aan voor de vorming van lymfoom-stromale celsferoïden met behulp van een optisch pincet. Deze methode construeert niet alleen de hybride sferoïden de novo , maar maakt het ook mogelijk om het aantal aangehechte cellen en de tijd van adhesievorming te beheersen, wat een belangrijke bron van informatie is voor weefselmanipulatie. Bovendien maakt OT het mogelijk om de vroege stadia van hybride sferoïde vorming te bestuderen, wat niet kan worden bereikt met standaard bulktechnieken. Belangrijk is dat het beschreven model kan worden gebruikt om de minimale veranderingen in adhesie te bestuderen die worden veroorzaakt door geneesmiddelen tegen kanker. Dit protocol kan eenvoudig worden toegepast op andere celtypen.

Inleiding

Driedimensionale (3D) cellulaire modellen versnellen het kankeronderzoek omdat ze in verschillende functionele en structurele eigenschappen beter op tumorweefsel lijken. Deze omvatten onder andere de productie van extracellulaire matrixen, interactie tussen cellen, het handhaven van nutriënten- en zuurstofgradiënten en soortgelijke reacties op de behandelingen 1,2,3,4. Om de in vivo omstandigheden beter weer te geven, zijn onlangs geavanceerde heterogene 3D-modellen ontwikkeld waarbij verschillende celtypen betrokken zijn 5,6,7.

B-cel non-Hodgkin lymfoom (B-NHL) is een heterogene groep maligniteiten afkomstig van B-lymfocyten, integrale componenten van het immuunsysteem8. Gekenmerkt door een breed scala aan klinische presentaties en histologische kenmerken, omvat B-NHL een spectrum van aandoeningen, variërend van indolente vormen met een langdurig klinisch beloop tot agressieve varianten die snel vorderen 9,10. De pathogenese van B-NHL en andere hematologische maligniteiten is vaak gekoppeld aan de impact van de micro-omgeving van de tumor11,12. Lymfoomcellen verspreiden zich bijvoorbeeld vaak naar het beenmerg, wat mogelijk kan leiden tot levensbedreigende complicaties13. Van mesenchymale stromale cellen (MSC's), de belangrijkste componenten van de beenmergniche, is erkend dat ze de groei en progressie van tumoren beïnvloeden14, grotendeels door directe cel-celinteracties 15,16,17; Er is dus een dringende behoefte aan het ontwikkelen van modellen die het mogelijk maken om dergelijke wisselwerkingen te bestuderen. We hebben eerder vastgesteld dat MSC's, wanneer ze worden gekweekt op agarose-hydrogels met lymfoomcellen, zichzelf aggregeren tot meercellige sferoïden, waarbij stromale cellen de kern vormen en uniform worden omringd door lymfoomcellen18. In dit artikel presenteren we een protocol voor de fabricage van een hybride lymfoom-stromale cellen 3D-model met behulp van een optisch pincet.

Meer dan 35 jaar geleden rapporteerde Ashkin voor het eerst het fenomeen van niet-invasieve optische vangst van virussen en bacteriën door gefocusseerde laserstraal19. Tegenwoordig hebben optische pincetten (OT) een dynamisch toenemende impact op biomedisch gebied, inclusief celbiologisch onderzoek 20,21,22,23. OT maakte het mogelijk om niet alleen de fysisch-mechanische eigenschappen van individuele cellen te bestuderen 24,25,26, maar ook de directe cel-celinteracties op het niveau van een enkele cel, en verdere 2D en 3D cellulaire rangschikking en structurering 27,28,29. De optische vangtechniek is gebaseerd op de optische krachten in de orde van enkele piconewtons die worden uitgeoefend als elektromagnetische straling (fotonen), die zijn momentum verandert wanneer het in wisselwerking staat met materie30. Als gevolg hiervan kunnen operators door het gebruik van een of meer laserstralen selectief posities, beweging en dynamiek van objecten manipuleren op micro- en nanoschaal20. In de praktijk maakt de optische vangtechniek het mogelijk om levende cellen selectief en niet-destructief te vangen, ze in contact te brengen met het oppervlak van een andere cel of molecuul en het adhesieproces op gang te brengen31. Aan de hand van bovenstaande functionaliteiten hebben we eerst geprobeerd om een enkele lymfoomcel optisch op een monolaag van stromale cellen te plaatsen om de adhesieve eigenschappen ervan te onderzoeken. Vervolgens gingen we verder met het beoordelen van het vermogen van een optisch pincet om een meercellige sferoïde fysiek na te bootsen in real-time modus33. Om dit te bereiken, werden individuele lymfoomcellen één voor één gevangen en bevestigd aan een eerder geprepareerde 3D-stromale sferoïde. Een andere toepasbaarheid van optische trapping was het meten van de minimale hechtingstijd tussen cellen en het beoordelen van de minieme veranderingen in hechting als gevolg van de antikankerbehandeling34,35. Hoewel 3D-modellen veel worden gebruikt in kankeronderzoek, blijft het bestuderen van de vroege stadia van sferoïdevorming een uitdaging. Dit is voornamelijk te wijten aan de beperkte beschikbaarheid van methoden waarmee de microwereld met hoge precisie en tegelijkertijd een minimaal invasieve impact kan worden aangeraakt. Omgekeerd moet het volledige potentieel van OT nog worden bereikt binnen het bereik van cellulaire rangschikking en structuur in 3D. Daarom wordt in dit artikel stap voor stap een gecombineerde workflow beschreven om 3D-lymfoomconstructie te genereren met behulp van standaard 3D-technieken en manipulaties in optische pincetten. Belangrijk is dat het protocol gemakkelijk kan worden aangepast voor gebruik met andere celtypen die van belang zijn bij hematopathologische maligniteiten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Fabricage van micromallen op basis van agarosegel

OPMERKING: De juiste aseptische technieken zijn essentieel bij het hanteren van alle celculturen. Alle reagentia die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel. Bereid drie gels met MSC's voor een enkel experiment, zoals weergegeven in figuur 1A.

figure-protocol-1
Figuur 1: Preparaat van mesenchymale stromale cel (MSC) sferoïden. (A) Illustratie van de stap voor het bereiden van de agarose-micromallen. (B) Zaaien van mesenchymale stromale cellen (MSC's) en kweken van mesenchymale sferoïden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Begin met het voorbereiden van de agarose-micromallen. Spoel de micromold 3D petrischaal (zie materiaaltabel) af met gedeïoniseerd water (3x) en plaats deze 30 minuten onder de UV-lamp om de sterilisatie uit te voeren.
  2. Bereid eerst een 2% agarose-oplossing voor. Meet 1 g puur steriel agarosepoeder van hoge kwaliteit af (zie materiaaltabel) en doe het in een steriele conische tube van 50 ml. Voeg 50 ml steriele 0,9% natriumchloride-oplossing (zie materiaaltabel) toe aan de agarose en meng goed. Schroef het deksel van de conische buis vast totdat deze goed vastzit maar nog los zit.
  3. Gebruik de magnetron om het agarosepoeder aan de kook te brengen en volledig op te lossen. Stop elke 10 s met de magnetron en draai de conische buis voorzichtig rond om ervoor te zorgen dat de agarose oplost. Vermijd het ontstaan van luchtbellen tijdens het mengen of pipetteren van agarose. Koel agarose af tot ongeveer 70 °C.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat er geen resten van doorschijnend onopgelost poeder zijn.
    LET OP: Gesmolten agarose is extreem heet en kan ernstige brandwonden veroorzaken.
  4. Werk in de laminaire flowkast met behulp van aseptische technieken. Bereid hydrogels voor door eerder gesteriliseerde micromallen te vullen met 500 μL agarose. Zuig eventuele luchtbellen op die vastzitten in de kleine kenmerken van de microvorm met behulp van een pipet.
  5. Na 15 minuten incubatie bij kamertemperatuur, wanneer de agarose is gestold, verwijdert u de gels voorzichtig uit de micromallen op een steriele plaat met 6 putjes. Beschadig de gelstructuur niet. Voordat u doorgaat naar de volgende stap, controleert u onder een microscoop of de micromallen correct zijn voorbereid en zorgt u ervoor dat de randen intact zijn. Controleer of er openingen zijn waardoor het medium kan lekken.
  6. Voeg voldoende 1x fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) toe om de micromallen volledig te bedekken voordat u de plaat 30 minuten onder een UV-lamp plaatst voor sterilisatie.
    OPMERKING: De agarose micromallen kunnen voor gebruik maximaal 2 weken worden bewaard in een conische buis afgedekt met 1x PBS onder koelkastomstandigheden (4 °C).
  7. Voordat u de micromallen gebruikt om sferoïden te produceren, moet u de gel in evenwicht brengen door deze volledig te bedekken met RPMI-medium (4,0 ml/putje voor een plaat met 6 putjes) en minimaal 15 minuten te incuberen.

2. Preparaat van mesenchymale stromale cellen (MSC's) sferoïden

  1. Kweek de HS-5-cellijn (zie materiaaltabel), een menselijke mesenchymale stromale cellijn, in RPMI 1640 kweekmedium aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (zie materiaaltabel) in standaardtoestand, waarbij het medium elke 48 uur wordt vervangen.
  2. Wanneer de HS-5-cellen voor ongeveer 90% samenvloeien, voert u de celpassage als volgt uit:
    1. Verwijder de kweekmedia met behulp van een serologische pipet.
    2. Was cellen door 1x PBS toe te voegen en te wervelen en aan te zuigen om eventuele resterende media te verwijderen.
    3. Maak de cellen los van de bodem van de kweekkolf door 2 ml trypsine-EDTA-oplossing (zie materiaaltabel) aan de celkweekkolf toe te voegen en bij 37 °C te incuberen om de celloslating te vergemakkelijken.
    4. Stop de trypsinisatie door 2 ml volledig kweekmedium toe te voegen.
    5. Gebruik een pipet van 5 ml om de cellen voorzichtig op te schorten en breng ze over in een conische buis van 15 ml.
    6. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 7 min. Verwijder het bovenstaande en suspendeer de cellen in 1 ml vers kweekmedium.
    7. Neem 10 μL van de celpellet en breng deze over in een tube van 0,5 ml. Voeg vervolgens 10 μL 0,4% Trypan blauwoplossing toe (zie Materiaaltabel) en tel de cellen in een automatische cellenteller (zie Materiaaltabel).
    8. Verdun de cellen op basis van de hierboven verkregen celdichtheid tot 2 x 105 cellen/ml medium.
  3. Verwijder het celkweekmedium uit de agarose-microvorm.
  4. Zaai voorzichtig 190 μL van de hierboven genoemde celsuspensie (stap 2.2.8) in de celzaaikamer van de agarose-microschimmel. Een enkel putje bevat ongeveer 150 cellen (38.000 cellen/gel).
  5. Incubeer de cellen in agarosemicromold in een incubator (5% CO2, 37 °C, vochtige atmosfeer) gedurende 30 minuten totdat de cellen zich op de bodem van de gel nestelen. Verwijder na 30 minuten de plaat met microschimmel uit de broedmachine en voeg langzaam een extra medium toe aan de buitenkant van de gels en bedek ze volledig (bijv. 4,0 ml/putje voor de plaat met 6 putjes).
    OPMERKING: Voeg het medium niet rechtstreeks toe aan de gel-agarose-microschimmel, maar aan de kweekschaal, om beschadiging van de vers gevormde sferoïden te voorkomen.
  6. Plaats de gel in een broedmachine bij 37 °C in een vochtige atmosfeer van 5% CO2 gedurende 72 uur tot uniforme sferoïden zijn gevormd. (Figuur 1B).
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de sferoïde vorming de volgende 3 dagen onder een omgekeerde microscoop te observeren. Over het algemeen beginnen mesenchymale stromale cellen binnen 24 uur sferoïden te vormen, maar dit proces kan sneller of langzamer verlopen met verschillende celpassages en dichtheden. Na 72 uur incubatie op agarose-microschimmel vormen mesenchymale stromale cellen relatief uniforme sferoïden; Het is echter vermeldenswaard dat ze in grootte en vorm kunnen variëren, ondanks dat ze onder identieke omstandigheden zijn uitgebroed. Het medium moet worden vervangen wanneer het verandert van een paars-rode kleur naar geel.

3. Kweken van lymfoomcellen en voorbereiding op optische vangst

OPMERKING: Hematologische cellijnen, inclusief lymfoomcellen, groeien vrij zwevend in de kweekmedia in kolven die zijn ontworpen voor suspensiecultuur zonder enige bevestiging aan de kweekplaat of het vat. Om optimale celeigenschappen te behouden, wordt aanbevolen om niet eerder dan 30 minuten voor de procedure van het samenstellen van de hybride sferoïden met het optische pincet te beginnen met de voorbereiding van het monster. Belangrijk is dat het protocol dat in deze sectie wordt beschreven, betrekking heeft op de Ri-1 menselijke lymfoomcellijn, maar een soortgelijk protocol is van toepassing op andere hematologische kankercellijnen.

  1. Kweek de Ri-1-lymfoomcellijn (zie materiaaltabel) in RPMI 1640-medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine.
  2. Bewaar de lymfoomcellen in de broedmachine onder standaard kweekomstandigheden, waaronder 37 °C en bevochtigde lucht met 5% CO2 . Houd culturen tussen 3-5 x 105 cellen/ml in de logaritmische fase door elke 2-3 dagen te passeren.
  3. Verzamel de cellen en breng de suspensie over in een polystyreenbuis van 15 ml. Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur om een celpellet te verkrijgen. Verwijder het bovenstaande middel en voeg 10 ml vers medium toe, pipetteer voorzichtig tot een homogene suspensie is verkregen.
  4. Zuig 10 μL celsuspensie op in een nieuwe centrifugebuis en voeg 10 μL Trypan blauw toe. Pipetteer de suspensie ruim voordat u 10 μl in de telkamer overbrengt om de celdichtheid en levensvatbaarheid te bepalen (doorgaans hoger dan 95%).
  5. Verdun de celsuspensie om een uiteindelijke dichtheid van 1 x 104 cellen/ml te bereiken. Houd lymfoomcellen op 37 °C tot optische manipulaties.

4. Het optische pincetsysteem instellen

OPMERKING: Het onderstaande protocol is speciaal ontwikkeld voor het op maat gemaakte optische pincet36 (Afbeelding 2A). Deze test kan echter worden gebruikt met andere in de handel verkrijgbare vangsystemen. Ongeacht het type apparatuur dat beschikbaar is, blijven de basisstappen voor de voorbereiding van het systeem (bijv. het starten van de laser- en computersoftware, het monteren van het monster en het testen van de mogelijkheid om de cel in een optische val te verplaatsen) hetzelfde. Alle experimenten werden uitgevoerd bij kamertemperatuur, d.w.z. 25 °C.

figure-protocol-2
Figuur 2: Een schema dat het werkingsmechanisme van hybride sferoïde generatie door optische pincetten illustreert. (A) Op maat ontworpen optische pincetten. (B) Het proces van het hechten van individuele lymfoomcellen aan het oppervlak van MSC's sferoïde. Een enkele lymfoomcel werd optisch gevangen en vastgemaakt aan het oppervlak van een stromale sferoïde totdat een stabiele verbinding werd gevormd. Dit proces ging door totdat het hele oppervlak van de stromale sferoïde bedekt was met lymfoomcellen. (C) Een representatief beeld van immunohistochemische kleuring van de hybride sferoïde sectie werd verkregen met behulp van een monoklonaal anti-CD20-antilichaam van de muis tegen CD20. De immunokleuring werd uitgevoerd met behulp van een monoklonaal anti-humaan antilichaam van muizen tegen CD20 op een autokleurer (zie materiaaltabel), volgens de instructies van de fabrikant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Zet de lichtbron van de microscoop aan.
  2. Draag een laserveilig beschermglas.
  3. Zet de laser aan en stel het vermogen in om een trapstijfheid van ongeveer 50 pN/μm in het optische pincetsysteem te verkrijgen. Wacht 10 minuten voordat u verder gaat, zodat de laserstraal kan stabiliseren.
    OPMERKING: In het op maat gemaakte systeem wordt gegeven valstijfheid bereikt voor het laservermogen van 100 mW bij de ingang van het microscoopobjectief, gemeten voor 3 μm polystyreenparel. De minimale invasiviteit op lymfoomcellen werd eerder bevestigd32,33, terwijl het vermogen om levende cellen te manipuleren behouden bleef.
  4. Start in de tussentijd de computersoftware op. In het softwarevenster verschijnt een afbeelding van het microscoopmonster. Gebruik de markeringen die zichtbaar zijn op het scherm om de optische val in de gewenste richting te bewegen.
  5. Zodra het systeem klaar is, voegt u 30 μL gedeïoniseerd water toe aan het midden van het onderste objectief.
    OPMERKING: Het op maat gemaakte systeem maakt gebruik van een wateronderdompelingsobjectief; De onderdompelingsmedia kunnen echter verschillen, afhankelijk van de opstelling van de gebruiker.
  6. Plaats een celkweekschaaltje van 35 mm (zie materiaaltabel) met een glazen bodem op de microscooptafel. Stabiliseer de schaal met de houders.
  7. Breng het objectief omhoog met behulp van de micrometrische microscoopschroef totdat de waterdruppel de glazen bodem van de schaal raakt.
  8. Pas met behulp van de micrometerschroef de microscopische tafel voorzichtig aan totdat men de laserstraal scherp gefocusseerd ziet op een enkel, helder punt op het scherm. Een afbeelding van het microscoopmonster zal aanwezig zijn in het softwarevenster. Gebruik de markeringen die zichtbaar zijn op het scherm om de optische val in elke gewenste richting te bewegen.
  9. Voeg 100 μl eerder bereide lymfoomcelsuspensie (zie punt 3.5) toe aan het midden van de schaal met glazen bodem. Laat ze ongeveer 5 minuten naar de bodem van de schaal zinken.
  10. Gebruik de bewegingen van de microscoopfase om een zwevende lymfoomcel te vinden. Laat de optische val het monster raken door op de trapcursor op het scherm te klikken. Probeer de cel naar de gewenste locatie te verplaatsen. Om bruikbaar te zijn voor manipulatie moet een cel gemakkelijk in de gegeven richting kunnen bewegen.
    OPMERKING: Volgens onze observatie zal tussen de 5 en 10% van de lymfoomcellen die aan de glazen schaal worden toegevoegd, zich na de incubatietijd permanent aan de bodem hechten. Dit percentage zal toenemen met de duur van de manipulatie en kan na 60 minuten 30% bereiken. Ondanks deze verliezen zal het aantal cellen dat aanvankelijk aan de schaal wordt toegevoegd, zowel een effectieve systeemkalibratie als de dekking van de sferoïde met lymfoomcellen mogelijk maken.

5. Generatie van hybride sferoïden met behulp van een optisch pincet

  1. Verwijder voorzichtig een enkele stromale sferoïde uit een putje van de agarosevorm met een pipetpunt (100-1000 μL) en plaats deze op een 35 mm microscopie glazen bodemschaal.
  2. Voeg 2 ml RPMI-kweekmedium toe en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C onder standaardomstandigheden. Gedurende deze tijd zal de sferoïde voorzichtig aan het glas blijven plakken, wat beweging tijdens manipulatie voorkomt.
  3. Plaats de schaal met de sferoïde op de microscooptafel en stabiliseer de schaal op de microscopische tafel met de houders.
  4. Voeg voorzichtig 100 μl lymfoomceloplossing toe met een uiteindelijke dichtheid van 1 x 104 cellen/ml (stap 3.5). Laat ze ongeveer 5 minuten naar de bodem van de schaal zinken.
  5. Gebruik de bewegingen van het microscoopstadium om een zwevende lymfoomcel te vinden. Laat de optische val de geselecteerde cel raken door op de overvulcursor op het scherm te klikken. Zodra de cel vastzit en beweegbaar is, verplaatst u de microscooptafel om de cel in contact te brengen met het stromale bolvormige oppervlak.
  6. Begin met het bevestigen van de lymfoomcel aan het oppervlak van de stromale sferoïde gedurende 10 s. Controleer vervolgens of de cel permanent is bevestigd met drie herhaalde pogingen om de lymfoomcel los te maken met behulp van het optische pincet.
  7. Als het cellulaire contact is verbroken, bevestigt u de lymfoomcel nogmaals aan het sferoïde oppervlak met behulp van de optische val; Echter, deze keer voor een langere periode, ongeveer 20 seconden.
    OPMERKING: Het is essentieel om specifieke tijdsintervallen voor het overvullen van één cel voor elke cellijn afzonderlijk te bepalen. In voorlopige manipulaties werd vastgesteld dat lymfoomcellen van de Ri-1-cellijn een sterke hechtende eigenschap vertonen aan stromale sferoïden, die zich voornamelijk in 10-20 s aan het oppervlak hechten. De specifieke contacttijdsintervallen voor het vangen van enkele Ri-1-cellen waren dus 10, 20 en 30 s. Vanwege het tijdrovende karakter van de procedure, wordt aanbevolen om cellijnen te gebruiken met een minimale hechtingstijd van niet langer dan 30 s voor sferoïdevorming met een optisch pincet.
  8. Herhaal de procedure met opeenvolgende lymfoomcellen totdat het hele oppervlak van de stromale sferoïde bedekt is met lymfoomcellen.
  9. Om het beschikbare oppervlak van de stromale sferoïde gelijkmatig te bedekken met lymfoomcellen, is het noodzakelijk om de positie van de optische val in het volume van het microscopische monster te veranderen. Door het beeldvormingsvlak te veranderen met behulp van de micrometrische microscoopschroef, kan men de positie van de optische val veranderen, waardoor een diepere beweging van de gevangen objecten in het monster mogelijk wordt.
  10. Om de spontaan gevormde sferoïde beter weer te geven, bedek je de kern van stromale cellen met 2-3 lagen lymfoomcellen.
  11. Breng de schaal met glazen bodem met de sferoïde onder standaardomstandigheden over naar een incubator gedurende 1 uur incubatie.
    OPMERKING: Hybride sferoïde kan langdurig worden gekweekt in 20 μL RPMI-medium in een hangende druppel.

6. Bepaling van de levensvatbaarheid van sferoïden

  1. Beoordeel de levensvatbaarheid van celsferoïde met behulp van een levende/dode kleuringskit (zie materiaaltabel). Verwijder voorzichtig het kweekmedium en was de sferoïde direct met 100 μL 1x PBS.
  2. Incubeer de sferoïde in 100 μl 1x PBS-oplossing met 1 μM calceïne-AM en 2 μM ethidiumhomodimeer-1 gedurende 20 minuten bij 37 °C.
  3. Observeer de sferoïden met een fluorescentiemicroscoop (zie Materiaaltabel) en leg de beelden vast (zie Materiaaltabel).
    OPMERKING: Het is niet nodig om de sferoïde na de kleuring te wassen. Achtergrondfluorescentieniveaus zijn inherent laag bij deze test omdat de kleurstoffen vrijwel niet-fluorescerend zijn voordat ze in wisselwerking staan met cellen.
  4. Met behulp van het ImageJ-programma (zie Materiaaltabel) kunt u de levensvatbaarheid van sferoïden bepalen door de verhouding te berekenen tussen het groen gekleurde gebied (levende cellen) en het totale gebied dat rood (dode cellen) en groen is gekleurd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Onze eerdere resultaten toonden aan dat mesenchymale stromale cellen gekweekt met lymfoomcellen de homogene stromale kern vormen waaraan kankercellen zich uniform hechten18. In deze studie hebben we met succes de menselijke hybride sferoïde bestaande uit mesenchymale stromale cellen en lymfoomcellen ontwikkeld met behulp van op maat gemaakte optische pincetten. Figuur 2B toont een representatieve sferoïde in een helderveldmicroscoop, ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In deze studie werden de hybride sferoïden van mesenchymale stromale kern- en lymfoomcellen in realtime ontwikkeld met behulp van een optisch pincet. Nieuwe op laser gebaseerde technologieën, waaronder vangsystemen, zijn nu in de handel verkrijgbaar en worden steeds populairder. Tot op heden zijn de meeste optische pincetten echter nog steeds op maat gemaakte instrumenten; Kalibratie, bedieningsprocedures en experimentele geometrieën kunnen dus variëren tussen laboratoria

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Auteurs oprechte dankbaarheid Nicholas Czarnik, wiens zorgvuldige redactie de duidelijkheid van de studie aanzienlijk verbeterde.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
µ-Dish 35 mm, hoog glazen onderstelIBIDI81158
12-256 mico-mold 3D PetriDish Microtissues Inc., RI, USA12-256TR
3 µm polystyreen microsfeerPolysciences17134-15
anti CD20 antilichaam (clone L26)DakoIS604
Automatische celteller, EVENanoEntekEVE/ EVE-MC
Autostainer Link 48DakoD09634
Camera OlympusU-TV0.63XC
CelCulture CO2 IncubatorEsco Technologies, Inc.CCL
Celtellingsslides, EVENanoEntekNE-EVS
Cellijn HS-5ATCCCRL-3611
Cellijn Ri-1 DSMZ ACC 585
Fetaal bovien serumGibcoA5256701
Fluorescentiemicroscoop OlympusBX43
ImageJ programmaNational Institutes of Health, MD, USA
Omgekeerd microscoopOlympusIX73
Live/Dead reagenskit Thermo Fisher ScientificL3224
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)Gibco15140122
Fosfaatbuffer oplossing, pH 7,4Gibco10010023
RPMI 1640 MediumGibco11875093
Natriumchloride oplossingSigma-Aldrich7647-14-5
Natriumchloride oplossing 0,9 %, sterielITW ReITW Reagents, S.R.L.agents, S.R.L.A1671
Trypanblauw oplossing, 0,4%Gibco15250061
TrypLE Express enzym (1X), zonder fenol roodGibco12604013
Trypsine-EDTA (0,05%), fenol roodGibco25300096
UltraPure AgaroseInvitrogen16500500
Optische pincet setup
Dichroische spiegelsThorlabsDMSP805R
Digitale cameraMikrotron GmbHMC1362
Galvano-spiegel XY scansysteemThorlabsGVS002
Omgekeerd microscoop OlympusIX71
Lens 1ThorlabsAC254-050-B-ML
Lens 2ThorlabsAC508-200-B-ML
Nd:YAG 1064 nm laserLaser QuantumVentus

Referenties

  1. Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744(2020).
  2. Fontoura, J. C., et al. Comparison of 2D and 3D cell culture models for cell growth, gene expression and drug resistance. Mater Sci Eng. C. 107, 110264(2020).
  3. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2018).
  4. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).
  5. Barbosa, M. A. G., Xavier, C. P. R., Pereira, R. F., Petrikaitė, V., Vasconcelos, M. H. 3D cell culture models as recapitulators of the tumor microenvironment for the screening of anti-cancer drugs. Cancers (Basel). 14 (1), 190(2021).
  6. Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 12, 155(2022).
  7. Pape, J., Emberton, M., Cheema, U. 3D cancer models: the need for a complex stroma, compartmentalization and stiffness. Front Bioeng Biotechnol. 9, 660502(2021).
  8. Singh, R., et al. Non-Hodgkin's lymphoma: A review. J Family Med Prim Care. 9 (4), 1834-1840 (2020).
  9. Campo, E., et al. The International consensus classification of mature lymphoid neoplasms: a report from the clinical advisory committee. Blood. 140 (11), Erratum in: Blood. 141 (4), 437 (2023). 1229-1253 (2022).
  10. Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
  11. Ng, W. L., Ansell, S. M., Mondello, P. Insights into the tumor microenvironment of B cell lymphoma. J Exp Clin Cancer Res. 41, 362(2022).
  12. Mancini, S. J. C., et al. Deciphering tumor niches: lessons from solid and hematological malignancies. Front Immunol. 12, 766275(2021).
  13. Zhang, Q. Y., Foucar, K. marrow involvement by Hodgkin and non-Hodgkin lymphomas. Hematol. Oncol Clin North Am. 23 (4), 873-902 (2009).
  14. Gao, Q., et al. marrow mesenchymal stromal cells: Identification, classification, and differentiation. Front Cell Dev Biol. 9, 787118(2022).
  15. Lwin, T., et al. Lymphoma cell adhesion-induced expression of B cell-activating factor of the TNF family in bone marrow stromal cells protects non-Hodgkin's B lymphoma cells from apoptosis. Leukemia. 23 (1), 170-177 (2009).
  16. Kumar, A., Bhattacharyya, J., Jaganathan, B. G. Adhesion to stromal cells mediates imatinib resistance in chronic myeloid leukemia through ERK and BMP signaling pathways. Sci Rep. 7 (1), 9535(2017).
  17. Cuiffo, B. G., Karnoub, A. E. Mesenchymal stem cells in tumor development: emerging roles and concepts. Cell Adh Migr. 6 (3), 220-230 (2012).
  18. Duś-Szachniewicz, K., Gdesz-Birula, K., Rymkiewicz, G. Development and characterization of 3D hybrid spheroids for the investigation of the crosstalk between B-Cell non-Hodgkin lymphomas and mesenchymal stromal cells. OncoTargets Ther. 15, 683-697 (2022).
  19. Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
  20. Spyratou, E. Advanced biophotonics techniques: The role of optical tweezers for cells and molecules manipulation associated with cancer. Front Phys. 10, 247-285 (2022).
  21. Choudhary, D., Mossa, A., Jadhav, M., Cecconi, C. Bio-molecular applications of recent developments in optical tweezers. Biomolecules. 9 (1), 23(2019).
  22. Nussenzveig, H. M. Cell membrane biophysics with optical tweezers. Eur Biophys J. 47 (5), 499-514 (2018).
  23. Zhang, X., Ma, L., Zhang, Y. High-resolution optical tweezers for single-molecule manipulation. Yale J Biol Med. 86 (3), 367-383 (2013).
  24. Li, X., et al. Optical tweezers study of membrane fluidity in small cell lung cancer cells. Opt Express. 29 (8), 11976-11986 (2021).
  25. Wullkopf, L., et al. Cancer cell's ability to mechanically adjust to extracellular matrix stiffness correlates with their invasive potential. Mol Biol Cell. 29, 2378-2385 (2018).
  26. Yousafzai, M. S., et al. Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation. J Biomed Opt. 21 (5), 57004(2016).
  27. Gupta, S. K., et al. Quantification of cell-matrix interaction in 3D using optical tweezers. Multi-Scale Extracellular Matrix Mechanics and Mechanobiology. Studies in Mechanobiology, Tissue Engineering and Biomaterials. Zhang, Y. , Springer. Berlin/Heidelberg, Germany. 283-310 (2020).
  28. Ma, Z., et al. Laser patterning for the study of MSC cardiogenic differentiation at the single-cell level. Light Sci Appl. 2, 68(2013).
  29. Kirkham, G. R., et al. Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers. Sci Rep. 5, 8577(2015).
  30. Pesce, G., et al. Optical tweezers: theory and practice. Eur Phys J Plus. 135, 949(2020).
  31. Avsievicha, T., Zhua, R., Popovb, A., Bykova, A., Meglinski, I. The advancement of blood cell research by optical tweezers. Rev Phys. 5, 100043(2020).
  32. Duś-Szachniewicz, K., et al. Physiological hypoxia (physioxia) impairs the early adhesion of single lymphoma cell to marrow stromal cell and extracellular matrix. Optical tweezers study. Int J Mol Sci. 19, 1880(2018).
  33. Duś-Szachniewicz, K., Gdesz-Birula, K., Nowosielska, E., Ziółkowski, P., Drobczyński, S. Formation of lymphoma hybrid spheroids and drug testing in real time with the use of fluorescence optical tweezers. Cells. 11 (13), 2113(2022).
  34. Hu, S., Gou, X., Han, H., Leung, A. Y., Sun, D. Manipulating cell adhesions with optical tweezers for study of cell-to-cell interactions. J Biomed Nanotechnol. 9 (2), 281-285 (2013).
  35. Johansen, P., Fenaroli, F., Evensen, L., Griffiths, G., Koster, G. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974(2016).
  36. Drobczyński, S., Duś-Szachniewicz, K. Real-time force measurement in double wavelength optical tweezers. J Opt Soc AmB. 34, 38-43 (2017).
  37. Pavlasova, G., Mraz, M. The regulation and function of CD20: an "enigma" of B-cell biology and targeted therapy. Haematologica. 105 (6), 1494-1506 (2020).
  38. Gieseler, J., et al. Optical tweezers- from calibration to applications: a tutorial. Adv Opt Mater. 13, 74-241 (2021).
  39. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nat Rev Methods Primers. 1, 25(2021).
  40. Mitrakas, A. G., et al. Applications and advances of multicellular tumor spheroids: Challenges in their development and analysis. Int J Mol Sci. 24 (8), 6949(2023).
  41. Malm, M., et al. Evolution from adherent to suspension: systems biology of HEK293 cell line development. Sci Rep. 10, 18996(2020).
  42. Ling, Y., et al. A cell-laden microfluidic hydrogel. Lab on a Chip. 7 (6), 756-762 (2007).
  43. Azizipour, N., Avazpour, R., Sawan, M., Ajji, A., Rosenzweig, H. Surface optimization and design adaptation toward spheroid formation on-chip. Sensors. 22 (9), 3191(2022).
  44. Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620(2019).
  45. Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell Int. 21, 152(2021).
  46. Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. Microgel assembly: Fabrication, characteristics, and application in tissue engineering and regenerative medicine. Bioact Mater. 9, 105-119 (2021).
  47. Volpe, G., et al. Roadmap for optical tweezers. J Phys Photonics. 5, 022501(2023).
  48. Pradhan, M., Pathak, S., Mathur, D., Ladiwala, U. Optically trapping tumor cells to assess differentiation and prognosis of cancers. Biomed Opt Express. 7, 943(2016).
  49. Duś-Szachniewicz, K., et al. Differentiation of single lymphoma primary cells and normal B-cells based on their adhesion to mesenchymal stromal cells in optical tweezers. Sci Rep. 9, 9885(2019).
  50. Gdesz-Birula, K., Drobczyński, S., Sarat, K., Duś-Szachniewicz, K. Sonidegib Inhibits the adhesion of acute myeloid leukemia to the bone marrow in hypoxia: An optical tweezer study. Biomedicines. 13, 578(2025).
  51. Matheson, A. B., et al. Optical tweezers with integrated multiplane microscopy (OpTIMuM): A new tool for 3D microrheology. Sci Rep. 11, 5614(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

3D-celkweeklymfoomcellenstromale sferoïdenoptisch vangenceladhesiefluorescentiemicroscopieagarose micro-malweefseltechnologie
Gebruik van optische pincetten voor het genereren van hybride sferoïden
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.