Methodenartikel

Massacytometrie-analyse van systemische en lokale immuunresponsen bij hepatocellulair carcinoom

DOI:

10.3791/67425

⸱

25 april 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, The First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst een uitgebreide massacytometrie (cytometrie door time-of-flight [CyTOF]) analysemethode voor het evalueren van zowel systemische als lokale immuunresponsen bij hepatocellulair carcinoom (HCC). De aanpak is bedoeld om inzicht te geven in het immuunlandschap van HCC en een beter begrip te bieden van de micro-omgeving van de tumor en de bijbehorende immuunmechanismen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatocellulair carcinoom (HCC) is wereldwijd een van de meest voorkomende en dodelijkste vormen van leverkanker. Ondanks de vooruitgang in de behandeling blijft de prognose voor HCC-patiënten slecht vanwege het complexe samenspel van genetische, omgevings- en immunologische factoren die de progressie ervan aansturen. Inzicht in het immuunlandschap van HCC is cruciaal voor het ontwikkelen van effectieve therapieën, met name op het gebied van immunotherapie, die grote beloften inhoudt voor het verbeteren van de patiëntresultaten. Deze studie maakt gebruik van massacytometrie (cytometrie door time-of-flight [CyTOF]) technologie om zowel systemische als lokale immuunresponsen bij patiënten met HCC te onderzoeken. Door perifere bloed- en tumormonsters te analyseren, heeft het onderzoek tot doel unieke immuuncelpopulaties en hun functionele toestanden geassocieerd met HCC-progressie te identificeren. De bevindingen geven een uitgebreid overzicht van het immuunlandschap in HCC, met de nadruk op mogelijke biomarkers en therapeutische doelen. Deze aanpak biedt waardevolle inzichten in de immuunmechanismen die aan de basis liggen van HCC en maakt de weg vrij voor de ontwikkeling van effectievere immunotherapieën voor deze maligniteit.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatocellulair carcinoom (HCC) is de meest voorkomende primaire leverkanker en een belangrijk wereldwijd gezondheidsprobleem vanwege de hoge incidentie en sterftecijfers1. Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie is HCC wereldwijd de vijfde meest voorkomende vorm van kanker en de op één na belangrijkste doodsoorzaak door kanker2. Het komt vooral voor in regio's met een hoog percentage chronische hepatitis B- en C-infecties, zoals Oost-Azië en Afrika bezuiden de Sahara3. Belangrijke risicofactoren zijn virale hepatitis, cirrose en metabool syndroom4. HCC vereist langdurige behandeling, die aanzienlijke fysieke en financiële lasten met zich meebrengt, wat de noodzaak van effectieve preventie, vroege opsporing en innovatieve behandelingsstrategieën onderstreept5.

Het immuunsysteem speelt een cruciale rol bij de ontwikkeling van HCC. De lever is een immunologisch actief orgaan met een overvloed aan immuuncellen, waaronder lever-residente macrofagen, natural killer (NK) -cellen en T-cellen, die essentieel zijn voor het monitoren en elimineren van abnormale cellen6. HCC kan echter immuunsurveillance omzeilen door immunosuppressieve moleculen tot expressie te brengen, immunosuppressieve cellen te rekruteren en de micro-omgeving van de tumor te veranderen 7,8. Deze immuunontsnapping bevordert niet alleen tumorgroei en metastase, maar beïnvloedt ook de respons op immunotherapie 9,10.

Systemische en lokale immuunresponsen in de micro-omgeving van de tumor zijn sleutelfactoren die de progressie van kanker en de therapeutische resultaten beïnvloeden. Systemische immuunresponsen omvatten circulerende immuuncellen die verre tumorcellen kunnen herkennen en aanvallen, zoals perifere T-cellen, NK-cellen en monocyten die zich door het hele lichaam op tumorcellen kunnen richten. Lokale immuunresponsen richten zich op de activiteit van immuuncellen in de micro-omgeving van de tumor, waaronder tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL's), tumor-geassocieerde macrofagen (TAM's) en regulerende T-cellen (Tregs). Hoewel TIL's vaak cytotoxische effecten hebben tegen tumorcellen, dragen TAM's en Tregs doorgaans bij aan een immunosuppressieve omgeving die tumorgroei ondersteunt11,12. Tumorcellen en stromale cellen kunnen de micro-omgeving van de tumor hervormen om immunosuppressie te bevorderen en immuunbewaking te omzeilen. De interactie tussen systemische en lokale immuunresponsen bepaalt de algehele effectiviteit van antitumorimmuniteit11. Inzicht in deze interactie kan helpen bij het ontwikkelen van effectievere immunotherapiestrategieën.

Traditionele flowcytometrie en immunohistochemie, hoewel veel gebruikt in immunologische studies, vertonen aanzienlijke beperkingen als het gaat om het analyseren van complexe immuunlandschappen vanwege hun onvermogen om uitgebreide, hoogdimensionale analyses uit te voeren. Flowcytometrie is zeer effectief voor het detecteren van oppervlakte- en functionele markers op eencellig niveau; De capaciteit voor gelijktijdige analyse van meerdere markers is echter beperkt, vaak beperkt door spectrale overlap en praktische beperkingen op het aantal fluorescerende tags dat kan worden gebruikt13,14. Immunohistochemie daarentegen biedt waardevolle inzichten in de weefselcontext van specifieke markers, maar wordt op dezelfde manier belemmerd door het beperkte aantal analyseerbare markers en de inherente moeilijkheden om robuuste, kwantitatieve, hoogdimensionale beoordelingen te bereiken15.

Om complexe immuunomgevingen effectief te karakteriseren, zijn hoogdimensionale technieken zoals massacytometrie (cytometrie door time-of-flight [CyTOF]) essentieel. Massacytometrie is een geavanceerde technologie die massaspectrometrie gebruikt om meerdere eiwitmarkers in afzonderlijke cellen te analyseren. Het maakt multiparametrische analyse van individuele cellen mogelijk zonder de spectrale overlappingsproblemen die worden gezien in traditionele flowcytometrie16. Door gebruik te maken van metaalgelabelde antilichamen kan het tientallen markers tegelijk meten, waardoor een uitgebreid en onbevooroordeeld beeld wordt geboden van cellulaire fenotypes en functies17. Gadalla et al. ontwikkelden bijvoorbeeld een CyTOF-panel met meer dan 40 parameters voor de analyse van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) en tumorweefsel, wat het voordeel ervan aantoont bij hoogdimensionale immunofenotypering18. Traditionele flowcytometrie, met zijn beperkte aantal detecteerbare parameters, was niet in staat om deze zeldzame celpopulaties met unieke fenotypes te identificeren. Daarentegen maakte massacytometrie een uitgebreide evaluatie van de functionele toestanden van deze cellen mogelijk, wat een meer gedetailleerde en robuuste karakterisering opleverde. Behbehani et al. gebruikte massacytometrie om beenmergmonsters van patiënten met myelodysplastische syndromen (MDS) te analyseren, waarbij zeldzame afwijkende hematopoëtische voorlopercellen met succes werden geïdentificeerd en gekarakteriseerd18. Het vermogen van massacytometrie om tegelijkertijd meer dan 40 oppervlakte- en intracellulaire markers te detecteren, verbeterde de detectie van deze laagfrequente celsubsets aanzienlijk19. Deze mogelijkheden overwinnen traditionele beperkingen en bieden diepere inzichten in immuunlandschappen, waardoor vooruitgang in immunologie en therapeutische ontwikkeling wordt gestimuleerd. Het vermogen om cellulaire fenotypes en functies op eencellig niveau uitgebreid te profileren, bevordert het begrip van immunologische processen aanzienlijk en helpt bij de ontwikkeling van gerichte therapieën.

Massacytometrie biedt uitgebreide inzichten in de systemische en lokale immuuncelpopulaties in HCC door tegelijkertijd meerdere eiwitmarkers te detecteren. Deze technologie kan onderscheid maken tussen verschillende soorten T-cellen in de micro-omgeving van de tumor, zoals effector-T-cellen, regulerende T-cellen (Tregs) en uitgeputte T-cellen, waardoor hun specifieke rol in tumorprogressie wordt opgehelderd. Door gebruik te maken van massacytometrie kunnen onderzoekers immuunmarkers identificeren die verband houden met HCC-prognose20. Subsets van T-cellen met een hoge expressie van Programmed Cell Death Protein 1 (PD-1) kunnen bijvoorbeeld dienen als voorspellers van de reactie van een patiënt op immuuncheckpointremmers21. Bovendien vergemakkelijkt het de ontdekking van nieuwe therapeutische doelen door specifieke immunosuppressieve moleculen te identificeren, waardoor een basis wordt gelegd voor gepersonaliseerde behandelingsstrategieën. Het vermogen van de technologie om meerdere markers te detecteren en de resolutie van één cel maken het bijzonder voordelig voor het ontdekken van nieuwe therapeutische doelen en het ontwerpen van combinatie-immunotherapieën. Deze geavanceerde aanpak heeft een aanzienlijk potentieel voor het verbeteren van de behandelingsresultaten bij HCC-patiënten door een gedetailleerd begrip van het immuunlandschap te bieden en de ontwikkeling van op maat gemaakte therapeutische interventies mogelijk te maken.

Deze studie heeft tot doel massacytometrie te gebruiken om de systemische en lokale immuuncelprofielen van patiënten met HCC te analyseren. De doelstellingen zijn het karakteriseren van de immuuncelpopulaties, het correleren van deze kenmerken met klinische resultaten en therapeutische responsen, en het identificeren van specifieke immuunmarkers en celsubsets die verband houden met de HCC-prognose. Door de rol van verschillende immuuncellen in behandelingsresponsen op te helderen, probeert deze studie een basis te leggen voor gepersonaliseerde behandelingsstrategieën. De bevindingen zullen naar verwachting bestaande immunotherapieën optimaliseren en waardevolle inzichten bieden voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingen, met als uiteindelijk doel de algehele overleving en kwaliteit van leven van HCC-patiënten te verbeteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De stappen voor het afnemen van bloed- en HCC-monsters, isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's), dissociatie van één cel en kleuring worden beschreven in het volgende plan. De experimentele reagentia en materialen staan allemaal vermeld in de Materialentabel. Alle experimenten werden uitgevoerd met de goedkeuring van de ethische commissie van het First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, om ervoor te zorgen dat het verzamelen van tumormonsters de pathologische diagnose niet verstoorde. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle menselijke proefpersonen.

1. Isolatie van PBMC's

  1. Neem een bloedmonster uit de ader van HCC-patiënten en gebruik een buisje gevuld met een antistollingsmiddel om te voorkomen dat het bloed stolt. Er werden bloedmonsters afgenomen van 4 patiënten (2 mannen en 2 vrouwen) in de leeftijd van 50-60 jaar, met een gemiddelde leeftijd van 55 jaar. Verzamel voor elke patiënt 10-20 ml perifeer bloed om voldoende volume te garanderen voor daaropvolgende PBMC's-isolatie en tegelijkertijd het ongemak voor de patiënt tot een minimum te beperken.
  2. Neem een bepaald volume bloed op (bijv. 6 ml) en voeg een gelijk volume perifere bloedlymfocytenscheidingsvloeistof (Ficol-paque of Lymphoprep) toe aan een centrifugebuis van 15 ml.
    OPMERKING: Het totale volume mag idealiter niet groter zijn dan 12 ml om ruimte te laten voor een goede menging en om overlopen te voorkomen; het maximaal aanbevolen volume voor een centrifugebuis van 15 ml is 14 ml.
  3. Kantel de centrifugebuis op 45° en voeg langzaam het bloed toe langs de wand van de buis, waarbij u het bloed voorzichtig langzaam op de scheidingsvloeistof voor perifere bloedlymfocyten legt om vermenging van de twee lagen te voorkomen.
    OPMERKING: Een pipet kan worden gebruikt om langzaam bloed toe te voegen langs de wand van de buis.
  4. Plaats de centrifugebuis in de centrifuge en stel de versnelling in op 8 en de vertraging op 3. Centrifugeren bij 450 x g, 4 °C, gedurende 30 min. Na centrifugatie worden in de reageerbuis 4 lagen gevormd, van boven naar beneden: plasmalaag, PBMCs-laag (witte membraanlaag), Ficol-Paque-laag en rode bloedcel- en granulocytlaag.
  5. Verzamel met behulp van een pipet voorzichtig de PBMC-laag in een nieuwe steriele centrifugebuis. Voeg 3 keer het volume PBS toe en centrifugeer 5 minuten bij 500 x g bij 4°C. Na het centrifugeren wordt op de bodem van de buis een pellet gevormd.
  6. Gooi het bovenstaande weg met behulp van een pipet, voeg 1 ml 2% foetaal runderserum-fosfaatgebufferde zoutoplossing (FBS-PBS) toe om de cellen te resuspenseren en voeg vervolgens 3 ml lysisbuffer van rode bloedcellen (RBC) toe. Centrifugeren bij 500 x g bij 4°C gedurende 5 min.
  7. Zorg ervoor dat er geen rode bloedcellen op de bodem van de buis zitten, wat aangeeft dat de rode bloedcellen volledig zijn gelyseerd. Resuspendeer de cellen in 2% FBS-PBS en ga direct verder met de volgende experimenten, of voeg een cryopreservatieoplossing voor cellen toe en bewaar ze 2-3 maanden bij -80°C.
    OPMERKING: Als algemene richtlijn geldt dat u voor resuspensie 0,5 ml 2% FBS-PBS per 1 x 106 cellen gebruikt. Het celgetal wordt bepaald met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller na trypanblauwe kleuring om levende cellen van dode cellen te onderscheiden. Deze verhouding zorgt voor een optimaal celherstel en levensvatbaarheid tijdens volgende procedures.

2. Isolatie van tumorweefselcellen

OPMERKING: De methode voor de isolatie van tumorweefselcellen is aangepast van Song et al.22.

  1. Gebruik na het verwijderen van de HCC, onder begeleiding van een patholoog, een steriel scalpel om een deel van het tumorweefsel weg te snijden. Het weefselblok moet ongeveer 1cm3 groot zijn. Spoel eventuele oppervlaktevlekken af met voorgekoelde 1x PBS. Dompel het weefsel onder in een centrifugebuis van 15 ml met ongeveer 5 ml RPMI 1640-medium met 10% FBS. Plaats de tube op ijs en transporteer deze terug naar het laboratorium voor verdere verwerking.
  2. Spoel bloedvlekken grondig af en verwijder handmatig vettig bindweefsel met behulp van een tang om een volledige weefselreiniging met voorgekoelde 2% FBS-PBS te garanderen. Breng het weefsel over naar een met weefselcultuur behandeld schaaltje met een digestieoplossing. Zet het tumorweefsel vast met een tang en snijd het met een scalpel in stukjes kleiner dan 1 mm3. Breng de weefselverteringsoplossing over in een centrifugebuis van 50 ml en voeg meer weefselverteringsoplossing toe tot het totale volume ongeveer 15 ml is.
  3. Plaats de centrifugebuis met het weefselverteringsmengsel in een shaker. Kantel of druk het plat en zet het vast voor de spijsvertering bij 150 tpm en 37 °C gedurende 1 uur. Filtreer de digestieoplossing door een filter van 70 μm.
    1. Gebruik tijdens deze procedure een zuiger van een spuit van 1 ml om de weefselfragmenten te vermalen. Spoel het filter af met een 2% FBS-1640-oplossing. Neem het filtraat en breng het over in een centrifugebuis van 15 ml.
  4. Centrifugeer het filtraat bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi na het centrifugeren het bovenstaande weg. Resuspendeer de pellet voorzichtig opnieuw in ongeveer 10 ml 36% Percoll-oplossing. Centrifugeer het vervolgens opnieuw bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  5. Zuig voorzichtig 1 ml RBC-lysisbuffer op met een pipet om de celsuspensie opnieuw te suspenderen. Breng de suspensie over in een nieuwe centrifugebuis van 15 ml en voeg de RBC-lysisbuffer toe om een totaal volume van 10 ml te bereiken. Laat het mengsel 10 minuten op kamertemperatuur staan.
    OPMERKING: Er wordt een nieuwe centrifugebuis gebruikt om te voorkomen dat onzuiverheden op de buiswand opnieuw in de celsuspensie terechtkomen, waardoor het risico op verminderde celopbrengst wordt verkleind.
  6. Centrifugeer de celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en suspendeer de cellen vervolgens opnieuw in een geschikt volume van 2% FBS-PBS. Gebruik als algemene richtlijn 0,5 ml 2% FBS-PBS per 1 x 106 cellen voor resuspensie.
    OPMERKING: Het celgetal wordt bepaald met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde cellenteller na trypanblauwe kleuring om levende cellen van dode cellen te onderscheiden. Het resuspensievolume is afhankelijk van de vereiste celhoeveelheid voor volgende experimenten. Deze verhouding zorgt voor een optimaal celherstel en levensvatbaarheid tijdens volgende procedures.

3. Cisplatine kleuring

  1. Neem respectievelijk 3 x 106 cellen van de PBMC's verkregen in stap 1.7 en de tumorcellen geïsoleerd in stap 2.6. Na celherstel resuspendeert u ze in 1 ml PBS zonder Ca2+ en Mg2+. Voeg cisplatine toe tot een eindconcentratie van 0,5 μM, meng goed en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Cisplatinekleuring wordt uitgevoerd om dode cellen te onderscheiden van levende cellen op basis van membraanintegriteit. Dode cellen met aangetaste membranen zullen cisplatine opnemen en een positief signaal vertonen, terwijl levende cellen ongekleurd blijven23. Het aantal cellen moet minimaal 1 x 106 zijn.
  2. Centrifugeer de buisjes 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, gooi het supernatant weg en voeg vervolgens 1 ml celkleuringsbuffer toe aan elk buisje met de in stap 3.1 voorbereide celsuspensies om de reactie te stoppen. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, gooi het supernatant weg en zorg ervoor dat de celpellet na het centrifugeren niet lineair over de wand van de buis wordt verdeeld.

4. Fc-receptor blokkeren

  1. Bereid van tevoren een blokmix van 50 μl voor elk monster: Combineer 48 μl celkleuringsbuffer en voeg vervolgens 2 μl Fc-blokkerende oplossing toe (celkleuringsbuffer: Fc-blokkerende oplossing = 9:1).
  2. Suspendeer de cellen uit stap 3.2 in het bovenstaande mengsel en laat ze 10 minuten op kamertemperatuur staan.

5. Incubatie van membraaneiwitantilichamen

  1. Bereid voor elk celmonster dat uit stap 4.2 is verkregen, de membraaneiwitantilichaammix voor door 1,1 μl-eenheden van elk antilichaam toe te voegen. Voeg vervolgens de celkleuringsbuffer toe om een eindvolume van 55 μL te bereiken. Op dit punt is het totale volume ongeveer 100 μL.
    OPMERKING: De mix bevat antilichamen gericht op belangrijke membraaneiwitten, zoals CD163, CCR3, CD141, CD117 en CD4524,25. Deze antilichamen werden geselecteerd vanwege hun specificiteit bij het identificeren van membraaneiwitmarkers en werden verkregen uit in de handel verkrijgbare bronnen (zie Materiaaltabel voor details, inclusief kloonnummers, fabrikanten en catalogusnummers).
  2. Voeg 50 μL bereide antilichaammix toe aan elk buismonster, breng het totale volume op 100 μL. Draai de monsters voorzichtig rond en incubeer ze gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Voeg 2 ml celkleuringsbuffer toe aan elk monster, centrifugeer 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Herhaal deze stap 2x.
  4. Gooi het bovenstaande weg en draai de resterende vloeistof kort met de celpellet om de cel te resuspenseren en grondig te verspreiden.

6. Nucleus eiwit kleuring

  1. Nadat de cellen volledig zijn geresuspendeerd, voegt u 500 μl van de gemengde oplossing (fixatie: fixatie/permeabilisatie = 3:1) toe aan elk monster uit stap 5.4. Meng de monsters voorzichtig en broed gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.
  2. Verdun de permeabilisatiebuffer (10x) met gedeïoniseerd water. Centrifugeer na de incubatie gedurende 500 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi het bovenstaande weg. Voeg 1000 μL 1x permeabilisatiebuffer toe aan elke buis om de cellen te wassen. Centrifugeer bij kamertemperatuur bij 1.000 x g gedurende 5 minuten en gooi het bovenstaande dan weg.
  3. Resuspendeer antilichamen in 1x permeabilisatiebuffer. Gooi het supernatant weg en voeg 50 μL van het antilichaammengsel toe aan elk buisje cellen. Piket de cellen voorzichtig om te mengen en incubeer vervolgens 30-45 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Voeg 1000 μL 1x permeabilisatiebuffer toe aan elke buis, centrifugeer bij kamertemperatuur bij 1.000 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
  5. Voeg 1000 μL celkleuringsbuffer toe aan elk buisje om de cellen opnieuw te suspenderen, centrifugeer bij kamertemperatuur op 1.000 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.

7. Cel fixatie

  1. Bereid een 1,6% formaldehyde-oplossing in PBS, waarbij 1 ml per monster nodig is.
  2. Voeg 1 ml 1,6% formaldehydeoplossing toe aan elk monster uit stap 6.5, vortex om grondig te mengen en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Hoewel formaldehyde vaak wordt gebruikt voor celfixatie, kunnen ook alternatieve reagentia zoals 4% paraformaldehyde (PFA) of methanol worden gebruikt. De keuze van het fixatief moet gebaseerd zijn op de specifieke vereisten van het experiment en de cellulaire kenmerken die moeten worden waargenomen.
  3. Centrifugeer bij kamertemperatuur bij 800 x g gedurende 5 minuten en gooi het bovenstaande weg.

8. Nucleaire intercalatie kleuring

  1. Bereid de oplossing voor celintercalatie: Verdun Cell-ID Intercalator-Iridium (Ir) met fixatie- en permeabilisatiebuffer tot een eindconcentratie van 125 nM. Bereid 1 ml van de oplossing per monster.
  2. Voeg 1 ml van de bereide celintercalatieoplossing toe aan elk vast monster uit stap 7.3. Meng voorzichtig en vortex onmiddellijk. Dit helpt de vorming van celaggregaten te minimaliseren.
  3. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4°C. Centrifugeer bij 500 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi het bovenstaande weg.

9. Bereiding van de celsuspensie

  1. Voeg vanaf stap 8.3 1000 μL celkleuringsbuffer toe aan de buis en centrifugeer gedurende 5 minuten op 800 x g . Gooi het bovenstaande weg. Herhaal deze stap 2x.
  2. Voeg 450 μL toe aan 900 μL gedeïoniseerd water om de cellen te resuspensie. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde cellenteller na trypanblauwe kleuring. Ga na het tellen verder met het verzamelen en analyseren van gegevens met behulp van massacytometrie.

10. Massacytometrie en data-analyse

  1. Verkrijg massacytometriegegevens met behulp van een CyTOF-systeem en sla deze op als Flow Cytometry Standard (FCS)-bestanden. Zorg voor de juiste kalibratie en kwaliteitscontrole van het instrument om achtergrondruis en batcheffecten te verminderen volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Verwerk de CD45+ -celpopulatie in het FCS-bestand voor met behulp van de bijbehorende software. Verwijder vuil op basis van celgrootte (voorwaartse verstrooiing, FSC) en granulariteit (zijverstrooiing, SSC). Sluit doubletten uit door opeenvolgende poorten van FSC-A/FSC-H of SSC-A/SSC-H plots. Verwijder dode cellen met behulp van levensvatbaarheidskleuring, zoals cisplatine-uitsluiting. Gate de CD45+ -populatie om zich te concentreren op immuuncellen en exporteer de gated populatie voor verdere analyse.
  3. Transformeer de data met een cofactor van 5 en identificeer de belangrijkste clusters met behulp van clusteringsoftware. Voer clustering uit op basis van het SPADE-algoritme (Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events), dat cellen met vergelijkbare markerexpressieprofielen groepeert in clusters26. Gebruik Hiërarchische stochastische buurinbedding (HSNE) voor dimensionaliteitsreductie en identificatie van afzonderlijke clusters26.
  4. Voer herclustering van de belangrijkste clusters uit met behulp van het cytofkit-pakket in R-software voor clustering zonder toezicht. Identificeer subclusters met PhenoGraph met behulp van standaardparameters.
  5. Pas Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) toe voor dimensionaliteitsvermindering. Voer statistische analyse uit met behulp van de Wilcoxon-test, waarbij een P-waarde < 0,05 als statistisch significant wordt beschouwd. Visualiseer de resultaten met behulp van ggplot2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de immunologische kenmerken van HCC op te helderen, werd een uitgebreide analyse van immuuncelpopulaties uitgevoerd. Gepaarde PBMC's en HCC-weefselmonsters werden verzameld van 4 patiënten met HCC. Massacytometrieprofilering werd uitgevoerd om immuuncelpopulaties op eencellig proteomisch niveau te onderzoeken, met behulp van twee antilichaampanels voor zowel PBMC's als HCC-weefselmonsters.

Na...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie maakt gebruik van massacytometrietechnologie om een diepgaande analyse te bieden van zowel systemische als lokale immuunresponsen bij HCC. De toepassing van massacytometrie in deze context maakt de gelijktijdige detectie van meerdere markers op eencellig niveau mogelijk, wat een gedetailleerde immunofenotypische karakterisering biedt die cruciaal is voor het begrijpen van het complexe immuunlandschap van HCC. Massacytometrie heeft een revolutie teweeggebracht in immunologisch...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het National Key Research and Development Program van China (subsidie 2019YFA0803000 aan J.S.), de Excellent Youth Foundation van Zhejiang Scientific (subsidie R22H1610037 aan J.S.), de National Natural Science Foundation of China (subsidie 82173078 aan J.S.), de Natural Science Foundation van de provincie Zhejiang (subsidie 2022C03037 aan J.S.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1×PBSHyCloneSH30256.01
10×PBSHyCloneSH30256.01
100 mm×20 mm tissue-culture-treated culture dishCorning430167
1000 mL pipette tipsRainin30389218
15 mL centrifuge tubeNEST601052
200 mL pipette tipsRainin30389241
40 mm nylon cell strainer/70-mm nylon cell strainerFalcon352340
50 mL centrifuge tubeNEST602052
70 μm syringe fifilterSangon BiotechF613462-9001
Anti-Human CCR2 Antibody (clone: K036C2)BioLegend357224
Anti-Human CCR3 Antibody (clone: 5E8)BioLegend310724
Anti-Human CCR7 Antibody (clone: G043H7)BioLegend353240
Anti-Human CD103 Antibody (clone: Ber-ACT8)BioLegend350202
Anti-Human CD115 Antibody (clone: 9-4D2-1E4)BioLegend347314
Anti-Human CD117 Antibody (clone: 104D2)BioLegend313201
Anti-human CD11b Antibody (clone: 1CRF44) BD562721
Anti-human CD11c Antibody (clone: B-ly6) BD563026
Anti-Human CD123 Antibody (clone: 6H6)BioLegend306002
Anti-Human CD127 Antibody (clone: A019D5)BioLegend351337
Anti-Human CD13 Antibody (clone: WM19)BioLegend301701
Anti-Human CD138 Antibody (clone: MI15)BioLegend356535
Anti-human CD14 Antibody (clone: HCD14)BioLegend325604
Anti-Human CD141 Antibody (clone: M80)BioLegend344102
Anti-Human CD15 Antibody (clone: QA19A61)BioLegend376302
Anti-human CD16 Antibody (clone: B7311) BD561313
Anti-Human CD161 Antibody (clone: HP-3G10)BioLegend339902
Anti-Human CD163 Antibody (clone: GHI/61)BioLegend333603
Anti-Human CD169 Antibody (clone: 7-239)BioLegend346002
Anti-human CD19 Antibody (clone: HIB19)BioLegend302226
Anti-Human CD1c Antibody (clone: L161)BioLegend331501
Anti-Human CD20 Antibody (clone: 2H7)BioLegend302301
Anti-Human CD206 Antibody (clone: 15-2)BioLegend321151
Anti-Human CD24 Antibody (clone: ML5)BioLegend311129
Anti-Human CD25 Antibody (clone: BC96)BioLegend302624
Anti-human CD3 Antibody (clone: UCHT1) BD555916
Anti-Human CD31 Antibody (clone: W18200D)BioLegend375902
Anti-Human CD32 Antibody (clone: FUN-2)BioLegend303232
Anti-Human CD326 Antibody (clone: CO17-1A)BioLegend369812
Anti-Human CD33 Antibody (clone: WM53)BioLegend303402
Anti-human CD4 Antibody (clone: L200) BD563094
Anti-Human CD45 Antibody (clone: HI30) BD563716
Anti-Human CD45RO Antibody (clone: UCHL1)BioLegend304220
Anti-human CD56 Antibody (clone: 5.1H11)BioLegend362510
Anti-Human CD64 Antibody (clone: S18012C)BioLegend399502
Anti-Human CD66b Antibody (clone: 6/40c)BioLegend392917
Anti-human CD68 Antibody (clone: Y1/82A)BioLegend333808
Anti-Human CD69 Antibody (clone: FN50)BioLegend310902
Anti-Human CD7 Antibody (clone: 4H9/CD7)BioLegend395602
Anti-human CD8 Antibody (clone: RPA-T8) BD557750
Anti-Human CD80 Antibody (clone: W17149D)BioLegend375402
Anti-Human CD86 Antibody (clone: BU63)BioLegend374202
Anti-Human FOXP3 Antibody (clone: 206D)BioLegend320101
Anti-Human HLA_ABC Antibody (clone: W6/32)BioLegend311426
Anti-human HLA-DR Antibody (clone: L243)BioLegend307650
Anti-Human IgD Antibody (clone: IA6-2)BioLegend348211
Anti-Human Ki67 Antibody (clone: Ki-67)BioLegend350501
Anti-Human PD_L2 Antibody (clone: MH22B2)BD567783
Anti-Human PD1 Antibody (clone: EH12.2H7)BioLegend329951
Anti-Human PDL1 Antibody (clone: MIH2)BioLegend393602
Anti-human TCR-γδ Antibody (clone: B1) BD740415
Cell cryopreservation

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, C. H., Cheng, Y., Zhang, S., Fan, J., Gao, Q. Changing epidemiology of hepatocellular carcinoma in Asia. Liver Int. 42 (9), 2029-2041 (2022).
  2. Renne, S. L., et al. Hepatocellular carcinoma: A clinical and pathological overview. Pathologica. 113 (3), 203-217 (2021).
  3. Sayiner, M., Golabi, P., Younossi, Z. M. Disease burden of hepatocellular carcinoma: A global perspective. Dig Dis Sci. 64 (4), 910-917 (2019).
  4. Zhang, X., et al. Risk factors and prevention of viral hepatitis-related hepatocellular carcinoma. Front Oncol. 11, 686962(2021).
  5. Zou, H., et al. Economic burden and quality of life of hepatocellular carcinoma in greater China: A systematic review. Front Public Health. 10, 801981(2022).
  6. Li, Y., You, Z., Tang, R., Ma, X. Tissue-resident memory t cells in chronic liver diseases: Phenotype, development and function. Front Immunol. 13, 967055(2022).
  7. Shen, K. Y., Zhu, Y., Xie, S. Z., Qin, L. X. Immunosuppressive tumor microenvironment and immunotherapy of hepatocellular carcinoma: Current status and prospectives. J Hematol Oncol. 17 (1), 25(2024).
  8. Oura, K., Morishita, A., Tani, J., Masaki, T. Tumor immune microenvironment and immunosuppressive therapy in hepatocellular carcinoma: A review. Int J Mol Sci. 22 (11), 5801(2021).
  9. Chen, Y., et al. Effect of infiltrating immune cells in tumor microenvironment on metastasis of hepatocellular carcinoma. Cell Oncol. 46 (6), 1595-1604 (2023).
  10. Du, Q., An, Q., Zhang, J., Liu, C., Hu, Q. Unravelling immune microenvironment features underlying tumor progression in the single-cell era. Cancer Cell Int. 24 (1), 143(2024).
  11. Xu, L., et al. Reshaping the systemic tumor immune environment (stie) and tumor immune microenvironment (time) to enhance immunotherapy efficacy in solid tumors. J Hematol Oncol. 15 (1), 87(2022).
  12. Mao, X., et al. Crosstalk between cancer-associated fibroblasts and immune cells in the tumor microenvironment: New findings and future perspectives. Mol Cancer. 20 (1), 131(2021).
  13. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: Visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  14. Sahaf, B., Rahman, A., Maecker, H. T., Bendall, S. C. Biomarkers for immunotherapy of cancer: Methods and protocols. , Springer. New York, New York, NY. (2020).
  15. Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PLoS One. 8 (6), e68519(2013).
  16. Wu, K., et al. Redefining tumor-associated macrophage subpopulations and functions in the tumor microenvironment. Front Immunol. 11, 1731(2020).
  17. Elaldi, R., et al. High dimensional imaging mass cytometry panel to visualize the tumor immune microenvironment contexture. Front Immunol. 12, 666233(2021).
  18. Gadalla, R., et al. Validation of cytof against flow cytometry for immunological studies and monitoring of human cancer clinical trials. Front Oncol. 9, 415(2019).
  19. Ijsselsteijn, M. E., Van Der Breggen, R., Farina Sarasqueta, A., Koning, F., De Miranda, N. A 40-marker panel for high dimensional characterization of cancer immune microenvironments by imaging mass cytometry. Front Immunol. 10, 2534(2019).
  20. Zhang, Q., et al. Mass cytometry-based peripheral blood analysis as a novel tool for early detection of solid tumours: A multicentre study. Gut. 72 (5), 996-1006 (2023).
  21. Zheng, B., et al. Trajectory and functional analysis of pd-1(high) cd4(+)cd8(+) t cells in hepatocellular carcinoma by single-cell cytometry and transcriptome sequencing. Adv Sci. 7 (13), 2000224(2020).
  22. Song, J., et al. Protocol for isolating single cells from human pancreatic cancer tissues and analyzing major immune cell populations using flow cytometry. STAR Protoc. 4 (4), 102679(2023).
  23. Simoni, Y., Chng, M. H. Y., Li, S., Fehlings, M., Newell, E. W. Mass cytometry: A powerful tool for dissecting the immune landscape. Curr Opin Immunol. 51, 187-196 (2018).
  24. Comi, M., et al. Coexpression of cd163 and cd141 identifies human circulating il-10-producing dendritic cells (dc-10). Cell Mol Immunol. 17 (1), 95-107 (2020).
  25. Fan, L., et al. High-dimensional single-cell analysis delineates peripheral immune signature of coronary atherosclerosis in human blood. Theranostics. 12 (15), 6809-6825 (2022).
  26. Sheng, J., et al. Human endogenous retrovirus activation contributes to biliary atresia pathogenesis through re-education of resident macrophages. Biorxiv. , (2022).
  27. Terekhova, M., et al. Single-cell atlas of healthy human blood unveils age-related loss of nkg2c(+)gzmb(-)cd8(+) memory t cells and accumulation of type 2 memory t cells. Immunity. 56 (12), 2836-2854.e9 (2023).
  28. Sathaliyawala, T., et al. Distribution and compartmentalization of human circulating and tissue-resident memory t cell subsets. Immunity. 38 (1), 187-197 (2013).
  29. Lee, S., Vu, H. M., Lee, J. H., Lim, H., Kim, M. S. Advances in mass spectrometry-based single cell analysis. Biology. 12 (3), 395(2023).
  30. Iyer, A., Hamers, A. A. J., Pillai, A. B. Cytof for the masses. Front Immunol. 13, 815828(2022).
  31. Yuan, X., Wang, J., Huang, Y., Shangguan, D., Zhang, P. Single-cell profiling to explore immunological heterogeneity of tumor microenvironment in breast cancer. Front Immunol. 12, 643692(2021).
  32. Serban, G. M., Mănescu, I. B., Manu, D. R., Dobreanu, M. Optimization of a density gradient centrifugation protocol for isolation of peripheral blood mononuclear cells. Acta Marisiensis - Seria Medica. 64 (2), 83-90 (2018).
  33. Shcherbakova, A., et al. Factors affecting cell viability during the enzymatic dissociation of human endocrine tumor tissues. Biology (Basel). 13 (9), 665(2024).
  34. Devine, R. D., Alkhalaileh, H. S., Lyberger, J. M., Behbehani, G. K. Alternative methods of viability determination in single cell mass cytometry. Cytometry A. 99 (10), 1042-1053 (2021).
  35. Gonzalez, V. D., Huang, Y. W., Fantl, W. J. Mass cytometry for the characterization of individual cell types in ovarian solid tumors. Methods Mol Biol. 2424, 59-94 (2022).
  36. Zabransky, D. J., et al. Profiling of syngeneic mouse hcc tumor models as a framework to understand anti-pd-1 sensitive tumor microenvironments. Hepatology. 77 (5), 1566-1579 (2023).
  37. Levine, L. S., et al. Single-cell analysis by mass cytometry reveals metabolic states of early-activated cd8(+) t cells during the primary immune response. Immunity. 54 (4), 829-844.e5 (2021).
  38. Lv, B., et al. Immunotherapy: Reshape the tumor immune microenvironment. Front Immunol. 13, 844142(2022).
  39. Zhou, Z., et al. Deciphering the tumor immune microenvironment from a multidimensional omics perspective: Insight into next-generation car-t cell immunotherapy and beyond. Mol Cancer. 23 (1), 131(2024).
  40. Hsieh, W. C., et al. Spatial multi-omics analyses of the tumor immune microenvironment. J Biomed Sci. 29 (1), 96(2022).
  41. Wang, Z., et al. Gdf15 induces immunosuppression via cd48 on regulatory t cells in hepatocellular carcinoma. J Immunother Cancer. 9 (9), e002787(2021).
  42. Krams, S. M., Schaffert, S., Lau, A. H., Martinez, O. M. Applying mass cytometry to the analysis of lymphoid populations in transplantation. Am J Transplant. 17 (8), 1992-1999 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Immune ProfilingCyTOF AnalysisPeripheral BloodTumor Immune ResponseSingle Cell AnalysisImmune Cell SubsetsBiomarker DiscoverySPADE Clustering

Gerelateerde artikelen